流式细胞分析（通用10篇）
流式细胞分析 篇1
0 引言
在日常维修医疗仪器电源时, 美国贝克曼公司的cytomics TM FC 500全自动流式细胞分析仪、美国BD Biosciences公司FACSCanto II流式细胞分析仪器里面的激光电源大多采用美国JDS Uniphase公司的激光电源驱动器。无论哪种电子设备, 只要采用了开关电源供电, 开关电源的故障率均最高, 约占整机故障率的50%[1]。然而, 我们在实践中探索了一个通过绘制电源的电路图来维修开关电源的方法, 这种方法既提高了仪器的维修成功率, 也使开关电源的维修变得快捷而容易。在制作电路图的同时还发现不同品牌机器的激光电源内部的设计其实大同小异, 因此, 对激光电源的故障维修也具有共性可以参考。以美国贝克曼公司的cytomics TM FC 500全自动流式细胞分析仪中的激光电源为例, 激光电源内部主要含有功率因数控制器、电流控制器、三角波与正弦波发生器及与机器相连的接口电路。在对该激光电源进行维修时发现, 故障经常发生在整机集成块供电电源部分、激光电源功率因数控制器部分及激光恒流控制器部分。下面对这几部分常见的故障分别进行分析。
1 电路分析与维修方法
1.1 波形合成器和集成块供电电源的维修
图1是波形合成器和集成块供电电源的主要部分, 它既是整机激光电源集成块的供电电源, 也是电压波形合成器的功率输出。它是通过接插件与电源主板相连的, 因此可以从电源主板上卸下进行检查和维修。图1是一个他激型的半桥驱动器, 他激型半桥式开关电源电路中的PWM电路包括PWM发生器、PWM驱动器、PWM控制器等电路[2]。U1A (IR21531) 就是这个他激型半桥式开关电源的PWM控制芯片。Q3和Q4是功率输出VMOS管, 这样的电路共有2个 (另1个图中没有画出) 。这部分电路经常会损坏, 元件损坏后的现象是F1熔断丝熔断, 但主板的主熔断丝一般不断。这时必有Q3或Q4功率场效应管损坏。维修时可将Q3和Q4同时换掉。整机集成块供电电源 (13.8 V) 是通过U2稳压块来提供的。U2 (MC33269) 是一个可调节的串联型稳压模块, 类似于LM317, 输出电压为改变R12或R13的值, 可以改变该稳压电源的数值, PCB板子上标注为12 V。根据R12和R13的实际阻值计算得到是13.8 V, 正常工作时测得的电压也是13.8 V。对此电路工作是否正常进行判别时, 只要在U2的输入端对地外加17 V的直流电压, 检查在外加17 V输入电压时, 输出电压是否为13.8 V。如果13.8 V输出电压正常, 则MC33269模块完好。D9 (SA24A) 是一个瞬态电压抑制保护TVS管, 当该路13.8 V电压故障时, 这个TVS管也常常击穿损坏, 维修可用相应24 V的TVS管替换。另一路波形合成器 (没在电路中画出) 的输入由2块ICL8038和另1块PWM控制器 (IR21531) 及2个功率场效应管组成, 2块ICL8038分别组成正弦波和三角波发生器。检查2块ICL8038有否损坏, 可用示波器检查这2块集成块在外加+12 V电压时是否有正弦波或三角波输出, 这2块集成块一般不常损坏, 所以也没在图1中画出。但与ICL8038相连的另1块IR21531和另2个功率场效应管, 类似于图1的U1A和Q3、Q4也容易损坏, 当这2个功率场效应管损坏时, 故障现象也是局部熔断丝F1熔断。维修时同样可将另一个IR21531芯片和2个功率场效应管一并换掉。此时, 这块波形合成器和集成块供电电源板就基本修复。检查这块电源板的最终好坏可在图1的+385 V处串联1个100 W的钨丝灯泡外加+300 V的直流电压 (注意是在这块电源板和主板分离的情况下) , 正常情况下灯泡灯丝微红, output+200 V处应该测到的电压, 同时在U2的输出端能测到13.8 V的直流电压。
1.2 功率因数控制器部分的维修
电源的功率因数控制器芯片采用ML4800, 是一款平均电流控制型PFC控制器。ML4800由平均电流控制的Boost型PFC前级和1个PWM后级组成, PWM级可以用作电流型或电压型控制的变换器[3]。平均电流PFC控制环路通常包括电压和电流2个环路, 通过电压环调节平均输入电流, 以保持输出电压稳定, 通过电流环控制输入电流, 使之跟踪输入电压[4]。
功率因数控制器部分在激光电源的主板上, 具体电路如图2所示 (见上页) 。
在图2中, U1 (ML4800) 兼功率因数控制器和PWM输出器双重的作用, 12脚是功率因数控制器输出, 最终控制Q9 (47N60) VMOS管, 使输入电压和输入电流接近正弦波。11脚是PWM控制输出, 主要控制激光电源的恒流输出。当U1损坏时, 功率因数调整管Q9一般会损坏 (短路) , 由于385 V直流部分短路, 主板熔断丝会熔断。维修时, 需要更换U1 (ML4800) 、Q9 (47N60) VMOS管。由电路分析可知, Q9烧毁时会累及Q8, 此时要检查Q8 (IRP802) 驱动场效应管的好坏, 该场效应管损坏时可以用其他VMOS管替代, 但Q9最好换上47N60, 因为这是一个VDS耐压达600 V以上的大电流功率场效应管, 普通管子很难替代。有时功率场效应管的前置驱动器U3或U4 (EL7242) 也会损坏, 现象为U3或U4的8脚对地电阻变小。用R×1挡指针式万用表红表笔接地, 黑表笔接U3或U4的8脚, 若阻值小于100Ω, 要考虑U3或U4损坏, 维修时可将相应的U3或U4集成块换掉。
1.3 激光电流控制器功率部分损坏的维修
激光恒流部分是通过控制图2的A2改变U1 (ML4800) 的PWM输出实现的。U2 (IR2117) 是功率驱动器;Q3、Q4是一对互补型的晶体三极管, 作功率场效应管的驱动;Q5 (RIFP460) 是输出VMOS管, Q5的漏-源极回路即为激光电流的输出回路。恒流的负反馈是通过串在回路中的LTS25-NP电流互感器对图2中的U1进行综合控制而实现的。若电源主板熔断丝熔断、Q5烧毁, 但Q9完好, 则功率因数控制器部分没有损坏, 是激光电流输出器件损坏, 这时除了更换Q5 (IRFP460) 功率场效应管以外, 还要检查D2 (HFA15TB60) 、Q3或Q4这对互补晶体管三极管, 如果这对晶体管没损坏, 则U2 (IR2117) 基本是好的, 否则需要同时更换U2。功率场效应管的检测和代换可参考有关书籍[5]。
1.4 接口电路分析
接口电路是位于电源面板背面的另一块接插件 (图中没有画出) , 它的电源来自图1中B1的另一个次级绕组, 经整流、7815和7915 2个三端电压稳压块稳压 (图中没有画出) 给相应的接口元器件供电, 维修时须在7815和7915稳压块的输入端加上±20 V的电压, 检查有否有±15 V的输出, 如果有, 说明7815和7915稳压块是好的;否则, 需要更换稳压块。另外, 图2中A2与接口电路部分是通过光耦相连的, 因此, 接口电路部分不容易损坏。
2 讨论
各种有源的医疗仪器大量采用新型的开关电源, 为了减少开关电源的噪声、提高开关电源的效率, 往往加1个功率因素控制器。开关电源可以做稳压 (恒压) 输出, 也可以做恒流输出, 平常看得比较多的是稳压电路, 而激光电源需要稳流控制。本文对开关电源的功率因数控制器及开关电源恒流控制的维修经验做了一些探讨。维修任何开关电源, 我们的经验是最好把其电路图画出来, 这步骤看起来似乎有些难度, 但熟能生巧。有了电源的电路图, 就可以对各种故障进行准确的分析和判别, 从而能大大提高仪器的维修成功率。
参考文献
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流式细胞分析 篇2
摘 要：随着现代激光技术、电子检测技术和电子计算机技术等的迅速发展，流式细胞仪(FCM)在免疫学、生物学、遗传学、血液学、临床检验等领域中得到了更加广泛的应用。在免疫学研究领域，FCM以快速、灵活及定量等特点被广泛地应用于基础研究和临床治疗的各个方面，尤其是与单克隆抗体技术的结合，使其在免疫分型、分选、免疫监测、免疫细胞的系统发生及特性研究等方面发挥了重要的作用，成为现代免疫学研究不可缺少的工具。该文对近年来流式细胞仪在免疫学研究中的应用进展进行了综述。
