流式细胞技术（精选10篇）
流式细胞技术 篇1
流式细胞分选技术是借鉴荧光标记、激光、计算机分析技术, 对单细胞定量分析的一种新技术, 其具有极高的细胞检测速度与统计精确性, 广泛应用于医学临床实践的细胞生物学、血液学、免疫学、遗传及临床检验学等各个领域。利用其技术特性, 在奶牛性控冻精的生产上也得到了广泛应用, 从而进一步提高奶牛生产性能和育种进程。
1 性染色体DNA质量差异
哺乳动物每一个体的X精子和Y精子, 其DNA含量都是恒定的, 通常X染色体较Y染色体大, X精子的DNA含量较Y精子多3.0%~4.5%, 例如牛X精子的DNA含量较Y精子多3.8%。利用哺乳动物精子携带X染色体和Y染色体的DNA含量存在差异这一特性, 为流式细胞仪进行X、Y精子的分离奠定了理论基础。
2 荧光染料Hoechst33342与精子细胞定量结合特性
在精子分离的前期处理时应用的染色剂Hoechst33342是一种相对安全的只对活细胞中DNA染色的荧光染料, 它能穿透活细胞的脂质膜, 以非嵌入方式特异性与DNA结合。其特性在于渗透入精子细胞后, 对精子细胞的活力、受精的胚胎及后代个体发育不会造成显著影响。
3 精子细胞分选的技术及原理
取定量活力在70%以上, 精子密度为 (9~14) ×108个/m L原精液, 用Hepes缓冲液稀释至2×108个/m L, 加入定量的Hoechst33342荧光染料, 经34℃的水浴处理后, 置于分离仪上样仓。当经荧光染色标记的精子细胞被高压压入细微进样管经流动室时被具有导电特性的鞘液包裹, 形成单个细胞的微小液滴, 并被排成单列, 液滴以一定速度从流动室70μm喷嘴喷出, 并逐个与激光束交截。被染色的精子细胞被激发出蓝色激发光, 由于X精子DNA含量较Y精子多, 比Y精子结合更多的荧光染料, 因此经激光束激发释放出强弱不同的荧光信号, 信号经流式细胞仪自带的计算机系统扩增放大并且定位分析后做出判断, 分辨出X精子、Y精子或是模糊难以分辨精子, 同时在计算机上设定程序, 根据分辨结果给每个包裹单个X精子或Y精子的液滴附予正电荷或负电荷。在微小液滴通过流动室中部的超高频压电晶体偏转板时, 充电振动, 在高压电场的作用下偏转, 分路落入各自的收集容器中, 没有充电的模糊精子液滴落入中间的废液容器, 从而实现细胞的分离。目前, 先进的流式细胞仪分选速度理论上可达20 000个细胞/s以上, 其分选纯度能达到90%以上, 一次分离的最大合理量约为108个细胞。如果分选的精液样本量大时, 为避免细胞活性降低, 可采取分段式收集。
4 流式细胞仪分选过程中对精子产生损伤的几个因素
在分离精子的过程中, 对精液的高度稀释、荧光染色、分离过程中的激光照射、高压力机械损伤以及分离后的离心作用等诸多操作都不同程度地影响精子的生理机能;尤其对精子细胞最外层的细胞膜造成损伤, 直接影响精子活力, 顶体完整率、线粒体活性和获能状况, 并使得分选的精子存活时间和受精能力下降。
5 性控冻精用于奶牛生产前景展望
近年来, 流式细胞分离仪用于分选奶牛精液的技术趋于成熟, 分选精子细胞的效率也大幅提高, 其用于生产实践中显示出了较大的优势, 但目前这项技术的应用还存在许多问题。首先, 生产成本较高, 流式细胞仪价格昂贵, 专利技术使用及后期维护费用也较高, 增加了生产成本;其次, 虽然分选精子的速度较早期有了明显提高, 但还远不能满足现在生产所需;再次, 研究表明性控冻精的受精能力明显低于常规冻精的受精能力, 通过试验证实, 母牛使用性控冻精 (每只细管精子数2×106个) 的受孕率为常规冻精 (每只细管精子数20×106个) 受孕率的60%~80%, 单位细管的精子数量和精子在分离过程中受到的损伤是产生这一现象的主要原因, 因此, 设法减少精子在分离过程中的损伤和进一步提高分选效率, 是今后性控精液分离技术发展的重点方向。
流式细胞技术 篇2
1．1 流式细胞仪的基本概念 流式细胞仪（flow cytonletry，FCM）是对高速直线流动的细胞或生物微粒进行快速定量测定和分析的仪器，主要包括样品的液流技术、细胞的计数和分选技术，计算机对数据的采集和分析技术等。流式细胞仪以流式细胞术为理论基础，是流体力学、激光技术、电子工程学、分子免疫学、细胞荧光化学和计算机等学科知识综合运用的结晶。流式细胞术是一种自动分析和分选细胞或亚细胞的技术。其特点是：测量速度快、被测群体大、可进行多参数测量，即对同一个细胞做有关物理、生物化学特性的多参数测量，且在统计学上有效。
1．2 流式细胞仪的发展简史 最早的流式细胞仪雏形诞生于1934年，Moldavan提出使悬浮的单个血红细胞流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置测量的设想。1953年Crosland-Taylor根据牛顿流体在圆形管中流动规律设计了流动室。其后又经过Coulter、Parker & Horst、Kamentsky、Gohde、Fulwyler、Herzenberg等人的不断改进，设计了光电检测设备和细胞分选装置、完成了计算机与流式细胞仪的物理连接及多参数数据的记录和分析、开创了细胞的免疫荧光染色及检测技术、推广流式细胞仪在临床上的应用。近20年来，随着流式细胞仪及其检测技术的日臻完善，人们越来越致力于样品制备、细胞标记、软件开发等方面的工作，以扩大FCM的应用领域和使用效果。
宋平根的《流式细胞术的原理和应用》是迄今为止对流式细胞仪及其技术阐述的最为详尽和透彻的中文著作。这本书非常详细地介绍了流式细胞术的历史、结构、原理、技术指标等，例举了其在医学和生物工程中的应用，非常适合从事此方面专业研究的人。由于这本书是13年前出版的，所以基本上没有涉及植物流式细胞仪检测技术。此外对于只需要对流式细胞仪有些基本认识的人士来说，这本书太复杂太深奥。谢小梅主要介绍了流式细胞仪在生物工程中的应用。杨蕊概括了流式细胞仪的工作原理，简单提及了流式细胞仪的应用。本文在分析这三篇论著或文章的优缺点后，用比较通俗的语言介绍了掌握流式细胞仪检测技术必须了解的一些原理，并对目前市场上的主流型号进行了客观的性能概括。2 流式细胞仪的工作原理和技术指标
2．1 流式细胞仪工作原理 除电源外，流式细胞仪主要由四部分组成：流动室和液流系统：激光源和光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统，其中流动室是仪器的核心部件。这四大部件共同完成了信号的产生、转换和传输的任务。
流动室和液流系统
流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作。设计和制作均很精细，是液流系统的心脏。样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射出。为了保证液流是稳液，一般限制液流速度υ<10m/s。由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴线上。流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。
激光源和光学系统
经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。常用的光源有弧光灯和激光；激光器又以氩离子激光器为普遍，也有配和氪离子激光器或染料激光器。光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。汞灯是最常用的弧光灯，其发射光谱大部分集中于300～400nm，很适合需要用紫外光激发的场合。氩离子激光器的发射光谱中，绿光514nm和蓝光488nm的谱线最强，约占总光强的80%；氪离子激光器光谱多集中在可见光部分，以647nm较强。免疫学上使用的一些荧光染料激发光波长在550nm以上，可使用染料激光器。将有机染料做为激光器泵浦的一种成份，可使原激光器的光谱发生改变以适应需要即构成染料激光器。例如用氩离子激光器的绿光泵浦含有Rhodamine6G水溶液的染料激光器,则可得到550～650nm连续可调的激光，尤在590nm处转换效率最高，约可占到一半。为使细胞得到均匀照射，并提高分辨率，照射到细胞上的激光光斑直径应和细胞直径相近。因此需将激光光束经透镜会聚。光斑直径d可由下式确定：d=4λf/πD。λ为激光波长；f为透镜焦距；D为激光束直径。色散棱镜用来选择激光的波长，调整反射镜的角度使调谐到所需要的波长λ。为了进一步使检测的发射荧光更强，并提高荧光讯号的信噪比，在光路中还使用了多种滤片。带阻或带通滤片是有选择性地使某一滤长区段的光线滤除或通过。例如使用525nm带通滤片只允许FITC（Fluoresceinisothiocyanate,异硫氰荧光素）发射的525nm绿光通过。长波通过二向色性反射镜只允许某一波长以上的光线通过而将此波长以下的另一特定波长的光线反射。在免疫分析中常要同时探测两种以上的波长的荧光信号，就采用二向色性反射镜，或二向色性分光器，来有效地将各种荧光分开。
光电管和检测系统
经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而进行测量的。光电倍增管（PMT）最为常用。PMT的响应时间短，仅为ns数量级；光谱响应特性好，在200～900nm的光谱区，光量子产额都比较高。光电倍增管的增益从10到10可连续调节，因此对弱光测量十分有利。光电管运行时特别要注意稳定性问题，工作电压要十分稳定，工作电流及功率不能太大。一般功耗低于0.5W；最大阳极电流在几个毫安。此外要注意对光电管进行暗适应处理，并注意良好的磁屏蔽。在使用中还要注意安装位置不同的PMT，因为光谱响应特性不同，不宜互换。也有用硅光电二极管的，它在强光下稳定性比PMT好。
从PMT输出的电信号仍然较弱，需要经过放大后才能输入分析仪器。流式细胞计中一般备有两类放大器。一类是输出信号辐度与输入信号成线性关系，称为线性放大器。线性放大器适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号，例DNA测量等。另一类是对数放大器，输出信号和输入信号之间成常用对数关系。在免疫学测量中常使用对数放大器。因为在免疫分析时常要同时显示阴性、阳性和强阳性三个亚群，它们的荧光强度相差1～2个数量级；而且在多色免疫荧光测量中，用对数放大器采集数据易于解释。此外还有调节 便利、细胞群体分布形状不易受外界工作条件影响等优点。
计算机和分析系统
经放大后的电信号被送往计算机分析器。多道的道数是和电信号的脉冲高度相对应的，也是和光信号的强弱相关的。对应道数年纵坐标通常代表发出该信号的细胞相对数目。多道分析器出来的信号再经模-数转换器输往微机处理器编成数据文件，或存贮于计算机的硬盘和软盘上，或存于仪器内以备调用。计算机的存贮容量较大，可存贮同一细胞的6～8个参数。存贮于计算机内的数据可以在实测后脱机重现，进行数据处理和分析，最后给出结果。除上述四个主要部分外，还备有电源及压缩气体等附加装置。
2．1．1 信号的产生、转换和传输 在压力作用下，鞘液管中的鞘液被持续不断地压入流动室，形成一股稳定地连续的液流，保证了样本液稳定地处于鞘液液流的轴线上，并以单个细胞形式直线通过激光照射区。激光照射区又称测量区，是指液流与激光束垂直相交的点。当细胞携带荧光素标记物（每种物质携带的标记物不同吗?）通过激光照射区时，产生代表细胞内部不同物质、不同波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向空间360°立体角发射，产生散射光和荧光信号。散射光不依赖任何细胞样品的制备技术，因此被称为细胞的物理参数或固有参数。散射光又包括前向角散射和测向角散射。前向角散射与被测细胞直径的平方密切相关，测向角散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。荧光信号也有二种；一种是细胞自身在激光照射下发出的微弱荧光信号，另一种是经过特异荧光素标记后的细胞受激发照射后得到的荧光信号。在免疫分析中常要同时探测两种以上波长的荧光信号，就采用二向色性反射镜，或二向色性分光器，来有效地将各种荧光分开。
经荧光染色的细胞受到适合的光激发后产生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而进行测量的。最常用的光电转换器是光电倍增管（PMT）。从PMT输出的电信号需要经过放大后才能输入分析仪器。流式细胞仪中一般备有两类放大器。一类是线性放大器，其输出信号与输入信号成线性关系。线性放大器适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号，如DNA测量等。另一类是对数放大器，其输出信号和输入信号之间成常用对数关系。在免疫学测量中常使用对数放大器。放大后的电信号被传送到计算机，再经模一数转换器传输到微机处理器形成数据文件，保存在计算机上。保存在计算机上的数据可在脱机后再进行数据处理和分析。
参数（例如：细胞的大小、形态、质膜和细胞内部结构）测量原理
流式细胞仪可同时进行多参数测量，信息主要来自特异性荧光信号及非荧光散射信号。测量是在测量区进行的，所谓测量区就是照射激光束和喷出喷孔的液流束垂直相交点。液流中央的单个细胞通过测量区时，受到激光照射会向立体角为2π（360°）的整个空间散射光线，散射光的波长和入射光的波长相同。散射光的强度及其空间分布与细胞的大小、形态、质膜和细胞内部结构密切相关，因为这些生物学参数又和细胞对光线的反射、折射等光学特性有关。未遭受任何损坏的细胞对光线都具有特征性的散射，因此可利用不同的散射光信号对不经染色活细胞进行分析和分选。经过固定的和染色处理的细胞由于光学性质的改变，其散射光信号当然不同于活细胞。散射光不仅与作为散射中心的细胞的参数相关，还跟散射角、及收集散射光线的立体角等非生物因素有关。
在流式细胞术测量中，常用的是两种散射方向的散射光测量：①前向角（即0角）散射（FSC）；②侧向散射（SSC），又称90角散射。这时所说的角度指的是激光束照射方向与收集散射光信号的光电倍增管轴向方向之间大致所成的角度。一般说来，前向角散射光的强度与细胞的大小有关，对同种细胞群体随着细胞截面积的增大而增大；对球形活细胞经实验表明在小立体角范围内基本上和截面积大小成线性关系；对于形状复杂具有取向性的细胞则可能差异很大，尤其需要注意。侧向散射光的测量主要用来获取有关细胞内部精细结构的颗粒性质的有关信息。侧向散射光虽然也与细胞的形状和大小有关，但它对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，也能对细胞质内较大颗粒给出灵敏反映。
在实际使用中，仪器首先要对光散射信号进行测量。当光散射分析与荧光探针联合使用时，可鉴别出样品中被染色和未被染色细胞。光散射测量最有效的用途是从非均一的群体中鉴别出某些亚群。
