流式细胞术及应用

流式细胞术及应用（精选7篇）

流式细胞术及应用 篇1

流式细胞术 (flow cytometry FCM) 是一种可以对细胞和亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术, 也称荧光激活细胞分类术。因其具有检测速度快, 测量指标多, 分析全面, 方法灵活等特点, 得到广泛应用和推广。现将其主要临床应用综述如下:

1 流式细胞术在免疫学中的应用

流式细胞术与单克隆抗体相结合, 对于细胞表面和细胞内抗原、癌基因蛋白及膜受体的定量检测已广泛应用于临床医学, 通过对患者淋巴细胞各亚群数量的测定来监控患者的免疫状态, 指导治疗。流式细胞术可进行淋巴细胞亚群分析, 正常人群T淋巴细胞CD4/CD8比值大约是2:1, 但在人体细胞免疫低下时可以出现比例下降或倒置, 这对于评估细胞免疫功能有重要作用, 已有报道外周血淋巴细胞免疫表型的参考值, 并对其相关影响因素进行了探讨[1]。也有大量文献介绍了淋巴细胞在各种疾病中的变化, 如在SLE患者的淋巴细胞变化可以反映该病的活动情况及器官侵犯程度, 在伴有肾损害时可出现低CD4+、高CD8+的现象。用流式细胞术PNH患者血细胞膜上的CD55、CD59, 亦比传统的溶血试验具有更高的特异性和灵敏度。此外, 流式细胞术还可以进行HLA群体分析, HLA-B27抗原的阳性率在强直性脊柱炎的患者中高达85%~95%[2]。二者有着不同程度的正相关。流式细胞术应用HLA-B27特异性单抗检测抗原, 可以排除交叉反应, 提高检测的灵敏度和准确性[3,4]。

2 流式细胞术在血液学中的应用

流式细胞术可用于检测孕妇血中的Ig G抗-D[5], 并能通过流式细胞技术区分自体和异体细胞, 排除异体细胞干扰, 准确鉴定患者输血后, 造血干细胞移植后的自体血型[6], 以协助治疗。

流式细胞术能很好地对白血病进行免疫分型, 测量细胞数量一般在1万至5万个细胞之间, 而且快速特异, 准确性好, 并能够提供正常细胞在演变成恶性肿瘤过程中细胞基因及抗原标志发生变化的信息, 而这种细微的变化是常规FAB法所不能分辨的。这种分型对于治疗方案的正确选择与预后有着重要的意义, 也提供了可靠的依据[7,8]。尤其是当形态学检查难以区别时, 免疫表型参数对于各种急性白血病的诊断和鉴别诊断有着决定性的作用, 比形态学检查的准确性提高10%~20%[9]。微小残留病灶常常是白血病复发的主要根源, 而流式细胞术以其特有的高分辨力与敏感性可在患者缓解期检测到是否有残留病变细胞, 及早发现以决定进一步的治疗策略和选择造血干细胞移植及骨髓移植的时机。

流式细胞术可以定量测定网织红细胞中的RNA, 得到网织红细胞占成熟红细胞的成熟度, 对于判断红细胞的繁殖力很有意义。

3 流式细胞术在血小板疾病诊断中的应用

利用流式细胞术检测血小板标志物, 在许多血小板相关疾病的诊断上有重要临床价值。用流式细胞术通过对外周血网织血小板的测定, 有助于血小板减少症的病因学诊断和治疗效果的评价[10,11]。同时还可用于血小板膜糖蛋白异常所致疾病的诊断, 包括先天性或获得性血小板疾病, 尤其是不典型病例。血小板微粒 (PMPS) 是监测血小板活化、预测和诊断血栓性疾病的一个重要指标, 评价活化血小板程度在血栓性疾病和血栓前状态发生发展中的作用, 有利于血栓性疾病的诊断和治疗[12]。采用流式细胞术内参定位法可以准确而快速的定量分析PMPS, 监测血栓性疾病的发生[13]。

4 流式细胞术在肿瘤学中的应用

流式细胞术在肿瘤学中的应用主要是对肿瘤细胞DNA进行测定, 解析细胞周期, 通过肿瘤细胞异倍体测定, 鉴别良性与恶性肿瘤, 评估预后并能在化疗中对药物的选择、放疗中射线强度、时间的决定起主要作用。不仅如此, 它还可根据化疗过程中肿瘤DNA分布直方图的变化评估疗效, 了解细胞动力学的变化, 直接地看到肿瘤细胞的杀伤变化, 以便有针对性地选择药物达到最大杀伤效果。流式细胞术可以精确定量DNA含量, 能对癌前病变的性质和发展趋势做出判断, 有助于癌变的早期诊断。

5 流式细胞术在器官移植中的作用

流式细胞术在器官移植中占有重要地位, 它可以用来鉴别和定型同种异体反应抗体, 如果受者血清中存在针对供者的循环抗体, 就会同供者的淋巴细胞结合, 再加入荧光素的二抗来显示这种结合, 就可在移植手术前发现高风险的受体, 以判定供者和受者之间是否合适。移植后免疫表型的监测可敏感地预测移植后免疫排斥反应, 为临床治疗提供有效依据。

6 流式细胞术在临床细菌学中的应用

流式细胞术广泛用于细菌、病原体、毒素、血清抗体及药敏试验。在免疫荧光方法中的流式微球分析 (Cytometric Bead Array, CBA) 是流式细胞术的一个新应用, 他将近似于细胞大小的微珠作为捕获载体, 使其携带已知荧光抗原或抗体, 来捕获检测物中的相关抗体或抗原。由于遮蔽效应可以使荧光微球的发散光减弱, 应用不同大小的荧光微球, 可同时检测同一标本的多种抗原或抗体。这种方法需用标本量少, 可用于单细胞分子水平的多参数检验, 也可用于真菌、寄生虫、病毒或混合感染的检测。

7 流式细胞术在细胞凋亡检测中的应用

应用流式细胞术多参数分析, 可以分析细胞周期, 评估细胞凋亡的状态。细胞凋亡的早期, 一些与膜通透性改变及凋亡有关的蛋白在细胞膜表面有特定的表达, 通过流式细胞术结合单克隆抗体可以检测表达这些蛋白的细胞, 从而确定凋亡的情况。

应用流式细胞术进行细胞分选, 为特定的细胞群的分子学的研究提供了可能, 并为临床研究、诊断、治疗提供了丰富的信息, 依靠其快速特异的优点, 其在分子水平的应用将越来越广泛。

流式细胞仪工作原理与临床应用 篇2

流式细胞术(Flow cytometry,FCM)是采用流式细胞仪对处于快速直流中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析和分选的技术。1973年美国BD公司推出全球第一台流式细胞仪,它是集激光技术、电子生物技术、光电测量技术、电子计算机技术以及荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。它通过对流动液体中排列成单列细胞或颗粒进行逐个检测,得到该细胞或颗粒的光散射和荧光指标,分析获得其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理及化学性质,还能对所需要的细胞进行分选等,具有检测速度快、测量指标多、采集数据量大,对所需的细胞或生物颗粒进行分析或分选等特点,其在生物学、临床医学、遗传学、免疫学、药物学等众多研究领域得到广泛应用[1]。

1 流式细胞仪的工作原理

流式细胞仪主要由液流系统、光学系统、电子系统、分析系统和细胞分选系统五个部分组成。将待测细胞染色后制成单细胞悬液,用一定压力将待测样品压入流动室,不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出,鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度,这样,鞘液就能够包绕着样品高速流动,组成一个圆形的流束,待测细胞在鞘液的包绕下单行排列,依次通过检测区域。流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束,垂直照射在样品流上,被荧光染色的细胞在激光束的照射下,产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测,这种信号基本上反映了细胞体积的大小;荧光信号的接收方向与激光束垂直,经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离,形成多个不同波长的荧光信号。这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度,经光电倍增管接收后可转换为电信号,再通过模/数转换器,将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机系统将这些数字信号收集、储存,以一维直方图或二维点阵图及数据表或三维图形显示出来,可以用不同的标记物进行双参数、三参数甚至多参数的分析。[2,3,4]

科研型流式细胞仪还可以根据所规定的参量把指定的细胞亚群从整个群体中分选出来,以便对它们进行进一步的研究分析。其分选原理是把液滴形成的信号加在压电晶体上使之产生机械振动,流动室即随之振动,使液柱断列成一连串均匀的液滴,一部分液滴中包有细胞,而细胞性质是在进入液滴以前已经被测定了的,如果其特征与被选定要进行分选的细胞特征相符,则仪器在这个被选定的细胞刚形成液滴时给整个液柱充以指定的电荷,使被选定的细胞形成液滴时就带有特定的电荷,而未被选定细胞形成的细胞液滴和不包含细胞的空白液滴不被充电。带有电荷的液滴向下落入偏转板的高压静电场时,按照所带电荷符号向左或向右偏转,落入指定的收集器内,完成分类收集的目的。对分选出的细胞可以进行培养或其他处理,做更深的研究。