关键词：流式细胞仪；免疫学；检测
流式细胞仪(flow cytometry，FCM)是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术、细胞荧光化学技术以及单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器[1]。FCM 可对细胞大小、细胞表面抗原的表达等进行快速、灵活、定量、多参数的检测，而且，可同时用于检测细胞内的核酸定量、DNA倍体、细胞周期分析，细胞因子和黏附分子等[2]。具有分析速度快、精确度高、重复性好和费用低廉等优点。流式细胞仪介绍
1.1 流式细胞仪的工作原理
流式细胞仪主要由流动室和液流系统，激光源和光学系统，光电管和检测系统，计算机分析系统和细胞分选系统5部分组成，其中，流动室是仪器的核心部件。
将待测标本制备成单细胞悬液，经特异性荧光染料染色后，由气压装置送入流动室，以一定的流速经过喷嘴进入激光聚焦区，流速的选择与检测的目的有关，此时，在激光束的照射下，被荧光染色的细胞产生散射光和激发荧光，其散射光信号和荧光信号经光学系统收集，由检测系统转换成为电信号，再通过模/数转换器，转换为可被计算机识别的数字信号，各种信号经计算机采集后，用相应的应用软件进行分析处理，最后，以直方图或三维图的形式显示出来。选择不同的单克隆抗体及荧光染料，可同时测定一个细胞上的多种不同的特征参数，从而可以对细胞进行分类[3]。1.2 流式细胞仪机型介绍
近年，流式细胞仪的主要生产厂家有美国的BD(BectonDickinson)公司、贝克曼库耳(Beckman Coulter)公司和德国的Partec公司。国内使用的流式细胞仪主要由前两家生产。它们生产出一系列科研型和临床型的流式细胞仪，并研制生产了流式细胞仪所用的各种单克隆抗体和荧光试剂。
流式细胞仪可分为两大类，一类为临床分析型(又称小型机、台式机)，其特点为仪器光路调节系统固定，自动化程度高，易学易掌握，适合在临床实验室中应用。如BD公司的FACSCalibur，BeckmanCoulter公司的EPICSXL，Partec公司的Pas，Cytomation公司的MOFLO，Aber公司的Microcyte，Ortho公司Cytoron等。
另一类为科研分选型(又称综合型)，特点为功能齐全，分析灵活，可快速将所感兴趣的细胞分选出来，同时可选配多种波长类型的激光器，适用于广泛的科学研究之用。如BD公司的FACSVantage，Beckman Coulter公司的EPICS ALTRA，Partec公司的PasIII及Cytomation公司的MOFLOMLS等。
随着计算机技术、电子制造技术、激光技术及荧光素合成技术的发展，流式细胞仪的制造工艺、功能、精确度等有了质的飞跃。流式细胞仪已开始向模块化发展，即它的光学系统、检测器单元和电子系统都可以按照试验要求随意更换[4]。各流式细胞仪生产厂商继续推出新产品以满足用户的不同需要。如BD公司的FACSAria(高速细胞分选仪)、分选增强型FACSVantage SETM(多色分析和高速分选流式细胞仪)、LSR II(数字化分析型流式细胞仪)，FACSCanto(双激光六色分析流式细胞仪)。BeckmanCoulter公司近年又推出了Cytomics ™FC 500系列，如FC 500MCL/MPL 采用单激光或双激光激发方式，可进行五色分析。Partec公司的顶级科研型十三色荧光流式细胞仪CYFLOW ML，临床科研型六色荧光流式细胞仪DYFLOW SL。Amnis公司的Image Stream100(激光流动成像细胞仪)，将流式多色检测技术和荧光显微图像显示技术结合在一个平台上，不仅可以通过荧光信号的强度，还可以通过细胞荧光图像对细胞内外信号定位，从而对细胞亚群进行定性和定量分析。流式细胞仪在免疫学中的应用近年来，随着生物医学等相关学科的发展和免疫学研究的深入，流式细胞仪在分子免疫学、免疫生物学和免疫遗传学，免疫血液学、免疫药理学、移植免疫学、肿瘤免疫学、抗感染免疫学、临床免疫学等免疫学领域的基础学科，以及淋巴细胞及其亚群分析、淋巴细胞免疫分型、细胞因子检测等临床研究中，也有了越来越广泛的应用。
2.1 淋巴细胞及其亚群分析
FCM在临床淋巴细胞及其亚群分析中得到广泛应用，可同时检测出一种或几种淋巴细胞细胞表面抗原，将不同的淋巴细胞亚群区分开，并计算出它们相互间的比例。通过淋巴细胞及其亚群数量的检测，可了解在不同情况下机体的免疫功能状态，辅助临床疾病的诊断，探索疾病的发病机理、病程、预后，指导临床治疗方案[5]。
由于FCM可以进行高灵敏度、高速度和多参数分析，使FCM对血液淋巴细胞亚群的检测较其他方法更精确，故其被认为是血液淋巴细胞亚群分析的标准方法[6]。
2.1.1 检测项目 在临床上，淋巴细胞及其亚群分析项目包括：B/NK/CD4/CD8/CD4：CD8；绝对计数(TruCount)；活化淋巴细胞的检测(CD69/HLADR/CD71/B27)；CD4＋ Th/i和CD8＋Ts/c的进一步区分；Naive/Memory T细胞亚群的检测；Th1/Th2亚群的检测。
用流式细胞仪诊断某种疾病时，经常需要检测多个项目，如当人类感染免疫缺陷病病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)后，HIV主要选择地侵入人类具有重要免疫功能的T淋巴细胞亚群中的辅助性T细胞，即Th细胞(CD4＋)，使具有重要免疫功能的T细胞群被破坏，继而累及全身免疫器官，使机体免疫功能下降。检测的免疫指标表现为：T淋巴细胞总数减少(正常值的65%～81%)；T细胞亚群比值倒置，即Th/Ts<1.0(正常1.3∶12～2.1∶1)；Th细胞(CD4＋)绝对计数<200个/μL(正常值400～1 500细胞/μL)，CD8＋ T细胞在感染早期增多，后期则下降；Ts细胞增高，NK细胞减少或活力下降，B淋巴细胞群则在正常范围；CD4＋/CD8＋ 明显低于健康成人(P<0.01)。
2.1.2 检测技术的发展 随着新的荧光色素分子的不断发现，荧光标记技术的进步和流式细胞仪的多激光激发技术的进展，多色荧光分析得到迅速发展，三色、四色甚至五色或六色荧光分析对细胞亚群的识别、细胞功能评价等更为精确。近年，淋巴细胞及其亚群的分析已经发展到三色荧光以上分析，且借用MultiSET全自动获取分析软件完成。如：通过四色荧光标记，对外周血T淋巴细胞亚群可进行快速、客观、准确检测及绝对计数分析[78]。利用流式细胞仪，采用多色荧光标记的单克隆抗体，分析黏附性T 细胞表面CD3＋ CD4＋ 或CD8＋CD19－CD16－CD45RO＋CD62＋CD27＋ CD57 抗原，从而对LFA1adhesive T 细胞快速准确地测定[9]。
总之，用流式细胞仪检测淋巴细胞及其亚群的检测技术朝着多激光、多色分析方向发展。近年来，为了使样本一次检测，得到更多结果，满足临床多色分析诊断的需要，一些厂家为临床应用专门设计了六色分析流式细胞仪。
2.2 白血病免疫分型
白血病是白细胞在分化到某个阶段受阻后呈克隆性异常增殖的结果，它的发病是多阶段的，不同病因引起的白血病的发病机制不同，在治疗和预防上也不同，所以，利用白细胞分化不同阶段出现的细胞表面标志，可以对白血病进行免疫分型，对其进行导向治疗[10]。近年，白血病的MICM(形态学、免疫学和细胞遗传学，分子生物学)分型已成为现代白血病诊断的重要指标，其中应用流式细胞仪进行免疫表型的检测在分型中发挥了越来越重要的作用，现已积累了丰富的应用经验。它具有快速、客观、准确、特异性强、重复性好等优点，对白血病进行免疫分型具有极其重要的临床诊断意义[11]。
准确的免疫分型关键是区分正常细胞与白血病细胞，传统的流式细胞仪白血病免疫分型依赖于白血病细胞的FSC/SSC特性来设定原始细胞群，然后根据门内某些阳性单抗占门内细胞的百分比来确定其抗原表达情况。很显然，这种方法是不能将原始细胞与正常细胞完全分开的。