荧光信号主要包括两部分：①自发荧光，即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光；②特征荧光，即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光，其荧光强度较弱，波长也与照射激光不同。自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和测量。在免疫细胞化学等测量中，对于结合水平不高的荧光抗体来说，如何提高信噪比是个关键。一般说来，细胞成分中能够产生的自发荧光的分子（例核黄素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强；培养细胞中死细胞/活细胞比例越高，自发荧光越强；细胞样品中所含亮细胞的比例越高，自发荧光越强。
减少自发荧光干扰、提高信噪比的主要措施是：①尽量选用较亮的荧光染料；②选用适宜的激光和滤片光学系统；③采用电子补偿电路，将自发荧光的本底贡献予以补偿。
2．1．2 流式细胞仪分选原理 并不是所有的流式细胞仪都具有分选功能。流式细胞仪的分选功能是由细胞分选器来完成的。由喷嘴射出的液流柱在电信号作用下发生振动，断裂形成均匀的小液滴。根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选，而后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集器中。使用不同孔径的喷孔及改变液流速度，可能会改变分选效果。从参数测定经逻辑选择再到脉冲充电需要一段延迟时间。精确测定延迟时间是决定分选质量的关键，可根据具体要求进行适当调整。
2．1．3 数据的显示和分析 数据处理主要包括数据的显示和分析。单参数直方图是使用最多的图形显示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析。单参数直方图是由X、Y二方向组成的二维平面图。横座标X是所测的荧光或散射光的强度，用“道数”（Channel No．）来表示。选择的放大器类型不同，标度不同。纵座标Y通常表示被测细胞的绝对数目。正常情况下，数据分析得到的图形为具有一个或若干个峰的曲线图。对曲线图的解释应该具体问题具体分析。
除直方图外，数据显示方式还包括二维点图、二维等高图、假三维图和列表模式等。二维点图也是比较常用的数据显示类型。它显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系，也是二维平面图，横纵坐标可以根据自己选定的被测参数自行决定，点的位置表明了细胞和颗粒具有的二个被测参数的数值。二维点图所提供的信息量要大于单参数直方图。
数据分析的方法大体可分为参数法和非参数法两大类。当被检测的生物学系统能够用某种数学模型时则多使用参数方法。非参数分析法不用对显示的图像做任何假设，也不采用数学模型，分析程序可以很简单，也可能很复杂。临床医学较常使用非参数分析法。
2．2 流式细胞仪性能的技术指标 流式细胞仪性能的技术指标主要有荧光分辨率、荧光灵敏度、适用样品浓度、分选纯度等。荧光分辨率是指分辨两个相邻峰的最小距离，通常用变异系数（CV值）来表示。现在市场上主流型号出厂时的荧光分辨率应该小于2.0%。荧光灵敏度反映了仪器探测最小荧光光强的能力。一般用荧光微球上可测出的FITC的最少分子数来表示。目前仪器均可达到1000左右。仪器工作时样品浓度一般在105～107细胞/ml。分析速度/分选速度是指流式细胞仪每秒种可分析或分选的颗粒数目。一般分析速度为5000～10000，分选速度控制在1000以下。流式细胞仪测量的数据是相对值，因此需要在使用前对系统进行校准或标定。流式细胞仪的校准有二个目的，即仪器的准直调整和定量标度。通常使用标准微球作为非生物学标准样品，鸡血红细胞做为生物学标准样品。主流流式细胞仪型号及其特性介绍
目前拥有市场较大份额的公司是美国的BD（Becton-Dickinson）公司、Beckman-Coulter公司（原名称Coulter）和德国的Partec公司。
3．1 BD公司流式细胞仪介绍 BD公司生产的流式细胞仪都冠以FACs（fluorescence activated cell sorter），即荧光激活细胞分选器。其型号种类比较齐全，如早期的FACSort、FACS Canto、FACSean。现在市场上供应的型号有五种：FACSCount（小型流式细胞仪）、FACS CAlibur（流式细胞仪）、FACSA ria（流式细胞分选仪）、FACSV antage SETM（多色分析和高速分选流式细胞仪）、LSR II（数字化分析型流式细胞仪）。
FACSCount为精确计数淋巴细胞CD3，CD4，CD8绝对数而设计的。FACSCalibur是全自动多色流式系统，偏重于临床，其整体设计帮助临床医生快速实现常规免疫表型、CD4T细胞计数、DNA、网织红细胞、血小板等临床分析，兼具分选功能。配备有二根激光管，可同时检测4个荧光参数。可识别粘联细胞。
BD FACSA ria流式细胞分选仪为台式高速细胞分选仪，获取速度达70，000细胞/s，分析速度达50，000/s。使用石英杯流动检测池固定光路校准技术。使用三种激光，多色分析，分析参数可达15色。两管或四管分选，可以使用多种规格的收集管。液流监测系统白动监测液流断点，检查堵塞，实现了细胞分选的无人操作。配件BDACDU装置，可以在微孔板或载波片上定量分选细胞。
FACSV antage SETM是在FACSV antage的细胞分选功能基础上推出的分选增强型流式细胞仪。六色荧光分析系统，点对点分选，配置FACS Diva数字化系统，提供全面的配套试剂。速度和功能优于FACSV antage。BD LSR II是LSR的数字化升级版，其性能介于FACSV antage SE和FACS Calibur之间，是专为生命科学研究设计的台式机。配备固定校准的紫外激光，四种激光立体空间激发、十色荧光同时分析、电子系统数字化、比较易学易用。
3．2 Beckman-Coulter公司流式细胞仪介绍 Beckman-Coulter公司生产的流式细胞仪以Profile（早期，现已停产）和EPICS系列为代表，近年又推出了Cytomics FC500系列。EPICS系列是大型流式细胞仪，目前市场上有XL、XL-MCL和ALTRA三种型号，其中ALTRA具有分选功能，适用于免疫学、细胞生理、分子生物学、遗传学、微生物学、水质分析和植物细胞分析。Cytomics FC500系列流式细胞仪体积小，可自动进行5种颜色的分析，适用于免疫学检测，如人类HIV诊断。特别是FC500MPL的独特设计可以在同一系统上使用12×75mm的离心管和24或96孔的平板。特别适合工作量大的实验室。
这二个公司主要针对医学研究和临床工作进行设计和生产，其产品可应用于生物医学基础研究以及临床检测的许多领域，如遗传、肿瘤、血液、免疫等诸多研究中红细胞、T细胞、淋巴细胞亚群测定、检测早期细胞凋亡、肿瘤细胞免疫测定等。这二个公司的流式细胞仪价格昂贵，我国主要购买、使用的单位基本上都是一些医疗机构。
3．3 Partec公司流式细胞仪介绍 与BD和Becman-Coutler公司的产品相比，德国Partec公司生产的流式细胞仪的共同特点是体积小，造价低，易操作，便于携带，适合植物学研究，适合边远地区和发展中国家。德国Partec公司的产品分为三类：CCA家族、PAS家族和CyFlow家族（Galaxy为早期产品，已停产）。CCA家族包括细胞计数分析仪CCA和倍性分析仪PA-I。它是单或双参数的台式小型机，可以进行一些常规分析，如核DNA测定（检测倍性或细胞周期）、细胞计数、细胞凋亡。它的特点是体积小，易操作，价格低，检测范围广，可以检测多种荧光素（如PI、DAPI、Fluorescein）发出的荧光。PAS家族包括粒子分析系统PAS、粒子分析系统III（PAS-III）和倍性分析仪PA-II。提供三种激光器的三种组合，可检测十余种荧光染料。最多可检测和记录八个独立荧光参数。倍性分析仪PA能够在2分钟内自动测量植物的倍性水平，检测异倍体。可以对叶片、幼苗、种子、果皮、根、花等植物材料进行分析。在大多数植物中，异倍体染色体的检测分辨率为±1条染色体。PA-I使用HBO-100汞灯，属于弧光灯，可产生紫外激发光和蓝光。PA-II中增加了488nm氩离子激光器，能够检测几乎所有的荧光染料，如DAPI，Hoeehst，PI，EB，MMC，FITC，FDA等。汞灯发光是电流经过气体时，气体电离产生的。它能提供最佳的激发波长。
CyFlow（R）SL配备三种激光管，可应用于诸如人类健康、微生物学、工业应用、过程控制、生态学等研究。如HIV扫描中免疫标记细胞计数、食品处理过程中的微生物计数、细胞凋亡等。它使用l2 V直流电，特别适合边远地区和发展中国家。
国际上20世纪80年代开始将流式细胞仪检测应用到植物的研究中（Galbraith，1983），众多学者都认为流式细胞仪是一种准确、快速的检测DNA含量的方法（Michaelson，1991）。应用范围主要是利用流式细胞仪研究属内、属间多种植物的DNA含量（Baird，1994；Jacob，1996；HALL，2000）和倍性水平（Costich，1993；Meng，2002）、检测体细胞杂种（Pfosser，1995；Keller，1996）和游离小孢子培养再生株（Kim，2003）的DNA含量。过去我国应用这一检测技术的植物研究工作者寥寥无几，且大多是在国外实验室完成的。研究内容包括植物生理、程序性死亡、倍性鉴定等。植物研究中使用的流式细胞仪基本上都是Partec公司的产品，也有少量是BD公司生产的流式细胞仪。BD公司的产品主要定位于医学研究与应用，与Partec产品相比，不太适合从事植物染色体倍性的鉴定。主要体现在不能提供植物样品制备技术/试剂，数据获取软件可同时检测到的倍性数目少。鉴于目前我国科研院所中使用较多的是BD公司生产的流式细胞仪，在下一篇中将会对利用BD流式细胞仪进行植物倍性检测的技术和技巧做详细报告。
如何选择流式细胞仪
自七十年代出现第一代流式细胞仪以来，随着计算机技术、电子制造技术、激光技术及荧光素合成技术的不断发展，现代流式细胞仪已今非昔比，制造工艺、功能、精确度有了质的飞跃。
流式细胞仪生产厂商推出各种不同型号的流式细胞仪来满足用户的不同需要。现生产流式细胞的厂商全球至少有六家，各厂商产品又有不同的系列，各具特点。如何从众多的型号中挑选出最适合自己的机型，我们还需从分析应用出发，评估自己的需求来决定什么样的流式细胞仪最具性价比、最适合自己。⑴、DNA倍体分析
DNA分析是流式细胞仪最初且是现在应用最广检测项目。由于恶性细胞DNA含量通常与正常细胞不同，存在异倍体细胞，所以现有很研究评价异倍体细胞与肿瘤恶性度及其预后的关系。DNA含量检测还可提供细胞周期方面的信息，这在细胞生物学中运用很广泛。特别地，它可表示出细胞毒性药物对细胞作用过程。这些DNA检测还可与细胞表面标志物标记同时进行，这样在细胞混合培养中，可通常追踪表达特异标志物的细胞显示其生长周期情况。所有方法都是基于染料能与核酸起特异的化学反应并发射出荧光，常用的染料为PI，DAPI。
流式细胞仪要求：488nm光源，575nm滤光片。⑵、细胞生存能力实验
使用Heochest 33342染料与DNA特异性结合，后因细胞活力不同，染料的结合程度也各异，故可评估细胞的活性度。
流式细胞仪要求：360nm光源，455nm滤光片。⑶、计数外周血中检测网织红细胞
使用TO染料能够特异性地与RNA结合，结合系数高达3000，故具有很好的性价比。流式细胞仪要求：488nm光源，525nm滤光片，液量绝对计数系统。
⑷、外周血、骨髓采集物中CD34阳性干细胞计数，临床上用于骨髓移植前干细胞数理的测定
使用标准ISHAG方案，需要DNA或其他核染料占用FITC通道，PE标记CD34抗体，PE-CY5标记CD45抗体。流式细胞仪要求：488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片，液量绝对计数系统。⑸、交叉淋巴细胞、粒细胞毒实验
检测识别供体血清中免疫球蛋白与受体粒细胞之间是否存在反应有着重要临床意义，因为这种反应会导致移植后发热、移植后肺损伤及免疫性粒细胞缺乏症。流式细胞仪可检测全血样本与血清孵育后粒细胞上结合的人免疫球蛋白。FITC标记人免疫球蛋白抗体、PE标记粒细胞表面标志物、PE-CY5标记HLA抗体。流式细胞仪要求：488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片。⑹、血小板自身抗体检测
血小板自身抗体识别人血小板抗原，会引起各种临床相关症状，如新生儿自免性血小板减少症、输血后紫癜、难治性血小板减少。流式细胞可快速准确地检测血小板自身抗体。FITC标记抗人免疫球蛋白抗体、PE标记识别血小板抗体。
流式细胞仪要求：488nm光源，525nm、575nm滤光片。⑺、移植交叉配型
原细胞毒实验，主要用于避免移植物超急性排拆反应。流式细胞仪用于监测T或B细胞是否受到受体血清中免疫球蛋白攻击，作为HLA配型前的预实验。流式细胞仪因其高精确性已成为该领域内的金标准。FITC标记抗人免疫球蛋白抗体、PE标记识别T细胞CD3或B细胞CD29抗体。仪器要求：488nm光源，525nm、575nm滤光片。⑻、检测细胞经抗原或细胞有丝分裂刺激后活化效应
淋巴细胞早期活化指标CD69可用来检测免疫治疗效果。流式细胞使用三色分析可监测淋巴细胞各亚群活化情况：FITC标记的CD3抗体、PE标记的CD8抗体、PE-CY5标记的CD69抗体。流式细胞仪要求：488nm光源，525nm、575nm、575nm滤光片。⑼、检测细胞内因子（TH1/TH2细胞检测）
未活化的淋巴细胞所分泌的细胞因子极少，用流式细胞仪很难检测出来，因此在检测前需刺激活化。活化所用的刺激素为PMA 佛波酯+Ionomycin。淋巴细胞在刺激素的作用下，活化分泌细胞因子到细胞外。因流式细胞仪只能对细胞表面或内部的抗原进行检测，如细胞因子分泌到细胞外则检测不到，因此必须阻止细胞因子的分泌。抑制细胞因子分泌的试剂为Brefedlin A或Monensin。Th1/Th2细胞首先是CD4+T细胞，因此存在着用CD4来设定细胞群的问题。我们知道CD4不但在T 细胞上表达，还在所有的单核细胞上表达，因此单独用CD4设门无法将CD4+T细胞区分开来。那么我们用CD3和CD4双参数设门是否可以呢？回答是否定的。因为在佛波酯的刺激作用下CD4 抗原的表达会迅速下调，甚至完全丧失，所以不适合于设门。用CD3和CD8设门，因CD8不受佛波脂的影响且绝大多数CD3+CD8-的细胞都是CD3+CD4+细胞，因此可用CD3+CD8-细胞群来确定CD4+T细胞群。FITC标记CD8，PE标记IL-4和，PE-CY5标记IFN-r，APC或PE-CY7标记CD3。
流式细胞仪要求：488nm或633nm（仅限APC染料）光源，525nm、575nm、675nm，767nm滤光片。⑽、细胞增殖状态检测
核增殖抗PCNA、Ki67、BrdUrd用于衡量细胞增殖分裂状况，在评估肿瘤预后有重要意义。为些标志物的检测一般同细胞表面标志物同时检测。FITC标记PCNA或Ki67或BrdUrd，PE或（并）PE-CY5标记细胞表面标志物。
流式细胞仪要求：488nm或633nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片。⑾、染色体分析