2 流式细胞仪的临床应用

2.1 在肿瘤学方面的应用

利用FCM可以进行细胞周期分析,DNA倍体分析,定量分析检测细胞增殖标志物、细胞表面标志、癌基因蛋白产物、耐药蛋白、细胞凋亡等,从而获得组织形态学方法难以得到的信息,可为肿瘤的临床诊断、治疗、预防和预后提供帮助[5]。DNA非整倍体的出现可能是发生早期癌变的一个重要指标。淋巴瘤、白血病在病理形态学还不能进行早期诊断之前,FCM可以提供确切的诊断信息。流式细胞术对淋巴瘤的早期诊断比形态学检查更为敏感、准确。DNA非整倍体的交界瘤应按恶性肿瘤对待,形态学表现为良性的肿瘤出现非整倍体提示有恶性转变的可能。FCM主要是利用实体瘤标本或穿刺标本、胃镜、食管镜及支气管镜、肿瘤冲洗液、尿液等少量组织进行DNA含量测定,进行包括癌前病变及早期癌变的检出,从而为临床辅助诊断和进一步治疗如放疗中的药物选择、强度、时间等提供较确切、可靠的信息。

2.2 在血液病诊断中的应用

2.2.1 白血病的诊断和治疗

FCM采用各种抗血细胞表面分化抗原(CD)的单克隆抗体,借助于各种荧光染料(异硫氰基荧光素FITC,藻红蛋白PE等)测定一个细胞的多种参数,以正确地判断出该细胞的属性。各种血细胞系统都具有其独特的抗原,当形态学检查难以区别时,免疫表型参数对各种急性白血病的诊断和鉴别诊断有决定性作用[6]。例如干细胞表达CD34,髓系表达CD13、CD14,B细胞系表达CD10、CD19、CD20等,T细胞系表达CD2、CD3、CD5、CD7,利用FCM可以测定出血细胞表达各种抗原的水平,协助临床确诊。

同其他肿瘤的治疗一样,测定DNA倍体和进行细胞周期分析对指导白血病化疗有一定作用,不同的白血病患者或同一患者在不同病期白血病细胞增殖状况不同,定期了解细胞增殖情况采取相应药物可以提高疗效。

目前,临床除化疗药物治疗外还采用造血干细胞移植技术治疗急性白血病和一些疑难性疾病[7]。FCM通过对人白细胞抗原(HLA)配型的测定,可以为异体干细胞移植病人选择出最合适的供体。造血干细胞移植技术主要包括干细胞的鉴别、活性测定、干细胞动员和采集、分离纯化、保存扩增、肿瘤细胞的净化、干细胞回输以及术后保持移植物抗宿主病的低发生率等一系列过程。FCM测定CD34、HLA-DR、CD33等细胞表面标志物,成为干细胞移植技术重要的监测手段。用FCM检测一系列指标观察病人的恢复状态,可以对预后做出早期的判断。

2.2.2 阵发性睡眠性血红蛋白尿的诊断

根据CD59表达将阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)病人分为三型,研究证明不同亚型对补体的敏感程度不同。特异地分析网织红细胞的CD59的表达,对于PNH的诊断及病情评估有非常重要的意义。用流式细胞仪检测并计数缺乏这类膜蛋白的异常血细胞,是目前诊断PNH最直接、最敏感、特异性最强且可以定量的良好手段,比传统的溶血试验具有更高的特异性和灵敏度[8]。

2.2.3 网织红细胞的测定及临床应用

网织红细胞计数是反映骨髓造血功能的重要指标,FCM通过某些荧光染料与红细胞中RNA结合,定量测定网织红细胞中RNA,得到网织红细胞占成熟红细胞的百分比。有作者报道FCM方法比目测法结果精确度更高[9]。此外,FCM还可以测量出网织红细胞的成熟度,对红细胞增殖能力的判断很有意义,为干细胞移植术后恢复的判断、贫血的治疗监测、肿瘤病人放化疗对骨髓的抑制状况等提供了依据。

细胞计数在临床上可以提供评估骨髓相中的红细胞造血功能的信息,在贫血的鉴别诊断中有很重要的作用。贫血患者骨髓功能正常,而网织红细胞增加,多见于内源性溶血性疾病,如镰状细胞溶血性贫血、地中海贫血、球状细胞溶血性贫血、6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺陷、免疫性溶血、脾功能亢进等。失血时网织红细胞亦升高,因此,网织红细胞也可以作为隐性失血的指标。

2.3 在血栓与出血性疾病中的应用

2.3.1 血小板功能的测定

血小板膜糖蛋白(GP)是参与止血、血栓形成的重要分子基础,这些膜糖蛋白是一类重要的黏附分子。利用针对GP的单克隆抗体对血小板进行免疫荧光标记,并用流式细胞仪分析单个血小板或血小板亚群的GP,是血小板膜糖蛋白检测分析方法的重大发展。其方法简便、快速、标本用量少、灵敏度高、结果准确。与血小板有关的抗原的临床意义有以下两点:(1)诊断遗传性血小板功能缺陷疾病,如GPⅠb/Ⅸ复合物先天缺陷导致巨大血小板综合征;GPⅡb/Ⅲa复合物先天缺陷导致血小板无力症[10]。(2)血栓性疾病和血栓前状态,活化血小板的检测。由于活化血小板是血栓的主要成分之一,也是引起血栓形成的主要原因,所以血小板活化程度增高与疾病发生发展有关。如心绞痛和心肌梗死、冠状动脉血管成形术、脑动脉硬化病人活化血小板百分率和绝对数显著高于正常人[10,11]。

2.3.2 血小板相关抗体的测定

免疫性血小板减少性紫瘢病人血浆中可产生血小板自身抗体,结合在血小板表面,称为血小板相关抗体,其分子可以是Ig G、Ig A或Ig M,用鼠抗人Ig G、Ig A、Ig M荧光抗体标记被测血小板,FCM可以测定血小板相关抗体含量。直接法检测血小板表面的相关抗体,间接法可测定血清中的相关抗体。该方法用于该病的诊断及治疗监测,具有检测速度快、灵敏度高的优点。

2.4 流式细胞术在免疫学中的应用

淋巴细胞分为T淋巴细胞(CD3)、B淋巴细胞(CD19)和NK细胞三大群。T淋巴细胞又分为辅助性T细胞(CD4)、细胞毒性T细胞(CD8)。流式细胞术检测T淋巴细胞和B淋巴细胞百分数可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病。CD4和CD8T淋巴细胞的百分数有助于监测患有免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病或有免疫反应的病人的免疫状态。正常人T淋巴细胞CD4/CD8比值大约为2/1,比值升高表明机体免疫机能亢进,见于自身免疫性疾病,如SLE、类风湿性关节炎、自身免疫性溶血等;比值降低表明机体免疫机能下降,如艾滋病、病毒感染、肿瘤、活动性肝硬化、AA等[12]。当人体感染HIV后,CD4T淋巴细胞的百分比和数量减低,可辅助HIV监控治疗。若比值<0.2,应停用免疫抑制剂,以免发生感染而导致移植失败。CD19与机体免疫球蛋白呈正相关。NK细胞反映机体对病毒感染的细胞和肿瘤细胞的杀伤能力及巨噬细胞的杀菌活性。

2.5 在造血干细胞移植中的应用

造血干细胞移植加强烈化疗是治愈某些难治疾病的有效方法。骨髓移植(BMT)或外周血造血干细胞移植(PBSCT)的成功与否,除与是否合并并发症有关外,移植物中CD34+细胞的数量和质量是重要因素。随着近年来外周血造血干细胞移植病例的日益增多,外周血造血干细胞的流式准确定量越来越成为关键问题。1995年,血液病治疗及移植国际联合会成立了干细胞绝对计数(Enumeration)小组,致力于寻求一种简单、快速、灵敏的流式细胞仪检测方法去定量外周血中造血干细胞的数量。这一方法对于临床实验室中不同的流式细胞仪都有效,而且在不同的移植中心具有可比性。这一方案即为1996年问世的ISHAGE方案,迄今为止,其他各种改进方案均是以此方案为基础的。精确测定CD34对于判断移植后的植活和选择G-CSF动员外周血造血干细胞的采集时间有着重要的指导意义。