随着免疫学和遗传学及流式细胞仪检测技术的发展，由开始的主要采用间接免疫荧光标记法到直接免疫荧光标记法，从单色或双色到利用CD45抗体标记设门法进行多色免疫标记。利用造血系统细胞CD45表达量与细胞分化程度的高度相关性，可以精确地将原始/幼稚细胞与正常成熟细胞群完全分开。使免疫分型的准确性得到很大的提高，现在，已成为诊断白血病免疫分型的重要工具[12]。国际上普遍采用三色或四色分析的方法，利用CD45SSC设门法，并结合其他技术进行免疫分型。如应用流式细胞仪，采用CD45 SSC 设门法多参数，并利用抗体积分系统诊断标准，可以准确地、完整地分析白血病免疫分型[13]。采用三色流式细胞术CD45/侧散射(SSC)双参数散点图设门，并结合FAB 形态学能对急性白血病进行准确分型[14]。应用流式细胞仪四色荧光标记技术，CD45/SSC双参数散点图设门方法，能清楚地区分各种免疫细胞，可准确、客观地进行白血病免疫分型[15]。
2.3 血小板膜表面受体检测
血小板膜上有丰富的糖蛋白受体，是血小板发挥其功能的物质基础，静止期和活化期的血小板膜糖蛋白受体的种类、含量、结构和功能显著不同。应用流式细胞仪检测血小板膜上受体，主要是对血小板特异性膜糖蛋白和活化标志物进行免疫荧光标记，结合单克隆抗体和免疫荧光技术，用不同的抗血小板单克隆抗体，可以从分子水平上诊断血小板功能和数量的异常。使用流式细胞仪测定活化血小板是目前公认的快捷而灵敏的方法之一[16]，可直接、灵敏、特异地分析血小板的活化程度和功能状态。
普遍采用的技术是以全血为标本，应用流式细胞仪进行多参数分析，即全血法流式细胞术。如采用流式细胞仪三色荧光标记技术，能准确地检测冠心病患者血小板表面糖蛋白的变化[17]。采用流式细胞仪和三色免疫荧光标记的单克隆抗体，可直接检测全血样本中血小板膜表面CD41、CD61、CD62的表达水平[18]。
与常规血小板功能测定法相比，全血法流式细胞术虽然有许多优点，如直接使用全血样本，且标本用量少；简化标本的处理，避免了样本处理不当等因素导致的血小板体外激活，并可防止血小板亚群的丢失，从而更客观、更准确地反映血小板的功能[19]。但是，全血法流式细胞术也存在不足之处，如流式细胞仪价格昂贵，为了避免血小板体外活化，血样不能久置，需在45 min内处理；只能分析循环中的血小板的数量和功能，不能反映血小板代谢和最近被清除的血小板的数量。所以，还需对该方法进行更深入的研究，并使之标准化[20]。
2.4 细胞因子的检测 细胞因子(cytokine)是由免疫细胞或非免疫细胞合成和分泌的小分子多肽，在调节机体多种细胞的生长、分化和功能，调节正常与病理状态下的免疫应答过程中起着十分重要的作用。检测细胞因子对于阐明机体免疫应答机制及相关疾病的发生、发展规律和临床治疗具有重要意义。
随着研究的进展，仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能满足需要。目前，越来越重视在单细胞水平上研究细胞因子的表达能力。应用流式细胞仪结合间接免疫荧光法，可在单细胞水平上客观、正确地检测细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群，进行多参数相关分析，是一种有效地在单细胞水平研究细胞因子的方法[21]。
近年主要采用的是胞内流式分析法。该方法是基于BD公司的快速免疫细胞因子系统(fast Immune cytokine system)。以植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)，佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)加离子霉素(ionomycin，Ion)作刺激剂，刺激全血中淋巴细胞表达细胞因子；用雷菲德菌(Brefeldin A，BFA)与莫能霉素(monensin，MN)等药物阻断细胞因子分泌至胞外，用CD3和CD8设门，应用两种免疫荧光抗体同时标记淋巴细胞膜表面特异分子和被阻滞在胞内的细胞因子，然后用流式细胞仪进行检测和分析。
该方法具有许多优点，如完善的全血激活方法，保留体内细胞及生化微环境，能更准确反映体内状况，避免了人工假象的产生。高效荧光结合抗体，确保高度灵敏及低背景染色。高质量的膜通透剂，可以保证一致的灵敏度与低背景染色，且免除了为增加通透性所需冷冻细胞过夜的步骤。同型对照，避免了使用重组细胞因子进行繁琐的竞争性封闭。
该技术虽然已成为一项可在单细胞水平上检测细胞因子的有效方法，尤其是在确定功能不同的T细胞亚群方面具有重要的作用[22]，具有其他方法难以比拟的优点。但是，也存在一定的缺陷，如现有的激活剂可导致部分至表面分子表达的下调。因此，今后还要寻找更佳的激活剂。结语
流式细胞仪检测技术与质量控制 篇3
【摘要】流式細胞术（FCM）检测HLA等位基因是最近新建立的方法，与原有的分型技术相比，技术上有很大的改进和突破。流式细胞术已广泛用于临床常规检验中，为保证检验结果的可靠性，提高准确度和室间结果的可比性，流式细胞术质量控制越来越受到重视。它在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选，同传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精密度高、准确性好等特点。
【关键词】流式细胞术；检测技术；质量控制
流式细胞仪检验技术（FCM），即流式细胞术，是以流式细胞仪作为检测手段，以免疫荧光技术作为主要标记方法的一门先进的分析技术。该方法用免疫磁珠作为载体，在同一微孔内进行反应，利用流式细胞仪检测杂交信号和区分探针的种类。本技术使用的免疫磁珠具有一定的特性，磁珠可利用颜色进行标识[1]。当免疫磁珠上两种颜色混合的比例不同时，经流式细胞仪检测后即可区分定义为不同种类的免疫磁珠，目前两种颜色的组合在流式细胞仪上最多可区分成为100种不同的免疫磁珠。
1 材料与方法
1.1 标本收集
收集近3年本院治疗的30例患者，对30例患者行流式细胞仪检测，30例受检者中，男性患者16例，女性患者14例，最大年龄60岁，最小年龄17岁，患者平均年龄39岁。
2 检测方法
2.1 采用特定的免疫磁珠作为载体，将已知序列特异性探针（SSO）固定在免疫磁珠上，每一种特异性探针固定在已知颜色比例的免疫磁珠上。由于免疫磁珠上颜色比例的不同，在流式细胞仪红色激光束下可进行区分，根据事先设计的标记情况，通过流式细胞仪检测后可确认特定颜色比例免疫磁珠上携带的特异性探针的种类，从而达到将探针区分的目的。
2.2利用标记的特异性引物对目的DNA进行扩增，将PCR扩增产物与免疫磁珠上的序列特异性探针（SSO）在同一孔内进行特异性杂交，再加入荧光显色剂，然后利用流式细胞仪绿色激光束检测杂交信号，红色激光束区分探针的种类，利用软件分析杂交结果得出样本HLA基因型别。
3 方法学评价 该方法与PCR-SSO有相似的地方，但是技术上有重大的突破。本方法灵敏度非常高，在96孔微板上可进行大规模的检测，实现了所有探针的杂交于液相条件下在同一个孔内进行，而且采用免疫磁珠作为载体，具有快速、简便、可靠的优点，平均每个孔在流式细胞仪上检测的时间不到30s。目前已有商品化的试剂供应，同时该技术也广泛应用于其他方面（如传染病指标等）的检测和研究。
4 讨论
流式细胞术常规测定由一系列繁琐的步骤组成，大体可分为样本采集和处理、免疫荧光染色、流式细胞仪检测、数据分析及结果报告解释，做好这些步骤中每一环节的工作可以确保室内质量控制（1Qc）和室间质量控制（EQA）顺利达标。
标本采集和制备，用于流式细胞分析的样本种类很多，包括外周血、骨髓穿刺液、肺泡灌洗液、胸腹水、脑脊液及组织等，每种样本都有不同的采集、保存、运输和制备要求。原则上标本应在采集后立刻进行处理和荧光染色，尤其对检测细胞活性的标本，需要在采集后1小时内染色测定。在某些特殊情况下不能及时进行标本制备和检测而需要保存时，EDTA抗凝的标本在室温下可保存12～24小时，肝素抗凝通常在室温下可保存至48～72小时，枸橼酸抗凝在室温下可保存至72小时，对于只作胞内染色的样本，根据待分析细胞的抗原特性和染色方式，可采用70%冷乙醇或1%多聚甲醛等固定细胞后保存数周。
流式细胞仪的校准通常包括液路的稳定性、光路的稳定性、多色标记荧光颜色补偿、光电倍增管转换的线性和稳定性等[2]。仪器校准品主要成分为聚苯乙烯，它被制成各种大小或同时拥有定量免疫球蛋白结合位点的荧光微球，这种制成固定荧光强度、大小和光散射性的聚苯乙烯微球，已成为流式细胞仪质控中的一种常用的标准品。
