流式细胞分选仪

流式细胞分选仪（精选7篇）

流式细胞分选仪 篇1

流式细胞分选技术是借鉴荧光标记、激光、计算机分析技术, 对单细胞定量分析的一种新技术, 其具有极高的细胞检测速度与统计精确性, 广泛应用于医学临床实践的细胞生物学、血液学、免疫学、遗传及临床检验学等各个领域。利用其技术特性, 在奶牛性控冻精的生产上也得到了广泛应用, 从而进一步提高奶牛生产性能和育种进程。

1 性染色体DNA质量差异

哺乳动物每一个体的X精子和Y精子, 其DNA含量都是恒定的, 通常X染色体较Y染色体大, X精子的DNA含量较Y精子多3.0%~4.5%, 例如牛X精子的DNA含量较Y精子多3.8%。利用哺乳动物精子携带X染色体和Y染色体的DNA含量存在差异这一特性, 为流式细胞仪进行X、Y精子的分离奠定了理论基础。

2 荧光染料Hoechst33342与精子细胞定量结合特性

在精子分离的前期处理时应用的染色剂Hoechst33342是一种相对安全的只对活细胞中DNA染色的荧光染料, 它能穿透活细胞的脂质膜, 以非嵌入方式特异性与DNA结合。其特性在于渗透入精子细胞后, 对精子细胞的活力、受精的胚胎及后代个体发育不会造成显著影响。

3 精子细胞分选的技术及原理

取定量活力在70%以上, 精子密度为 (9~14) ×108个/m L原精液, 用Hepes缓冲液稀释至2×108个/m L, 加入定量的Hoechst33342荧光染料, 经34℃的水浴处理后, 置于分离仪上样仓。当经荧光染色标记的精子细胞被高压压入细微进样管经流动室时被具有导电特性的鞘液包裹, 形成单个细胞的微小液滴, 并被排成单列, 液滴以一定速度从流动室70μm喷嘴喷出, 并逐个与激光束交截。被染色的精子细胞被激发出蓝色激发光, 由于X精子DNA含量较Y精子多, 比Y精子结合更多的荧光染料, 因此经激光束激发释放出强弱不同的荧光信号, 信号经流式细胞仪自带的计算机系统扩增放大并且定位分析后做出判断, 分辨出X精子、Y精子或是模糊难以分辨精子, 同时在计算机上设定程序, 根据分辨结果给每个包裹单个X精子或Y精子的液滴附予正电荷或负电荷。在微小液滴通过流动室中部的超高频压电晶体偏转板时, 充电振动, 在高压电场的作用下偏转, 分路落入各自的收集容器中, 没有充电的模糊精子液滴落入中间的废液容器, 从而实现细胞的分离。目前, 先进的流式细胞仪分选速度理论上可达20 000个细胞/s以上, 其分选纯度能达到90%以上, 一次分离的最大合理量约为108个细胞。如果分选的精液样本量大时, 为避免细胞活性降低, 可采取分段式收集。

4 流式细胞仪分选过程中对精子产生损伤的几个因素

在分离精子的过程中, 对精液的高度稀释、荧光染色、分离过程中的激光照射、高压力机械损伤以及分离后的离心作用等诸多操作都不同程度地影响精子的生理机能;尤其对精子细胞最外层的细胞膜造成损伤, 直接影响精子活力, 顶体完整率、线粒体活性和获能状况, 并使得分选的精子存活时间和受精能力下降。

5 性控冻精用于奶牛生产前景展望

近年来, 流式细胞分离仪用于分选奶牛精液的技术趋于成熟, 分选精子细胞的效率也大幅提高, 其用于生产实践中显示出了较大的优势, 但目前这项技术的应用还存在许多问题。首先, 生产成本较高, 流式细胞仪价格昂贵, 专利技术使用及后期维护费用也较高, 增加了生产成本;其次, 虽然分选精子的速度较早期有了明显提高, 但还远不能满足现在生产所需;再次, 研究表明性控冻精的受精能力明显低于常规冻精的受精能力, 通过试验证实, 母牛使用性控冻精 (每只细管精子数2×106个) 的受孕率为常规冻精 (每只细管精子数20×106个) 受孕率的60%~80%, 单位细管的精子数量和精子在分离过程中受到的损伤是产生这一现象的主要原因, 因此, 设法减少精子在分离过程中的损伤和进一步提高分选效率, 是今后性控精液分离技术发展的重点方向。

流式细胞分选仪 篇2

摘 要：随着现代激光技术、电子检测技术和电子计算机技术等的迅速发展，流式细胞仪(FCM)在免疫学、生物学、遗传学、血液学、临床检验等领域中得到了更加广泛的应用。在免疫学研究领域，FCM以快速、灵活及定量等特点被广泛地应用于基础研究和临床治疗的各个方面，尤其是与单克隆抗体技术的结合，使其在免疫分型、分选、免疫监测、免疫细胞的系统发生及特性研究等方面发挥了重要的作用，成为现代免疫学研究不可缺少的工具。该文对近年来流式细胞仪在免疫学研究中的应用进展进行了综述。

关键词：流式细胞仪；免疫学；检测

流式细胞仪(flow cytometry，FCM)是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术、细胞荧光化学技术以及单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器[1]。FCM 可对细胞大小、细胞表面抗原的表达等进行快速、灵活、定量、多参数的检测，而且，可同时用于检测细胞内的核酸定量、DNA倍体、细胞周期分析，细胞因子和黏附分子等[2]。具有分析速度快、精确度高、重复性好和费用低廉等优点。流式细胞仪介绍

1.1 流式细胞仪的工作原理

流式细胞仪主要由流动室和液流系统，激光源和光学系统，光电管和检测系统，计算机分析系统和细胞分选系统5部分组成，其中，流动室是仪器的核心部件。

将待测标本制备成单细胞悬液，经特异性荧光染料染色后，由气压装置送入流动室，以一定的流速经过喷嘴进入激光聚焦区，流速的选择与检测的目的有关，此时，在激光束的照射下，被荧光染色的细胞产生散射光和激发荧光，其散射光信号和荧光信号经光学系统收集，由检测系统转换成为电信号，再通过模/数转换器，转换为可被计算机识别的数字信号，各种信号经计算机采集后，用相应的应用软件进行分析处理，最后，以直方图或三维图的形式显示出来。选择不同的单克隆抗体及荧光染料，可同时测定一个细胞上的多种不同的特征参数，从而可以对细胞进行分类[3]。1.2 流式细胞仪机型介绍

近年，流式细胞仪的主要生产厂家有美国的BD(BectonDickinson)公司、贝克曼库耳(Beckman Coulter)公司和德国的Partec公司。国内使用的流式细胞仪主要由前两家生产。它们生产出一系列科研型和临床型的流式细胞仪，并研制生产了流式细胞仪所用的各种单克隆抗体和荧光试剂。

流式细胞仪可分为两大类，一类为临床分析型(又称小型机、台式机)，其特点为仪器光路调节系统固定，自动化程度高，易学易掌握，适合在临床实验室中应用。如BD公司的FACSCalibur，BeckmanCoulter公司的EPICSXL，Partec公司的Pas，Cytomation公司的MOFLO，Aber公司的Microcyte，Ortho公司Cytoron等。

另一类为科研分选型(又称综合型)，特点为功能齐全，分析灵活，可快速将所感兴趣的细胞分选出来，同时可选配多种波长类型的激光器，适用于广泛的科学研究之用。如BD公司的FACSVantage，Beckman Coulter公司的EPICS ALTRA，Partec公司的PasIII及Cytomation公司的MOFLOMLS等。