流式细胞仪染色分析运用两种特异性染料：Hoechest33258与核苷酸AT结合；Chromomycin A3与GC相结合。从而在双参数坐标上根据染色体ATCG含量的不同识别各种染色体。平时进行的染色体分析耗时且需要操作者极具经验，而用流式细胞仪时可快速地识别出异常染色体，如加配分选系统可将这些异常染色体分选出来作进一步分析。
流式细胞仪要求：360nm或488nm光源，450nm、580nm滤光片。⑿、BrdUrd标记追踪细胞分化
通过细胞分化时涉入溴化尿嘧啶，再使用抗BrdUrd抗体及PI核酸染料可精确识别它们。在流式细胞仪上可清楚地识别出处于G1、S、G2、M期的细胞，在肿瘤研究中有着重要作用。流式细胞仪要求： 488nm光源，525nm、575nm滤光片。⒀、淋巴细胞亚群分析
外周血CD3、CD4、CD8、CD19、NK等各类淋巴细胞亚群定量分析。
流式细胞仪要求： 488nm光源，525nm、575nm滤光片，液量绝对计数系统。⒁、白血病免疫分型
CD45设门三色白血病免疫分型。
流式细胞仪要求： 488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片。最少三色荧光，参数越多检测越为灵敏。⒂、血小板分析
血小板活化实验、血小板功能分析。血小板识别抗体及相应活化指标。
流式细胞仪要求： 488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片，液量绝对计数系统。⒃、白血病、淋巴瘤微小残留病灶检测
根据初诊免疫分型结果，多参数联合设门检测是否有残留白血病细胞，监测白血病的复发。T系白血病微小残留病灶检测
流式细胞仪要求： 488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片，液量绝对计数系统。B系白血病微小残留病灶检测，液量绝对计数系统
流式细胞仪要求： 488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片。最少三色荧光，参数越多检测越为灵敏。
髓系白血病微小残留病灶检测，液量绝对计数系统
流式细胞仪要求： 488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片。最少三色荧光，参数越多检测越为灵敏。
⒄、细胞凋亡分析
DNA凋亡峰检测、ANNEXIN-V/PI双染法凋亡检测。流式细胞仪要求： 488nm光源，525nm、575nm滤光片。⒅、肿瘤耐药分析
P-gp、LRP、MRP、BCRP各类耐药蛋白表达及功能检测。流式细胞仪要求： 488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片。⒆、强直性脊柱炎诊断
检测淋巴细胞B27表达强度及百分比，诊断强直性脊柱炎。流式细胞仪要求： 488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片。⒇、PNH诊断
外周血或骨髓检测淋巴细胞、粒细胞、红细胞或单核细胞CD55、CD59表达强度或百分比，确诊夜间阵发性血红蛋白尿。
流式细胞技术 篇3
【关键词】CD4T淋巴细胞；FACSCount；流式细胞仪；HIV
【中图分类号】R19 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）03-01576-01
流式细胞术自70年代中期就成为研究细胞生物学的重要技术，至今己被广泛应用于肿瘤学、免疫学、血液学、药物学等领域[1]。FACSCount系统是美国BD公司专门为辅助性T淋巴细胞（CD4细胞）监测而设计的一台经济普及型流式细胞仪，用来计数未裂解全血中的CD4，CD8和CD3T淋巴细胞绝对数值，与传统的流式细胞仪相比，具有完善的CD4、CD8、CD3绝对计数系统；最简化的样本处理过程，全血标本，不需要额外的裂解和洗涤步骤；完善的软件功能，实现样本采集、结果分析和打印的全程自动化；严格完整的质控和对照系统，具有SFDA认证等特点，在CD4+T 细胞监测领域已得到广泛应用和开展。但应用FACSCount流式细胞仪有一个最大的问题，一些标本在FACSCount系统检测不出结果，最终显示为XXXX，这是我们在实际工作中经常遇到和头疼的地方。
1 FACSCount流式细胞仪常见故障原因分析
1.1 环境因素
FACSCount流式细胞仪对环境要求非常高，最适宜环境为温度20-25℃，湿度68-77%RH。在南方，湿度过大会导致仪器软盘磁性丧失，仪器不能进入系统正常运转，实验室内应配置冷暖空调和除湿机。在北方，湿度不够会使过滤泵干燥或上样针结晶，实验室内应配置冷暖空调和加湿器。仪器安装应接单独可靠地线，接地电阻小于1欧姆，电阻过大会导致流式细胞仪的激光器损坏，同时要可持续电源、稳压器，防止突然断电导致数据丢失、仪器损坏。
1.2 样本因素
1.2.1 标本数值超出系统检测可检测范围
1.2.2 严重溶血、凝血或坏死，因为死细胞增强标本对荧光染料的非特异性染色，这使背景荧光增多，干扰真正的荧光信号；
1.2.3 样品内存在干扰因素，黄疸指数过高、吸毒人员的血样、抗凝剂运用不对等；
1.3 操作因素
1.3.1 进样时，样品液面没有因为上样而变少，屏幕显示数值缓慢降为0，最终出现XXXX的结果。可能是进样针堵塞，仪器扑捉不到相应的淋巴细胞，获取细胞率低，此时应进行上样针的清洁并运行清洁程序，一般可以解决。
1.3.2 进样时，样品液面因上样而变少，屏幕获取数值会迅速减少为0而出现XXXX的打印结果。可能是鞘液过滤器里有空气，使得仪器获取率低而致。解决办法是松开滤器处的塑料夹，使空气通过排除管，排尽所有气体后，关闭塑料夹。
1.3.3进样时，液面因上样而变少，屏幕获取数值缓慢减少，但不会降到很低，检测很长一段时间后才会降为0出现XXXX的打印结果。原因可能是流动池内有空气，进入清洗程序界面，按[DRAN]进行灌冲冲洗，排掉流动池内空气。
2 质控运行过程中出现的故障及解决办法
质控运行的目的是校准机器，检查试剂的活性和线性，每日开机或启用一个新批号的试剂前都应运行质控。质控运行结果是不可选择的，所有质控结果都会被打印出来并储存在程序软盘中，最后一次质控运行的数据最终显示在测试结果中，下次运行质控时，数据会自动更新。质控结果会出现在屏幕上，以“通过（PASSED）”和“失败（FAILED）”显示，并且自动打印。打印结果包括很多统计数据，但最重要的是运行结果如何。质控通过不成功，病人的样品报告会出现“上次质控：失败（FAILED）”的标记。如果不重新进行质控检测并成功通过，样品报告上就会一直出现这条信息，这时应该检查打印出的错误编码，与FACSCount 中文操作手册99页中列出的错误对照并找出可能原因，直至质控运行成功通过。没有成功的质控运行不能确保病人结果的可靠，不能发出病人的检测报告。
3 样本运行过程中出现的故障及解决办法
样品测试中出现的一些错误常使测试过程出现异常可能会影响样品测试结果，屏显以[confirm]显示，点击[confirm]键则会出现[continue]显示，按此键出现xxxx的打印结果，此时可以根据打印出的错误编码或屏幕上显示出错误信息与FACSCount 中文操作手册7.2、7.3中错误编码及信息列表对比查看，每一个错误都给出了可能引起的原因和解决方法。如果应用这些推荐方法后错误仍然存在，请与当地BD公司服务商或代理商联系。有时标本测试出现错误，但输出结果中仍然打印出测试结果数值，表明这一错误不会影响测试结果。只有出现错误影响测试结果，测试数值才会不显示。
艾滋病最主要的免疫学特征是CD4+T淋巴细胞数量显著减少，同时 CD4+/CD8+ 比例倒置，准确可靠的CD4+T 细胞检测是评价HIV感染感染者或病人免疫状况，预测判断疾病进程、评价抗病毒治疗效果和评测预后的重要指标， 通过上文介绍的FACSCount流式细胞仪的一些应用细节和使用技巧，能有效地提高CD4计数检测水平和能力，为艾滋病预防、诊断和治疗提供的客观准确的检测结果。
参考文献：
流式细胞技术 篇4
巨噬细胞(Macrophage)能吞噬感染异物并诱导T细胞活化,启动免疫应答[1],在机体损伤修复、抵抗病原入侵[2]等方面起重要作用,是机体先天免疫的重要部分[3]。巨噬细胞属于无颗粒白细胞的一种,是由单核细胞(Monocyte)分化而来的。单核细胞来源于骨髓,成熟后释放进入血液并随外周血循环进入组织,分化成为巨噬细胞发挥相应的功能[4]。研究者可以对人外周血进行分离,获取单核细胞后进行体外分化,分化得到的巨噬细胞可用于进行各种功能研究。
目前常用的获取人外周血单核细胞的方法是密度梯度离心法。基于Ficoll-Hypaque的单次密度梯度离心可以将红细胞,粒细胞,血小板以及单个核细胞逐层分开。其中,外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)主要包括淋巴细胞和单核细胞,进一步对PBMC离心清洗并用贴壁方法去除悬浮细胞后,可得到单核细胞[5]。但该方法对于液层吸取操作要求较高,获得的单核细胞中会存在较多淋巴细胞,粒细胞以及血小板的污染。通常的解决方法是用抗体标记结合免疫磁珠对PBMC中的单核细胞进行纯化富集。然而不论基于抗体阴选还是阳选的方法,都不可避免对单核细胞产生一定程度的免疫刺激或者机械损伤;分选操作过程较长,在实验过程中要对细胞进行反复洗涤离心等操作,也会造成目的细胞的遗失,对于少量的临床样品难以操作。另外也可以选择基于Percoll分层液的连续密度梯度离心分离法,可以直接将单核细胞与淋巴细胞、红细胞、粒细胞分层,但是操作繁琐,耗时较长,对试剂的消耗量也比较大。因此,寻找一种简便、快捷而又高效的单核细胞分离方式对于单核-巨噬细胞相关研究的开展至关重要。
单核细胞是体积最大的白细胞,其内容物的颗粒形状与淋巴细胞以及粒细胞等具有显著的差别。本文中尝试对外周血白细胞直接进行流式细胞分选,根据细胞组分的分群特征,直接获得其中的单核细胞,并通过单核细胞表面标志物CD14染色进行验证,该方法对于单核细胞的分选效率能达到85%以上,可以简单快捷的获得纯度较高的单核细胞用于实验。
1 材料与方法
1.1 实验材料和试剂
人外周血白细胞成分血来自军事医学科学院附属医院输血科。红细胞裂解液(10×,#420301)购自Biolegend公司。人CD14抗体(130—091—242)购自Miltenyi Biotec公司。流式细胞分离管购自BD公司。人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子GM-SCF购自R&D公司。RPMI1640 培养液(C11875),进口胎牛血清,购于 Invitrogen 公司。
1.2 红细胞裂解
人外周血白细胞成分血中仍含有大量红细胞,在流式分选前需要进行红细胞裂解处理。将白细胞成分血与稀释为1×的红细胞裂解液按照1∶10的比例混合,避光室温裂解15 min,300 g 离心10 min,PBS洗涤一次。细胞计数,将细胞用流式缓冲液重悬(1×107细胞用500 μL缓冲液重悬)。
流式缓冲液:高压灭菌的PBS,pH值为7.2,加入0.5%的牛血清白蛋白以及 2 mol EDTA。
1.3 流式抗体标记
取1×106细胞,即50 μL上述细胞悬液,加入1 μL CD14-PE抗体,避光冰上标记10 min,向离心管中加入1 mL流式缓冲液终止染色,迅速离心去除上清后将细胞重新用100 μL 流式缓冲液悬起,通过细胞滤网后进行流式细胞分析。其余经红细胞裂解处理的细胞按照细胞计数结果直接用流式缓冲液重悬,通过细胞滤网后放置于冰上,准备进行流式分选。
1.4 流式细胞仪分选
本室购置的流式细胞仪为BD FACS AriaTMII 。根据外周血各个成分细胞的分群,确定单核细胞在流式细胞仪中的大小以及颗粒度等特征,限定分选条件,获取单核细胞。同时对CD14-PE抗体标记的细胞进行流式分析,确定单核细胞分群中CD14阳性的细胞所占比率。
1.5 单核细胞体外培养分化
上述分选得到的单核细胞经300 g离心后用含有10%进口胎牛血清以及双抗的RPMI—1640培养基重悬,种于细胞培养皿中,加入10 ng/mL GM-CSF 共培养(5~7)d,镜下观察分选得到的单核细胞体外分化的巨噬细胞形态。
2 实验结果
2.1人外周血流流式细胞检测分群以及CD14抗体预染分析
外周血白细胞成分血经过红细胞裂解处理并进行CD14抗体预染,流式细胞仪分析,结果见图1,左图为样品直接流式分群结果,其中左上角为粒细胞群,中间圈定细胞群(P1)为单核细胞,占白细胞总数的8%左右;居中偏下的为淋巴细胞群。右图为CD14抗体阳性细胞(P2),该阳性细胞群占左图中单核细胞分群(P1)的85%~90%左右。结果证明,根据目的细胞群的大小以及颗粒度的差异通过流式细胞分群方式可以分离并获取单核细胞。
2.2流式细胞仪直接分选得到的单核细胞CD14抗体标记分析
将其余的外周血白细胞成分血根据细胞分群直接选择单核细胞群进行分选。将分选得到的单核细胞进行CD14抗体标记后,再次进行流式分析。结果如图2,左图为分选后细胞经流式细胞仪直接分析,R1即分选得到单核细胞;右图显示该群单核细胞分选后CD14抗体标记的结果, CD14阳性的细胞占分选获得所有细胞的比例为85%左右。如在后期实验中进一步优化条件,预期可以获得纯度更高的单核细胞。
2.3流式细胞仪分选得到的单核细胞体外培养分化
上述流式分选得到的单核细胞经过体外分化培养7 d,镜下观察细胞形态与文献报道一致[6]。证明基于流式细胞分选得到的人外周血单核细胞分化正常,可以用于对巨噬细胞进一步的功能研究。
3 讨论
单核巨噬细胞的相关研究是当前免疫学研究的热点,2011年底,免疫学国际顶级期刊《Nature.Reviews Immunology》对近年来单核巨噬细胞的的相关研究进行专刊评述,对巨噬细胞的极化过程[7],巨噬细胞与感染和免疫[8]、巨噬细胞与机体保护和致病[9]以及巨噬细胞与重要疾病[10]的关系等列为免疫学的前沿领域的热点问题进行了全面的总结和述评。
传统方法对于单核细胞的分离过程需要反复离心清洗,会造成大量细胞在操作过程中的遗失,而且操作时需要对抗凝血作适当稀释,在血量较多时要分成数管进行离心,对于分离试剂的需求较大。如需获取纯度较高的单核细胞进行实验操作,则需要进一步利用抗体以及磁珠等技术方法加以纯化,增加了实验成本,而且获得的单核细胞容易被激活而给实验结果带来影响。
基于流式细胞仪的功能,根据细胞的大小以及颗粒度等特征,对白细胞直接进行分选获取人外周血中的单核细胞的方法,避免了多次重复离心,节省了梯度离心的试剂。经重复验证,本方法能够分选得到纯度在80%~90%之间的单核细胞用于实验。该方法可以用于在少量临床血液样本中获取高纯度的单核细胞,为深入研究单核-巨噬细胞与疾病之间关系提供了良好的技术平台。
参考文献
[1] Gordon S,Taylor P R.Monocyte and macrophage heterogeneity.NatRev Immunol,2005;5:953—964