精密度及其校准微球精密度是通过对标准荧光微球检测其散射光和荧光的分布范围来描述的，通常以变异系数CV%来说明，CV%小于5可以满足大多数实验的要求。但细胞周期和倍体分析对仪器的精密度要求很高的，均质性细胞间的变异必须小于2%。灵敏度及其校准微球流式细胞仪的灵敏度可有多种表达方式，目前使用最为广泛的方式是可溶性荧光染料等价分子数（MESF）法。该方法所用试剂盒由一系列标记有MESF值的微球组成（包括未标记荧光的空白微球），表明该微球所标记荧光物质的荧光强度等同于溶液中荧光染料的分子数，根据微球检测结果的平均荧光强度进行线性回归分析，可得到流式细胞仪灵敏度的回归曲线，回归曲线与Y轴的交点即为该机的灵敏度，或叫做最低检测限度[3]。准确度及其校准流式细胞仪的准确度同精密度和灵敏度相比不很重要，但随着定量流式细胞技术的发展和荧光定量分析在实际工作中的需求越来越大，流式细胞仪准确度的评价和质控品也开始受到重视，在样品中加入内标或某些生物活细胞，如鸡或鱼的红细胞，可对仪器准确度进行有效监测。当使用两种或以上的荧光素进行分析时，激光激发下的相邻或相近荧光素发出的荧光会产生交叉重叠，从而干扰检测结果，通过调整荧光补偿，可以保证每个检测器检测到恰当的单一荧光信号，即保证了结果的可靠性。荧光补偿是流式细胞术多色分析前必须进行的仪器校准，通常采用每种荧光素或相应的标记抗体对抗原表达量适中的细胞进行单染色，来进行仪器补偿调整，也可以通过商品化荧光补偿试剂进行。当使用各种标准微球对仪器进行校正时，需要将微球测定结果绘制成质控图，Levey-Jennings质控图是目前在临床检验质量控制中使用较多的方法，根据Levey-Jennings质控图的评价要点来观察质控结果是否超过控制限以决定失控与否。室间质量评价主要是控制实验室工作的不准确度，自2000年以来，我国由卫生部临床检验中心开始组织开展临床流式细胞术室间质评工作，现已开展的项目包括T细胞亚群分析和CD34绝对计数。
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流式细胞分析 篇4
FCM不但快速、灵敏而且还可以同时对多个参数进行分析, FCM在临床微生物检测中的作用受到越来越多人的关注。FCM不但可以用来检测受染细胞内的病毒抗原, 而且还可以对受染细胞表面的病毒抗原进行检测[1]。由于FCM检测的一般只是单个细胞, 因此经过FCM检测的受染细胞只适用于支气管灌洗液、血液、尿标本以及一些经酶消化过的组织细胞, 同时由于FCM进行的是多参数分析。所以FCM体外抗生素药敏试验的主要机制是, 通过FCM检测病原体和染料结合在一起后所发出的不同强度的荧光。从而间接地反映出病原体的功能状态以及活性, 以达到帮助判断病原体对抗生素的反应性目的, 其中用于研究抗菌效应的荧光染料主要有2大类:其中用来标记DNA和RNA的染料主要包括如溴化乙锭、碘化丙啶等;其次是用来反映代谢活性或结合蛋白的探针, 其中包括异硫氰酸荧光素、膜电位敏感性染料等[2]。怎样选择这些物质, 与这种染料本身的发射特性有关, 同时抗生素的作用机制也可能关系到这些物质的选择。近年来FCM在细菌的药敏效应的研究领域已获成功, 将这些荧光染料和FCM联合运用到一起, 可以判断其细菌活力与功能状态, 这种方法由于有速度快等优势, 临床实验室的常规药敏试验中也应用到这种方法。
方法
本实验用到的细胞定量分析和分选技术, 这个技术要用的实验细胞包括MCF7、293 (T) 、U2OS等。以U2OS细胞为例, 他们通常所用的操作方法:首先对细胞进行培养以及铺板, 转染、细胞分板、上机样本制备、加药刺激、细胞收获及处理、相关试剂配制等步骤。其中在细胞培养时, 以U2OS细胞作为细胞株和材料, 在这个过程我们要注意的是一瓶细胞总数一般情况下会达到1×107个。在铺板的过程首先要对细胞进行分化, 然后才对细胞进行计数, 计数时如果发现细胞密度很大, 影响计数, 就必须对细胞进行合适倍数的稀释后才计数[3]。最后才能进行铺板。铺板的过程是:首先在6 cm培养皿按照每孔6×105个的数量加入细胞, 然后将6 cm培养皿沿水平面方向前后左右来回晃动, 使细胞能够均匀分布, 晃动时要小心以防止培养液泼出, 再将细胞放置培养箱里生长。将这些过程都完成后, 然后可以用转染色剂Lipofectamin2000进行转染操作, 其操作过程:首先在DEF-FN载体上构建目的基因质粒, 当细胞密度为达到50%~60%时, 再进行转染操作, 转染12~16 h后, 再根据细胞密度按1∶3进行分板, 使分板后细胞密度30%左右。除了以转染质粒作为阳性对照外, 我们还可以以药物处理细胞作为阳性对照。将细胞铺板24 h后, 再加药对其进行刺激, 加药培养24 h后, 然后就可以对细胞进行收获处理了。注意在这个过程中要分别对培养液进行收集, 在每个6 cm规格的板中加入1 m L胰酶进行消化。待消化完毕后, 再向内一一对应地加入已收集的培养液来中和胰酶[4]。上述过程进行完之后, 最少要放置4 h, 才能从将细胞样本从冰箱里取出进行离心操作来收集细胞。将1×PBS清洗2遍后, 再加入100μL 1×PBS将两者混匀, 加入10μL PI (终浓度100μg/m L) , 10μL Rnase (终浓度50μg/m L) , 置于37℃水浴锅, 避光处理30 min。这样才算完成上机样本制备。在处理分选细胞样本前, 要对细胞进行贴壁培养, 每个细胞样本至少需要1个10 cm规格的细胞板, 去除培养液酶消化, 在37℃条件下充分消化至细胞轻拍脱壁, 再加入5 m L培养液进行中和, 以充分分散细胞, 取100μL细胞上机, 测定转染效率, 剩余细胞计数、离心, 根据转染效率, 分选模式, 调节细胞浓度, 达到上样速率1 000~3 000个/s。
结果
经过实验分析得出结果, 将其用于病毒检测具有以下优点及可行性:可在单个细胞中同时获得多个分析参数;能定量检出受染细胞, 当用不同荧光染料标记不同的病毒抗原特异性抗体或将特异性病毒抗体与不同大小的乳胶颗粒相联时, FCM可同时检测到同一样本中的多种病毒或病毒抗原, 这种方法也可用于真菌、寄生虫、病毒以及这些病原体混合感染的检测。
讨论
随着科学技术的发展, 流式细胞技术也取得了快速的发展, 其临床应用越来越广泛, 在临床工作中发挥着重要的作用。流式细胞术已普遍应用于免疫学、细胞生物学、生物化学等临床医学和基础医学研究领域[5]。随着对FCM研究的日益深入, 其价值已经从科学研究走入了临床应用阶段, 在我国临床医学领域里已有着广泛的应用。可见流式细胞术在临床检验的应用具有很好的发展前景和可靠性。
摘要：目的:通过了解和讨论, 对流式细胞术在临床检验中的应用情况做出详细分析。方法:通过多次严谨性实验并且真实详细记录每次实验数据, 进一步分析流式细胞术在临床检验中的应用效果和可行性。结果:经过实验数据分析, 流式细胞术在检验HLA-B27抗原、淋巴细胞亚群、肿瘤标志物、白血病免疫、临床微生物等应用中有着明显的效果。结论:流式细胞术在临床检验中可以得到很好的应用。
关键词：流式细胞术,流式细胞仪,临床检验,应用
参考文献
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灯泡贯流式机组事故分析报告 篇5
HUNAN YOUYUAN ENGINEERING SUPERVISION AND CONSULTING &
SCIENCE AND TECHNOLOGY CO., LTD
监理联系单
长联字8#［2012］第001号
长洲电站8#机组事故分析报告
一、8#机组发生事故情况简要介绍
2012年4月23日上午8:30，我部监理熊玉江同志在8#机组调速器油压装置旁观察和记录油压装置油泵启动和停止时间。到9点钟时，1#油泵停泵，油罐压力为6.3Mpa，机组运行正常，此时油罐的油位为1米，调速器机械液压柜仪表显示导叶开度为80%，轮叶开度为70%。此时，我部监理谢荣兴同志从8#机组转轮室层上至11.85米层对熊说“8#机组的震动很大，运行声音不正常”。
9点10分左右，油压装置2#油泵启动，熊从油罐旁观察油泵启动情况，当走到2#油泵时，听到了3#备用泵随即也启动了，当其转头看油罐的油位计时，油罐翻板油位计急剧下降。熊马上跑到调速器控制柜前看到轮叶在往全关动作，导叶开度还停留在80%的开度。当轮叶关到0%时，导叶才开始关机。