随着计算机技术、电子制造技术、激光技术及荧光素合成技术的发展，流式细胞仪的制造工艺、功能、精确度等有了质的飞跃。流式细胞仪已开始向模块化发展，即它的光学系统、检测器单元和电子系统都可以按照试验要求随意更换[4]。各流式细胞仪生产厂商继续推出新产品以满足用户的不同需要。如BD公司的FACSAria(高速细胞分选仪)、分选增强型FACSVantage SETM(多色分析和高速分选流式细胞仪)、LSR II(数字化分析型流式细胞仪)，FACSCanto(双激光六色分析流式细胞仪)。BeckmanCoulter公司近年又推出了Cytomics ™FC 500系列，如FC 500MCL/MPL 采用单激光或双激光激发方式，可进行五色分析。Partec公司的顶级科研型十三色荧光流式细胞仪CYFLOW ML，临床科研型六色荧光流式细胞仪DYFLOW SL。Amnis公司的Image Stream100(激光流动成像细胞仪)，将流式多色检测技术和荧光显微图像显示技术结合在一个平台上，不仅可以通过荧光信号的强度，还可以通过细胞荧光图像对细胞内外信号定位，从而对细胞亚群进行定性和定量分析。流式细胞仪在免疫学中的应用近年来，随着生物医学等相关学科的发展和免疫学研究的深入，流式细胞仪在分子免疫学、免疫生物学和免疫遗传学，免疫血液学、免疫药理学、移植免疫学、肿瘤免疫学、抗感染免疫学、临床免疫学等免疫学领域的基础学科，以及淋巴细胞及其亚群分析、淋巴细胞免疫分型、细胞因子检测等临床研究中，也有了越来越广泛的应用。

2.1 淋巴细胞及其亚群分析

FCM在临床淋巴细胞及其亚群分析中得到广泛应用，可同时检测出一种或几种淋巴细胞细胞表面抗原，将不同的淋巴细胞亚群区分开，并计算出它们相互间的比例。通过淋巴细胞及其亚群数量的检测，可了解在不同情况下机体的免疫功能状态，辅助临床疾病的诊断，探索疾病的发病机理、病程、预后，指导临床治疗方案[5]。

由于FCM可以进行高灵敏度、高速度和多参数分析，使FCM对血液淋巴细胞亚群的检测较其他方法更精确，故其被认为是血液淋巴细胞亚群分析的标准方法[6]。

2.1.1 检测项目 在临床上，淋巴细胞及其亚群分析项目包括：B/NK/CD4/CD8/CD4：CD8；绝对计数(TruCount)；活化淋巴细胞的检测(CD69/HLADR/CD71/B27)；CD4＋ Th/i和CD8＋Ts/c的进一步区分；Naive/Memory T细胞亚群的检测；Th1/Th2亚群的检测。

用流式细胞仪诊断某种疾病时，经常需要检测多个项目，如当人类感染免疫缺陷病病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)后，HIV主要选择地侵入人类具有重要免疫功能的T淋巴细胞亚群中的辅助性T细胞，即Th细胞(CD4＋)，使具有重要免疫功能的T细胞群被破坏，继而累及全身免疫器官，使机体免疫功能下降。检测的免疫指标表现为：T淋巴细胞总数减少(正常值的65%～81%)；T细胞亚群比值倒置，即Th/Ts<1.0(正常1.3∶12～2.1∶1)；Th细胞(CD4＋)绝对计数<200个/μL(正常值400～1 500细胞/μL)，CD8＋ T细胞在感染早期增多，后期则下降；Ts细胞增高，NK细胞减少或活力下降，B淋巴细胞群则在正常范围；CD4＋/CD8＋ 明显低于健康成人(P<0.01)。

2.1.2 检测技术的发展 随着新的荧光色素分子的不断发现，荧光标记技术的进步和流式细胞仪的多激光激发技术的进展，多色荧光分析得到迅速发展，三色、四色甚至五色或六色荧光分析对细胞亚群的识别、细胞功能评价等更为精确。近年，淋巴细胞及其亚群的分析已经发展到三色荧光以上分析，且借用MultiSET全自动获取分析软件完成。如：通过四色荧光标记，对外周血T淋巴细胞亚群可进行快速、客观、准确检测及绝对计数分析[78]。利用流式细胞仪，采用多色荧光标记的单克隆抗体，分析黏附性T 细胞表面CD3＋ CD4＋ 或CD8＋CD19－CD16－CD45RO＋CD62＋CD27＋ CD57 抗原，从而对LFA1adhesive T 细胞快速准确地测定[9]。

总之，用流式细胞仪检测淋巴细胞及其亚群的检测技术朝着多激光、多色分析方向发展。近年来，为了使样本一次检测，得到更多结果，满足临床多色分析诊断的需要，一些厂家为临床应用专门设计了六色分析流式细胞仪。

2.2 白血病免疫分型

白血病是白细胞在分化到某个阶段受阻后呈克隆性异常增殖的结果，它的发病是多阶段的，不同病因引起的白血病的发病机制不同，在治疗和预防上也不同，所以，利用白细胞分化不同阶段出现的细胞表面标志，可以对白血病进行免疫分型，对其进行导向治疗[10]。近年，白血病的MICM(形态学、免疫学和细胞遗传学，分子生物学)分型已成为现代白血病诊断的重要指标，其中应用流式细胞仪进行免疫表型的检测在分型中发挥了越来越重要的作用，现已积累了丰富的应用经验。它具有快速、客观、准确、特异性强、重复性好等优点，对白血病进行免疫分型具有极其重要的临床诊断意义[11]。

准确的免疫分型关键是区分正常细胞与白血病细胞，传统的流式细胞仪白血病免疫分型依赖于白血病细胞的FSC/SSC特性来设定原始细胞群，然后根据门内某些阳性单抗占门内细胞的百分比来确定其抗原表达情况。很显然，这种方法是不能将原始细胞与正常细胞完全分开的。

随着免疫学和遗传学及流式细胞仪检测技术的发展，由开始的主要采用间接免疫荧光标记法到直接免疫荧光标记法，从单色或双色到利用CD45抗体标记设门法进行多色免疫标记。利用造血系统细胞CD45表达量与细胞分化程度的高度相关性，可以精确地将原始/幼稚细胞与正常成熟细胞群完全分开。使免疫分型的准确性得到很大的提高，现在，已成为诊断白血病免疫分型的重要工具[12]。国际上普遍采用三色或四色分析的方法，利用CD45SSC设门法，并结合其他技术进行免疫分型。如应用流式细胞仪，采用CD45 SSC 设门法多参数，并利用抗体积分系统诊断标准，可以准确地、完整地分析白血病免疫分型[13]。采用三色流式细胞术CD45/侧散射(SSC)双参数散点图设门，并结合FAB 形态学能对急性白血病进行准确分型[14]。应用流式细胞仪四色荧光标记技术，CD45/SSC双参数散点图设门方法，能清楚地区分各种免疫细胞，可准确、客观地进行白血病免疫分型[15]。

2.3 血小板膜表面受体检测

血小板膜上有丰富的糖蛋白受体，是血小板发挥其功能的物质基础，静止期和活化期的血小板膜糖蛋白受体的种类、含量、结构和功能显著不同。应用流式细胞仪检测血小板膜上受体，主要是对血小板特异性膜糖蛋白和活化标志物进行免疫荧光标记，结合单克隆抗体和免疫荧光技术，用不同的抗血小板单克隆抗体，可以从分子水平上诊断血小板功能和数量的异常。使用流式细胞仪测定活化血小板是目前公认的快捷而灵敏的方法之一[16]，可直接、灵敏、特异地分析血小板的活化程度和功能状态。

普遍采用的技术是以全血为标本，应用流式细胞仪进行多参数分析，即全血法流式细胞术。如采用流式细胞仪三色荧光标记技术，能准确地检测冠心病患者血小板表面糖蛋白的变化[17]。采用流式细胞仪和三色免疫荧光标记的单克隆抗体，可直接检测全血样本中血小板膜表面CD41、CD61、CD62的表达水平[18]。