2.6 流式细胞术在临床细菌学中的应用

FCM泛用于细菌、病原体、毒素、血清抗体及药敏试验。在免疫荧光方法中的流式微球捕获芯片技术(Cytometric Bead Array,CBA)是流式细胞术的一个新应用,它将近似于细胞大小的微珠作为捕获载体,使其携带已知荧光抗原或抗体,来捕获检测物中的相关抗体或抗原。由于遮蔽效应可以使荧光微球的发散光减弱,应用不同大小的荧光微球,可同时检测同一标本的多种抗原或抗体。这种方法能同时检测单一液相样本中多个目的蛋白(如同时测定多种细胞因子、多种自身抗体),检测需用标本量少,灵敏度高,重复性好,直接荧光标记易于使用,检测线性范围宽,避免酶联反应所致的人工假象,可用于单细胞分子水平的多参数检验,也可用于真菌、寄生虫、病毒或混合感染的检测。

2.7 流式细胞术在器官移植中的作用

FCM在器官移植中也占有重要地位,它被用来判断供者与受者之间配型是否合适。其检测手段是检测受者血清中抗供者的抗HLA的抗体。根据抗体的种型、效价、靶抗原和器官移植的类型不同,抗体介导的排斥反应也有所不同。FCM与传统方法相比更灵敏、操作时间短并可同时检测细胞亚型、分辨出Ig G和Ig M抗体。FCM所分析的靶细胞不只局限于淋巴细胞,为移植的配型提供更有利的支持。移植术后,免疫表型的监测也很重要。移植后CD4/CD8比值低下的病人排斥反应发生较多;受者血清中产生抗供体细胞抗体者预后较差,应及时监测以便进行抗排斥的预防和治疗。

3 结语

总之,流式细胞仪应用极为广泛,本文所介绍的只是其中的一部分,随着科学技术的迅猛发展,流式细胞仪在临床上会有更广阔的应用前景。

参考文献

[1]左连富.流式细胞术与生物医学[M].沈阳:辽宁人民出版社,1996:129-422.

[2]Grogan WM.Guide to flow cytometry methods[M].NewYork:MarcelDekker Inc,1990:1-20.

[3]沈关心,周汝麟.现代免疫学实验技术[M].武汉:湖北科学技术出版社,2002:226-230.

[4]王书奎,周振英.实用流式细胞术彩色图谱[M].上海:第二军医大学出版社,2004:1-56.

[5]李元堂.流式细胞术在血液系统肿瘤诊断、治疗中的应用[J].黑龙江医药科学,2005,28(2):93-95.

[6]肖志坚,郝玉书.免疫表型分析与急性白血病诊断[J].中华血液学杂志,1997,18:53-55.

[7]韩忠朝,冯四洲,韩明哲.造血干细胞移植技术及其应用[J].中华血液学志,1998,19:663-666.

[8]Krauss J S.Laboratory diagnosis of paroxysmalnocturnal hemoglobinuria[J].Ann Clin Lab Sci,2003,33(4):401-406.

[9]刘小林,周彦,孙林.流式细胞仪检测网织红细胞百分比性能评价[J].蚌埠医学院学报,2010,08:828-830.

[10]王志杰.流式细胞术在血小板疾病中的应用[J].血栓与止血学,2004,10(1):39-41.

[11]Linden MD,Frelinger A L 3rd,Barnard MR,et al.Application of flow cytometry to platelet disorders[J].Semin Thromb Hemost,2004,30(5):501-511.

非成像式流式细胞仪的发展与应用 篇3

流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)也称为荧光激活细胞分类术(Fluorescence Activated Cell Sorting,FACS),是利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或者生物颗粒进行多参数、快速定量分析,同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。

流式细胞仪(Flow Cytometer)是集激光技术、光电检测技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术以及计算机技术于一体的新型高科技仪器。它能够高效检测细胞大小、粒度、表面积等细胞结构参数和细胞表面/胞质/核的特异性抗原、细胞内细胞因子、酶活性、Ca2+[1]、细胞活性等细胞功能参数[2],同时还具有细胞分选和计数能力。自上世纪70年代第一台流式细胞仪问世以来,历经40多年的迅猛发展,目前流式细胞仪已经广泛应用于生物学、药理学、免疫学、血液学、肿瘤学以及细胞凋亡检测和临床检验等领域。

1 流式细胞仪的结构

流式细胞仪主要由液流系统、光学系统、电子系统和细胞分选系统4部分组成。

经过特定荧光染色的待测样本细胞悬液,在鞘流的包围约束下,细胞成单列排布,由流动室喷嘴高速喷出,形成细胞液柱。液柱与激光束垂直相交,相交位置即为检测区,在入射激光照射下产生荧光信号和前向散射光信号(FSC,Forward Scatter)与90°侧向散射光信号(SSC,Side Scatter),可被电子系统检测并输入到计算机利用专业软件进行细胞多参数分析与分选。

1.1 液流系统

液流系统主要负责将待测样品从样品室运送到流动室的测量区域,其理想状态是把细胞传送到激光束的中心,并且在一次曝光时间内,只允许一个细胞通过激光束,然后根据需要,液流流入废液桶或者分选收集管。液流系统主要由流动室和液流驱动系统构成。

流动室内充满鞘液,根据层流原理,在鞘液的包围下,细胞排成单列从流动室的喷嘴流出,并且被鞘液包围形成细胞液柱。另外,同轴流动的设计,使得样品流(核流)和鞘流始终保持分层鞘流的状态。

1.2 光学系统

光学系统负责产生并采集荧光、散射光信号,主要由包括激光、光纤、光束形成棱镜、聚焦镜的光学激发系统和包括荧光物镜、光纤、光学滤片、检测器的光学采集系统组成。

目前流式细胞仪广泛使用的是488nm的氩离子激光器和635nm的氦-氖激光器。光学滤光片放置在光电倍增管前面,对去除干扰信号、提高结果的准确性至关重要。

1.3 电子系统

电子系统的功能是将荧光和散射光信号转换成电信号,并进行数字化处理后送入计算机用专用软件进行分析,包括光电转化器、信号放大器、信号处理系统和计算机软件分析系统。

液柱中的细胞经过测量区域被激光照射,产生荧光信号和前向角散射与90°侧向角散射信号。其中荧光信号由光电倍增管检测,2个散射光信号由光电二极管检测。荧光信号与产生荧光的化学物质有关,前向散射光信号与细胞大小有关,90°侧向散射光信号与细胞粒度有关。通过安装多个滤光片和不同波长的激光器就能得到更多的荧光信号和散射光信号,这对于人们认识细胞内化学物质的相互作用具有十分重要的现实意义。

1.4 分选系统

利用流动室喷嘴上的高频压电晶体的振动,将液流变成只包含单个靶细胞的小液滴,系统根据鞘流的流速与晶体振动的频率,精确算出小液滴的间距,然后对其施加相应的电压,当小液滴通过正负极板时就会发生偏转,流入相应的收集管里,不带电的液滴就会流入中间的废液桶里,从而实现对细胞(包括中性粒细胞)的分选[3]。

2 流式细胞仪的最新进展

2.1 光学系统的完善

随着激光技术的发展,激光器的性能更加优异,价格也更加低廉,这使得激光逐渐取代非相干光源,在流式细胞仪中得以广泛应用。目前,除德国的Partec等公司的部分产品仍使用汞灯作为光源激发紫外的荧光物质外,多数的流式细胞仪都配备多个激光器,同时发出不同波长的激光以激发出多种荧光。例如BD公司的FACSAria流式细胞分选仪除配备较为常用的488nm蓝光和640nm红光外,还配备407nm光源。同时,染料激光器的出现,使得光源发出连续可调的光谱成为可能,极大地扩展波长范围,可以满足用户多种特殊的需求。另外,通过配备多个光学滤光片,可同时检测多种荧光信号和包括FSC和SSC在内的信号,丰富人们的视野,更好地实现对细胞的检测。

2.2 灵敏度和分辨率的提高

灵敏度反映仪器能够检测到最弱的荧光和散射光信号,直接决定能否检测出待检测指标。灵敏度主要与待检测物体被激光照射效率和荧光接收效率有关,灵敏度的高低也是衡量流式细胞仪性能的最重要指标之一[4]。通过使用更加贴近最大吸收波长的激发光源和改善光路系统设计能够有效提高流式细胞仪灵敏度,同时,使用较高灵敏度的光电检测元件也可以分析微弱的荧光信号,较大程度上提高流式细胞仪灵敏度。目前流式细胞仪多使用石英微流动室[5]和数值孔径较大的物镜,使得收集到的细胞荧光信号显著增强。另外,通过使用光子计数系统[6],也能够实现对一些微弱荧光信号的检测。光子计数系统具有较高灵敏度,但是检测面积比较小,使用时应该用高质量的透镜组将光子汇聚到它的有效面积上。随着荧光技术的发展,市场上出现更多类型的荧光染料可供选择,荧光的激发光强也有很大的提高,实现灵敏度提高。另外,使用高透射率、高折射率的光纤,也能够更好地与光源、光电检测器和芯片耦合,显著降低光强损失,提高仪器灵敏度。