从油压下降开始起，泡头内还有强大的压力油流声，导叶和轮叶都全关后，油压装置油泵还在不停地运转。电厂运行人员到达8#机组现场后关闭轮叶的开关腔球阀，因球阀侧压力过大关不了，运行人员又找来加长杆方才关闭。
此时，我部熊工又进入到泡头内看到受油器体下游侧仍在继续喷油，大约持续了5分钟。停止喷油后，经我部熊工检查发现操作油管和受油器体的下部有摩擦发黑的痕迹。熊又到轮毂高位油箱层，发现高位油箱室地面都是油，油雾很大，漏油箱也装满了水。
二、事故相关概念性问题的认识
1、根据在轮叶开度关闭到零位时，导叶的开度还停留在80%，这一运行状况表明，笔者认为能否这样解释，在这一瞬间事故中，传感器的钢丝绳的拉紧度、反馈信号、协联关系就被破坏了，因此轮叶提前关闭，导叶的关闭就滞后了。
双调机组轮叶与导叶的协联关系曲线有两种方式得到，一种可从模型曲线上计算出来，一种是由原制造厂家提供的协联曲线中换算得到。
一般在发电工况下，对应7个分界水头，不同轮叶开度对应有相应导叶开度表，在协联关系曲线上轮叶从0~100%，每隔5%取一个点，共21个点。逐点输入与轮叶行程相对应的导叶行程，并经过定位试验和行程传感器定位试验及一系列的动态试验，即形成了控制程序——导叶与轮叶开度协联的随动性。
2、对转动部件左右螺栓设计理念的认识
一般的设计理念倾向于左螺栓，如阿厂、东方厂都有这方面的要求，而哈厂从50年代起则倾向于右螺栓的设计理念。
左螺栓在机组启动时有松的趋势，停机时有紧的趋势，而右螺栓则反之。综合历来发生事件证明，不论何种设计理念，关键是止动措施采取的程度有很大的关系。
3、事故的隐患具有一定的连续时间量变，而事故突发则是量变积累后质变的结果，发生时间短而快速。
三、8#机组发生事故根源
8#机安装投运至今已经有4年多时间，期间经历过一次B修，但未动操作油管。因厂家设计每根中管只有一端有铜瓦，而在这次事故抢修中发现原机组安装时由于第三根中管装反，导致第二根中管连接处没有铜瓦。此安装疏忽严重违背了图纸要求，这是造成此次事故的主要原因。
经初步分析，机组在长期频繁启停和运行中，由于内管在第二节管接距6m范围内无导向支撑（图纸要求3m左右有一轴承，见图一），以致造成内管套筒连接处所点焊的四点（点焊强度不够）陆续开裂，一直到4月23日9:05分时，由于机组发生大的震动，短时间内促使内管承接处全部脱扣，造成跑油和事故停机（见图
二、图
三、图
四、图五）
在此需说明一点，如果认为第二节内管管套丝扣是在一个长时间内脱开到里程约50mm，那种情况的可能性不大。因为如果是此种情况那么势必会影响传感器反馈信号的传输，破坏轮叶与导叶开闭的协联关系。假设有此种情况存在，那么在每次开停机和机组运行中，中控室会要发现的，所以说管套慢慢脱开到约50mm的情况可能性不大。
四、事故造成设备损坏情况
一是第二节内管弯曲约30mm；二是下泄水锥与上泄水锥连接法兰脱开、上泄水锥上12个M30螺孔内丝扣被拉掉约20mm深；三是受油器与外管配合间隙处有磨损，并有发黑的痕迹；四是受油器支架弯曲变形、基础板焊缝开裂。
其他还有开腔浮动瓦磨损严重，外管与浮动瓦配合的关腔部位因干磨形成锥度，靠下游侧大1.3mm，盘车检测受油器，开腔最大摆度+0.32mm，关腔最大摆度+0.36mm。
在这次抢修拆卸中，推力轴承面向下游10点钟方位和1、2、3点方位的四块正推力瓦有掉块现象，其他推力瓦有环状划痕，镜面有多条环形轻微磨痕。
桨叶接力器缸内壁在1#、2#桨叶之间的方位有较严重的锈蚀状水垢，结垢区弧长约1100mm、高度350mm。从检查情况分析，应该是停机后该部位长时间处于下方，缸内油中含水导致出现锈蚀结垢。
另外，按照厂家图纸描述，在转轮体上找到了全关刻度线，但未能找到全开位置和中心位置刻度线，在桨叶上也没有找到相应的记号。
这次抢修中还对泡头垂直、水平支撑进行了全面检查未发现异常，这说明不是因泡头存在有摆动和下沉的现象而导致受油器的磨损及支撑变形。
1、下泄水锥脱开受力分析
当内管连接处失去密封和脱扣到最大口径的一瞬间，从桨叶开启腔来的一股高压油经内管向下游冲向泄水锥空腔内，在969t力的作用下，使下泄水锥法兰脱离。
经初步计算有如下计算数值
a、下泄水锥承压直径是取大小直径的平均数，再计算受压面积与6.3Mpa相乘得969t；
b、下泄水锥及轮毂腔内设计水压要求0.3Mpa计算，只能承受46t的力，泄水锥在运转中内外受力是复杂的，这在模型试验和设计时已考虑过了，可能数值还要偏大。
c、上泄水锥法兰连接螺栓为M36，8.8 级，36个，应力计算为586t（取中碳钢应力值σ=1600kg/cm2）
d、下泄水锥法兰螺栓为M30，8.8级，24个，计算应力为271t（取中碳钢应力值σ=1600kg/cm2）
综合上述数据看来，发生破坏常在设计应力最小处，即下泄水锥法兰连接部位。
2、内管弯曲受力分析
a、桨叶关闭时活塞操作力为955t b、最大正向水推力606t a-b=955t-606t=349t 如考虑349t的力再消耗在构件的重力，操作机构的传动和摩擦力上，据初步估算还约有50t的力，由油塞缸体带动，作用在内管的轴向移动上（因时间关系没有过细地计算）。
为此，当内管一旦伸脱到大于55mm时，机组又在事故停机时以50t的力将内管挤压在第一节外管缩口处发生弯曲缩短约30mm，使轴向运动变轨形成一种不规则的力从而引起受油器和支架的形变及间隙磨损加大。
五、事故中跑油点及跑油量的估算 基本上有五股油的跑向：
a、一股油从开启腔高压油进入内管→轮毂供油管→轮毂油箱（0.5m3容积）→地面；
b、一股油从开启腔高压油进入内管→轮毂内→泄水锥法兰开口→转轮室内； c、一股油从开启腔高压油通过浮动瓦磨损间隙→密封筒→轮毂供油管→排油管→漏油箱；
d、关闭腔高压油→浮动瓦磨损间隙→排油管→漏油箱；
e、关闭腔高压油→甩油环（52）→U密型密封（102）→受油器盖（57）→外部地板（见图6）；
根据调速系统压油槽、集油箱及轮毂油箱容积和油位下降情况以及时间上的分析估算，此次事故跑油约10t左右。
六、结束语
因笔者掌握的资料和台账记录不全，以及水平有限，在编写和分析中难免会存在有疏漏或不足之处，敬请沈总、林总和生技部给予指正。
友源监理公司长洲项目部 二○一二年六月二十四日
主送：长洲水电公司沈总、林总、生技部
流式细胞分析 篇6
1 资料与方法
1.1 资料与试剂
收集2010年1月～2011年12月本院流式细胞室进行血细胞簇分化抗原CD系列检测的初发急性白血病患者208例。男123例,女85例;年龄1.1～80.0岁,平均36.2岁。所有患者抽骨髓及外周血涂片经瑞氏染色后分类计数,按FAB分型标准[1]进行细胞形态学分型。208例患者中,急性淋巴细胞白血病(ALL)71例,男44例,女27例,年龄1.1～66岁,平均27.9岁。急性髓细胞白血病(AML)123例,男68例,女55例,年龄6～80岁,平均41.5岁;混合细胞白血病(MAL)14例,男11例,女3例,年龄6～66岁,平均33.1岁。所有荧光标记单克隆抗体(McAb)及相关其他试剂均为BD公司产品;所用荧光包括FITC(异硫氰酸荧光素)、PE(藻红蛋白荧光素)和PerCP(叶绿素蛋白);所选用胞膜单克隆抗体为CD13、CD33、CD14、CD15、CD117、CD11b、CD3、CD5、CD7、CD4、CD8、CD1a、CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、HLA-DR、CD45;胞浆抗体为CD79a、c CD3、MPO。
1.2 仪器与设备
所用仪器为美国BD公司生产的BD FACSCalibur单激光三色流式细胞仪;美国贝克曼公司的Beckman AllegraTM21R Centrifuge高速低温离心机。
1.3 试验方法