与常规血小板功能测定法相比，全血法流式细胞术虽然有许多优点，如直接使用全血样本，且标本用量少；简化标本的处理，避免了样本处理不当等因素导致的血小板体外激活，并可防止血小板亚群的丢失，从而更客观、更准确地反映血小板的功能[19]。但是，全血法流式细胞术也存在不足之处，如流式细胞仪价格昂贵，为了避免血小板体外活化，血样不能久置，需在45 min内处理；只能分析循环中的血小板的数量和功能，不能反映血小板代谢和最近被清除的血小板的数量。所以，还需对该方法进行更深入的研究，并使之标准化[20]。

2.4 细胞因子的检测 细胞因子(cytokine)是由免疫细胞或非免疫细胞合成和分泌的小分子多肽，在调节机体多种细胞的生长、分化和功能，调节正常与病理状态下的免疫应答过程中起着十分重要的作用。检测细胞因子对于阐明机体免疫应答机制及相关疾病的发生、发展规律和临床治疗具有重要意义。

随着研究的进展，仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能满足需要。目前，越来越重视在单细胞水平上研究细胞因子的表达能力。应用流式细胞仪结合间接免疫荧光法，可在单细胞水平上客观、正确地检测细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群，进行多参数相关分析，是一种有效地在单细胞水平研究细胞因子的方法[21]。

近年主要采用的是胞内流式分析法。该方法是基于BD公司的快速免疫细胞因子系统(fast Immune cytokine system)。以植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)，佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)加离子霉素(ionomycin，Ion)作刺激剂，刺激全血中淋巴细胞表达细胞因子；用雷菲德菌(Brefeldin A，BFA)与莫能霉素(monensin，MN)等药物阻断细胞因子分泌至胞外，用CD3和CD8设门，应用两种免疫荧光抗体同时标记淋巴细胞膜表面特异分子和被阻滞在胞内的细胞因子，然后用流式细胞仪进行检测和分析。

该方法具有许多优点，如完善的全血激活方法，保留体内细胞及生化微环境，能更准确反映体内状况，避免了人工假象的产生。高效荧光结合抗体，确保高度灵敏及低背景染色。高质量的膜通透剂，可以保证一致的灵敏度与低背景染色，且免除了为增加通透性所需冷冻细胞过夜的步骤。同型对照，避免了使用重组细胞因子进行繁琐的竞争性封闭。

该技术虽然已成为一项可在单细胞水平上检测细胞因子的有效方法，尤其是在确定功能不同的T细胞亚群方面具有重要的作用[22]，具有其他方法难以比拟的优点。但是，也存在一定的缺陷，如现有的激活剂可导致部分至表面分子表达的下调。因此，今后还要寻找更佳的激活剂。结语

流式细胞分选仪 篇3

流式分选已成为一种最常用和有效的分离细胞方法[1]。其原理是:通过对喷嘴喷出的射流施加周期扰动,迫使射流逐渐断裂成包裹细胞的液滴。当一束激光透过刚从喷嘴喷出的射流时,包裹其中的一个细胞所产生的散射光投射到光电倍增管,转换为电信号,即被识别了。液流中依次排列的每个细胞,都一一识别。就在包含该细胞的液滴从液流脱离的瞬间使其带电,不同的细胞的液滴充电量不同。接着,带电液滴在下落过程中受到高压电场的作用,会偏离自由落体轨迹。不同细胞液滴所带的电荷量不同,偏离角度也不同,落下后可被处在不同位置上的试管收集[2]。在这过程中,从细胞被识别到含着该细胞的液滴脱离液流的时间称为液滴延迟,若设置的液滴延迟与实际不一致,会导致液滴充电时机不准确,从而引起细胞分选的混乱。因此,液滴延迟是决定分选精度的一个重要参数,也使得精确测定并稳定控制液滴延迟一直是流式分选的研究热点。

传统流式分选仪的液滴延迟获取方法是:在预先设定的液滴延迟下,分选一定数量的荧光微球并观察分选效果,之后改变液滴延迟的设定值并重复分选实验,反复进行多次,比较结果,直到分选效果达到最好[3]。其过程繁琐,需要丰富经验,且无法维持液滴延迟稳定。面对不足,有关厂家提出了各自的自动液滴延迟获得方法。例如,BD公司通过激光检测代替人工观察,确定分选出液流中包含的微球数目[4],提高了获得液滴延迟的效率和精度;Beckman Coulter公司则是利用摄像机拍摄液流,获得高分辨率图像,经图像处理后得到相应的液滴延迟[5],提高了精度。两者方法各异,然而都是通过调节压电激励的幅度来维持液滴断点位置固定不变[6],从而保证液滴延迟稳定。可是,当工作压力发生波动即变化时,维持液滴断点位置固定并不能保证液滴延迟的稳定,也会影响分选精度。

针对上述不足,本研究力求在分析液滴延迟形成机理的基础上,建立液滴延迟与工作压力和压电信号幅值等参数的数学关系,并经实验验证,为根据工作压力变化调节压电激励幅度来实现自动校准液滴延迟提供理论指导。

1 模型建立与理论计算

液滴延迟既与压电激励幅度有关,又与射流速度有关,射流速度却受工作压力影响。因此,深入分析射流速度与工作压力、液滴延迟与工作压力以及液滴延迟与压电激励幅值等关系,都是十分必要的。

1.1 射流速度与工作压力的关系

流式分选仪采用高压气体驱动液体流动,显然,气体压力(又称工作压力)决定射流速度,射流速度则影响液滴延迟。因此,首先应确定工作压力与射流速度的关系。

由于样品流量远小于鞘液流量,忽略其影响。这样,在喷嘴结构尺寸、管路直径和长度以及流体性质一定时,喷嘴出口流速只与工作压力有关,可用伯努利方程[7,8,9,10,11]概括表示:

式中:αi,αo—动能修正系数;pi—工作压力;po—喷嘴出口压力;vi—入口流速;vo—射流速度;h—入口到出口的高度差;ρ—液体密度;g—重力加速度;hf—由入口到出口的沿程损失,hf=∑λ(l/d)·(v2/2g),其中:l,d—各段管路的长度和直径,λ—相应的沿程损失系数,假设在管路中各处均为圆管层流,则:λ=64μ/ρvd;hm—管口扩张或收缩引起的局部损失hm=∑ξ(v2/2g);ξ—局部损失系数,可利用经验公式或查表获得。

由于各段管路直径不一致,以上各式中的流速v也不相同。根据质量守恒可得,不同直径d的管路中液体流速v=vodo2/d2。

将方程(1)整理后得到关于射流速度v0和压力pi的方程:

求解得到:

其中:

式(3)表明,在管路结构和流体性质确定时,射流速度vo仅与工作压力pi有关,射流速度vo随pi增大而增大,呈现二次函数关系,即工作压力决定射流速度。

先根据实验条件确定管路结构和流体性质等相关参数的值(模型计算涉及参数如表1所示),再利用式(3)可以计算出不同工作压力下的射流速度,其结果将在3.1节中与实验结果进行比较和讨论。

1.2 液滴延迟与工作压力和压电激励幅值的关系

液滴形成过程如图1所示。根据射流不稳定理论,喷嘴喷出的射流在外界扰动的作用下会破断成一个一个的液滴[12]。早在1878年,Lord.Rayleigh[13]就基于流体力学基本方程分析了毛细射流在外界扰动下破断成液滴的机理,他提出,射流在轴对称扰动下,当扰动的波长大于射流的周长时,射流表面受到的扰动可表达为:

式中:R(t)—时间函数的射流半径;R0—射流的初始半径;ε0—初始扰动;β—扰动增长率;k—波数,k=2π/λ=2πf/v;λ—扰动波长;v—射流速度;f—扰动频率;z—射流向下发展的长度。