[2] Mantovani A,Sozzani S,Locati M,et al..Macrophage polarization:tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mono-nuclear phagocytes.Trends Immunol,2002;23:549—555
[3] Gordon S.Alternative activation of macrophages.Nat Rev Immunol,2003;3:23—35
[4] Van Furth R,Cohn Z A.The origin and kinetics of mononuclearphagocytes.J Exp Med,1968;128:415—435
[5] Berthold F.Isolation of human monocytes by ficoll density gradientcentrifugation.Annals of Hematology,2004;43:367—371
[6] Li T,Morgan M J,Choksi S,et al.MicroRNAs modulate the nonca-nonical transcription factor NF-kappaB pathway by regulating expres-sion of the kinase IKKalpha during macrophage differentiation.NatImmunol,2010;11(9):799—805
[7] Lawrence T,Natoli G.Transcriptional regulation of macrophage po-larization:enabling diversity with identity.Nature Reviews Immunol-ogy,2011;11:750—761
[8] Shi C,Pamer E G.Monocyte recruitment during infection and inflam-mation.Nature Reviews Immunology,2011;11:762—774
[9] Murray P J,Wynn T A.Protective and pathogenic functions of macro-phage subsets.Nature Reviews Immunology2,011;11:723—737
流式细胞技术 篇5
敏
政
刘有余
齐学义（甘肃工业大学流体机械与流体动力工程系）
摘要
不适当地采用水润滑橡胶轴承、装机容量单机匹配不合理以及转轮型号与电站水力参数不相适应是造成多泥沙河流上小型轴流定桨式电站不能充分利用水能的3个主要因素。我们对几座该类电站的技术改造实例表明，蜗壳式电站中的水润滑橡胶轴承可以容易地改造为稀油润滑轴承；容量匹配不合理的电站可以把1台机组的转轮更换为适宜于小流量发电的低比速转轮；转轮型号不妥的电站应重新设计与水力参数相符的转轮。通过这些合理、简便、经济的手段，可大幅提高电站的发电量和经济效益。
关键词：轴流定桨式水轮机；导轴承；蜗壳；转轮 分类号：TK733
在我省乃至全国的中小型水电站中，轴流定浆式水轮机是应用较广泛的机型,但因水轮机方面的问题不能正常发电的情况较普遍，经济效益差。该种机型单机容量小，不易引起有关部门的重视。近10年来老电站改造工作开展得如火如荼，但小型轴流定浆式机组的改造工作几乎成为一个不为人重视的死角。以经济、简便、合理的方法进行这类机组的改造，具有不可小视的社会和经济效益。本文通过作者对几座小型轴流定桨式电站水轮机的技术改造实例,介绍其因情况而异的实施方案、改造后的效果以及从中总结出的几点看法，供同行参考，不妥之处敬请予以指正。
西北地区小型轴流定桨式水轮机组常见问题
造成这种问题的主要原因，一方面是由于现有转轮型谱，特别是中小型型谱尚不完善，型谱中可供选择的转轮数目少,有些水头段还空缺，即便型谱中已有的转轮，性能也不能与电站水力参数相匹配，导致选型中迫于无奈只好选择性能相对接近实际需求的转轮；另一方面，由于考虑问题出发点的不同，也有选型不妥的情况存在。对于后者，最简单的应对措施是重新选择合适的转轮更换原有转轮，以这种手段解决其基本问题；而对于前者，就需有针对性的进行转轮设计了。1.1 转轮型号与电站水力参数不相适应
至于设计出的转轮性能如何、是否满足要求，能否在完成转轮设计后直接进行真机制造，这就只能凭设计者的经验和水平，或参考流场计算分析过程中给出的性能预估而定[1]。水轮机的模型试验费用较高，对于小型机组不可能进行专门的模型试验，但由于小型机组的转轮制造费用并不高，因而也不存在多大的风险。
1.2 装机容量单机匹配不合理问题
由于小型轴流定桨式水轮机容量较小，在电站设计中很少有正规的设计部门参与，设计随意性较大，易出现选型设计方面的问题。比较常见的现象是所有机组容量都一样大，造成单机容量与不同季节的来流条件不相适应。由于定浆式机组的特点是对流量变化极为敏感，因而这种方式的选型设计就造成了电站在丰水季节能达到满负荷运行，但在枯水季节小流量时却发不了电的问题。为使机组能够有效利用小流量，有些电站的定浆式转轮叶片采取“可调”型式，叶片与轮毂间不予焊接，而是将叶片轴从轮毂内侧用卡环卡住，叶片角度调好后用销子来实现叶片和轮毂间的定位。从设计角度来说，这种结构在枯水季节可以通过调小叶片角度来部分解决小流量下发电的问题，但在实际应用中每调一次角度相当于机组一次大修；更重要的是，由于叶片与轮毂间没有焊接固死，在水力波动的作用下，销子与孔均不可避免地产生磨损而松动，从而也使叶片松动。叶片松动加剧了水机振动，水机振动反过来又加速销子与孔磨损，如此恶性循环直至机组因振动而无法运行。实际上近年生产的轴流定桨式转轮基本上都采取了叶片与轮毂焊接的结构。我们认为，对于已建成的装机容量单机匹配不合理的轴流定桨式水电站，可以装备一个与现有机组过流通道兼容的、适用于枯水期小流量的低比速转轮，来解决枯水季发不了电的问题，而不宜采用“可调”式转轮。
1.3 水润滑橡胶轴承结构与含沙水工作介质不相适应
水润滑橡胶轴承要求清洁有压水作为润滑水源[2]。在水质较好的南方大部分电站，运行状况还算不错；但在西北多泥沙河流上采用这种轴承，虽可利用沉沙池或离心分离等手段获得一定程度上的清洁水，但因建造和维护运行费用太高而无实际价值。用过机含泥沙水略作过滤后引入轴承，不可避免地使橡胶轴承快速磨损，导致转轮与转 轮室互相接触引起碰撞、磨擦，经一段运行时间后转轮间隙变得很大，容积损失大大增加。对轴流定浆式水轮机而言，由于其特性曲线陡窄，决定了其对流量变化极为敏感的特点,当转轮室间隙变得很大后，在容积损失增加到一定程度时，因经过转轮的有效流量大量减少而使转轮运行工况点远离其有效工作区域，出力即急剧下降乃至带不上负荷。这是运行多年后水润滑橡胶轴承机组普遍存在的问题。
采用水润滑橡胶轴承的小型轴流定桨式水轮机按引水室的不同分为明槽式和蜗壳式两种类型。蜗壳式水电站水轮机导轴承与过机水流是隔离的，具备采用稀油润滑导轴承的条件，但因稀油润滑导轴承设计制做较水润滑橡胶轴承复杂、成本高,同时还需妥善解决主轴密封问题，所以迄今转轮直径在1.2m 以下的小型机组，用户在厂家定货时依然采用橡胶轴承结构。明槽式水电站水工建筑物简单，其水轮机水导轴承完全浸泡在工作水流中,由于其工程造价低廉，有很多电站采用了这种型式以减少投资，但水轮机导轴承的润滑问题尚需妥善解决，特别是对多泥沙河流上的电站。
我们认为以油润滑水导轴承取代水润滑橡胶轴承是解决问题的根本途径，并在蜗壳式电站上进行了成功的尝试。但在明槽式水电站，如果要改用稀油润滑水导轴承，先要使水轮机导轴承与过机水流隔绝，必须对水工建筑做一些相应的改造，相对来说麻烦一些、费用较高，是否进行轴承改造需依据经济和社会效益分析而定。水轮机改造实例
2.1 甘肃省武威市西营河水管处电站
西营水管处电站水头H=6m,机组转速nr=428.6r/min,发电机额定功率为160kW,选用的水轮机型号ZD560-LM-100（0°）。该机型在本电站的水力条件下，导叶全开时其最大流量仅为3.2m3/s，机组出力只有105kW,存在大量弃水和发电机容量不能充分利用的弊端。按该电站的水力参数计算，其机组的最优单位转速应为175r/min，而 ZD560-100（0°）转轮的最优单位转速才140 r/min，但型谱[3]中的ZD760-100（5°）转轮的最优单位转速为165 r/min，相对于ZD560-100（0°）更接近于机组应具有的最优单位转速,且最大过流能力可达4.3 m3/s,比ZD560-100（0°）要大得多。显然，ZD760-100（5°）转轮更 合适。若水轮机整体更换为ZD760-LM-100（+5°），机组出力最大可达190kW。2002年4月份我们制造了ZD760-LM-100（+5°）转轮用以取代ZD560-LM-100（0°）转轮，而过流通道未予改动，虽然其导叶高度较ZD760-LM-100（+5°）型水轮机短了50㎜，存在转轮与导水机构不匹配、效率略低的问题，却依然在4m3/s流量下达到了160kW的额定出力，充分利用了发电机容量和电站的水能潜力。此次改造仅通过更换1个转轮便使机组出力增加了52.4%，取得了显著的效益。如果对过流通道再做相应的改造，其效果会更佳是不言而喻的。
2.2 武威市南营梯级电站
南营电站始建于1979年，8个梯级小站，每站两台ZD760－LM－100（+5°），每梯级站的水头均为5m，单机额定出力160kW，机组转速428.6r/min。建站之初9m3/s流量就可使双机满负荷运行，4m3/s流量就可使单机满负荷运行。由于水润滑橡胶轴承不适应多泥沙水流，几年运行后转轮和转轮室在碰撞、磨擦和磨蚀作用下间隙达20mm,造成很大的容积损失，从而使通过转轮的流量偏离有效运行区较远，以致于机组带不上负荷。近几年来要使双机满负荷运行，必须有10.5～11m3/s流量，4m3/s 的流量只能使单机带30 kW负荷。2000年4月在南营电站的支持下完成了该梯级站的改造工作。由于铸铁制的原装转轮和转轮室无法补焊修复，重新制造了铸焊结构的铸钢转轮和转轮室;原有水导轴承座与顶盖的配合方式不佳，在几年磨蚀作用下已无法准确定位和固定，对此也进行了加工处理。改造后该梯级站的带负荷能力恢复到了建站之初的水平，与未改造相比，平均每一梯级站增加发电量20万kWH，增幅达47％，取得了很好的效益。另外，该梯级电站运行期间几乎有一半时间，引水流量在3m3/s或者7m3/s。在3m3/s引水流量时，从停机的另一台机组关闭的导叶和水导轴承等处缝隙间漏损了部分流量，实际运行机组通过的流量约只有2m3/s左右，这样，偏离机组有效运行区域太远，致使效率太低而发不了电，只能维持空载运行；在7m3/s左右，当一台机满负荷运行时，通过另一台机的流量也就约在2.5m3/s左右了，同样也带不上负荷。如果能设计制造出最优单位转速为190r/min最优单位流量为1.12 m3/s左右、现型谱上没有的转轮，则可能会大大增加南营电站发电量，提高其经济效益。我们根据多年积累的经验，自行设计、制造了该转轮，于2002年4月20日安装于5级站。目前，电站水库放水量仅为3m3/s，此次更换转轮的机组可带负荷70kW，而其上、下游其他没有改造的7个电站中的机组却无法发电。可见，新转轮的运行效果是令人满意的。
2.3 青海省同仁县多哇电站
多哇电站建于1999年10月，水头13.5m,机组转速750r/min，装机350kW×2，水轮机型号ZD560-LH-80（Ф=+5°）。该电站建于多泥沙的隆务河上，水轮机水润滑橡胶导轴承需要的清洁润滑水无法解决。该电站在机组采购阶段就向若干厂家提出水导轴承采用稀油润滑型式的要求，但对1.2m以下水轮机制造厂家不采用稀油润滑轴承结构[4]，只好被迫接受现行产品。在安装阶段，该电站就委托我们将其水导轴承改造为稀油润滑轴承。
在狭小的顶盖空间内，我们采用自行研制的主轴密封结构[5]，解决了主轴密封问题;在此基础上，根据顶盖上现有的配合面，设计了大小高低适宜的稀油润滑分块瓦水导轴承，主轴上加装了挡油筒、轴领等；在轴领与水轮机轴焊接时，采取了切实可行的焊接工艺，尽可能的避免了水轮机轴的焊接变形，使其径向摆度没有超过0.05mm。该轴承投运至今已近3年，温度从未超过450 C，性能稳定可靠，使用方便，保证了机组高效、长寿、稳定可靠的运行。
2.4 青海省河南县优干宁电站
优干宁电站水头12m,装机250kW×2，机组转速 n=600r/min。水轮机型号为ZD560-LH-80（+5°）。该站转轮采用“可调”式结构，而电站在发电季节流量并不存在大的波动，不需要调整叶片角度，实际上也从未调过。经过几年运行后转轮室间隙太大，使机组出力降至200kW。由于转轮叶片定位销孔磨大，使叶片松动导致机组水力振动太大无法继续运行。我们根据电站并不需要“可调”转轮的实际，在校正好叶片位置后将其与轮毂焊死，并对转轮叶片进行补焊，车削、打磨处理,恢复至设计水平，机组出力达到了额定的250kW，同时振动消失。结论及建议 3.1 西北地区多泥沙河流上不宜采用水润滑橡胶瓦水导轴承，更不宜采用明槽轴流定桨式机组。从长期效益来考虑近期投资节省得不偿失;制造厂家应根据实际水质和运行条件的需要在小型机组上亦应采用油润滑水导轴承结构，以满足多泥沙水质的西北地区电站的要求；
3.2 具有蜗壳式引水室的机组，其水导橡胶轴承可以很方便地改造成性能良好的油润滑轴承；
3.3 在轴流定桨式水电站中，容积损失对发电能力的影响非常显著，及时维修转轮，恢复转轮室设计间隙值，可以大大提高水能利用率、增加发电量，将获得良好的效益回报。
3.4 对于已建成的装机容量单机匹配不合理的轴流定桨式水电站，可以装备1个与现有机组过流通道兼容的、适用于枯水期小流量的低比速转轮，来解决枯水季节发不了电的问题，而不宜采用“可调”式转轮。
参考文献： 1.2.3.4.齐学义 吴萍.水力机械轴面流场计算的研究[J].动力工程,1999,19(2): 61~64 天津电气传动设计研究所编.水轮机结构图册[M].北京:科学出版社,1978.79~83 哈尔滨大电机研究所编.水轮机设计手册[M].北京:机械工业出版社,1976.30~31 张维 张淑英等译.机械工程手册(第一卷)[M].北京:清华大学出版社,1991.106 ~109 5.敏政 唐建波.HL160-WJ-84水轮机的增容改造[J].甘肃工业大学学报,1996,22(1):58~62
作者简介： 敏政，（1965——）男，青海同仁人，工学硕士，甘肃工业大学能源与动力机械工程系 副研究员，硕士研究生导师，全国水轮机标准化技术委员会 委员，主要从事中小型水电站的改造技术研究工作。刘有余,(1976——)男,安徽桐城人,2000年毕业于安徽机电学院。现为甘肃工业大学流体动力与控制工程学院硕士研究生，研究方向为中小 型水电站增容改造技术。齐学义，（1946——）男，辽宁台安人，工学硕士，教授，中国动力工程学会 理事、中国机械工业教育协会流体机械学科 副主任委员，甘肃工业大学 博导。主要研究方向流体机械内部流场及性能研究。
The Reformation Technique Of Small Propeller Turbine