荧光标记染色方法采用直接免疫荧光标记法,所有病例于治疗前抽取抗凝骨髓或外周血(幼稚细胞比例>30%)3～5 m L送流式细胞室。所有标本染色前需计数细胞数,骨髓标本经磷酸盐缓冲液(PBS)1︰10稀释后计数,调整有核细胞数密度为1×106个/m L,室温下6 h内进行染色标记。所用主要试剂CD34、CD14、CD13、CD45、CD1a、HLA-DR终浓度为0.0250 mg/m L,CD10、CD3、CD7、CD19、MPO、CD8终浓度为0.012 5 mg/m L,CD20、CD11b终浓度为0.0500 mg/m L,CD15、c CD3终浓度为0.1000 mg/m L,CD117终浓度为0.0100 mg/m L,CD33终浓度为0.0120 mg/m L,CD79a终浓度为0.0001 mg/m L,CD4终浓度为0.0030 mg/m L,CD5终浓度为0.0050 mg/m L。1.3.1胞膜抗原染色过程标记流式专用试管,每管加入FITC、PE和PerCP标记的抗体,同时设定同型对照(IgG2a与IgG1),各管加入抗凝骨髓,避光孵育15 min,溶血素2 m L裂解红细胞10 min,离心,弃上清,PBS洗涤,每管加300μL PBS缓冲液上机检测。胞浆抗原染色过程:标记了膜抗原后的标本经固定加破膜剂作用10 min,PBS洗涤,然后加胞浆抗体,避光孵育15 min,PBS洗涤,每管加300μL PBS缓冲液上机检测。
1.3.2流式细胞仪检测与分析所有标本上机检测前以BD公司三色标准荧光微球校准仪器,检测仪器流路和光路,设置和调节仪器的各种参数于最佳状态,以Cellquest软件设置获取条件,依次上样获取数据,每管获取细胞数2万个,以CD45/SSC双参数二维散点图设门方法进行免疫表型分析,计算幼稚细胞群中白血病细胞的表面标记。结果判定时根据同型对照的设置来描述抗原表达的强弱,以强阳性、阳性、弱阳性、阴性为分析判断标准。
1.4 诊断标准
所有病例均根据临床表现、骨髓细胞形态学、细胞化学染色及免疫分型等指标而确诊。细胞形态学诊断根据FAB分型标准,MAL免疫表型的诊断参照欧洲白血病免疫分型协作组(EGIL)(1998年)积分标准[2]进行判断。对于FAB分型诊断为ALL或AML而免疫分型为ALL又同时存在髓系抗原表达或AML又同时存在淋系抗原表达而积分不符合MAL诊断标准的视为My+ALL(髓系抗原阳性的急性淋巴细胞白血病)或Ly+AML(淋系抗原阳性的急性髓细胞白血病)。
2 结果
2.1 FAB分型结果
71例ALL,FAB分型诊断15例L1,51例L2,4例L3,1例M1(结合临床、免疫分型结果及复查FAB,临床最终诊断为My+B-ALL)。123例AML,FAB分型诊断为23例M1,36例M2,24例M3,10例M4,27例M5,1例M6,1例分型待定,1例L1(结合临床、免疫分型结果等,临床最终诊断为M0)。14例混合细胞白血病,FAB分型诊断结果:1例L1,6例L2,2例M1,1例M2,1例M5,3例混合细胞白血病(见表1)。
2.2 免疫表型分型结果
71例FAB分型诊断为ALL,其免疫表型纯淋系抗原表达31例(31/71,43.66%),My+ALL为40例(40/71,56.34%),所表达的髓系抗原有CD13(32例表达)、CD33(27例表达)、CD15(3例表达)、CD117(1例表达)。123例FAB分型诊断为AML,其免疫表型纯髓系抗原表达的79例(79/123,64.23%),Ly+AML44例(44/123,35.77%),所表达的淋系抗原为CD7(30例表达)、CD19(15例表达)、CD22(6例表达)、CD3(1例表达)。见表2。
14例混合细胞白血病,1例L1其免疫表型为T/髓混合;6例L2其免疫表型结果:2例B/髓混合,1例B/髓混合伴CD7+,2例T/B混合,1例T/B混合伴髓系表达;2例M1免疫表型结果为B/髓混合;1例M2免疫表型为B/髓混合;1例M5a免疫表型为B/髓混合;3例FAB为混合细胞白血病其免疫表型为1例B/髓混合,2例B/髓混合伴CD7+(见表3)。
2.3 14例混合细胞白血病免疫分型主要抗原表达情况见表4
2.4 14例混合细胞白血病患者治疗情况
14例BAL患者,2例在诊断明确后放弃治疗自动出院,12例在确诊后接受化疗,经化疗完全缓解6例,未愈3例,3例经1～2个疗程化疗后由于病情较重及经济原因最终放弃继续治疗自动出院。
3 讨论
MAL又称杂合性白血病,是一组异质性白血病,其特征是急性白血病患者骨髓中有髓细胞系和淋巴细胞系同时出现,1998年EGIL新标准将髓系和B淋巴系或T淋巴系积分均>2分的白血病归为MAL,根据其细胞表面标记表达情况可分为3种类型:双表型、双克隆型和双系列型,其发病率为4%～8%[3]。根据EGIL积分系统,笔者分析了流式细胞室2010～2011年208例初诊急性白血病患者血细胞簇分化抗原CD系列检测结果,MAL为14例,所占比例6.7%,其中B/髓系共表达者10例(71.4%,10/14),T/B共表达者3例(21.4%,3/14),T/髓共表达者1例(7.1%,1/14),与相关文献报道一致[4],与KILLICK等[5]和MATUTES等[6]报道的B系与髓系共表达者多于T系与髓系共表达者、B/T与髓系共同表达者最少相符。由于白血病细胞分化抗原表达的异质性,白血病细胞跨系列表达逐渐被证实,笔者在临床检测中发现,随着技术的提高及分型研究的逐步深入,髓系伴淋系抗原表达及淋系伴髓系抗原表达的病例较为多见,71例FAB分型诊断为ALL,纯淋系抗原表达31例,而淋系伴髓系抗原表达(My+ALL)者40例,所占比例56.34%(40/71),表达的髓系抗原有CD13、CD33、CD15,123例FAB分型诊断为AML,纯髓系抗原表达79例,髓系伴淋系抗原表达(Ly+AML)者44例,所占比例35.77%(44/123),表达的淋系抗原有CD7、CD19、CD22、CD3。在临床检测中,对于MAL的诊断应非常谨慎,不要轻易下结论,同时免疫学分型判断MAL要与My+ALL和Ly+AML相鉴别,笔者的经验是当出现两个系列膜抗原表达时,胞浆抗原的检测尤为重要。CD79a、c CD3及MPO被认为是较特异的抗原标志[7],笔者的研究中所有病例均进行CD79a、c CD3及MPO的检测,14例MAL,CD79a、c CD3及MPO表达比例为100%、100%和81.8%。因此,当白血病细胞有髓系和淋系抗原表达而胞浆抗原阴性时,此时要依据EGIL积分系统进行判断,当积分不符合MAL诊断标准时,应依主系定型为Ly+-AML或My+-ALL。
CD34是造血干/祖细胞的相关抗原,随细胞成熟其抗原的表达逐渐减弱直至消失,是一个阶段特异而非系列特异的抗原[8]。本组14例MAL中11例表达CD34(78.6%),2例白血病细胞部分弱表达,1例不表达,与文献报道相符[9],提示MAL患者白血病细胞来源于较早期的造血干细胞,可能为保留早期分化相关抗原的多能干细胞受累引起。CD117抗原主要表达于髓细胞,大多数AML中的原始细胞均有CD117的表达,与CD13、CD33相比较,CD117在AML中的表达率不如前者高[10],但更具有髓系特异性。本组71例ALL,CD117阳性表达率仅为1.4%(1/71),而123例AML,其阳性表达率为95.9%(118/123),11例淋系和髓系混合细胞白血病中,CD117的表达率为81.8%(9/11),提示CD117是较好的一个系列标志,在白血病免疫分型中可作为排除ALL及辅助诊断AML的标志,也是白血病免疫学分型实验室必做的一个抗体。EGIL(1998)积分系统将CD117的积分分值提高到1分也说明了它的系列特异性较高。CD7抗原是T细胞发育过程中的一个特征性标志,在白血病免疫分型初期被当作T系早期的一个良好标志并用于T淋巴细胞白血病的诊断及其亚型的区分。随着研究的深入发现,CD7抗原并非T淋巴细胞的特异性标志抗原,具有多项分化潜能的造血干细胞阶段也可表达此抗原[11],是较不分化的AML的一个常见标志物,它可能与某一髓系祖细胞相关[12]。本组123例FAB分型诊断为AML,Ly+AML为44例(44/123,35.77%),表达一个或多个淋系抗原,以表达CD7抗原为最多,表达率24.39%(30/123),14例MAL中3例为B/髓混合伴CD7表达,该3例B/髓混合者虽有CD7的表达,但不能诊断为B/髓与T系共同表达者,而应解释为患者骨髓中髓系白血病细胞来源于较早期的具有多项分化潜能的造血干细胞阶段,提示该类患者白血病细胞恶性度高,是造血发育早期细胞恶性转化所致。由于例数较少,B/髓混合伴CD7表达患者的特征还有待于积累更多的病例加以研究说明。