当射流表面初始小扰动增长到与初始射流半径相等时射流断裂,液滴形成,即有:

对式(5)求解,便可得到液流从喷嘴喷出到发生断裂的时间,即液滴延迟时间则为:

通常,用压电晶体产生振荡来扰动射流,实验结果也表明初始扰动的大小与压电激励幅值A成正比[14]。液滴延迟常用液滴周期数表示,假设εn=k A,则液滴延迟可表示为:

式(7)表明,当射流的初始半径和扰动频率确定后,液滴延迟T与压电信号幅值A成对数关系,与扰动增长率β成反比。研究表明,扰动增长率β与流体和环境介质的性质以及射流速度v有关[15,16,17]。

液滴延迟理论计算过程,首先是根据式(3)计算出不同工作压力下射流速度,再利用文献[11]所述的修正算法,选用表1所述的物性值及其他相关参数,计算出不同射流速度下的β值(修正参数A取0.175)。然后,根据式(7),完成两项理论计算:

(1)固定压电幅值A。利用不同工作压力下的值,计算出液滴延迟T。其结果将在3.2节中与实验结果进行比较和讨论。

(2)固定某个工作压力下的β值。利用不同的压电幅值A,计算出液滴延迟T。其结果将在3.3节中与实验结果进行比较和讨论。

2 实验系统和实验操作

实验系统利用所在实验已有的分选平台,示意图如图2所示。

实验中,以高压气体作为气源,经调压阀调节压力后驱动鞘液喷出喷嘴,输出压力范围0~45 psi,喷嘴出口直径约为70μm。检测光源采用波长为488 nm的固体激光器;样品选择荧光微球,发射波长532 nm,直径10μm;用光电倍增管检测前向和侧向光信号;压电振荡频率为10 k Hz~100 k Hz可调,幅值为0~100 V可调。系统分选速度超过8 000/s,分选纯度高于90%。同时,使用与压电振荡频率相同的高频闪光灯照射液流,用摄像头观察液流状态,其中液滴断点位置的改变可以反映出液滴延迟的变化。

实验操作方法:

(1)先后打开气路和液路阀门,接着旋转调压阀,将工作压力调整到设定值。

(2)待流速稳定后,使用量筒收集一定体积的喷出液体,同时记录收集时间。

(3)通过摄像头观察液滴并调节压电信号频率和幅值,使液滴形成状态较为理想。

(4)将制备好的荧光微球悬液放入上样器,打开进样开关,微球悬液在气压驱动下通过管路缓慢流入喷嘴。待检测到微球事件后,微调样品压力使事件速率约为400/s。然后调节光路和光电倍增管增益,直到散点图呈现为清晰的一团。

(5)在初定的延迟周期(即液滴延迟整数部分)下,分选160个液滴,使用显微镜观察并统计分选到的微球数量。改变设定延迟周期并重复以上实验,比较各个延迟周期下的分选结果,以分选到微球数最多的延迟周期作为当前系统的延迟周期。

(6)在步骤(5)确定的延迟周期下,设定延迟相位(即液滴延迟小数部分,分辨率为1/16个液滴周期),分选10个液滴,使用显微镜观察并统计分选到的微球数量。改变设定延迟相位并重复以上实验,比较不同延迟相位下的分选结果,以分选到微球数最多的延迟相位作为当前系统的延迟相位。这样,前一步所确定的延迟周期与这次所确定的延迟相位之和即为液滴延迟。

(7)停止上样,冲洗管路。先后关闭液路和气路阀门。

3 实验结果分析

3.1 射流速度随工作压力变化

按照前述实验操作,在工作压力为5 psi~40 psi之间,以5 psi为间隔,分别采集一定体积的液体,而后根据单位时间流量计算出射流速度,实验结果如图3所示。

为了便于分析,也将1.2节所述的理论计算结果表示在其中。

从图3可见,实验结果与理论计算的变化趋势一致,曲线形状都是对称轴沿横轴的抛物线。从图3中还可见,实验拟合方程与理论方程的形式完全相同,这说明射流速度随工作压力变化的数学模型是合理的。不同之处是实验曲线在理论曲线之上,即实验值大于理论值,其拟合方程系数差异与之吻合。分析原因,可能是计算中所使用的管路直径偏小,过高估计了局部损失以及部分结构参数的测量不准确导致的。

3.2 液滴延迟随工作压力变化

压电信号频率和幅值分别选定在52 k Hz和100 V。依照前述实验操作,在工作压力为22 psi~38 psi之间,以2 psi为间隔,使用人工校准方法分别获取其液滴延迟,实验结果如图4所示。

为了便于分析,本研究也将1.2节所述液滴延迟随工作压力变化的理论计算结果表示在其中。

由图4可见,实验曲线与理论曲线的变化趋势一致:在所选择的参数范围内,一开始液滴延迟随工作压力增大迅速减小,且减小速率逐渐变缓;在工作压力的一定区间内,液滴延迟T几乎不变;曲线存在拐点,工作压力过了拐点后,液滴延迟又缓慢增大。同时,还不难看出,实验值小于理论值,对应曲线也更平缓,实验曲线要先于理论曲线出现拐点。分析其原因:一是在推导增长率过程中,线性近似不完全符合真实流体的复杂运动,势必引起误差;二是计算时所选用的相关参数和实际情况存在差异,也会造成偏差。在实际应用中,可通过标定来获得不同工作压力下的实际增长率,使理论值与实测值等同或接近。

3.3 液滴延迟随压电激励幅值变化

工作压力和压电信号频率分别选定在30 psi和52 k Hz。依照前述实验操作,在压电幅值分别为5 V、10 V、20 V、40 V、60 V、80 V、100 V的条件下,使用人工校准方法分别获取其液滴延迟,实验结果如图5所示。

为了便于分析,本研究同样将1.2节所述液滴延迟随压电幅值变化的理论计算结果表示在其中。

由图5可见,在所选择的参数范围内,实验曲线与理论曲线的变化趋势一致,液滴延迟T随着压电激励幅值A增大而减小。同时还可见,实验拟合方程与理论方程的形式完全相同,均呈对数关系且所含系数非常接近,说明液滴延迟随压电信号幅值变化的数学模型原理正确。然而,理论曲线在实验曲线之上,表明前者稍大一点,其拟合方程的系数差异也与之吻合。分析引起原因,可能是增长率的计算值与实际情况存在偏差所致。

3.4 根据工作压力调节压电幅值保持液滴延迟稳定

按照3.3节所述方法,压电频率固定在52 k Hz,分别先在工作压力为28 psi、30 psi和32 psi的条件下校准液滴延迟,再根据校准结果得出对应的液滴延迟随压电幅值变化的拟合方程。其中:

令液滴延迟T=30,代入式(8)中,可得到压电激励幅值A=54.8 V,这说明工作压力为28 psi时,压电激励幅值应为54.8 V,液滴延迟才能维持在30。同理,T=30代入式(9)和式(10)后,可知工作压力分别为30 psi和32 psi时,压电信号幅值应分别为46.3 V和为44.1 V时,对应的液滴延迟才能稳定在30。

实验结果如图6所示。

由图6清楚可见,根据预设液滴延迟T=30计算出的3个实验条件下,测量得实际液滴延迟分别为30.06、30.06、30,误差为0.06,包含拟合方程不准确引起的计算误差和实验误差。液滴延迟测量值与预设值基本一致,说明根据标定数据调节压电激励幅值的方法行之有效。但是,随工作压力增加,液滴断点却明显发生了向下移动,充分表明当工作压力发生变化时,若要保证液滴延迟不变,液滴断点位置必然会发生变化。换言之,工作压力发生变化,如果还维持液滴断点位置固定不变,就不可能保证液滴延迟的稳定。