MIN Zheng , LIU You-yu,QI Xue-yi(Dept.of Energy and Power Engineering, Gansu Univ.of Tech., Lanzhou,730050)Abstract
The small propeller turbines installed on rivers abounding silt can’t work very well.One of the reasons is that the rubber guide bearing
lubricated by water is used unsuitable.Capacity distribution between units is unreasonable and the runner is unfit to the hydraulic conditions, these are another two main reasons, too.The rubber guide bearing lubricated by water can be easily reformed as guide bearing lubricated by oil at turbines with spiral case.In order to solve the problem that the unit can’t generate at small discharge, another runner with lower specific speed can be used.Unsuitable runner can be replaced by another special designed one.These are proved by practices at several small hydraulic power stations.Key words: propeller;turbine;guide bearing;spiral case;runner
流式细胞技术 篇6
1 资料与方法
1.1 资料与试剂
收集2010年1月～2011年12月本院流式细胞室进行血细胞簇分化抗原CD系列检测的初发急性白血病患者208例。男123例,女85例;年龄1.1～80.0岁,平均36.2岁。所有患者抽骨髓及外周血涂片经瑞氏染色后分类计数,按FAB分型标准[1]进行细胞形态学分型。208例患者中,急性淋巴细胞白血病(ALL)71例,男44例,女27例,年龄1.1～66岁,平均27.9岁。急性髓细胞白血病(AML)123例,男68例,女55例,年龄6～80岁,平均41.5岁;混合细胞白血病(MAL)14例,男11例,女3例,年龄6～66岁,平均33.1岁。所有荧光标记单克隆抗体(McAb)及相关其他试剂均为BD公司产品;所用荧光包括FITC(异硫氰酸荧光素)、PE(藻红蛋白荧光素)和PerCP(叶绿素蛋白);所选用胞膜单克隆抗体为CD13、CD33、CD14、CD15、CD117、CD11b、CD3、CD5、CD7、CD4、CD8、CD1a、CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、HLA-DR、CD45;胞浆抗体为CD79a、c CD3、MPO。
1.2 仪器与设备
所用仪器为美国BD公司生产的BD FACSCalibur单激光三色流式细胞仪;美国贝克曼公司的Beckman AllegraTM21R Centrifuge高速低温离心机。
1.3 试验方法
荧光标记染色方法采用直接免疫荧光标记法,所有病例于治疗前抽取抗凝骨髓或外周血(幼稚细胞比例>30%)3～5 m L送流式细胞室。所有标本染色前需计数细胞数,骨髓标本经磷酸盐缓冲液(PBS)1︰10稀释后计数,调整有核细胞数密度为1×106个/m L,室温下6 h内进行染色标记。所用主要试剂CD34、CD14、CD13、CD45、CD1a、HLA-DR终浓度为0.0250 mg/m L,CD10、CD3、CD7、CD19、MPO、CD8终浓度为0.012 5 mg/m L,CD20、CD11b终浓度为0.0500 mg/m L,CD15、c CD3终浓度为0.1000 mg/m L,CD117终浓度为0.0100 mg/m L,CD33终浓度为0.0120 mg/m L,CD79a终浓度为0.0001 mg/m L,CD4终浓度为0.0030 mg/m L,CD5终浓度为0.0050 mg/m L。1.3.1胞膜抗原染色过程标记流式专用试管,每管加入FITC、PE和PerCP标记的抗体,同时设定同型对照(IgG2a与IgG1),各管加入抗凝骨髓,避光孵育15 min,溶血素2 m L裂解红细胞10 min,离心,弃上清,PBS洗涤,每管加300μL PBS缓冲液上机检测。胞浆抗原染色过程:标记了膜抗原后的标本经固定加破膜剂作用10 min,PBS洗涤,然后加胞浆抗体,避光孵育15 min,PBS洗涤,每管加300μL PBS缓冲液上机检测。
1.3.2流式细胞仪检测与分析所有标本上机检测前以BD公司三色标准荧光微球校准仪器,检测仪器流路和光路,设置和调节仪器的各种参数于最佳状态,以Cellquest软件设置获取条件,依次上样获取数据,每管获取细胞数2万个,以CD45/SSC双参数二维散点图设门方法进行免疫表型分析,计算幼稚细胞群中白血病细胞的表面标记。结果判定时根据同型对照的设置来描述抗原表达的强弱,以强阳性、阳性、弱阳性、阴性为分析判断标准。
1.4 诊断标准
所有病例均根据临床表现、骨髓细胞形态学、细胞化学染色及免疫分型等指标而确诊。细胞形态学诊断根据FAB分型标准,MAL免疫表型的诊断参照欧洲白血病免疫分型协作组(EGIL)(1998年)积分标准[2]进行判断。对于FAB分型诊断为ALL或AML而免疫分型为ALL又同时存在髓系抗原表达或AML又同时存在淋系抗原表达而积分不符合MAL诊断标准的视为My+ALL(髓系抗原阳性的急性淋巴细胞白血病)或Ly+AML(淋系抗原阳性的急性髓细胞白血病)。
2 结果
2.1 FAB分型结果
71例ALL,FAB分型诊断15例L1,51例L2,4例L3,1例M1(结合临床、免疫分型结果及复查FAB,临床最终诊断为My+B-ALL)。123例AML,FAB分型诊断为23例M1,36例M2,24例M3,10例M4,27例M5,1例M6,1例分型待定,1例L1(结合临床、免疫分型结果等,临床最终诊断为M0)。14例混合细胞白血病,FAB分型诊断结果:1例L1,6例L2,2例M1,1例M2,1例M5,3例混合细胞白血病(见表1)。
2.2 免疫表型分型结果
71例FAB分型诊断为ALL,其免疫表型纯淋系抗原表达31例(31/71,43.66%),My+ALL为40例(40/71,56.34%),所表达的髓系抗原有CD13(32例表达)、CD33(27例表达)、CD15(3例表达)、CD117(1例表达)。123例FAB分型诊断为AML,其免疫表型纯髓系抗原表达的79例(79/123,64.23%),Ly+AML44例(44/123,35.77%),所表达的淋系抗原为CD7(30例表达)、CD19(15例表达)、CD22(6例表达)、CD3(1例表达)。见表2。
14例混合细胞白血病,1例L1其免疫表型为T/髓混合;6例L2其免疫表型结果:2例B/髓混合,1例B/髓混合伴CD7+,2例T/B混合,1例T/B混合伴髓系表达;2例M1免疫表型结果为B/髓混合;1例M2免疫表型为B/髓混合;1例M5a免疫表型为B/髓混合;3例FAB为混合细胞白血病其免疫表型为1例B/髓混合,2例B/髓混合伴CD7+(见表3)。
2.3 14例混合细胞白血病免疫分型主要抗原表达情况见表4
2.4 14例混合细胞白血病患者治疗情况
14例BAL患者,2例在诊断明确后放弃治疗自动出院,12例在确诊后接受化疗,经化疗完全缓解6例,未愈3例,3例经1～2个疗程化疗后由于病情较重及经济原因最终放弃继续治疗自动出院。
3 讨论
MAL又称杂合性白血病,是一组异质性白血病,其特征是急性白血病患者骨髓中有髓细胞系和淋巴细胞系同时出现,1998年EGIL新标准将髓系和B淋巴系或T淋巴系积分均>2分的白血病归为MAL,根据其细胞表面标记表达情况可分为3种类型:双表型、双克隆型和双系列型,其发病率为4%～8%[3]。根据EGIL积分系统,笔者分析了流式细胞室2010～2011年208例初诊急性白血病患者血细胞簇分化抗原CD系列检测结果,MAL为14例,所占比例6.7%,其中B/髓系共表达者10例(71.4%,10/14),T/B共表达者3例(21.4%,3/14),T/髓共表达者1例(7.1%,1/14),与相关文献报道一致[4],与KILLICK等[5]和MATUTES等[6]报道的B系与髓系共表达者多于T系与髓系共表达者、B/T与髓系共同表达者最少相符。由于白血病细胞分化抗原表达的异质性,白血病细胞跨系列表达逐渐被证实,笔者在临床检测中发现,随着技术的提高及分型研究的逐步深入,髓系伴淋系抗原表达及淋系伴髓系抗原表达的病例较为多见,71例FAB分型诊断为ALL,纯淋系抗原表达31例,而淋系伴髓系抗原表达(My+ALL)者40例,所占比例56.34%(40/71),表达的髓系抗原有CD13、CD33、CD15,123例FAB分型诊断为AML,纯髓系抗原表达79例,髓系伴淋系抗原表达(Ly+AML)者44例,所占比例35.77%(44/123),表达的淋系抗原有CD7、CD19、CD22、CD3。在临床检测中,对于MAL的诊断应非常谨慎,不要轻易下结论,同时免疫学分型判断MAL要与My+ALL和Ly+AML相鉴别,笔者的经验是当出现两个系列膜抗原表达时,胞浆抗原的检测尤为重要。CD79a、c CD3及MPO被认为是较特异的抗原标志[7],笔者的研究中所有病例均进行CD79a、c CD3及MPO的检测,14例MAL,CD79a、c CD3及MPO表达比例为100%、100%和81.8%。因此,当白血病细胞有髓系和淋系抗原表达而胞浆抗原阴性时,此时要依据EGIL积分系统进行判断,当积分不符合MAL诊断标准时,应依主系定型为Ly+-AML或My+-ALL。
CD34是造血干/祖细胞的相关抗原,随细胞成熟其抗原的表达逐渐减弱直至消失,是一个阶段特异而非系列特异的抗原[8]。本组14例MAL中11例表达CD34(78.6%),2例白血病细胞部分弱表达,1例不表达,与文献报道相符[9],提示MAL患者白血病细胞来源于较早期的造血干细胞,可能为保留早期分化相关抗原的多能干细胞受累引起。CD117抗原主要表达于髓细胞,大多数AML中的原始细胞均有CD117的表达,与CD13、CD33相比较,CD117在AML中的表达率不如前者高[10],但更具有髓系特异性。本组71例ALL,CD117阳性表达率仅为1.4%(1/71),而123例AML,其阳性表达率为95.9%(118/123),11例淋系和髓系混合细胞白血病中,CD117的表达率为81.8%(9/11),提示CD117是较好的一个系列标志,在白血病免疫分型中可作为排除ALL及辅助诊断AML的标志,也是白血病免疫学分型实验室必做的一个抗体。EGIL(1998)积分系统将CD117的积分分值提高到1分也说明了它的系列特异性较高。CD7抗原是T细胞发育过程中的一个特征性标志,在白血病免疫分型初期被当作T系早期的一个良好标志并用于T淋巴细胞白血病的诊断及其亚型的区分。随着研究的深入发现,CD7抗原并非T淋巴细胞的特异性标志抗原,具有多项分化潜能的造血干细胞阶段也可表达此抗原[11],是较不分化的AML的一个常见标志物,它可能与某一髓系祖细胞相关[12]。本组123例FAB分型诊断为AML,Ly+AML为44例(44/123,35.77%),表达一个或多个淋系抗原,以表达CD7抗原为最多,表达率24.39%(30/123),14例MAL中3例为B/髓混合伴CD7表达,该3例B/髓混合者虽有CD7的表达,但不能诊断为B/髓与T系共同表达者,而应解释为患者骨髓中髓系白血病细胞来源于较早期的具有多项分化潜能的造血干细胞阶段,提示该类患者白血病细胞恶性度高,是造血发育早期细胞恶性转化所致。由于例数较少,B/髓混合伴CD7表达患者的特征还有待于积累更多的病例加以研究说明。
目前MAL的治疗尚无统一方案,其疗效报道不一。笔者研究的14例MAL,经化疗完全缓解6例,其中5例免疫分型结果为MAL而FAB结果为L2(2例)、M1、M2、M5,该5例患者临床根据免疫分型结果进行兼顾淋系和髓系的诱导化疗方案后CR,由此可见免疫分型在MAL的诊断和治疗中的价值。
对于MAL、My+-ALL、Ly+-AML等,单纯依靠细胞形态学均不能对其进行准确诊断,流式细胞术免疫表型分析的开展弥补了FAB分型的不足,减少了误诊率,可对白血病细胞进行准确的分型诊断,为临床诊断、选择合理的治疗方案等提供了科学的依据。
参考文献
[1]张之南,沈悌.血液病诊断及疗效标准[M].第3版.北京:科学出版社,2007:171-211.[1]ZHANG ZN,SHEN T.Diagnosis of Hematonosis and StandardsDiscipline on Clinical Effect[M].3th ed.Beijing:Science Press,2007:171-211.Chinese
[2]叶任高,陆再英.内科学[M].第6版.北京:人民卫生出版社,2004:604-605.[2]YE RG,LU ZY.Internal Medicine[M].6th ed.Beijing:People'sMedical Publishing House,2004:604-605.Chinese
[3]LEE PS,LIN CN,LIU C,et al.Acute leukemia with myeloidB-and natural killer cell differentiation[J].Arch Pathol Lab Med,2003,127(2):E93-95.
[4]吴国林,朱微波,蔡晓燕,等.急性双表型白血病的临床和实验室特征及预后分析[J].临床输血与检验,2008,10(1):19-23.[4]WU GL,ZHU WB,CAI XY,et al.Analysis of the clinical andlaboratory features and the prognosis of biphenotypic acuteleukemia[J].Journal of Clinical Transfusion and LaboratoryMedicine,2008,10(1):19-23.Chinese
[5]KILLICK S,MATUTES E,POWLES R,et al.Outcome ofbiphenotypic acute leukemia[J].Haematologica,1999,84:699-706.
[6]MATUTES E,MORILLA R,FARAHAT N,et al.Definition ofacute biphenotypicleukemia[J].Haematologica,1997,82:64-66.