随着液流系统、光电检测技术和计算机技术的发展,流式细胞仪的分辨率也有显著提高。目前市场上流式细胞仪的分辨率可以达到1:512000,能够得到CV值(变异系数)很小的实验数据,彻底改变以往很难把染色体区分开的局面,这使得分辨率较高的染色体的分析和分选成为可能。

同时,随着灵敏度和分辨率的提高,实验所需的样品容量也进一步减少,如C6流式细胞仪最小的样品大小仅为30μL,这对于难以获得较大样品量的研究实验具有十分重要的意义。

2.3 分析和分选速度的提高

流式细胞仪非常重要的一个特点就是它能够实现高速的细胞定量分析和目标细胞的分选。随着液流控制系统性能的改进和光电检测元件响应速度和计算机软件系统的不断发展进步,流式细胞仪的分析和分选速度都有质的提高。目前,BD公司出品的FACSAria流式细胞分选仪获取速度可达70000个细胞/s,分析速度可达50000个细胞/s。这对于要通过对大量细胞的分析,建立不同细胞类型的数据库具有十分重要的现实意义,如根据细胞形态变化和内部结构的变化对肿瘤细胞进行分类等。

2.4 实现多色分析

流式细胞仪另一个非常重要的特点就是它能够实现对细胞的多参数测量。通过使用多种荧光标记物对细胞进行标记,测量激光激发多色荧光信号,实现单次实验对细胞多种成分测量。然而,实际中荧光标记物的发射光谱多较宽,不同的标记物标记细胞后,光电检测器检测到的荧光信号往往有重叠的现象,这就需要对荧光信号进行补偿。

目前BD公司研发的细胞多色分析技术居于领先地位,它采用多根激光束同时激发流动室中的一个细胞,激发出来的荧光信号分别经过系统中的多个光学滤光片,被不同的光电检测器检测,这样就可以解决荧光信号重叠的问题,使多色分析达到最佳效果[7]。BD产品最多可进行15色荧光分析和前向、侧向散射光分析,这样单次实验就可以同时获得多达17个参数,提供丰富的细胞信息。

2.5 仪器小型化

低功耗、小型化、便携式的细胞分析分选仪器,一直都是各大厂商和科研院所的研究方向。随着激光光源、光电检测器件、电子计算机等相关领域的发展,器件的性能更加优越,体积也更小,这使得流式细胞仪的小型化取得很大进展。目前市场上的C6流式细胞仪的体积比小型微波炉还要小,重量不足14kg,功耗也不超过70W,是真正意义上的小型化分析仪器。

以MEMS技术(微机电系统)为基础的微流控芯片(microfluidic chip)技术具有体积小、效率高、集成度高、速度快等特点,为生化分析领域开辟新的研究方向[8]。国外课题组在这方面已经做很多研究。Hirono等人采用LED作光源的微芯片流式细胞成像分析系统实现对血小板凝集数量的计数[9]。Wolff课题组研制一种微芯片细胞分选器,他们将激光光源、检测器件和细胞的培养室统统集成到一个微型芯片上。该细胞分选器具有尺寸小、分选效率高、价格低等特点,同时采用封闭体系可以有效防止污染,满足环保要求[10]。国内方面也有很多课题组从事这方面研究。姚波等人采用静电力的方法实现对细胞的筛选。当细胞经过检测区后,在芯片出样管道的分支处被施加不同电压,带电荷细胞进入出样管道后,在静电场力作用下,发生不同方向的偏转,进入到相应的收集管里,同时,为有效消除电渗流影响,他们还对管壁做涂层处理[11]。

2.6 仪器自动化

以往流式细胞仪的使用都比较繁琐,使用起来有相当的难度。随着计算机技术、自动控制技术发展,目前流式细胞仪在进样、液流控制、多色荧光分析、细胞分选和数据处理等方面都已经实现自动化。例如BD公司的FACSAria细胞分选仪配备液流自动控制系统和软件自动清洗程序,实现进样仓自动加压、自动混匀样本、自动冲洗进样管路、液滴监控、自动检查堵塞。系统软件的分选设定和检测功能大大简化操作,实现细胞分选的无人操作。

3 流式细胞仪的应用

随着各种新型的荧光染料和单克隆抗体技术的发展应用,流式细胞仪在生物学和医学领域的应用范围得到进一步的扩展。目前,基本上能进行荧光分子标记的细胞或者亚细胞微粒都能被流式细胞仪检测,下面简要介绍流式细胞仪在细胞生物学、免疫学、肿瘤学等部分领域的应用。

3.1 在细胞生物学的应用

细胞内DNA的含量在整个细胞周期内随时都发生周期性的变化,通过荧光探针对细胞内DNA含量进行测量,能够有效分析各个时相的细胞百分比以及DNA异倍体[12]。相对于传统染色体核型分析,流式细胞仪不仅能够实现染色体分析还能进行纯化,以获得克隆实验所需的染色体。同时,流式细胞仪因其具有高效分析和分选能力,在分子遗传学中也有大量应用,主要是用于研究分离的染色体,以及对特定的染色体进行分选。流式细胞仪在微生物领域的应用相对较晚,但它快速、多参数测量的特点十分适合解决微生物学面临的一些问题。目前,在工业上流式细胞仪能够用于微生物的快速鉴定,例如对自来水中的微生物学鉴定和控制、对生乳中细菌总数的检测[13]等。

3.2 在肿瘤学中的应用

流式细胞仪在临床医学中最早应用于肿瘤学,主要是通过DNA含量和线粒体数量检测进行癌前病变和早期癌症的诊断以及化疗指导和愈后评估等[14]。流式细胞仪能够精确检测细胞内DNA含量,可对癌症的性质和发展趋势进行判断,利于早期诊断。实际应用中需要将实体瘤组织解聚、分散制成单细胞悬液,并用荧光染料(碘化吡啶PI)染色,对细胞内的DNA含量进行检测[15]。同时需要将不易区分的群体细胞分成G1期、S期和G2期3个细胞亚群,DNA的含量直接代表细胞的倍体状态,肿瘤的恶性程度和非倍体细胞有密切关系[16]。流式细胞仪还可对恶性肿瘤DNA倍体异质体[17]进行检测,对患者临床分期、病理分级、肿瘤转移具有重要意义。肿瘤早期诊断的一个重要依据就是DNA非整倍体细胞峰的存在。同时,细胞的DNA倍体分析也能够用于病人愈后情况的早期判断。异倍体肿瘤恶变的复发率和死亡率都比较高,然而,二倍体和近二倍体肿瘤的愈后状况明显比较好。流式细胞仪除能对癌症DNA含量进行分析外,还能够根据癌症DNA的分布直方图变化情况对化疗效果进行评估,这对于癌症的化疗具有重要的指导意义[15]。

3.3 在免疫学中的应用

随着单克隆抗体技术、荧光色素技术的发展,流式细胞仪以其快速、定量测量的特点,被广泛应用于免疫理论研究和临床实践当中。通过与荧光抗原抗体[18]结合,对细胞表面和细胞内部的抗原、癌细胞基因蛋白定量分析,实现细胞分类和亚群分析,这对于各种血液病、癌症、B细胞淋巴瘤的早期诊断和治疗以及对人体细胞免疫功能的评估都具有十分重要的现实意义[19]。通过对患者淋巴细胞各个亚群数量的检测可以了解淋巴细胞的分化功能,同时,通过对疾病的特异性淋巴细胞亚群或者细胞表面标记物的存在、缺失和过度表达等的研究,可以对一些免疫性疾病、感染性疾病和肿瘤等进行早期诊断和治疗[12]。此外,还可以利用流式细胞仪进行组织相容性抗原群体分析和器官移植和移植后免疫状态监测。

3.4 在血液学中的应用

临床中通过对外周血T淋巴细胞[20]、骨髓细胞[21]表面抗原和细胞内DNA含量的检测,可以对包括白血病、淋巴瘤等多种血液病进行早期诊断、及时治疗和愈后情况的判断。由于各类血细胞都具有特异的抗原,流式细胞仪通过采用特异的抗血细胞表面分化抗原的单克隆抗体,结合荧光染料,就可以测定某个细胞的多项参数,准确地判断细胞属性。流式细胞仪能够在患者恢复期检测体内是否还有残留的病变细胞,这对于及早发现并采取有效措施防止白血病[21]等疾病的复发具有极其重要的现实意义[12]。

上述应用只是流式细胞仪广泛应用的一个缩影,流式细胞仪在细胞凋亡检测[22]、器官移植、精子性别控制[23]、临床细菌学、植物学[24]等诸多领域都有十分广泛的应用。可以预见,随着激光、探测器、计算机技术等相关技术的发展,流式细胞仪也将会有更加广泛的应用前景。