4 结束语

综合上述理论计算、实验结果以及相关分析,不难得出如下结论:

(1)射流速度随工作压力变化,呈现二次函数关系;

(2)液滴延迟随工作压力增大而变小,变化速率先大后小,到达拐点后又缓慢变大;

(3)液滴延迟随压电信号的幅值变化呈对数关系;

(4)根据工作压力调节压电幅值能实现液滴延迟稳定,T值误差仅为0.062。

流式细胞分选仪 篇4

1 故障现象

仪器加压，放好上样管，使控制面板处于RUN模式，但RUN指示灯颜色显示为黄色，仪器未能达到READY状态，仪器无法进样。

2 故障分析及处理

此情况多是由压力问题而造成，导致样本不能顺利进入流动池进行检测。逐步查找故障原因：(1)确保压力阀处于加压位置;(2)确认鞘液筒是否漏气;(3)检查鞘液筒上的蓝色接口是否连接好;(4)检查样本管是否破损;(5)检查上样针上的Bal Sael是否磨损。经过仔细检查发现，在仪器加压状态下，鞘液筒仍可以前后移动，初步分析是由于鞘液筒漏气，导致仪器压力异常，系统无法进样。仪器减压，重新盖紧鞘液筒盖后，仪器加压，RUN指示灯仍显示为黄色，仪器仍无法进样，进而考虑可能为仪器内部管路漏气所致。打开仪器右侧机盖，真空泵正常震动，且仪器内管路连接完好无掉落。拧下鞘液筒盖，盖中的气孔正常有气体冒出。逐一排除以上故障原因后，最终判断是鞘液筒损坏而导致仪器压力异常。更换新的鞘液筒，盖紧鞘液筒盖，仪器加压，RUN指示灯显示为绿色，仪器恢复正常。

3 预防措施

每次开机时要检查鞘液筒是否被正常加压，且关机时要记得给仪器减压，使鞘液筒解除压力。

参考文献

流式细胞仪工作原理与临床应用 篇5

流式细胞术(Flow cytometry,FCM)是采用流式细胞仪对处于快速直流中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析和分选的技术。1973年美国BD公司推出全球第一台流式细胞仪,它是集激光技术、电子生物技术、光电测量技术、电子计算机技术以及荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。它通过对流动液体中排列成单列细胞或颗粒进行逐个检测,得到该细胞或颗粒的光散射和荧光指标,分析获得其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理及化学性质,还能对所需要的细胞进行分选等,具有检测速度快、测量指标多、采集数据量大,对所需的细胞或生物颗粒进行分析或分选等特点,其在生物学、临床医学、遗传学、免疫学、药物学等众多研究领域得到广泛应用[1]。

1 流式细胞仪的工作原理

流式细胞仪主要由液流系统、光学系统、电子系统、分析系统和细胞分选系统五个部分组成。将待测细胞染色后制成单细胞悬液,用一定压力将待测样品压入流动室,不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出,鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度,这样,鞘液就能够包绕着样品高速流动,组成一个圆形的流束,待测细胞在鞘液的包绕下单行排列,依次通过检测区域。流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束,垂直照射在样品流上,被荧光染色的细胞在激光束的照射下,产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测,这种信号基本上反映了细胞体积的大小;荧光信号的接收方向与激光束垂直,经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离,形成多个不同波长的荧光信号。这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度,经光电倍增管接收后可转换为电信号,再通过模/数转换器,将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机系统将这些数字信号收集、储存,以一维直方图或二维点阵图及数据表或三维图形显示出来,可以用不同的标记物进行双参数、三参数甚至多参数的分析。[2,3,4]

科研型流式细胞仪还可以根据所规定的参量把指定的细胞亚群从整个群体中分选出来,以便对它们进行进一步的研究分析。其分选原理是把液滴形成的信号加在压电晶体上使之产生机械振动,流动室即随之振动,使液柱断列成一连串均匀的液滴,一部分液滴中包有细胞,而细胞性质是在进入液滴以前已经被测定了的,如果其特征与被选定要进行分选的细胞特征相符,则仪器在这个被选定的细胞刚形成液滴时给整个液柱充以指定的电荷,使被选定的细胞形成液滴时就带有特定的电荷,而未被选定细胞形成的细胞液滴和不包含细胞的空白液滴不被充电。带有电荷的液滴向下落入偏转板的高压静电场时,按照所带电荷符号向左或向右偏转,落入指定的收集器内,完成分类收集的目的。对分选出的细胞可以进行培养或其他处理,做更深的研究。

2 流式细胞仪的临床应用

2.1 在肿瘤学方面的应用

利用FCM可以进行细胞周期分析,DNA倍体分析,定量分析检测细胞增殖标志物、细胞表面标志、癌基因蛋白产物、耐药蛋白、细胞凋亡等,从而获得组织形态学方法难以得到的信息,可为肿瘤的临床诊断、治疗、预防和预后提供帮助[5]。DNA非整倍体的出现可能是发生早期癌变的一个重要指标。淋巴瘤、白血病在病理形态学还不能进行早期诊断之前,FCM可以提供确切的诊断信息。流式细胞术对淋巴瘤的早期诊断比形态学检查更为敏感、准确。DNA非整倍体的交界瘤应按恶性肿瘤对待,形态学表现为良性的肿瘤出现非整倍体提示有恶性转变的可能。FCM主要是利用实体瘤标本或穿刺标本、胃镜、食管镜及支气管镜、肿瘤冲洗液、尿液等少量组织进行DNA含量测定,进行包括癌前病变及早期癌变的检出,从而为临床辅助诊断和进一步治疗如放疗中的药物选择、强度、时间等提供较确切、可靠的信息。

2.2 在血液病诊断中的应用

2.2.1 白血病的诊断和治疗

FCM采用各种抗血细胞表面分化抗原(CD)的单克隆抗体,借助于各种荧光染料(异硫氰基荧光素FITC,藻红蛋白PE等)测定一个细胞的多种参数,以正确地判断出该细胞的属性。各种血细胞系统都具有其独特的抗原,当形态学检查难以区别时,免疫表型参数对各种急性白血病的诊断和鉴别诊断有决定性作用[6]。例如干细胞表达CD34,髓系表达CD13、CD14,B细胞系表达CD10、CD19、CD20等,T细胞系表达CD2、CD3、CD5、CD7,利用FCM可以测定出血细胞表达各种抗原的水平,协助临床确诊。

同其他肿瘤的治疗一样,测定DNA倍体和进行细胞周期分析对指导白血病化疗有一定作用,不同的白血病患者或同一患者在不同病期白血病细胞增殖状况不同,定期了解细胞增殖情况采取相应药物可以提高疗效。

目前,临床除化疗药物治疗外还采用造血干细胞移植技术治疗急性白血病和一些疑难性疾病[7]。FCM通过对人白细胞抗原(HLA)配型的测定,可以为异体干细胞移植病人选择出最合适的供体。造血干细胞移植技术主要包括干细胞的鉴别、活性测定、干细胞动员和采集、分离纯化、保存扩增、肿瘤细胞的净化、干细胞回输以及术后保持移植物抗宿主病的低发生率等一系列过程。FCM测定CD34、HLA-DR、CD33等细胞表面标志物,成为干细胞移植技术重要的监测手段。用FCM检测一系列指标观察病人的恢复状态,可以对预后做出早期的判断。

2.2.2 阵发性睡眠性血红蛋白尿的诊断

根据CD59表达将阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)病人分为三型,研究证明不同亚型对补体的敏感程度不同。特异地分析网织红细胞的CD59的表达,对于PNH的诊断及病情评估有非常重要的意义。用流式细胞仪检测并计数缺乏这类膜蛋白的异常血细胞,是目前诊断PNH最直接、最敏感、特异性最强且可以定量的良好手段,比传统的溶血试验具有更高的特异性和灵敏度[8]。