[7]孔令环,韩梅,鲍彦娜,等.流式细胞术对急性白血病免疫分型的临床意义[J].中国实验诊断学,2010,14(10):1570-1573.[7]KONG LH,HAN M,BAO YN,et al.The clinical significance ofcytometer in immunophenotyping for acute leukemia[J].ChineseJournal of Laboratory Diagnosis,2010,14(10):1570-1573.Chi-nese
[8]邱阳,刘越坚,郭慧淑,等.流式细胞术在159例急性白血病免疫分型中的应用[J].中国实验诊断学,2009,13(1):103-105.[8]QIU Y,LIU YJ,GUO HS,et al.The application of immunophe-notype of 159 patients with acute leukemia by flow cytometry[J].Chinese Journal of Laboratory Diagnosis,2009,13(1):103-105.Chinese
[9]张静,秘营昌,王迎,等.成人急性双表型白血病的临床研究[J].中华血液学杂志,2009,30(1):18-21.[9]ZHANG J,MI YC,WANG Y,et al.Study on the clinical char-acteristics of adult biphenotypic acute leukaemia[J].ChineseJournal of Hematology,2009,30(1):18-21.Chinese
[10]张纯,李睿,赵菲,等.急性白血病细胞形态学与免疫学分型的关系[J].中国癌症杂志,2007,17(8):615-618.[10]ZHANG C,LI R,ZHAO F,et al.The correlation of cellmor-phological classification and immunological classification in acuteleukemia[J].China Oncology,2007,17(8):615-618.Chinese
[11]吴红红,曹晖,王业哲,等.CD7阳性急性髓系白血病骨髓干/祖细胞5个基因表达的研究[J].中国实验血液学杂志,2009,17(2):298-303.[11]WU HH,CAO H,WANG YZ,et al.Expression of 5 genes inCD7 positive acute myeloid leukemia stem/progentior cells frombone marrow[J].Journal of Experimental Hematology,2009,17(2):298-303.Chinese
流式细胞分析仪激光电源维修 篇7
在日常维修医疗仪器电源时, 美国贝克曼公司的cytomics TM FC 500全自动流式细胞分析仪、美国BD Biosciences公司FACSCanto II流式细胞分析仪器里面的激光电源大多采用美国JDS Uniphase公司的激光电源驱动器。无论哪种电子设备, 只要采用了开关电源供电, 开关电源的故障率均最高, 约占整机故障率的50%[1]。然而, 我们在实践中探索了一个通过绘制电源的电路图来维修开关电源的方法, 这种方法既提高了仪器的维修成功率, 也使开关电源的维修变得快捷而容易。在制作电路图的同时还发现不同品牌机器的激光电源内部的设计其实大同小异, 因此, 对激光电源的故障维修也具有共性可以参考。以美国贝克曼公司的cytomics TM FC 500全自动流式细胞分析仪中的激光电源为例, 激光电源内部主要含有功率因数控制器、电流控制器、三角波与正弦波发生器及与机器相连的接口电路。在对该激光电源进行维修时发现, 故障经常发生在整机集成块供电电源部分、激光电源功率因数控制器部分及激光恒流控制器部分。下面对这几部分常见的故障分别进行分析。
1 电路分析与维修方法
1.1 波形合成器和集成块供电电源的维修
图1是波形合成器和集成块供电电源的主要部分, 它既是整机激光电源集成块的供电电源, 也是电压波形合成器的功率输出。它是通过接插件与电源主板相连的, 因此可以从电源主板上卸下进行检查和维修。图1是一个他激型的半桥驱动器, 他激型半桥式开关电源电路中的PWM电路包括PWM发生器、PWM驱动器、PWM控制器等电路[2]。U1A (IR21531) 就是这个他激型半桥式开关电源的PWM控制芯片。Q3和Q4是功率输出VMOS管, 这样的电路共有2个 (另1个图中没有画出) 。这部分电路经常会损坏, 元件损坏后的现象是F1熔断丝熔断, 但主板的主熔断丝一般不断。这时必有Q3或Q4功率场效应管损坏。维修时可将Q3和Q4同时换掉。整机集成块供电电源 (13.8 V) 是通过U2稳压块来提供的。U2 (MC33269) 是一个可调节的串联型稳压模块, 类似于LM317, 输出电压为改变R12或R13的值, 可以改变该稳压电源的数值, PCB板子上标注为12 V。根据R12和R13的实际阻值计算得到是13.8 V, 正常工作时测得的电压也是13.8 V。对此电路工作是否正常进行判别时, 只要在U2的输入端对地外加17 V的直流电压, 检查在外加17 V输入电压时, 输出电压是否为13.8 V。如果13.8 V输出电压正常, 则MC33269模块完好。D9 (SA24A) 是一个瞬态电压抑制保护TVS管, 当该路13.8 V电压故障时, 这个TVS管也常常击穿损坏, 维修可用相应24 V的TVS管替换。另一路波形合成器 (没在电路中画出) 的输入由2块ICL8038和另1块PWM控制器 (IR21531) 及2个功率场效应管组成, 2块ICL8038分别组成正弦波和三角波发生器。检查2块ICL8038有否损坏, 可用示波器检查这2块集成块在外加+12 V电压时是否有正弦波或三角波输出, 这2块集成块一般不常损坏, 所以也没在图1中画出。但与ICL8038相连的另1块IR21531和另2个功率场效应管, 类似于图1的U1A和Q3、Q4也容易损坏, 当这2个功率场效应管损坏时, 故障现象也是局部熔断丝F1熔断。维修时同样可将另一个IR21531芯片和2个功率场效应管一并换掉。此时, 这块波形合成器和集成块供电电源板就基本修复。检查这块电源板的最终好坏可在图1的+385 V处串联1个100 W的钨丝灯泡外加+300 V的直流电压 (注意是在这块电源板和主板分离的情况下) , 正常情况下灯泡灯丝微红, output+200 V处应该测到的电压, 同时在U2的输出端能测到13.8 V的直流电压。
1.2 功率因数控制器部分的维修
电源的功率因数控制器芯片采用ML4800, 是一款平均电流控制型PFC控制器。ML4800由平均电流控制的Boost型PFC前级和1个PWM后级组成, PWM级可以用作电流型或电压型控制的变换器[3]。平均电流PFC控制环路通常包括电压和电流2个环路, 通过电压环调节平均输入电流, 以保持输出电压稳定, 通过电流环控制输入电流, 使之跟踪输入电压[4]。
功率因数控制器部分在激光电源的主板上, 具体电路如图2所示 (见上页) 。
在图2中, U1 (ML4800) 兼功率因数控制器和PWM输出器双重的作用, 12脚是功率因数控制器输出, 最终控制Q9 (47N60) VMOS管, 使输入电压和输入电流接近正弦波。11脚是PWM控制输出, 主要控制激光电源的恒流输出。当U1损坏时, 功率因数调整管Q9一般会损坏 (短路) , 由于385 V直流部分短路, 主板熔断丝会熔断。维修时, 需要更换U1 (ML4800) 、Q9 (47N60) VMOS管。由电路分析可知, Q9烧毁时会累及Q8, 此时要检查Q8 (IRP802) 驱动场效应管的好坏, 该场效应管损坏时可以用其他VMOS管替代, 但Q9最好换上47N60, 因为这是一个VDS耐压达600 V以上的大电流功率场效应管, 普通管子很难替代。有时功率场效应管的前置驱动器U3或U4 (EL7242) 也会损坏, 现象为U3或U4的8脚对地电阻变小。用R×1挡指针式万用表红表笔接地, 黑表笔接U3或U4的8脚, 若阻值小于100Ω, 要考虑U3或U4损坏, 维修时可将相应的U3或U4集成块换掉。
1.3 激光电流控制器功率部分损坏的维修
激光恒流部分是通过控制图2的A2改变U1 (ML4800) 的PWM输出实现的。U2 (IR2117) 是功率驱动器;Q3、Q4是一对互补型的晶体三极管, 作功率场效应管的驱动;Q5 (RIFP460) 是输出VMOS管, Q5的漏-源极回路即为激光电流的输出回路。恒流的负反馈是通过串在回路中的LTS25-NP电流互感器对图2中的U1进行综合控制而实现的。若电源主板熔断丝熔断、Q5烧毁, 但Q9完好, 则功率因数控制器部分没有损坏, 是激光电流输出器件损坏, 这时除了更换Q5 (IRFP460) 功率场效应管以外, 还要检查D2 (HFA15TB60) 、Q3或Q4这对互补晶体管三极管, 如果这对晶体管没损坏, 则U2 (IR2117) 基本是好的, 否则需要同时更换U2。功率场效应管的检测和代换可参考有关书籍[5]。
1.4 接口电路分析
接口电路是位于电源面板背面的另一块接插件 (图中没有画出) , 它的电源来自图1中B1的另一个次级绕组, 经整流、7815和7915 2个三端电压稳压块稳压 (图中没有画出) 给相应的接口元器件供电, 维修时须在7815和7915稳压块的输入端加上±20 V的电压, 检查有否有±15 V的输出, 如果有, 说明7815和7915稳压块是好的;否则, 需要更换稳压块。另外, 图2中A2与接口电路部分是通过光耦相连的, 因此, 接口电路部分不容易损坏。
2 讨论
各种有源的医疗仪器大量采用新型的开关电源, 为了减少开关电源的噪声、提高开关电源的效率, 往往加1个功率因素控制器。开关电源可以做稳压 (恒压) 输出, 也可以做恒流输出, 平常看得比较多的是稳压电路, 而激光电源需要稳流控制。本文对开关电源的功率因数控制器及开关电源恒流控制的维修经验做了一些探讨。维修任何开关电源, 我们的经验是最好把其电路图画出来, 这步骤看起来似乎有些难度, 但熟能生巧。有了电源的电路图, 就可以对各种故障进行准确的分析和判别, 从而能大大提高仪器的维修成功率。
参考文献
[1]刘建清.开关电源维修从入门到精通[M].北京:人民邮电出版社, 2010:55-56.
[2]王水平, 孙柯, 王禾.开关电源原理与应用设计[M].北京:人民邮电出版社, 2012:277-278.
[3]周志敏, 周继海, 纪爱华.开关电源功率因数校正电路设计与应用[M].北京:人民邮电出版社, 2004:179-180.
[4]贲洪奇, 张继红, 刘桂花, 等.开关电源中的有源功率因数校正技术[M].北京:机械工业出版社, 2010:225-226.
流式细胞仪工作原理与临床应用 篇8
流式细胞术(Flow cytometry,FCM)是采用流式细胞仪对处于快速直流中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析和分选的技术。1973年美国BD公司推出全球第一台流式细胞仪,它是集激光技术、电子生物技术、光电测量技术、电子计算机技术以及荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。它通过对流动液体中排列成单列细胞或颗粒进行逐个检测,得到该细胞或颗粒的光散射和荧光指标,分析获得其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理及化学性质,还能对所需要的细胞进行分选等,具有检测速度快、测量指标多、采集数据量大,对所需的细胞或生物颗粒进行分析或分选等特点,其在生物学、临床医学、遗传学、免疫学、药物学等众多研究领域得到广泛应用[1]。
1 流式细胞仪的工作原理
流式细胞仪主要由液流系统、光学系统、电子系统、分析系统和细胞分选系统五个部分组成。将待测细胞染色后制成单细胞悬液,用一定压力将待测样品压入流动室,不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出,鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度,这样,鞘液就能够包绕着样品高速流动,组成一个圆形的流束,待测细胞在鞘液的包绕下单行排列,依次通过检测区域。流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束,垂直照射在样品流上,被荧光染色的细胞在激光束的照射下,产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测,这种信号基本上反映了细胞体积的大小;荧光信号的接收方向与激光束垂直,经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离,形成多个不同波长的荧光信号。这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度,经光电倍增管接收后可转换为电信号,再通过模/数转换器,将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机系统将这些数字信号收集、储存,以一维直方图或二维点阵图及数据表或三维图形显示出来,可以用不同的标记物进行双参数、三参数甚至多参数的分析。[2,3,4]
科研型流式细胞仪还可以根据所规定的参量把指定的细胞亚群从整个群体中分选出来,以便对它们进行进一步的研究分析。其分选原理是把液滴形成的信号加在压电晶体上使之产生机械振动,流动室即随之振动,使液柱断列成一连串均匀的液滴,一部分液滴中包有细胞,而细胞性质是在进入液滴以前已经被测定了的,如果其特征与被选定要进行分选的细胞特征相符,则仪器在这个被选定的细胞刚形成液滴时给整个液柱充以指定的电荷,使被选定的细胞形成液滴时就带有特定的电荷,而未被选定细胞形成的细胞液滴和不包含细胞的空白液滴不被充电。带有电荷的液滴向下落入偏转板的高压静电场时,按照所带电荷符号向左或向右偏转,落入指定的收集器内,完成分类收集的目的。对分选出的细胞可以进行培养或其他处理,做更深的研究。
2 流式细胞仪的临床应用
2.1 在肿瘤学方面的应用
利用FCM可以进行细胞周期分析,DNA倍体分析,定量分析检测细胞增殖标志物、细胞表面标志、癌基因蛋白产物、耐药蛋白、细胞凋亡等,从而获得组织形态学方法难以得到的信息,可为肿瘤的临床诊断、治疗、预防和预后提供帮助[5]。DNA非整倍体的出现可能是发生早期癌变的一个重要指标。淋巴瘤、白血病在病理形态学还不能进行早期诊断之前,FCM可以提供确切的诊断信息。流式细胞术对淋巴瘤的早期诊断比形态学检查更为敏感、准确。DNA非整倍体的交界瘤应按恶性肿瘤对待,形态学表现为良性的肿瘤出现非整倍体提示有恶性转变的可能。FCM主要是利用实体瘤标本或穿刺标本、胃镜、食管镜及支气管镜、肿瘤冲洗液、尿液等少量组织进行DNA含量测定,进行包括癌前病变及早期癌变的检出,从而为临床辅助诊断和进一步治疗如放疗中的药物选择、强度、时间等提供较确切、可靠的信息。