摘要：流式细胞仪(Flow Cytometer)是一种对细胞进行定量分析和分选的新型高科技仪器,它具有分析速度快、灵敏度高等优点,是临床医学和生物学研究的重要工具。本文概述流式细胞仪的主要结构、工作原理、最新进展以及一些重要的实际应用。

流式细胞术的临床应用及研究进展 篇4

1流式细胞术和肿瘤的诊断、预后

恶性肿瘤的早期诊断是提高治愈和生存率的关键,但癌症早期多缺乏客观明确的诊断指标,难以获得形态学上的证据。流式细胞术可测定细胞内DNA含量的能力给肿瘤诊断带来了极大的帮助。因为人体正常细胞多是以二倍体形式存在,而癌变的细胞其DNA数量会发生变化,所以流式细胞术可为肿瘤生物学行为的判断提供重要依据,有助于癌变的早期诊断。流式细胞术的检测标本可为实体瘤标本、穿刺标本、胸腹水标本、尿液、胃镜、支气管镜钳取的活检标本等,首先将实体瘤组织解聚、分散制备成单细胞悬液,用荧光染料染色后对细胞的DNA含量进行分析,最后将不易区分的群体细胞分成三个亚群(G0/GI期、S期、G2期),DNA含量直接代表细胞的倍体状态,非倍体细胞与肿瘤恶性程度有关,DNA非整倍体细胞峰的出现即为癌变的重要标志[1]。

越来越多的研究表明流式细胞术在血液系统恶性病变的预后评估及疾病监测,肿瘤病人的免疫状态评价等方面有重要作用[2,3]。若仅依靠形态学诊断淋巴造血系统肿瘤,仅有一小部分明显的肿瘤如霍奇金淋巴瘤被确诊,目前淋巴造血系统肿瘤的分类综合了形态学、细胞学、分子生物学等指标[4],诊断更加准确。流式细胞术分析可以得出恶性病变细胞的免疫表型、细胞的DNA含量,这可以用来选择特异的治疗,并为疾病的诊断、预后提供重要信息。比如,不同的CD20阳性B细胞恶性病变目前通常使用抗CD20单抗治疗,一小部分CD52阳性的T细胞核B细胞恶性病变可使用抗CD52单抗治疗。流式细胞术可用来区分套细胞淋巴瘤和与之形态相似的其它CD20阳性B细胞淋巴瘤[5]。因为这些B细胞肿瘤的抗原表达谱各有不同,因此流式细胞术通过确定肿瘤细胞的抗原表达谱及相对的抗原表达量可促进疾病的诊断。流式细胞术还具有在混合细胞中检测少量特定细胞的能力,这可以用于评估肿瘤治疗后的残存恶性细胞,通常来说若治疗后仍存在恶性细胞提示较差的预后。流式细胞术还可快速检测细胞中DNA的相对含量,这可用于急性淋巴细胞白血病的治疗指导。

2流式细胞术和免疫性疾病

T、B和NK淋巴细胞的水平是监测机体的免疫状态的重要指标。通过表面标志物监测各免疫细胞及细胞内各种细胞因子水平,以及对淋巴细胞各亚群数量的测定可了解患者的免疫状态。流式细胞术与单克隆抗体结合,对细胞表面和细胞内抗原、癌基因及膜受体的定量检测取得了很大的进展。其原理主要是:利用抗原抗体特异性反应,先将不同单克隆抗体带上各种荧光染料作为荧光探针,这种荧光探针与单克隆抗体结合紧密。当细胞经过激光器发射的激光照射后,细胞膜的抗原抗体复合物上的荧光探针就可以发射出不同光谱的继发荧光,带荧光探针的单克隆抗体与细胞表面相应抗原的结合的继发荧光量转换成电信号,这就代表了细胞表面的抗原量。这些荧光通过流式细胞仪的识别和分辨,便可实现对细胞表面抗原的定量检测。

流式细胞术可用于HIV感染后CD4阳性T细胞的计数[6],以及多种原发性免疫缺陷病,如自发免疫性淋巴组织增生综合征、多发免疫缺陷、抗体缺陷病的分类和预后评估。流式细胞术对同种异体干细胞移植或同种异体骨髓移植后病人特定免疫细胞的定量对病人移植后的生存分析有重要作用。

3流式细胞术和细胞治疗、移植

流式细胞术可分选特定的细胞群,然后用于细胞治疗。CD34阳性是人造血干细胞的标志之一,应用流式细胞术可分离、提纯CD34阳性细胞以供细胞移植治疗。自体CD34阳性细胞移植治疗大大地减少了以往移植过程中可能的肿瘤细胞的混入,降低了疾病再复发的风险。已有文献报道采用分选、纯化的CD34阳性干细胞治疗乳腺癌、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤,结果表明治疗后可形成持久的造血重建[7,8,9],但是由于研究样本量较少且缺乏对照,因此其有效性有待进一步验证。

流式细胞术的应用还包括在输血后、移植前、孕期、移植前HLA型别判定时检测人类白细胞抗原(HLA)的抗体。20世纪80年代有研究[10]报道若流式细胞术可检测到移植捐赠者的HLA抗体,发生早期移植物抗宿主反应可能较大。之后,大量研究证实了这一发现不仅适用于肾移植,也适用于其他实体器官移植。在血液系统疾病中,明确地检测到针对HLA抗原的HLA抗体也提示移植失败。因此,多数情况下,捐赠者HLA抗体的测出是移植禁忌症。

基于微粒技术来检测HLA抗体的新方法极大地促进了流式细胞术的临床应用,这种技术显著地降低了以往方法的假阳性。新近,还出现了基于多路技术平台的新型流式细胞术,可同时检测100种独特的双色荧光微粒。在微粒上连接特异性DNA探针后,这种多路流式细胞术还可用于检测HLA基因型别,最多可同时检测100个HLA等位基因。因此,现在只需一台流式细胞仪就可开展高通量的HLA型别分析。这项技术在检测干细胞或器官移植病人的HLA分子间的单氨基酸序列差异上也有较高的敏感性和特异性。

4结语

流式细胞术的发展和应用对疾病的诊断、分类,肿瘤病人及同种异体干细胞移植、器官移植病人的监测、预后评估都有重要作用。流式细胞术产生的高通量数据应该得到很好的利用,这需要生物信息学的大力推动。

参考文献

[1]张韫,杨鑫,李忻.流式细胞术在临床检验中的应用[J].中日友好医院学报,2012,26(5):303-306.

[2]Zhou,Y.M.Othus,et al.Pre-and post-transplant quantification of measurable('minimal')residual disease via multiparameter flow cytometry in adult acute myeloid leukemia[J].Leukemia,2016,2.2

[3]Wang,Y.L.Peng,et al.Clinical value to quantitate hematogones in Chinese childhood acute lymphoblastic leukemia by flow cytometry analysis[J].International journal of laboratory hematology,2016.

[4]Swerdlow(2008).WHOclassificationoftumoursofhaematopoietic and lymphoid tissues,World Health Organization.

[5]Wang,W.L.Gao,et al.The a pplication of CD73 in minimal residual disease monitoring using flow cytometry in B-cell acute lymphoblastic leukemia[J].Leukemia&lymphoma,2015,1-8.

流式细胞术及应用 篇5

造血系统的细胞发生于骨髓中的一群具有自我更新能力的细胞,即造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)[1]。造血干细胞移植是恶性血液疾病的一种重要治疗手段,在科学研究中常利用动物模型模拟人体的生理条件来考察造血干细胞移植效果,流式细胞术在临床和科研监测移植效果中都发挥着重要的作用。目前关于检测小鼠骨髓造血干细胞表型的方法有LSK、SLAM、SP等。Osawa等利用CD34-/lowckit+Sca-1+Lin-组合检测小鼠HSC是比较常用的方法。SLAM家族的某些分子,其配体CD150和CD48也是分离小鼠HSC的标志。CD48-CD150+是高度富集的造血干细胞/祖细胞的标志[2,3,4,5,6]。Goodell等定义具有外排染料Hoechst33342的细胞为侧群细胞(SP细胞),用来筛选小鼠HSC[7,8,9]。

应用流式细胞术检测小鼠骨髓造血干细胞,其结果不仅受样品固有性质、样品的处理方法和荧光染色的影响,还受流式操作软件的影响。在实际工作中,美国BD公司的BD Aria和BD Influx分别是应用最多和最高端的流式细胞仪,其相应的进行流式分析和分选操作的专业软件分别为FACSDiva和FACSSortware,但是目前对上述2款软件使用操作方法的比较尚无报道。该研究旨在对不同流式操作软件的使用方法进行比较,并对应用不同软件检测小鼠骨髓造血干细胞的分析结果进行比较,希望能对流式操作软件的使用有一定借鉴意义。