2.2.3 网织红细胞的测定及临床应用

网织红细胞计数是反映骨髓造血功能的重要指标,FCM通过某些荧光染料与红细胞中RNA结合,定量测定网织红细胞中RNA,得到网织红细胞占成熟红细胞的百分比。有作者报道FCM方法比目测法结果精确度更高[9]。此外,FCM还可以测量出网织红细胞的成熟度,对红细胞增殖能力的判断很有意义,为干细胞移植术后恢复的判断、贫血的治疗监测、肿瘤病人放化疗对骨髓的抑制状况等提供了依据。

细胞计数在临床上可以提供评估骨髓相中的红细胞造血功能的信息,在贫血的鉴别诊断中有很重要的作用。贫血患者骨髓功能正常,而网织红细胞增加,多见于内源性溶血性疾病,如镰状细胞溶血性贫血、地中海贫血、球状细胞溶血性贫血、6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺陷、免疫性溶血、脾功能亢进等。失血时网织红细胞亦升高,因此,网织红细胞也可以作为隐性失血的指标。

2.3 在血栓与出血性疾病中的应用

2.3.1 血小板功能的测定

血小板膜糖蛋白(GP)是参与止血、血栓形成的重要分子基础,这些膜糖蛋白是一类重要的黏附分子。利用针对GP的单克隆抗体对血小板进行免疫荧光标记,并用流式细胞仪分析单个血小板或血小板亚群的GP,是血小板膜糖蛋白检测分析方法的重大发展。其方法简便、快速、标本用量少、灵敏度高、结果准确。与血小板有关的抗原的临床意义有以下两点:(1)诊断遗传性血小板功能缺陷疾病,如GPⅠb/Ⅸ复合物先天缺陷导致巨大血小板综合征;GPⅡb/Ⅲa复合物先天缺陷导致血小板无力症[10]。(2)血栓性疾病和血栓前状态,活化血小板的检测。由于活化血小板是血栓的主要成分之一,也是引起血栓形成的主要原因,所以血小板活化程度增高与疾病发生发展有关。如心绞痛和心肌梗死、冠状动脉血管成形术、脑动脉硬化病人活化血小板百分率和绝对数显著高于正常人[10,11]。

2.3.2 血小板相关抗体的测定

免疫性血小板减少性紫瘢病人血浆中可产生血小板自身抗体,结合在血小板表面,称为血小板相关抗体,其分子可以是Ig G、Ig A或Ig M,用鼠抗人Ig G、Ig A、Ig M荧光抗体标记被测血小板,FCM可以测定血小板相关抗体含量。直接法检测血小板表面的相关抗体,间接法可测定血清中的相关抗体。该方法用于该病的诊断及治疗监测,具有检测速度快、灵敏度高的优点。

2.4 流式细胞术在免疫学中的应用

淋巴细胞分为T淋巴细胞(CD3)、B淋巴细胞(CD19)和NK细胞三大群。T淋巴细胞又分为辅助性T细胞(CD4)、细胞毒性T细胞(CD8)。流式细胞术检测T淋巴细胞和B淋巴细胞百分数可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病。CD4和CD8T淋巴细胞的百分数有助于监测患有免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病或有免疫反应的病人的免疫状态。正常人T淋巴细胞CD4/CD8比值大约为2/1,比值升高表明机体免疫机能亢进,见于自身免疫性疾病,如SLE、类风湿性关节炎、自身免疫性溶血等;比值降低表明机体免疫机能下降,如艾滋病、病毒感染、肿瘤、活动性肝硬化、AA等[12]。当人体感染HIV后,CD4T淋巴细胞的百分比和数量减低,可辅助HIV监控治疗。若比值<0.2,应停用免疫抑制剂,以免发生感染而导致移植失败。CD19与机体免疫球蛋白呈正相关。NK细胞反映机体对病毒感染的细胞和肿瘤细胞的杀伤能力及巨噬细胞的杀菌活性。

2.5 在造血干细胞移植中的应用

造血干细胞移植加强烈化疗是治愈某些难治疾病的有效方法。骨髓移植(BMT)或外周血造血干细胞移植(PBSCT)的成功与否,除与是否合并并发症有关外,移植物中CD34+细胞的数量和质量是重要因素。随着近年来外周血造血干细胞移植病例的日益增多,外周血造血干细胞的流式准确定量越来越成为关键问题。1995年,血液病治疗及移植国际联合会成立了干细胞绝对计数(Enumeration)小组,致力于寻求一种简单、快速、灵敏的流式细胞仪检测方法去定量外周血中造血干细胞的数量。这一方法对于临床实验室中不同的流式细胞仪都有效,而且在不同的移植中心具有可比性。这一方案即为1996年问世的ISHAGE方案,迄今为止,其他各种改进方案均是以此方案为基础的。精确测定CD34对于判断移植后的植活和选择G-CSF动员外周血造血干细胞的采集时间有着重要的指导意义。

2.6 流式细胞术在临床细菌学中的应用

FCM泛用于细菌、病原体、毒素、血清抗体及药敏试验。在免疫荧光方法中的流式微球捕获芯片技术(Cytometric Bead Array,CBA)是流式细胞术的一个新应用,它将近似于细胞大小的微珠作为捕获载体,使其携带已知荧光抗原或抗体,来捕获检测物中的相关抗体或抗原。由于遮蔽效应可以使荧光微球的发散光减弱,应用不同大小的荧光微球,可同时检测同一标本的多种抗原或抗体。这种方法能同时检测单一液相样本中多个目的蛋白(如同时测定多种细胞因子、多种自身抗体),检测需用标本量少,灵敏度高,重复性好,直接荧光标记易于使用,检测线性范围宽,避免酶联反应所致的人工假象,可用于单细胞分子水平的多参数检验,也可用于真菌、寄生虫、病毒或混合感染的检测。

2.7 流式细胞术在器官移植中的作用

FCM在器官移植中也占有重要地位,它被用来判断供者与受者之间配型是否合适。其检测手段是检测受者血清中抗供者的抗HLA的抗体。根据抗体的种型、效价、靶抗原和器官移植的类型不同,抗体介导的排斥反应也有所不同。FCM与传统方法相比更灵敏、操作时间短并可同时检测细胞亚型、分辨出Ig G和Ig M抗体。FCM所分析的靶细胞不只局限于淋巴细胞,为移植的配型提供更有利的支持。移植术后,免疫表型的监测也很重要。移植后CD4/CD8比值低下的病人排斥反应发生较多;受者血清中产生抗供体细胞抗体者预后较差,应及时监测以便进行抗排斥的预防和治疗。

3 结语

总之,流式细胞仪应用极为广泛,本文所介绍的只是其中的一部分,随着科学技术的迅猛发展,流式细胞仪在临床上会有更广阔的应用前景。

参考文献

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流式细胞分选仪 篇6

1 流式细胞仪的基本原理

流式细胞仪的基本结构包括5部分: ①流动室及液流驱动系统; ②激光光源及光束形成系统; ③光学系统; ④信号检测、存储、显示、分析系统; ⑤细胞分类纯化系统。流式细胞仪检测时需将待测细胞制成单细胞悬液, 以保证细胞逐个地通过受检, 然后用稳定地流动, 依次经过喷嘴, 恒定通过激光束的焦斑区, 被功率恒定的激光束激发而产生散射光和激发荧光。散射光包括前向角散射光 ( FSC) 和侧向角散射光 ( SSC) 。FSC反映了被测细胞的大小, 细胞直径越大, FSC信号越强。SSC提供了细胞表面状况、胞内精细结构和胞质颗粒性质的信息, SSC信号越强, 细胞内颗粒越多。散射光和荧光是FCM中区分不同细胞类型的依据。根据FSC、SSC两个参数, 可将细胞初步分群。又因不同类型的细胞结合的荧光染料的质和量不同, 其激发荧光波长也不同, 故经荧光染料处理后, 可在物理参量相似的细胞群中再进一步区分细胞亚群 (亚型) 。在此基础上还可以根据有关参数把所需细胞亚群从整个样品中分选出来。流式细胞仪还可以对分析中的目的细胞进行分选提取, 它是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷嘴上安装有超高频的压电晶体, 可以产生高频振荡, 使液流断裂为均匀的液滴, 待测细胞就包含在液滴之中。将这些液滴充上正或负电荷, 当带电液滴通过电场, 在电场的作用下发生偏转, 然后落入相应的收集器之中, 从而实现细胞分选。流式细胞仪的分选速度从以往的5 000个/s提高到现在的25 000个/s。