2.2 在血液病诊断中的应用
2.2.1 白血病的诊断和治疗
FCM采用各种抗血细胞表面分化抗原(CD)的单克隆抗体,借助于各种荧光染料(异硫氰基荧光素FITC,藻红蛋白PE等)测定一个细胞的多种参数,以正确地判断出该细胞的属性。各种血细胞系统都具有其独特的抗原,当形态学检查难以区别时,免疫表型参数对各种急性白血病的诊断和鉴别诊断有决定性作用[6]。例如干细胞表达CD34,髓系表达CD13、CD14,B细胞系表达CD10、CD19、CD20等,T细胞系表达CD2、CD3、CD5、CD7,利用FCM可以测定出血细胞表达各种抗原的水平,协助临床确诊。
同其他肿瘤的治疗一样,测定DNA倍体和进行细胞周期分析对指导白血病化疗有一定作用,不同的白血病患者或同一患者在不同病期白血病细胞增殖状况不同,定期了解细胞增殖情况采取相应药物可以提高疗效。
目前,临床除化疗药物治疗外还采用造血干细胞移植技术治疗急性白血病和一些疑难性疾病[7]。FCM通过对人白细胞抗原(HLA)配型的测定,可以为异体干细胞移植病人选择出最合适的供体。造血干细胞移植技术主要包括干细胞的鉴别、活性测定、干细胞动员和采集、分离纯化、保存扩增、肿瘤细胞的净化、干细胞回输以及术后保持移植物抗宿主病的低发生率等一系列过程。FCM测定CD34、HLA-DR、CD33等细胞表面标志物,成为干细胞移植技术重要的监测手段。用FCM检测一系列指标观察病人的恢复状态,可以对预后做出早期的判断。
2.2.2 阵发性睡眠性血红蛋白尿的诊断
根据CD59表达将阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)病人分为三型,研究证明不同亚型对补体的敏感程度不同。特异地分析网织红细胞的CD59的表达,对于PNH的诊断及病情评估有非常重要的意义。用流式细胞仪检测并计数缺乏这类膜蛋白的异常血细胞,是目前诊断PNH最直接、最敏感、特异性最强且可以定量的良好手段,比传统的溶血试验具有更高的特异性和灵敏度[8]。
2.2.3 网织红细胞的测定及临床应用
网织红细胞计数是反映骨髓造血功能的重要指标,FCM通过某些荧光染料与红细胞中RNA结合,定量测定网织红细胞中RNA,得到网织红细胞占成熟红细胞的百分比。有作者报道FCM方法比目测法结果精确度更高[9]。此外,FCM还可以测量出网织红细胞的成熟度,对红细胞增殖能力的判断很有意义,为干细胞移植术后恢复的判断、贫血的治疗监测、肿瘤病人放化疗对骨髓的抑制状况等提供了依据。
细胞计数在临床上可以提供评估骨髓相中的红细胞造血功能的信息,在贫血的鉴别诊断中有很重要的作用。贫血患者骨髓功能正常,而网织红细胞增加,多见于内源性溶血性疾病,如镰状细胞溶血性贫血、地中海贫血、球状细胞溶血性贫血、6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺陷、免疫性溶血、脾功能亢进等。失血时网织红细胞亦升高,因此,网织红细胞也可以作为隐性失血的指标。
2.3 在血栓与出血性疾病中的应用
2.3.1 血小板功能的测定
血小板膜糖蛋白(GP)是参与止血、血栓形成的重要分子基础,这些膜糖蛋白是一类重要的黏附分子。利用针对GP的单克隆抗体对血小板进行免疫荧光标记,并用流式细胞仪分析单个血小板或血小板亚群的GP,是血小板膜糖蛋白检测分析方法的重大发展。其方法简便、快速、标本用量少、灵敏度高、结果准确。与血小板有关的抗原的临床意义有以下两点:(1)诊断遗传性血小板功能缺陷疾病,如GPⅠb/Ⅸ复合物先天缺陷导致巨大血小板综合征;GPⅡb/Ⅲa复合物先天缺陷导致血小板无力症[10]。(2)血栓性疾病和血栓前状态,活化血小板的检测。由于活化血小板是血栓的主要成分之一,也是引起血栓形成的主要原因,所以血小板活化程度增高与疾病发生发展有关。如心绞痛和心肌梗死、冠状动脉血管成形术、脑动脉硬化病人活化血小板百分率和绝对数显著高于正常人[10,11]。
2.3.2 血小板相关抗体的测定
免疫性血小板减少性紫瘢病人血浆中可产生血小板自身抗体,结合在血小板表面,称为血小板相关抗体,其分子可以是Ig G、Ig A或Ig M,用鼠抗人Ig G、Ig A、Ig M荧光抗体标记被测血小板,FCM可以测定血小板相关抗体含量。直接法检测血小板表面的相关抗体,间接法可测定血清中的相关抗体。该方法用于该病的诊断及治疗监测,具有检测速度快、灵敏度高的优点。
2.4 流式细胞术在免疫学中的应用
淋巴细胞分为T淋巴细胞(CD3)、B淋巴细胞(CD19)和NK细胞三大群。T淋巴细胞又分为辅助性T细胞(CD4)、细胞毒性T细胞(CD8)。流式细胞术检测T淋巴细胞和B淋巴细胞百分数可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病。CD4和CD8T淋巴细胞的百分数有助于监测患有免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病或有免疫反应的病人的免疫状态。正常人T淋巴细胞CD4/CD8比值大约为2/1,比值升高表明机体免疫机能亢进,见于自身免疫性疾病,如SLE、类风湿性关节炎、自身免疫性溶血等;比值降低表明机体免疫机能下降,如艾滋病、病毒感染、肿瘤、活动性肝硬化、AA等[12]。当人体感染HIV后,CD4T淋巴细胞的百分比和数量减低,可辅助HIV监控治疗。若比值<0.2,应停用免疫抑制剂,以免发生感染而导致移植失败。CD19与机体免疫球蛋白呈正相关。NK细胞反映机体对病毒感染的细胞和肿瘤细胞的杀伤能力及巨噬细胞的杀菌活性。
2.5 在造血干细胞移植中的应用
造血干细胞移植加强烈化疗是治愈某些难治疾病的有效方法。骨髓移植(BMT)或外周血造血干细胞移植(PBSCT)的成功与否,除与是否合并并发症有关外,移植物中CD34+细胞的数量和质量是重要因素。随着近年来外周血造血干细胞移植病例的日益增多,外周血造血干细胞的流式准确定量越来越成为关键问题。1995年,血液病治疗及移植国际联合会成立了干细胞绝对计数(Enumeration)小组,致力于寻求一种简单、快速、灵敏的流式细胞仪检测方法去定量外周血中造血干细胞的数量。这一方法对于临床实验室中不同的流式细胞仪都有效,而且在不同的移植中心具有可比性。这一方案即为1996年问世的ISHAGE方案,迄今为止,其他各种改进方案均是以此方案为基础的。精确测定CD34对于判断移植后的植活和选择G-CSF动员外周血造血干细胞的采集时间有着重要的指导意义。
2.6 流式细胞术在临床细菌学中的应用
FCM泛用于细菌、病原体、毒素、血清抗体及药敏试验。在免疫荧光方法中的流式微球捕获芯片技术(Cytometric Bead Array,CBA)是流式细胞术的一个新应用,它将近似于细胞大小的微珠作为捕获载体,使其携带已知荧光抗原或抗体,来捕获检测物中的相关抗体或抗原。由于遮蔽效应可以使荧光微球的发散光减弱,应用不同大小的荧光微球,可同时检测同一标本的多种抗原或抗体。这种方法能同时检测单一液相样本中多个目的蛋白(如同时测定多种细胞因子、多种自身抗体),检测需用标本量少,灵敏度高,重复性好,直接荧光标记易于使用,检测线性范围宽,避免酶联反应所致的人工假象,可用于单细胞分子水平的多参数检验,也可用于真菌、寄生虫、病毒或混合感染的检测。
2.7 流式细胞术在器官移植中的作用
FCM在器官移植中也占有重要地位,它被用来判断供者与受者之间配型是否合适。其检测手段是检测受者血清中抗供者的抗HLA的抗体。根据抗体的种型、效价、靶抗原和器官移植的类型不同,抗体介导的排斥反应也有所不同。FCM与传统方法相比更灵敏、操作时间短并可同时检测细胞亚型、分辨出Ig G和Ig M抗体。FCM所分析的靶细胞不只局限于淋巴细胞,为移植的配型提供更有利的支持。移植术后,免疫表型的监测也很重要。移植后CD4/CD8比值低下的病人排斥反应发生较多;受者血清中产生抗供体细胞抗体者预后较差,应及时监测以便进行抗排斥的预防和治疗。
3 结语
总之,流式细胞仪应用极为广泛,本文所介绍的只是其中的一部分,随着科学技术的迅猛发展,流式细胞仪在临床上会有更广阔的应用前景。
参考文献
[1]左连富.流式细胞术与生物医学[M].沈阳:辽宁人民出版社,1996:129-422.
[2]Grogan WM.Guide to flow cytometry methods[M].NewYork:MarcelDekker Inc,1990:1-20.
[3]沈关心,周汝麟.现代免疫学实验技术[M].武汉:湖北科学技术出版社,2002:226-230.
[4]王书奎,周振英.实用流式细胞术彩色图谱[M].上海:第二军医大学出版社,2004:1-56.
[5]李元堂.流式细胞术在血液系统肿瘤诊断、治疗中的应用[J].黑龙江医药科学,2005,28(2):93-95.
[6]肖志坚,郝玉书.免疫表型分析与急性白血病诊断[J].中华血液学杂志,1997,18:53-55.
[7]韩忠朝,冯四洲,韩明哲.造血干细胞移植技术及其应用[J].中华血液学志,1998,19:663-666.
[8]Krauss J S.Laboratory diagnosis of paroxysmalnocturnal hemoglobinuria[J].Ann Clin Lab Sci,2003,33(4):401-406.
[9]刘小林,周彦,孙林.流式细胞仪检测网织红细胞百分比性能评价[J].蚌埠医学院学报,2010,08:828-830.
[10]王志杰.流式细胞术在血小板疾病中的应用[J].血栓与止血学,2004,10(1):39-41.
[11]Linden MD,Frelinger A L 3rd,Barnard MR,et al.Application of flow cytometry to platelet disorders[J].Semin Thromb Hemost,2004,30(5):501-511.
非成像式流式细胞仪的发展与应用 篇9
流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)也称为荧光激活细胞分类术(Fluorescence Activated Cell Sorting,FACS),是利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或者生物颗粒进行多参数、快速定量分析,同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。
流式细胞仪(Flow Cytometer)是集激光技术、光电检测技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术以及计算机技术于一体的新型高科技仪器。它能够高效检测细胞大小、粒度、表面积等细胞结构参数和细胞表面/胞质/核的特异性抗原、细胞内细胞因子、酶活性、Ca2+[1]、细胞活性等细胞功能参数[2],同时还具有细胞分选和计数能力。自上世纪70年代第一台流式细胞仪问世以来,历经40多年的迅猛发展,目前流式细胞仪已经广泛应用于生物学、药理学、免疫学、血液学、肿瘤学以及细胞凋亡检测和临床检验等领域。
1 流式细胞仪的结构
流式细胞仪主要由液流系统、光学系统、电子系统和细胞分选系统4部分组成。
经过特定荧光染色的待测样本细胞悬液,在鞘流的包围约束下,细胞成单列排布,由流动室喷嘴高速喷出,形成细胞液柱。液柱与激光束垂直相交,相交位置即为检测区,在入射激光照射下产生荧光信号和前向散射光信号(FSC,Forward Scatter)与90°侧向散射光信号(SSC,Side Scatter),可被电子系统检测并输入到计算机利用专业软件进行细胞多参数分析与分选。
1.1 液流系统
液流系统主要负责将待测样品从样品室运送到流动室的测量区域,其理想状态是把细胞传送到激光束的中心,并且在一次曝光时间内,只允许一个细胞通过激光束,然后根据需要,液流流入废液桶或者分选收集管。液流系统主要由流动室和液流驱动系统构成。
流动室内充满鞘液,根据层流原理,在鞘液的包围下,细胞排成单列从流动室的喷嘴流出,并且被鞘液包围形成细胞液柱。另外,同轴流动的设计,使得样品流(核流)和鞘流始终保持分层鞘流的状态。
1.2 光学系统
光学系统负责产生并采集荧光、散射光信号,主要由包括激光、光纤、光束形成棱镜、聚焦镜的光学激发系统和包括荧光物镜、光纤、光学滤片、检测器的光学采集系统组成。
目前流式细胞仪广泛使用的是488nm的氩离子激光器和635nm的氦-氖激光器。光学滤光片放置在光电倍增管前面,对去除干扰信号、提高结果的准确性至关重要。
1.3 电子系统
电子系统的功能是将荧光和散射光信号转换成电信号,并进行数字化处理后送入计算机用专用软件进行分析,包括光电转化器、信号放大器、信号处理系统和计算机软件分析系统。
液柱中的细胞经过测量区域被激光照射,产生荧光信号和前向角散射与90°侧向角散射信号。其中荧光信号由光电倍增管检测,2个散射光信号由光电二极管检测。荧光信号与产生荧光的化学物质有关,前向散射光信号与细胞大小有关,90°侧向散射光信号与细胞粒度有关。通过安装多个滤光片和不同波长的激光器就能得到更多的荧光信号和散射光信号,这对于人们认识细胞内化学物质的相互作用具有十分重要的现实意义。
1.4 分选系统
利用流动室喷嘴上的高频压电晶体的振动,将液流变成只包含单个靶细胞的小液滴,系统根据鞘流的流速与晶体振动的频率,精确算出小液滴的间距,然后对其施加相应的电压,当小液滴通过正负极板时就会发生偏转,流入相应的收集管里,不带电的液滴就会流入中间的废液桶里,从而实现对细胞(包括中性粒细胞)的分选[3]。
2 流式细胞仪的最新进展
2.1 光学系统的完善
随着激光技术的发展,激光器的性能更加优异,价格也更加低廉,这使得激光逐渐取代非相干光源,在流式细胞仪中得以广泛应用。目前,除德国的Partec等公司的部分产品仍使用汞灯作为光源激发紫外的荧光物质外,多数的流式细胞仪都配备多个激光器,同时发出不同波长的激光以激发出多种荧光。例如BD公司的FACSAria流式细胞分选仪除配备较为常用的488nm蓝光和640nm红光外,还配备407nm光源。同时,染料激光器的出现,使得光源发出连续可调的光谱成为可能,极大地扩展波长范围,可以满足用户多种特殊的需求。另外,通过配备多个光学滤光片,可同时检测多种荧光信号和包括FSC和SSC在内的信号,丰富人们的视野,更好地实现对细胞的检测。
2.2 灵敏度和分辨率的提高