1材料与方法

1.1材料

BD Aria III流式细胞仪,BD Influx流式细胞仪, Accudrop Beads(美国Becton Dickinson公司),Rainbow Beads(美国Becton Dickinson公司),APC -Cy7标记的抗小鼠Lineage抗体,APC标记的抗小鼠ckit抗体,FITC标记的抗小鼠CD34抗体,PE-Cy7标记的抗小鼠Sca-1抗体,Per CP标记的抗小鼠CD150抗体,PE标记的抗小鼠CD41抗体,1×PBS鞘液,磷酸缓冲液。

1.2方法

1.2.1样品制备

将Rainbow Beads和Accudrop Beads用无菌鞘液稀释备用,取小鼠骨髓细胞,使用流式抗体染色, 避光30 min后,用2 m L磷酸缓冲液洗涤细胞,离心后重悬于PBS溶液,溶液中细胞浓度控制在107个/m L以下,2 h内上机进行流式分析。

1.2.2样品检测

开启BD Aria III流式细胞仪,用Rainbow Beads检测仪器各通道,应用FACSDiva检测软件。在前向角散射光/侧向角散射光(FSC/SSC)散点图中显示细胞群,利用DAPI染料除去死细胞,调节荧光电压等参数,记录总细胞数不少于200 000个。开启BD Influx流式细胞仪,用Rainbow Beads调节光路,检测仪器各通道,应用FACSSortware检测软件。相同方法调节参数,记录总细胞数不少于200 000个。

1.2.3小鼠骨髓造血干细胞流式分析

分别应用FACSDiva和FACSSortware检测软件,对小鼠骨髓造血干细胞进行流式分析,圈选表型为Lin-CD34-c-kit+sca-1+CD150+CD41-的小鼠骨髓造血干细胞,分析细胞群比例。

2结果

2.1 FACSDiva和FACSSortware软件总观

FACSDiva软件总观主要由数据获取、参数调节、 流式图显示、补偿调节、液流显示、流式分选、数据保存等几个模块组成。FACSSortware软件总观主要由数据获取、参数调节、流式图显示、补偿调节、流式分选、数据保存等几个模块组成。2款软件都可以完成多激光、多色的流式分析和高速流式分选,二者在总观方面有如下区别:

(1)FACSDiva软件可全屏显示于2台计算机显示器,操作较为方便,显示空间较大,各模块显示可不重叠;FACSSortware软件只能显示于单台计算机显示器,显示空间较小,各模块显示可能会有重叠, 但节省成本和空间。

(2)FACSDiva软件中有流式细胞仪液流情况界面,显示为“70 micron”2个模块;FACSSort-ware软件中没有这2个模块,而是将它们分别单独显示于计算机显示器上方的Drop显示屏和Stream显示屏。

2.2 FACSDiva和FACSSortware数据获取模块

FACSDiva和FACSSortware软件数据获取模块包括数据获取、记录、刷新、记录时间和细胞个数的 “Acquire”“、Record”“、Restart/Reset”“、Elapsed Time”、 “Rate”选项,二者主要区别如下:

(1)FACSDiva软件数据获取模块包含设置收集数据的“Stopping Gate”和“Storage Gate”;而FACSSortware将这2个选项设置在数据保存模块中。

(2)FACSDiva软件数据获取模块包含上样和调节流速的“Load”和“Flow Rate”选项;FACSSortware中没有上述2个选项,上样和调节流速的按键和旋钮被设置在机器上,这种设置适合于FACSSortware的单屏幕显示方式,将软件的部分功能安排在机器中,节约软件显示所需的空间。

2.3 FACSDiva和FACSSortware参数调节模块

FACSDiva和FACSSortware软件参数调节模块都包括各激光流式通道显示、电压调节、线性/对数方式选择等选项,二者差别如下:

(1)FACSDiva可以在软件中删除不需要的参数;FACSSortware不能删除。

(2)FACSSortware可以在参数调节模块中为各个通道添加标注,以表示这一荧光素连接的抗体;而FACSDiva需要在另外的“Experiment Layout”界面下实现这一功能。

2.4 FACSDiva和FACSSortware补偿调节模块

FACSDiva和FACSSortware软件补偿调节模块都包括补偿调节的基本功能,二者差别如下:

(1)作为分析软件,FACSDiva只需勾选“Enable Compensation”即可时刻观察调节补偿后的流式图形变化,而FACSSortware有时则需要在每次调节补偿后手动点击“Visualize”才能观察到流式图形的变化, 这是FACSSortware软件的一个小的不便之处。

(2)不同样本的补偿显示方面,FACSDiva只需在数据获取模块选择“Next Tube”,补偿数据会自动显示,而FACSSortware则需依次改变每个流式图显示的样本数据,并在补偿调节模块中的“Data Source” 选择相应的样本,才能显示不同样本的补偿。

2.5 FACSDiva和FACSSortware圈门显示方式

2款软件都可逐级圈门,并在等级图中显示。二者的区别在于:使用FACSDiva软件圈选子门时需在流式图中点击右键“Show Populations”选择显示上一级门,再在上一级门的基础上圈选子门;使用FACSSortware软件圈选子门时需要首先点击图标,使流式图显示上一级门,再用鼠标左键单击上一级门图标,才可以实现圈选子门。若未用鼠标左键单击上一级门图标,则圈选出的子门在等级图中显示为上一级门的平行门。从圈门的角度分析,FACSDiva软件更为便捷。

2.6 FACSDiva和FACSSortware数据保存模块

2款软件都可以实现流式数据的按要求保存。 二者的区别在于:FACSDiva软件需要在获取数据后手动将数据存储到目的文件夹中;FACSSortware软件可将数据的获取和存储同时进行,节省了操作时间。FACSSortware软件中“FCS File”选项下显示的即为存储路径和文件名,用户可以自行选择。

2.7 FACSDiva和FACSSortware流式管分选模块

FACSDiva和FACSSortware软件流式管分选模块都可实现高速二路分选和四路分选,并可在软件中选择分选模式,单细胞分选都可选择“Single Cell”模式。同时,软件可以设置连续分选和固定细胞个数分选,并能进行Accudrop调节等[10]。二者的区别在于:

(1)FACSSortware软件能够自动避免各路分选细胞的重叠所造成的逻辑错误; FACSDiva软件需要操作者自行判断分选设置的门是否存在逻辑错误。

(2)FACSSortware软件通过设置每路分选都有控制开始和停止的选项,可以实现在多路同时分选过程中停止单一路的分选;FACSDiva软件只能统一开始和停止分选。

2.8 FACSDiva和FACSSortware 96孔板分选模块

2款软件都可以实现96孔板分选等微孔板分选和单细胞分选。二者的区别在于:

(1)FACSDiva软件在单击 “Sort”开始分选时,微孔板会自动移动到设置好的分选位置; FACSSort软件需要先单击“Sort Ready”,将微孔板移动到设定的位置。

(2)FACSSort需要用鼠标将微孔板中需要分选的区域选中, 使阴影覆盖这一区域,才可以顺利分选,否则阴影未覆盖的区域不能进行分选;FACSDiva软件无需这项操作,一经开始即可连续分选。

2.9 FACSDiva和FACSSortware微孔板位置设置模块

2款软件都可以进行微孔板位置调节,通过上下左右箭头设置微孔板位置,并单击“Set Home”确定位置。二者的区别在于:FACSSortware软件可以通过数字设定微孔板横纵坐标的位置,这种设置更为精细;FACSDiva软件只能通过大格或小格的移动调节微孔板位置,无数字化设置。

2.10应用FACSDiva和FACS Sortware软件分析小鼠骨髓造血干细胞流式结果

图1(a)和图1(b)分别为FACSDiva和FACSSortware软件分析小鼠骨髓造血干细胞流式结果。P6门内为小鼠骨髓造血干细胞,其表型为Lin-CD34-c-kit+sca-1+CD150+CD41-。FACSDiva和FACSSortware软件分析小鼠骨 髓造血干 细胞群比 例分别为17.3% 和17.9%,分析结果具有较高的一致性。

3讨论

近年来,流式细胞仪在血液学,特别是血液病诊断方面有着较为广泛的应用[11,12],流式软件的功能也更加强大,在分析细胞周期、细胞凋亡等方面发挥着重要的作用[13,14]。2003年,BD推出了第一台FACSAria分析分选型流式细胞仪。后经多次更新换代, 目前主要使用的为BD FACSAriaⅢ。BD FACSDiva软件是BD LSR系列、BD Canto系列、BD Aria系列流式细胞仪通用的流式操作软件,能有效地支配仪器、获取及分析数据、完成质控等。它可以将一个实验方案由一个平台移动到另一个平台,给仪器的使用者和维护者提供了一个高效、便捷的工具,保证了数据的可靠性。BD Influx是当今最高端的、可与Beckman Moflo XDP相媲美的流式细胞分析分选仪。 BD FACSSortware软件提供对流式细胞仪的全面控制,从仪器设置到实验获取的补偿调节、分析和分选, 为操作者提供全方位的帮助。由于FACSSortware软件为单个显示器显示,所以部分功能被设置在机器上,如上样、调节流速、显示液流状态等。从使用角度分析,FACSDiva在参数设置、补偿调节和圈门方面更加方便,FACSSortware软件在数据存储、自动纠正分选中的逻辑错误、开始和停止单一路分选、数字化调节微孔板位置等方面有更多的优势。