目前MAL的治疗尚无统一方案,其疗效报道不一。笔者研究的14例MAL,经化疗完全缓解6例,其中5例免疫分型结果为MAL而FAB结果为L2(2例)、M1、M2、M5,该5例患者临床根据免疫分型结果进行兼顾淋系和髓系的诱导化疗方案后CR,由此可见免疫分型在MAL的诊断和治疗中的价值。
对于MAL、My+-ALL、Ly+-AML等,单纯依靠细胞形态学均不能对其进行准确诊断,流式细胞术免疫表型分析的开展弥补了FAB分型的不足,减少了误诊率,可对白血病细胞进行准确的分型诊断,为临床诊断、选择合理的治疗方案等提供了科学的依据。
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流式细胞术的临床应用(综述) 篇7
1 流式细胞术在免疫学中的应用
流式细胞术与单克隆抗体相结合, 对于细胞表面和细胞内抗原、癌基因蛋白及膜受体的定量检测已广泛应用于临床医学, 通过对患者淋巴细胞各亚群数量的测定来监控患者的免疫状态, 指导治疗。流式细胞术可进行淋巴细胞亚群分析, 正常人群T淋巴细胞CD4/CD8比值大约是2:1, 但在人体细胞免疫低下时可以出现比例下降或倒置, 这对于评估细胞免疫功能有重要作用, 已有报道外周血淋巴细胞免疫表型的参考值, 并对其相关影响因素进行了探讨[1]。也有大量文献介绍了淋巴细胞在各种疾病中的变化, 如在SLE患者的淋巴细胞变化可以反映该病的活动情况及器官侵犯程度, 在伴有肾损害时可出现低CD4+、高CD8+的现象。用流式细胞术PNH患者血细胞膜上的CD55、CD59, 亦比传统的溶血试验具有更高的特异性和灵敏度。此外, 流式细胞术还可以进行HLA群体分析, HLA-B27抗原的阳性率在强直性脊柱炎的患者中高达85%~95%[2]。二者有着不同程度的正相关。流式细胞术应用HLA-B27特异性单抗检测抗原, 可以排除交叉反应, 提高检测的灵敏度和准确性[3,4]。
2 流式细胞术在血液学中的应用
流式细胞术可用于检测孕妇血中的Ig G抗-D[5], 并能通过流式细胞技术区分自体和异体细胞, 排除异体细胞干扰, 准确鉴定患者输血后, 造血干细胞移植后的自体血型[6], 以协助治疗。
流式细胞术能很好地对白血病进行免疫分型, 测量细胞数量一般在1万至5万个细胞之间, 而且快速特异, 准确性好, 并能够提供正常细胞在演变成恶性肿瘤过程中细胞基因及抗原标志发生变化的信息, 而这种细微的变化是常规FAB法所不能分辨的。这种分型对于治疗方案的正确选择与预后有着重要的意义, 也提供了可靠的依据[7,8]。尤其是当形态学检查难以区别时, 免疫表型参数对于各种急性白血病的诊断和鉴别诊断有着决定性的作用, 比形态学检查的准确性提高10%~20%[9]。微小残留病灶常常是白血病复发的主要根源, 而流式细胞术以其特有的高分辨力与敏感性可在患者缓解期检测到是否有残留病变细胞, 及早发现以决定进一步的治疗策略和选择造血干细胞移植及骨髓移植的时机。
流式细胞术可以定量测定网织红细胞中的RNA, 得到网织红细胞占成熟红细胞的成熟度, 对于判断红细胞的繁殖力很有意义。
3 流式细胞术在血小板疾病诊断中的应用
利用流式细胞术检测血小板标志物, 在许多血小板相关疾病的诊断上有重要临床价值。用流式细胞术通过对外周血网织血小板的测定, 有助于血小板减少症的病因学诊断和治疗效果的评价[10,11]。同时还可用于血小板膜糖蛋白异常所致疾病的诊断, 包括先天性或获得性血小板疾病, 尤其是不典型病例。血小板微粒 (PMPS) 是监测血小板活化、预测和诊断血栓性疾病的一个重要指标, 评价活化血小板程度在血栓性疾病和血栓前状态发生发展中的作用, 有利于血栓性疾病的诊断和治疗[12]。采用流式细胞术内参定位法可以准确而快速的定量分析PMPS, 监测血栓性疾病的发生[13]。
4 流式细胞术在肿瘤学中的应用
流式细胞术在肿瘤学中的应用主要是对肿瘤细胞DNA进行测定, 解析细胞周期, 通过肿瘤细胞异倍体测定, 鉴别良性与恶性肿瘤, 评估预后并能在化疗中对药物的选择、放疗中射线强度、时间的决定起主要作用。不仅如此, 它还可根据化疗过程中肿瘤DNA分布直方图的变化评估疗效, 了解细胞动力学的变化, 直接地看到肿瘤细胞的杀伤变化, 以便有针对性地选择药物达到最大杀伤效果。流式细胞术可以精确定量DNA含量, 能对癌前病变的性质和发展趋势做出判断, 有助于癌变的早期诊断。
5 流式细胞术在器官移植中的作用
流式细胞术在器官移植中占有重要地位, 它可以用来鉴别和定型同种异体反应抗体, 如果受者血清中存在针对供者的循环抗体, 就会同供者的淋巴细胞结合, 再加入荧光素的二抗来显示这种结合, 就可在移植手术前发现高风险的受体, 以判定供者和受者之间是否合适。移植后免疫表型的监测可敏感地预测移植后免疫排斥反应, 为临床治疗提供有效依据。
6 流式细胞术在临床细菌学中的应用
流式细胞术广泛用于细菌、病原体、毒素、血清抗体及药敏试验。在免疫荧光方法中的流式微球分析 (Cytometric Bead Array, CBA) 是流式细胞术的一个新应用, 他将近似于细胞大小的微珠作为捕获载体, 使其携带已知荧光抗原或抗体, 来捕获检测物中的相关抗体或抗原。由于遮蔽效应可以使荧光微球的发散光减弱, 应用不同大小的荧光微球, 可同时检测同一标本的多种抗原或抗体。这种方法需用标本量少, 可用于单细胞分子水平的多参数检验, 也可用于真菌、寄生虫、病毒或混合感染的检测。
7 流式细胞术在细胞凋亡检测中的应用
应用流式细胞术多参数分析, 可以分析细胞周期, 评估细胞凋亡的状态。细胞凋亡的早期, 一些与膜通透性改变及凋亡有关的蛋白在细胞膜表面有特定的表达, 通过流式细胞术结合单克隆抗体可以检测表达这些蛋白的细胞, 从而确定凋亡的情况。
流式细胞分析 篇8
巨噬细胞(Macrophage)能吞噬感染异物并诱导T细胞活化,启动免疫应答[1],在机体损伤修复、抵抗病原入侵[2]等方面起重要作用,是机体先天免疫的重要部分[3]。巨噬细胞属于无颗粒白细胞的一种,是由单核细胞(Monocyte)分化而来的。单核细胞来源于骨髓,成熟后释放进入血液并随外周血循环进入组织,分化成为巨噬细胞发挥相应的功能[4]。研究者可以对人外周血进行分离,获取单核细胞后进行体外分化,分化得到的巨噬细胞可用于进行各种功能研究。
目前常用的获取人外周血单核细胞的方法是密度梯度离心法。基于Ficoll-Hypaque的单次密度梯度离心可以将红细胞,粒细胞,血小板以及单个核细胞逐层分开。其中,外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)主要包括淋巴细胞和单核细胞,进一步对PBMC离心清洗并用贴壁方法去除悬浮细胞后,可得到单核细胞[5]。但该方法对于液层吸取操作要求较高,获得的单核细胞中会存在较多淋巴细胞,粒细胞以及血小板的污染。通常的解决方法是用抗体标记结合免疫磁珠对PBMC中的单核细胞进行纯化富集。然而不论基于抗体阴选还是阳选的方法,都不可避免对单核细胞产生一定程度的免疫刺激或者机械损伤;分选操作过程较长,在实验过程中要对细胞进行反复洗涤离心等操作,也会造成目的细胞的遗失,对于少量的临床样品难以操作。另外也可以选择基于Percoll分层液的连续密度梯度离心分离法,可以直接将单核细胞与淋巴细胞、红细胞、粒细胞分层,但是操作繁琐,耗时较长,对试剂的消耗量也比较大。因此,寻找一种简便、快捷而又高效的单核细胞分离方式对于单核-巨噬细胞相关研究的开展至关重要。
单核细胞是体积最大的白细胞,其内容物的颗粒形状与淋巴细胞以及粒细胞等具有显著的差别。本文中尝试对外周血白细胞直接进行流式细胞分选,根据细胞组分的分群特征,直接获得其中的单核细胞,并通过单核细胞表面标志物CD14染色进行验证,该方法对于单核细胞的分选效率能达到85%以上,可以简单快捷的获得纯度较高的单核细胞用于实验。
1 材料与方法
1.1 实验材料和试剂
人外周血白细胞成分血来自军事医学科学院附属医院输血科。红细胞裂解液(10×,#420301)购自Biolegend公司。人CD14抗体(130—091—242)购自Miltenyi Biotec公司。流式细胞分离管购自BD公司。人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子GM-SCF购自R&D公司。RPMI1640 培养液(C11875),进口胎牛血清,购于 Invitrogen 公司。