2 流式细胞仪在精液细胞分离中的应用

在畜牧业生产中, 有选择地繁殖出具有预知性别的畜禽后代, 将能使产肉、产奶、产毛等与性别相关生产性能的经济效益在畜群后代中获得大大提高, 加快畜牧业生产的发展。传统的精子分离方法不但准确率低, 而且分离速度太慢, 不能满足现代畜牧业上大规模优良畜种的推广和改良的需要。而流式细胞仪在分离精子中的应用, 解决了这个问题。在哺乳动物中, 决定动物性别的关键是其所携带不同的性染色体。正常双倍体黄牛总共有60条染色体, 其中公牛为58条常染色体, 1条X染色体, 1条Y染色体;而母牛为58条常染色体, 2条X染色体。当经过减数分裂形成单倍体的配子后, X精子携带X染色体, 它与卵子受精后产生雌性后代;Y精子携带Y染色体, 它与卵子受精后产生雄性后代。在哺乳动物 (家畜) 中, 通常X精子的DNA含量比Y精子多3.0%~4.5%。Hoechst33342是一种相对安全的活细胞荧光染料, 分子式为C27H28N6O·3HC1, 分子质量为561.9 u。它能穿透活细胞的脂质膜, 以非嵌入 (Non-intercalate) 方式特异地结合到DNA双链小沟的腺嘌呤和胸腺嘧啶密集区域, 即主要通过氢键、范德华力和电场相互作用力与DNA结合。精子上的Hoechst33342在激光的照射下能定量地激发出荧光。该染料的特殊性在于不仅能渗透进入活精子膜, 而且在适当浓度时对精子活力、受精后的胚胎和动物后代的发育都没有造成显著影响。分离精子时Hoechst33342的染色方法:通常先将精子稀释到1.5个亿/mL, 加入Hoechst33342至40 μg/mL, 在35 ℃水浴中染色60 min。染色后精子通过流式细胞仪时, 在细微的进样管液流中排成单列, 高速射出喷嘴后逐个与激光交截。精子上的荧光染料Hoechst33342被氢离子紫外激光 (约350 nm) 激发, 产生蓝色激发光 (约460 nm) 。由于X精子所含有DNA比Y精子多, 结合上比较多的Hoechst33342, 所激发出的荧光就比Y精子强。流式细胞仪根据荧光强度的差别分辨出哪个是X精子, 哪个是Y精子。同时, 由于喷嘴产生高频率震动, 高速喷射出的液流形成了包含单个X精子或者Y精子的微小液滴。当液滴被充上正电荷或者负电荷后在电场力的引导下分别落入不同的收集容器中, X精子就得以分离。覃能斌、袁野、王洪章等利用流式细胞仪分离荷斯坦奶牛精子的效果特别好, X精子分离准确率在90%以上。X、Y精子之间的DNA含量差异是流式细胞检索仪进行X、Y精子分离的理论基础。许多研究表明, 哺乳动物的X染色体比Y染色体大, 所含的DNA也比Y多:人的X精子染色体DNA含量大约比Y精子的多2.8%~3.0%, 牛、猪、马、羊、犬、兔X精子染色体DNA含量分别比相应的Y精子多3.8%、3.6%、4.1%、4.2%、3.9%、3.0%。分离精子的基本流程为:经过处理的精子与荧光染料 (Hoechst33342) 在一定条件下共同孵育染色, 让这种活细胞染料与精子DNA的AT富含区域结合。X、Y精子在DNA含量上的差异使其结合的荧光染料量也有差异, 当他们被激光照射时, 所释放出的荧光信号强弱也有差异 (X精子较强) 。此信号通过仪器、计算机系统扩增和识别。当含有精子的液体离开激光系统时, 变成含精子的微液滴并被冲上正 (X精子) 或负 (Y精子) 电荷, 并借助于偏斜板 (电场) 把X或Y精子分别引导到2个收集管中, 分辨不清的精子被抛弃。准确分辨X和Y精子的关键在于正确定位、染色等。检索主要依靠头部染料结合后荧光信号的强弱来判断。哺乳动物精子头部多为短桨行, 激光从不同角度照射所激发的荧光强度差异很大 (桨的扁平面向着检测器时荧光低, 边缘向着检测器时高) , 很容易掩盖X、Y精子DNA差异带来的微弱的荧光强度差异。当精液通过检索系统时, 定位正确的精子被准确分离, 不正确的分辨不清而丢弃。通过改进喷嘴 (喷嘴内部的锥型构造使定位更好, 可对精子产生液压直到精子排到激光前) 、改进电场等系统设计, 结合系统压力的调整, 可提高单精子液滴的产生率、精子分离率和分离精子的产量。研究认为, 在精子定位理想, 50 Psi压力下每秒可形成80 000个液滴, 每秒可分离性别活精子各10 000个 (每小时3.6×107个) , 较初期的仪器效率提高极大, 要再突破则需要从分离程序上做大的变动, 短时间内难以办到;压力太高、速度太快会影响分离后精子的活力 (很少使用40 Psi以上压力) 。目前, 流式细胞检索仪精子性别分离速度一般可达到每小时1.5×107个, 分离精子的产量能够满足牛的人工授精需要, 对猪等 (每次需要10亿以上输精量) 动物则需要相关技术配合。不同动物精子的染色液、染色时间等都有差异, 而且常在荧光染色后, 用食物染料屏蔽细胞膜有损伤精子 (死、弱者) 的荧光, 以便分离过程中除去。研究表明, 精子DNA含量差异大的物种更好分离, 如牛精子比人、猪的好分离。使用流式细胞检索仪分离精子时, 在处理、分离及以后的保存、使用阶段, 精子细胞都可能受到许多因素的损害:高度稀释、核染色、机械压力 (通过检索仪时) 、激光、离心、冷冻等, 采用合适的染色液、鞘液、收集液、保存液和保存方式等都有益。如公猪用Test-蛋黄、公牛用XYTalp加蛋黄等稀释剂预置于收集管底部 (常加入2%~20%蛋黄, 某些品种加入10%精浆) 可减轻损害, 有利于提高分离后精子的活力和膜的完整性。在采精到分离这段时间, 环境温度下保存纯精液优于用稀释液稀释等。各种动物精子分离及处理、保存等要求差异很大。到目前为止, 尚未发现流式细胞检索仪分离精子对DNA等有明显影响: Catt等未见高浓度H33342和紫外线对DNA的内源性缺口有影响; Seidel等认为染色与未染色精子在通过检索仪后在运动性和DNA完整性方面无差异, 使流式细胞检索仪进行精子性别分离后产下的后代没有明显的表型或基因型变化; Johnson研究表明, 猪、牛、兔的精子分离后代可以正常繁殖下一代。但一些试验报道, 使用性别分离精子比非分离者授精后怀孕率低, 其原因还不很清楚。