实验中发现,FACSDiva软件和FACSSortware软件在使用过程中会出现与机器失去连接或死机的现象,影响软件的正常使用。此外,使用FACSSortware软件存在分选时有时不能显示分选所得细胞数、使用96孔板分选时微孔板不能正确移动等问题,这些都有待进一步改进。同时,FACSDiva软件和FACSSortware软件都应增加上样保护功能,即当样本接近吸空时自动停止上样,避免管路内进入气泡或液流断开,影响后续使用。只有不断改进软件的设置和功能,提高软件对使用者的友好度,软件才能为更多使用者所接受和掌握,更好地发挥其应有的作用。

综上所述,该文分析和比较了两款常用的流式细胞仪操作软件和小鼠骨髓造血干细胞流式结果,为流式操作软件的使用提供了借鉴。流式操作软件是使用流式细胞仪不可或缺的工具,可以预见,在不久的将来,在FACSDiva和FACSSortware软件的帮助下, BD Aria系列和BD Influx分析分选型流式细胞仪在临床和科研领域的应用范围会更加广阔、更为深入, 不断为人类认识疾病、治疗疾病提供帮助和动力。

摘要：目的 :探讨流式细胞术中不同分析软件在小鼠造血干细胞分析中的特点和差异。方法 :使用小鼠骨髓细胞悬液作为实验材料,在BD Aria III和BD Influx流式细胞仪上检测小鼠造血干细胞,分别应用FACSDiva、FACSSortware软件对检测数据进行分析,并比较分析结果。结果:FACSDiva和FACSSortware软件在参数调节、补偿调节、圈门、数据保存和分选设置方面存在细微差异,均可以实现多色流式分析和高速流式分选。结论:FACSDiva和FACSSortware软件分析同一样本所得结果有较高的一致性,均是使用流式细胞仪不可或缺的工具。

流式细胞术及应用 篇6

1 流式细胞仪的基本原理

流式细胞仪的基本结构包括5部分: ①流动室及液流驱动系统; ②激光光源及光束形成系统; ③光学系统; ④信号检测、存储、显示、分析系统; ⑤细胞分类纯化系统。流式细胞仪检测时需将待测细胞制成单细胞悬液, 以保证细胞逐个地通过受检, 然后用稳定地流动, 依次经过喷嘴, 恒定通过激光束的焦斑区, 被功率恒定的激光束激发而产生散射光和激发荧光。散射光包括前向角散射光 ( FSC) 和侧向角散射光 ( SSC) 。FSC反映了被测细胞的大小, 细胞直径越大, FSC信号越强。SSC提供了细胞表面状况、胞内精细结构和胞质颗粒性质的信息, SSC信号越强, 细胞内颗粒越多。散射光和荧光是FCM中区分不同细胞类型的依据。根据FSC、SSC两个参数, 可将细胞初步分群。又因不同类型的细胞结合的荧光染料的质和量不同, 其激发荧光波长也不同, 故经荧光染料处理后, 可在物理参量相似的细胞群中再进一步区分细胞亚群 (亚型) 。在此基础上还可以根据有关参数把所需细胞亚群从整个样品中分选出来。流式细胞仪还可以对分析中的目的细胞进行分选提取, 它是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷嘴上安装有超高频的压电晶体, 可以产生高频振荡, 使液流断裂为均匀的液滴, 待测细胞就包含在液滴之中。将这些液滴充上正或负电荷, 当带电液滴通过电场, 在电场的作用下发生偏转, 然后落入相应的收集器之中, 从而实现细胞分选。流式细胞仪的分选速度从以往的5 000个/s提高到现在的25 000个/s。

2 流式细胞仪在精液细胞分离中的应用

在畜牧业生产中, 有选择地繁殖出具有预知性别的畜禽后代, 将能使产肉、产奶、产毛等与性别相关生产性能的经济效益在畜群后代中获得大大提高, 加快畜牧业生产的发展。传统的精子分离方法不但准确率低, 而且分离速度太慢, 不能满足现代畜牧业上大规模优良畜种的推广和改良的需要。而流式细胞仪在分离精子中的应用, 解决了这个问题。在哺乳动物中, 决定动物性别的关键是其所携带不同的性染色体。正常双倍体黄牛总共有60条染色体, 其中公牛为58条常染色体, 1条X染色体, 1条Y染色体;而母牛为58条常染色体, 2条X染色体。当经过减数分裂形成单倍体的配子后, X精子携带X染色体, 它与卵子受精后产生雌性后代;Y精子携带Y染色体, 它与卵子受精后产生雄性后代。在哺乳动物 (家畜) 中, 通常X精子的DNA含量比Y精子多3.0%~4.5%。Hoechst33342是一种相对安全的活细胞荧光染料, 分子式为C27H28N6O·3HC1, 分子质量为561.9 u。它能穿透活细胞的脂质膜, 以非嵌入 (Non-intercalate) 方式特异地结合到DNA双链小沟的腺嘌呤和胸腺嘧啶密集区域, 即主要通过氢键、范德华力和电场相互作用力与DNA结合。精子上的Hoechst33342在激光的照射下能定量地激发出荧光。该染料的特殊性在于不仅能渗透进入活精子膜, 而且在适当浓度时对精子活力、受精后的胚胎和动物后代的发育都没有造成显著影响。分离精子时Hoechst33342的染色方法:通常先将精子稀释到1.5个亿/mL, 加入Hoechst33342至40 μg/mL, 在35 ℃水浴中染色60 min。染色后精子通过流式细胞仪时, 在细微的进样管液流中排成单列, 高速射出喷嘴后逐个与激光交截。精子上的荧光染料Hoechst33342被氢离子紫外激光 (约350 nm) 激发, 产生蓝色激发光 (约460 nm) 。由于X精子所含有DNA比Y精子多, 结合上比较多的Hoechst33342, 所激发出的荧光就比Y精子强。流式细胞仪根据荧光强度的差别分辨出哪个是X精子, 哪个是Y精子。同时, 由于喷嘴产生高频率震动, 高速喷射出的液流形成了包含单个X精子或者Y精子的微小液滴。当液滴被充上正电荷或者负电荷后在电场力的引导下分别落入不同的收集容器中, X精子就得以分离。覃能斌、袁野、王洪章等利用流式细胞仪分离荷斯坦奶牛精子的效果特别好, X精子分离准确率在90%以上。X、Y精子之间的DNA含量差异是流式细胞检索仪进行X、Y精子分离的理论基础。许多研究表明, 哺乳动物的X染色体比Y染色体大, 所含的DNA也比Y多:人的X精子染色体DNA含量大约比Y精子的多2.8%~3.0%, 牛、猪、马、羊、犬、兔X精子染色体DNA含量分别比相应的Y精子多3.8%、3.6%、4.1%、4.2%、3.9%、3.0%。分离精子的基本流程为:经过处理的精子与荧光染料 (Hoechst33342) 在一定条件下共同孵育染色, 让这种活细胞染料与精子DNA的AT富含区域结合。X、Y精子在DNA含量上的差异使其结合的荧光染料量也有差异, 当他们被激光照射时, 所释放出的荧光信号强弱也有差异 (X精子较强) 。此信号通过仪器、计算机系统扩增和识别。当含有精子的液体离开激光系统时, 变成含精子的微液滴并被冲上正 (X精子) 或负 (Y精子) 电荷, 并借助于偏斜板 (电场) 把X或Y精子分别引导到2个收集管中, 分辨不清的精子被抛弃。准确分辨X和Y精子的关键在于正确定位、染色等。检索主要依靠头部染料结合后荧光信号的强弱来判断。哺乳动物精子头部多为短桨行, 激光从不同角度照射所激发的荧光强度差异很大 (桨的扁平面向着检测器时荧光低, 边缘向着检测器时高) , 很容易掩盖X、Y精子DNA差异带来的微弱的荧光强度差异。当精液通过检索系统时, 定位正确的精子被准确分离, 不正确的分辨不清而丢弃。通过改进喷嘴 (喷嘴内部的锥型构造使定位更好, 可对精子产生液压直到精子排到激光前) 、改进电场等系统设计, 结合系统压力的调整, 可提高单精子液滴的产生率、精子分离率和分离精子的产量。研究认为, 在精子定位理想, 50 Psi压力下每秒可形成80 000个液滴, 每秒可分离性别活精子各10 000个 (每小时3.6×107个) , 较初期的仪器效率提高极大, 要再突破则需要从分离程序上做大的变动, 短时间内难以办到;压力太高、速度太快会影响分离后精子的活力 (很少使用40 Psi以上压力) 。目前, 流式细胞检索仪精子性别分离速度一般可达到每小时1.5×107个, 分离精子的产量能够满足牛的人工授精需要, 对猪等 (每次需要10亿以上输精量) 动物则需要相关技术配合。不同动物精子的染色液、染色时间等都有差异, 而且常在荧光染色后, 用食物染料屏蔽细胞膜有损伤精子 (死、弱者) 的荧光, 以便分离过程中除去。研究表明, 精子DNA含量差异大的物种更好分离, 如牛精子比人、猪的好分离。使用流式细胞检索仪分离精子时, 在处理、分离及以后的保存、使用阶段, 精子细胞都可能受到许多因素的损害:高度稀释、核染色、机械压力 (通过检索仪时) 、激光、离心、冷冻等, 采用合适的染色液、鞘液、收集液、保存液和保存方式等都有益。如公猪用Test-蛋黄、公牛用XYTalp加蛋黄等稀释剂预置于收集管底部 (常加入2%~20%蛋黄, 某些品种加入10%精浆) 可减轻损害, 有利于提高分离后精子的活力和膜的完整性。在采精到分离这段时间, 环境温度下保存纯精液优于用稀释液稀释等。各种动物精子分离及处理、保存等要求差异很大。到目前为止, 尚未发现流式细胞检索仪分离精子对DNA等有明显影响: Catt等未见高浓度H33342和紫外线对DNA的内源性缺口有影响; Seidel等认为染色与未染色精子在通过检索仪后在运动性和DNA完整性方面无差异, 使流式细胞检索仪进行精子性别分离后产下的后代没有明显的表型或基因型变化; Johnson研究表明, 猪、牛、兔的精子分离后代可以正常繁殖下一代。但一些试验报道, 使用性别分离精子比非分离者授精后怀孕率低, 其原因还不很清楚。