灵敏度反映仪器能够检测到最弱的荧光和散射光信号,直接决定能否检测出待检测指标。灵敏度主要与待检测物体被激光照射效率和荧光接收效率有关,灵敏度的高低也是衡量流式细胞仪性能的最重要指标之一[4]。通过使用更加贴近最大吸收波长的激发光源和改善光路系统设计能够有效提高流式细胞仪灵敏度,同时,使用较高灵敏度的光电检测元件也可以分析微弱的荧光信号,较大程度上提高流式细胞仪灵敏度。目前流式细胞仪多使用石英微流动室[5]和数值孔径较大的物镜,使得收集到的细胞荧光信号显著增强。另外,通过使用光子计数系统[6],也能够实现对一些微弱荧光信号的检测。光子计数系统具有较高灵敏度,但是检测面积比较小,使用时应该用高质量的透镜组将光子汇聚到它的有效面积上。随着荧光技术的发展,市场上出现更多类型的荧光染料可供选择,荧光的激发光强也有很大的提高,实现灵敏度提高。另外,使用高透射率、高折射率的光纤,也能够更好地与光源、光电检测器和芯片耦合,显著降低光强损失,提高仪器灵敏度。
随着液流系统、光电检测技术和计算机技术的发展,流式细胞仪的分辨率也有显著提高。目前市场上流式细胞仪的分辨率可以达到1:512000,能够得到CV值(变异系数)很小的实验数据,彻底改变以往很难把染色体区分开的局面,这使得分辨率较高的染色体的分析和分选成为可能。
同时,随着灵敏度和分辨率的提高,实验所需的样品容量也进一步减少,如C6流式细胞仪最小的样品大小仅为30μL,这对于难以获得较大样品量的研究实验具有十分重要的意义。
2.3 分析和分选速度的提高
流式细胞仪非常重要的一个特点就是它能够实现高速的细胞定量分析和目标细胞的分选。随着液流控制系统性能的改进和光电检测元件响应速度和计算机软件系统的不断发展进步,流式细胞仪的分析和分选速度都有质的提高。目前,BD公司出品的FACSAria流式细胞分选仪获取速度可达70000个细胞/s,分析速度可达50000个细胞/s。这对于要通过对大量细胞的分析,建立不同细胞类型的数据库具有十分重要的现实意义,如根据细胞形态变化和内部结构的变化对肿瘤细胞进行分类等。
2.4 实现多色分析
流式细胞仪另一个非常重要的特点就是它能够实现对细胞的多参数测量。通过使用多种荧光标记物对细胞进行标记,测量激光激发多色荧光信号,实现单次实验对细胞多种成分测量。然而,实际中荧光标记物的发射光谱多较宽,不同的标记物标记细胞后,光电检测器检测到的荧光信号往往有重叠的现象,这就需要对荧光信号进行补偿。
目前BD公司研发的细胞多色分析技术居于领先地位,它采用多根激光束同时激发流动室中的一个细胞,激发出来的荧光信号分别经过系统中的多个光学滤光片,被不同的光电检测器检测,这样就可以解决荧光信号重叠的问题,使多色分析达到最佳效果[7]。BD产品最多可进行15色荧光分析和前向、侧向散射光分析,这样单次实验就可以同时获得多达17个参数,提供丰富的细胞信息。
2.5 仪器小型化
低功耗、小型化、便携式的细胞分析分选仪器,一直都是各大厂商和科研院所的研究方向。随着激光光源、光电检测器件、电子计算机等相关领域的发展,器件的性能更加优越,体积也更小,这使得流式细胞仪的小型化取得很大进展。目前市场上的C6流式细胞仪的体积比小型微波炉还要小,重量不足14kg,功耗也不超过70W,是真正意义上的小型化分析仪器。
以MEMS技术(微机电系统)为基础的微流控芯片(microfluidic chip)技术具有体积小、效率高、集成度高、速度快等特点,为生化分析领域开辟新的研究方向[8]。国外课题组在这方面已经做很多研究。Hirono等人采用LED作光源的微芯片流式细胞成像分析系统实现对血小板凝集数量的计数[9]。Wolff课题组研制一种微芯片细胞分选器,他们将激光光源、检测器件和细胞的培养室统统集成到一个微型芯片上。该细胞分选器具有尺寸小、分选效率高、价格低等特点,同时采用封闭体系可以有效防止污染,满足环保要求[10]。国内方面也有很多课题组从事这方面研究。姚波等人采用静电力的方法实现对细胞的筛选。当细胞经过检测区后,在芯片出样管道的分支处被施加不同电压,带电荷细胞进入出样管道后,在静电场力作用下,发生不同方向的偏转,进入到相应的收集管里,同时,为有效消除电渗流影响,他们还对管壁做涂层处理[11]。
2.6 仪器自动化
以往流式细胞仪的使用都比较繁琐,使用起来有相当的难度。随着计算机技术、自动控制技术发展,目前流式细胞仪在进样、液流控制、多色荧光分析、细胞分选和数据处理等方面都已经实现自动化。例如BD公司的FACSAria细胞分选仪配备液流自动控制系统和软件自动清洗程序,实现进样仓自动加压、自动混匀样本、自动冲洗进样管路、液滴监控、自动检查堵塞。系统软件的分选设定和检测功能大大简化操作,实现细胞分选的无人操作。
3 流式细胞仪的应用
随着各种新型的荧光染料和单克隆抗体技术的发展应用,流式细胞仪在生物学和医学领域的应用范围得到进一步的扩展。目前,基本上能进行荧光分子标记的细胞或者亚细胞微粒都能被流式细胞仪检测,下面简要介绍流式细胞仪在细胞生物学、免疫学、肿瘤学等部分领域的应用。
3.1 在细胞生物学的应用
细胞内DNA的含量在整个细胞周期内随时都发生周期性的变化,通过荧光探针对细胞内DNA含量进行测量,能够有效分析各个时相的细胞百分比以及DNA异倍体[12]。相对于传统染色体核型分析,流式细胞仪不仅能够实现染色体分析还能进行纯化,以获得克隆实验所需的染色体。同时,流式细胞仪因其具有高效分析和分选能力,在分子遗传学中也有大量应用,主要是用于研究分离的染色体,以及对特定的染色体进行分选。流式细胞仪在微生物领域的应用相对较晚,但它快速、多参数测量的特点十分适合解决微生物学面临的一些问题。目前,在工业上流式细胞仪能够用于微生物的快速鉴定,例如对自来水中的微生物学鉴定和控制、对生乳中细菌总数的检测[13]等。
3.2 在肿瘤学中的应用
流式细胞仪在临床医学中最早应用于肿瘤学,主要是通过DNA含量和线粒体数量检测进行癌前病变和早期癌症的诊断以及化疗指导和愈后评估等[14]。流式细胞仪能够精确检测细胞内DNA含量,可对癌症的性质和发展趋势进行判断,利于早期诊断。实际应用中需要将实体瘤组织解聚、分散制成单细胞悬液,并用荧光染料(碘化吡啶PI)染色,对细胞内的DNA含量进行检测[15]。同时需要将不易区分的群体细胞分成G1期、S期和G2期3个细胞亚群,DNA的含量直接代表细胞的倍体状态,肿瘤的恶性程度和非倍体细胞有密切关系[16]。流式细胞仪还可对恶性肿瘤DNA倍体异质体[17]进行检测,对患者临床分期、病理分级、肿瘤转移具有重要意义。肿瘤早期诊断的一个重要依据就是DNA非整倍体细胞峰的存在。同时,细胞的DNA倍体分析也能够用于病人愈后情况的早期判断。异倍体肿瘤恶变的复发率和死亡率都比较高,然而,二倍体和近二倍体肿瘤的愈后状况明显比较好。流式细胞仪除能对癌症DNA含量进行分析外,还能够根据癌症DNA的分布直方图变化情况对化疗效果进行评估,这对于癌症的化疗具有重要的指导意义[15]。
3.3 在免疫学中的应用
随着单克隆抗体技术、荧光色素技术的发展,流式细胞仪以其快速、定量测量的特点,被广泛应用于免疫理论研究和临床实践当中。通过与荧光抗原抗体[18]结合,对细胞表面和细胞内部的抗原、癌细胞基因蛋白定量分析,实现细胞分类和亚群分析,这对于各种血液病、癌症、B细胞淋巴瘤的早期诊断和治疗以及对人体细胞免疫功能的评估都具有十分重要的现实意义[19]。通过对患者淋巴细胞各个亚群数量的检测可以了解淋巴细胞的分化功能,同时,通过对疾病的特异性淋巴细胞亚群或者细胞表面标记物的存在、缺失和过度表达等的研究,可以对一些免疫性疾病、感染性疾病和肿瘤等进行早期诊断和治疗[12]。此外,还可以利用流式细胞仪进行组织相容性抗原群体分析和器官移植和移植后免疫状态监测。
3.4 在血液学中的应用
临床中通过对外周血T淋巴细胞[20]、骨髓细胞[21]表面抗原和细胞内DNA含量的检测,可以对包括白血病、淋巴瘤等多种血液病进行早期诊断、及时治疗和愈后情况的判断。由于各类血细胞都具有特异的抗原,流式细胞仪通过采用特异的抗血细胞表面分化抗原的单克隆抗体,结合荧光染料,就可以测定某个细胞的多项参数,准确地判断细胞属性。流式细胞仪能够在患者恢复期检测体内是否还有残留的病变细胞,这对于及早发现并采取有效措施防止白血病[21]等疾病的复发具有极其重要的现实意义[12]。
上述应用只是流式细胞仪广泛应用的一个缩影,流式细胞仪在细胞凋亡检测[22]、器官移植、精子性别控制[23]、临床细菌学、植物学[24]等诸多领域都有十分广泛的应用。可以预见,随着激光、探测器、计算机技术等相关技术的发展,流式细胞仪也将会有更加广泛的应用前景。
摘要：流式细胞仪(Flow Cytometer)是一种对细胞进行定量分析和分选的新型高科技仪器,它具有分析速度快、灵敏度高等优点,是临床医学和生物学研究的重要工具。本文概述流式细胞仪的主要结构、工作原理、最新进展以及一些重要的实际应用。
流式细胞技术 篇10
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
FACS Calibur型流式细胞仪(美国Becton-DickinSon公司)。清洁级SD24h新生乳鼠。RPMI1640液体培养基和胎牛血清,购于Hyclone公司;Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(购于美国BD公司);二甲基亚砜(DMSO购于美国GIBCO公司)溶液10μL/mL储备液;西洋参茎叶总皂苷(解放军总医院病理生理室王琛博士惠赠)。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养
无菌操作取出大鼠心脏,立即在无菌D-Hanks液中洗去残血,分离出附着组织,剪成约1 mm3大小碎块,经反复D-Hanks液洗涤、0.15%胰蛋白酶消化,差速贴壁法,制备成心肌细胞悬液,最后用15%胎牛血清的DMEM培养液稀释成细胞密度为3×105/mL,接种于25 mL培养瓶中,放入37℃、5%CO2孵育箱内进行原代培养。
1.2.2 心肌细胞缺氧/复氧模型
按Li等[6]将心肌细胞置于缺氧仓内,通入95%N2-5%CO2混合气,缺氧4h小时后放回CO2孵箱37℃,常规培养12h后检测。
1.2.3 心肌细胞分组及诱导凋亡
将培养细胞心肌细胞分为正常组、缺氧/复氧损伤组、缺氧/复氧加西洋参茎叶总皂甘诱导的乳鼠心肌细胞组(西洋参茎叶总皂甘剂量:40 mg/L,80mg/L,160mg/L)用培养液将细胞稀释为106/mL,混匀后放入37℃,5%CO2的孵箱继续培养24h后分别检测。
1.2.4 流式细胞检测
采用FACS Calibur型分析流式细胞仪,用CELL Quest获取和分析数据。488nm激发光源,先将对照管上样,通过调整参数FAS和SSC,在散色光点图(FSC/SSC)中清楚显示出一个清晰、集中的细胞群体。在获取细胞前,根据FAS/SSC的特点,设定阈值,避免碎片和噪声干扰,确定电压及放大器数值后,再以门中细胞进行设门(gate),使门中细胞占95%以上,收集10000个门内细胞。以门中细胞进行后续荧光信号检测,将对照组细胞的荧光强度设定为非特异性本底荧光,并在此基础上确定阳性荧光表达率。调定流式细胞仪,FL1荧光通道检测Annexin V的荧光强度,FL2荧光通道检测PI的荧光强度。分别将设定阴性对照管使荧光散点图中细胞集中在左下(LL)象限,保持FL1、FL2电压不变。上样调整仪器荧光补偿值,进行校正后,即可分析样本,每个样本均获取10000个细胞,数据以List Mode的形式储存,采用CellQest功能软件进行分析。
2 实验结果
2.1 流式细胞仪检测不同剂量西洋参茎叶总皂甘诱导内质网应激心肌细胞凋亡
将培养乳鼠细胞上流式细胞仪检测。从Annexine V-FITC/PI荧光双参数点图观察到(见图1)对照组细胞主要分布在左下象限,为非凋亡细胞活细胞,右下象限为少量凋亡细胞。损伤组右下象限出现大量凋亡细胞及死亡细胞。增加随着西洋参茎叶总皂甘剂量增加,死亡细胞显著减少,凋亡细胞相对减少(见图1)。
2.2 西洋参茎叶总皂甘诱导内质网应激心肌细胞凋亡变化
正常对照组细胞生长状态良好,细胞凋亡率3.34±0.78%,损伤组缺氧/复氧损伤组细胞凋亡率38.53±6.15%。根据剂量40mg/L,80mg/L,160mg/L的西洋参茎叶总皂甘诱导细胞凋亡分别是19.65±4.77%,15.32±3.24%,12.64±2.23%(见图2)。结果表明:随着剂量增加大剂量西洋参茎叶总皂甘可明显降低凋亡,与以往文献报道一致[7](p<0.01)。
3 讨论
细胞凋亡又称细胞程序性死亡(PCD)是指细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自身的程序,自己结束生命的过程,它是一个主动的、高度有序的基因调控过程[8]。随着对细胞凋亡的深入研究,除两条经典死亡受体活化和线粒体损伤介导的传导通路细胞凋亡,近来研究发现过度内质网应激可启动一条新的细胞凋亡信号传导通路[9],内质网功能紊乱将导致细胞Ca2+失衡以及错误折叠和未折叠蛋白在内质网腔内聚集,从而导致内质网应激[10,11,12]。内质网应激可特异性激活Caspase-12.Caspase-3等下游效应蛋白酶,它不同于前两条经典途径,短期的内质网应激有保护细胞作用,但长期的内质网应激将激活一些凋亡信号分子如Chop、JNK、Caspases,可引起细胞凋亡[13]。因此有关细胞凋亡的检测方法也得到广泛发展,流式细胞仪自20世纪70年代后开始应用,细胞凋亡检测从细胞核到细胞膜,从单一色到多色,根据细胞光散射性质结合特异性荧光,细胞发生凋亡时出现特异性变化。在许多细胞凋亡早期会出现胞质内Ca2+浓度迅速持续升高[14]。Annexin V是一种分子量为35-36KD的Ca+依赖性磷脂结合蛋白,在细胞凋亡早期细胞膜磷脂酸丝氨酸外翻细胞膜外表面[15]可与标志的Annexin V-FITC结合[16],利用这一特性可以检测细胞凋亡[17]。但此时细胞膜是完整的而检测核DNA的PI不能进入细胞核。应用流式细胞仪将细胞分为4个亚群区分正常组细胞、早期凋亡细胞和晚期凋亡及死亡细胞比率。本研究采用Raynal P等[18]建立双标记的流式细胞术结合Annexin-FITC/PI荧光染色进行西洋参茎叶总皂甘通过抑制过度内质网应急减轻大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤结果与报道一致[19]。高剂量西洋参茎叶总皂甘降低在缺氧/复氧后心肌细胞凋亡率,应用流式细胞仪检测西洋参茎叶总皂甘通过抑制过度内质网应急降低细胞凋亡具有快速、准确、信息量大的特点。为深入发展研究细胞凋亡机制,提供更加直观、敏锐的方法。
摘要：利用流式细胞仪观察西洋参茎叶总皂甘通诱导大鼠心肌细胞后内质网应急引起细胞凋亡。选用原代培养心肌细胞,将心肌细胞分为正常细胞对照组,缺氧/复氧组和缺氧/复氧后加入西洋参茎叶总皂苷组。按照40mg/L,80mg/L,160mg/L浓度培养24h后,应用流式细胞仪采用Annexin-V/PI诱导凋亡。结果显示应用流式细胞仪检测最终浓度为160mg/L西洋参茎叶总皂苷凋亡率明显低于缺氧/复氧组。流式细胞仪检测由内质网应急诱导细胞凋亡对研究细胞凋亡的机理提供一种快速、准确检测方法。