3 展望

流式细胞分选仪 篇7

传统的细胞分选仪大多是基于石英管和毛细管等平台, 具有集成度比较低、耗费样品量大的缺点[3]。新兴的微流控芯片通过微机电技术 (MEMS) , 将细胞处理、检测与分选等操作集中在一块芯片上, 大大提高了集成度, 并且耗费样品低, 是一种应用前景广阔的技术[4]。本文在微流控芯片的平台上, 设计了癌细胞分选仪的硬件系统, 完成了癌细胞荧光检测电路与用于微流控芯片内细胞分选的高压脉冲源设计, 实现了在微流控芯片上癌细胞检测、计数以及分选的结合。

1 系统结构

整个仪器包括液滴产生系统、微流控平台与激发光路、主控电路、荧光检测电路、高压脉冲源和细胞分选系统。系统的结构如图1所示。

液滴生成系统通过恒流泵在微流控芯片内通过流体聚焦将细胞包裹在液滴中并且在芯片沟道中快速流动, 激光器 (532 nm) 发出的激光经过光路聚焦到芯片沟道一个点上, 对癌细胞进行荧光激发。

使用北京滨松公司生产的电流输出侧窗型光电倍增管 (PMT) 进行荧光检测[5], 将光信号转换为微弱负电流信号, 然后通过荧光检测电路的放大、滤波、A/D转换传送到主控电路, 主控电路对信号进行分析并判断是否让高压系统产生高压脉冲进行细胞分选。

系统主控电路采用Atmel公司的Atmega128芯片作为主控芯片, 完成与PC通信、采集与处理荧光数据、高压分选系统等功能。

微流控平台示意图如图2所示。整个微流控芯片包括进样口、液滴产生沟道 (图中未画出) 、主沟道、正负电极、分选沟道等部分。电极做在沟道两侧并与沟道处于同一高度, 以产生垂直于沟道的均匀电场。

2 荧光检测电路设计

荧光检测电路用于检测PMT输出的微弱负电流信号。癌细胞产生的荧光信号比较微弱, PMT输出的负电流范围为数百皮安~数微安。这要求前置放大电路具有低噪声、高精度的特性[6]。整个荧光检测电路包括前置变阻放大、滤波电路、DAC电路。

前置放大电路采用变阻放大的电路结构, 如图3所示。电路的直流增益倍数取决于反馈电阻R2, 根据Vout=Iin·R2可以计算前置电路输出电压。由相关文献可知[7], 采用一级放大可以获得最高的信噪比。为了避免输入屏蔽电缆的寄生电容[8]引起电路振荡, 在电路设计中加入电容C1, 用以补偿信号的相位。反馈电阻R2并联合适的反馈电容C2, 限制信号的带宽。R3和C3在信号回路中形成一个低通滤波器, 抑制由于背景光引起的噪声和电阻R2的热噪声, 同时避免了产生很大的负载效应[9]。

由于要检测微弱的负电流信号, 所以对于运算放大器U1有较高的要求。运放应当具备极小的输入偏置电流、噪声低和较大带宽增益积的特性。综合以上考虑, 设计中选择了美国Linear公司的CMOS输入型精密运放LTC6240HV, 该运放的性能参数有: (1) 0.1 Hz~10 Hz噪声为550n Vp-p; (2) 输入偏置电流IB:典型为0.2 p A, 最大为1 p A; (3) 带宽增益积:18 MHz。在实际的电路测试中, 该运放对弱电路的检测能力满足系统对检测精度的要求。

3 可调高压脉冲源设计

设计的高压脉冲源用于产生0~1 200 V范围的可变宽度的脉冲信号, 形成垂直电场加在微流控芯片的沟道两侧, 以分选检测到的癌细胞液滴。分选时通过调节脉冲的宽度和高度来达到最优的分选效果。

可调高压脉冲发生器的结构如图4所示, 整个电路包括了可调直流高压模块, DAC高压调节电路、IGBT以及IGBT驱动电路等部分。电路采用两个IGBT组成半桥结构, 采用悬浮驱动技术[10], 避免了采用单个IGBT时由于负载太轻而导致关断时放电太慢, 形成下降沿不够陡峭的问题。通过单片机的控制信号控制IGBT驱动器, 从而控制上下两个IGBT的导通与关断, 形成脉冲宽度可调的脉冲信号。单片机控制DAC输出不同电平的高压调节信号控制高压模块, 来获得0~1 200 V范围内的脉冲峰值。系统中采用的直流高压模块为恒博可调高压, 输出电压为0~1 200 V, IGBT为FGA25N120ANTD, 耐压值为1 200 V, IGBT驱动器采用exb841模块。

在电路测试中发现, IGBT切换产生脉冲时, 会产生比较大的电压尖峰, 当设置的电压较高时, 产生的电压尖峰很可能会对电路元件产生损坏, 因此在电路中加入了尖峰吸收与缓冲电路, 如图5所示。

电路中D2与D3构成双向限幅电路, 将驱动电压限制在-5 V~+15 V, R5与C8组成RC电路设定脉冲上升与下降时间, 以消除电压尖峰, RC时间常数越大, 消除尖峰效果越好, 但同时脉冲上升与下降时间变长, 测试中发现R5取10Ω, C8取20 p F时, 可以获得比较良好的消峰与脉冲边沿特性。D1与C7用于保护exb841内部的稳压管。

4 系统测试

4.1 荧光检测电路测量精度测试

直流信号下, 检测电路输出的结果与五位半万用表测量结果相比, 偏差小于50μV。

在电路悬空输入 (输入电流为零) 情况下测试电路噪声与分辨力, 当采样率为10 Hz时, 得到的输出噪声曲线如图6所示。可以看到在此采样率下电路本身噪声Vp-p小于5μV, 根据反馈电阻为100 kΩ, 等效输入电流噪声为50 p A, 可认为电路具有100 p A量级的输入电流信号分辨能力, 满足系统的测量要求。采样率上升时, ADC引起的噪声会有所增加。

采用检测电路检测浓度为8×104/m L的乳腺癌细胞荧光曲线如图7所示。细胞悬浮液中的杂质会引起一些较低的峰, 使用无癌细胞的悬浮液进行对比发现, 杂质引起的峰一般小于400 m V, 可以通过设定这个电压作为阈值来判断检测到的峰是否是细胞引起的。从图中可以看到, 5 s内检测到了6个癌细胞。

4.2 高压脉冲信号源测试

经过单片机软件的线性偏差修正后, 高压脉冲的峰值与预设值之间偏差小于1 V, 具有较高的精度, 满足系统的要求。

脉冲的上升时间和下降时间可以通过IGBT的基极串联电阻来调节, 以取得脉冲过冲尖峰大小和上升、下降时间大小的平衡, 在本设计中取基极串联电阻为10Ω, 得到的1 200 V左右时脉冲上升下降波形如图8所示。可以看到脉冲上升、下降时间都约为10μs, 脉冲源最高可以产生频率为20 k Hz的高压脉冲信号。

4.3 细胞分选的测试

用罗丹明液滴模拟带有癌细胞的液滴进行细胞分选。当检测到超过阈值的荧光脉冲时, 系统经过一定时间后产生一个脉冲分选出对应的液滴。图9是在显微镜下观察到的一组结果。

从图9中可以看到, 在电极上加上600 V、50 ms脉宽的高压脉冲后, 待分选的液滴发生偏离, 而其余的液滴不受影响, 最后成功将待分选液滴分选到左侧的沟道当中。

设计的基于微流控芯片的流式细胞分选系统采用AVR单片机为核心处理器, 完成了微弱细胞荧光的检测电路的设计、细胞分选高压脉冲电路以及控制电路设计, 在单片微流控芯片上实现了癌细胞的检测、计数以及分选。系统的硬件部分已经初步完成, 经过测试, 硬件各方面的参数均能满足系统的要求, 为后期系统的整合和优化打下了比较好的基础。

参考文献

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