3 展望

流式细胞术及应用 篇7

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

FACS Calibur型流式细胞仪(美国Becton-DickinSon公司)。清洁级SD24h新生乳鼠。RPMI1640液体培养基和胎牛血清,购于Hyclone公司;Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(购于美国BD公司);二甲基亚砜(DMSO购于美国GIBCO公司)溶液10μL/mL储备液;西洋参茎叶总皂苷(解放军总医院病理生理室王琛博士惠赠)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

无菌操作取出大鼠心脏,立即在无菌D-Hanks液中洗去残血,分离出附着组织,剪成约1 mm3大小碎块,经反复D-Hanks液洗涤、0.15%胰蛋白酶消化,差速贴壁法,制备成心肌细胞悬液,最后用15%胎牛血清的DMEM培养液稀释成细胞密度为3×105/mL,接种于25 mL培养瓶中,放入37℃、5%CO2孵育箱内进行原代培养。

1.2.2 心肌细胞缺氧/复氧模型

按Li等[6]将心肌细胞置于缺氧仓内,通入95%N2-5%CO2混合气,缺氧4h小时后放回CO2孵箱37℃,常规培养12h后检测。

1.2.3 心肌细胞分组及诱导凋亡

将培养细胞心肌细胞分为正常组、缺氧/复氧损伤组、缺氧/复氧加西洋参茎叶总皂甘诱导的乳鼠心肌细胞组(西洋参茎叶总皂甘剂量:40 mg/L,80mg/L,160mg/L)用培养液将细胞稀释为106/mL,混匀后放入37℃,5%CO2的孵箱继续培养24h后分别检测。

1.2.4 流式细胞检测

采用FACS Calibur型分析流式细胞仪,用CELL Quest获取和分析数据。488nm激发光源,先将对照管上样,通过调整参数FAS和SSC,在散色光点图(FSC/SSC)中清楚显示出一个清晰、集中的细胞群体。在获取细胞前,根据FAS/SSC的特点,设定阈值,避免碎片和噪声干扰,确定电压及放大器数值后,再以门中细胞进行设门(gate),使门中细胞占95%以上,收集10000个门内细胞。以门中细胞进行后续荧光信号检测,将对照组细胞的荧光强度设定为非特异性本底荧光,并在此基础上确定阳性荧光表达率。调定流式细胞仪,FL1荧光通道检测Annexin V的荧光强度,FL2荧光通道检测PI的荧光强度。分别将设定阴性对照管使荧光散点图中细胞集中在左下(LL)象限,保持FL1、FL2电压不变。上样调整仪器荧光补偿值,进行校正后,即可分析样本,每个样本均获取10000个细胞,数据以List Mode的形式储存,采用CellQest功能软件进行分析。

2 实验结果

2.1 流式细胞仪检测不同剂量西洋参茎叶总皂甘诱导内质网应激心肌细胞凋亡

将培养乳鼠细胞上流式细胞仪检测。从Annexine V-FITC/PI荧光双参数点图观察到(见图1)对照组细胞主要分布在左下象限,为非凋亡细胞活细胞,右下象限为少量凋亡细胞。损伤组右下象限出现大量凋亡细胞及死亡细胞。增加随着西洋参茎叶总皂甘剂量增加,死亡细胞显著减少,凋亡细胞相对减少(见图1)。

2.2 西洋参茎叶总皂甘诱导内质网应激心肌细胞凋亡变化

正常对照组细胞生长状态良好,细胞凋亡率3.34±0.78%,损伤组缺氧/复氧损伤组细胞凋亡率38.53±6.15%。根据剂量40mg/L,80mg/L,160mg/L的西洋参茎叶总皂甘诱导细胞凋亡分别是19.65±4.77%,15.32±3.24%,12.64±2.23%(见图2)。结果表明:随着剂量增加大剂量西洋参茎叶总皂甘可明显降低凋亡,与以往文献报道一致[7](p<0.01)。

3 讨论

细胞凋亡又称细胞程序性死亡(PCD)是指细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自身的程序,自己结束生命的过程,它是一个主动的、高度有序的基因调控过程[8]。随着对细胞凋亡的深入研究,除两条经典死亡受体活化和线粒体损伤介导的传导通路细胞凋亡,近来研究发现过度内质网应激可启动一条新的细胞凋亡信号传导通路[9],内质网功能紊乱将导致细胞Ca2+失衡以及错误折叠和未折叠蛋白在内质网腔内聚集,从而导致内质网应激[10,11,12]。内质网应激可特异性激活Caspase-12.Caspase-3等下游效应蛋白酶,它不同于前两条经典途径,短期的内质网应激有保护细胞作用,但长期的内质网应激将激活一些凋亡信号分子如Chop、JNK、Caspases,可引起细胞凋亡[13]。因此有关细胞凋亡的检测方法也得到广泛发展,流式细胞仪自20世纪70年代后开始应用,细胞凋亡检测从细胞核到细胞膜,从单一色到多色,根据细胞光散射性质结合特异性荧光,细胞发生凋亡时出现特异性变化。在许多细胞凋亡早期会出现胞质内Ca2+浓度迅速持续升高[14]。Annexin V是一种分子量为35-36KD的Ca+依赖性磷脂结合蛋白,在细胞凋亡早期细胞膜磷脂酸丝氨酸外翻细胞膜外表面[15]可与标志的Annexin V-FITC结合[16],利用这一特性可以检测细胞凋亡[17]。但此时细胞膜是完整的而检测核DNA的PI不能进入细胞核。应用流式细胞仪将细胞分为4个亚群区分正常组细胞、早期凋亡细胞和晚期凋亡及死亡细胞比率。本研究采用Raynal P等[18]建立双标记的流式细胞术结合Annexin-FITC/PI荧光染色进行西洋参茎叶总皂甘通过抑制过度内质网应急减轻大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤结果与报道一致[19]。高剂量西洋参茎叶总皂甘降低在缺氧/复氧后心肌细胞凋亡率,应用流式细胞仪检测西洋参茎叶总皂甘通过抑制过度内质网应急降低细胞凋亡具有快速、准确、信息量大的特点。为深入发展研究细胞凋亡机制,提供更加直观、敏锐的方法。

摘要：利用流式细胞仪观察西洋参茎叶总皂甘通诱导大鼠心肌细胞后内质网应急引起细胞凋亡。选用原代培养心肌细胞,将心肌细胞分为正常细胞对照组,缺氧/复氧组和缺氧/复氧后加入西洋参茎叶总皂苷组。按照40mg/L,80mg/L,160mg/L浓度培养24h后,应用流式细胞仪采用Annexin-V/PI诱导凋亡。结果显示应用流式细胞仪检测最终浓度为160mg/L西洋参茎叶总皂苷凋亡率明显低于缺氧/复氧组。流式细胞仪检测由内质网应急诱导细胞凋亡对研究细胞凋亡的机理提供一种快速、准确检测方法。