1.2 红细胞裂解
人外周血白细胞成分血中仍含有大量红细胞,在流式分选前需要进行红细胞裂解处理。将白细胞成分血与稀释为1×的红细胞裂解液按照1∶10的比例混合,避光室温裂解15 min,300 g 离心10 min,PBS洗涤一次。细胞计数,将细胞用流式缓冲液重悬(1×107细胞用500 μL缓冲液重悬)。
流式缓冲液:高压灭菌的PBS,pH值为7.2,加入0.5%的牛血清白蛋白以及 2 mol EDTA。
1.3 流式抗体标记
取1×106细胞,即50 μL上述细胞悬液,加入1 μL CD14-PE抗体,避光冰上标记10 min,向离心管中加入1 mL流式缓冲液终止染色,迅速离心去除上清后将细胞重新用100 μL 流式缓冲液悬起,通过细胞滤网后进行流式细胞分析。其余经红细胞裂解处理的细胞按照细胞计数结果直接用流式缓冲液重悬,通过细胞滤网后放置于冰上,准备进行流式分选。
1.4 流式细胞仪分选
本室购置的流式细胞仪为BD FACS AriaTMII 。根据外周血各个成分细胞的分群,确定单核细胞在流式细胞仪中的大小以及颗粒度等特征,限定分选条件,获取单核细胞。同时对CD14-PE抗体标记的细胞进行流式分析,确定单核细胞分群中CD14阳性的细胞所占比率。
1.5 单核细胞体外培养分化
上述分选得到的单核细胞经300 g离心后用含有10%进口胎牛血清以及双抗的RPMI—1640培养基重悬,种于细胞培养皿中,加入10 ng/mL GM-CSF 共培养(5~7)d,镜下观察分选得到的单核细胞体外分化的巨噬细胞形态。
2 实验结果
2.1人外周血流流式细胞检测分群以及CD14抗体预染分析
外周血白细胞成分血经过红细胞裂解处理并进行CD14抗体预染,流式细胞仪分析,结果见图1,左图为样品直接流式分群结果,其中左上角为粒细胞群,中间圈定细胞群(P1)为单核细胞,占白细胞总数的8%左右;居中偏下的为淋巴细胞群。右图为CD14抗体阳性细胞(P2),该阳性细胞群占左图中单核细胞分群(P1)的85%~90%左右。结果证明,根据目的细胞群的大小以及颗粒度的差异通过流式细胞分群方式可以分离并获取单核细胞。
2.2流式细胞仪直接分选得到的单核细胞CD14抗体标记分析
将其余的外周血白细胞成分血根据细胞分群直接选择单核细胞群进行分选。将分选得到的单核细胞进行CD14抗体标记后,再次进行流式分析。结果如图2,左图为分选后细胞经流式细胞仪直接分析,R1即分选得到单核细胞;右图显示该群单核细胞分选后CD14抗体标记的结果, CD14阳性的细胞占分选获得所有细胞的比例为85%左右。如在后期实验中进一步优化条件,预期可以获得纯度更高的单核细胞。
2.3流式细胞仪分选得到的单核细胞体外培养分化
上述流式分选得到的单核细胞经过体外分化培养7 d,镜下观察细胞形态与文献报道一致[6]。证明基于流式细胞分选得到的人外周血单核细胞分化正常,可以用于对巨噬细胞进一步的功能研究。
3 讨论
单核巨噬细胞的相关研究是当前免疫学研究的热点,2011年底,免疫学国际顶级期刊《Nature.Reviews Immunology》对近年来单核巨噬细胞的的相关研究进行专刊评述,对巨噬细胞的极化过程[7],巨噬细胞与感染和免疫[8]、巨噬细胞与机体保护和致病[9]以及巨噬细胞与重要疾病[10]的关系等列为免疫学的前沿领域的热点问题进行了全面的总结和述评。
传统方法对于单核细胞的分离过程需要反复离心清洗,会造成大量细胞在操作过程中的遗失,而且操作时需要对抗凝血作适当稀释,在血量较多时要分成数管进行离心,对于分离试剂的需求较大。如需获取纯度较高的单核细胞进行实验操作,则需要进一步利用抗体以及磁珠等技术方法加以纯化,增加了实验成本,而且获得的单核细胞容易被激活而给实验结果带来影响。
基于流式细胞仪的功能,根据细胞的大小以及颗粒度等特征,对白细胞直接进行分选获取人外周血中的单核细胞的方法,避免了多次重复离心,节省了梯度离心的试剂。经重复验证,本方法能够分选得到纯度在80%~90%之间的单核细胞用于实验。该方法可以用于在少量临床血液样本中获取高纯度的单核细胞,为深入研究单核-巨噬细胞与疾病之间关系提供了良好的技术平台。
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流式细胞分析 篇9
1 性染色体DNA质量差异
哺乳动物每一个体的X精子和Y精子, 其DNA含量都是恒定的, 通常X染色体较Y染色体大, X精子的DNA含量较Y精子多3.0%~4.5%, 例如牛X精子的DNA含量较Y精子多3.8%。利用哺乳动物精子携带X染色体和Y染色体的DNA含量存在差异这一特性, 为流式细胞仪进行X、Y精子的分离奠定了理论基础。
2 荧光染料Hoechst33342与精子细胞定量结合特性
在精子分离的前期处理时应用的染色剂Hoechst33342是一种相对安全的只对活细胞中DNA染色的荧光染料, 它能穿透活细胞的脂质膜, 以非嵌入方式特异性与DNA结合。其特性在于渗透入精子细胞后, 对精子细胞的活力、受精的胚胎及后代个体发育不会造成显著影响。
3 精子细胞分选的技术及原理
取定量活力在70%以上, 精子密度为 (9~14) ×108个/m L原精液, 用Hepes缓冲液稀释至2×108个/m L, 加入定量的Hoechst33342荧光染料, 经34℃的水浴处理后, 置于分离仪上样仓。当经荧光染色标记的精子细胞被高压压入细微进样管经流动室时被具有导电特性的鞘液包裹, 形成单个细胞的微小液滴, 并被排成单列, 液滴以一定速度从流动室70μm喷嘴喷出, 并逐个与激光束交截。被染色的精子细胞被激发出蓝色激发光, 由于X精子DNA含量较Y精子多, 比Y精子结合更多的荧光染料, 因此经激光束激发释放出强弱不同的荧光信号, 信号经流式细胞仪自带的计算机系统扩增放大并且定位分析后做出判断, 分辨出X精子、Y精子或是模糊难以分辨精子, 同时在计算机上设定程序, 根据分辨结果给每个包裹单个X精子或Y精子的液滴附予正电荷或负电荷。在微小液滴通过流动室中部的超高频压电晶体偏转板时, 充电振动, 在高压电场的作用下偏转, 分路落入各自的收集容器中, 没有充电的模糊精子液滴落入中间的废液容器, 从而实现细胞的分离。目前, 先进的流式细胞仪分选速度理论上可达20 000个细胞/s以上, 其分选纯度能达到90%以上, 一次分离的最大合理量约为108个细胞。如果分选的精液样本量大时, 为避免细胞活性降低, 可采取分段式收集。
4 流式细胞仪分选过程中对精子产生损伤的几个因素
在分离精子的过程中, 对精液的高度稀释、荧光染色、分离过程中的激光照射、高压力机械损伤以及分离后的离心作用等诸多操作都不同程度地影响精子的生理机能;尤其对精子细胞最外层的细胞膜造成损伤, 直接影响精子活力, 顶体完整率、线粒体活性和获能状况, 并使得分选的精子存活时间和受精能力下降。
5 性控冻精用于奶牛生产前景展望
流式细胞分析 篇10
造血系统的细胞发生于骨髓中的一群具有自我更新能力的细胞,即造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)[1]。造血干细胞移植是恶性血液疾病的一种重要治疗手段,在科学研究中常利用动物模型模拟人体的生理条件来考察造血干细胞移植效果,流式细胞术在临床和科研监测移植效果中都发挥着重要的作用。目前关于检测小鼠骨髓造血干细胞表型的方法有LSK、SLAM、SP等。Osawa等利用CD34-/lowckit+Sca-1+Lin-组合检测小鼠HSC是比较常用的方法。SLAM家族的某些分子,其配体CD150和CD48也是分离小鼠HSC的标志。CD48-CD150+是高度富集的造血干细胞/祖细胞的标志[2,3,4,5,6]。Goodell等定义具有外排染料Hoechst33342的细胞为侧群细胞(SP细胞),用来筛选小鼠HSC[7,8,9]。
应用流式细胞术检测小鼠骨髓造血干细胞,其结果不仅受样品固有性质、样品的处理方法和荧光染色的影响,还受流式操作软件的影响。在实际工作中,美国BD公司的BD Aria和BD Influx分别是应用最多和最高端的流式细胞仪,其相应的进行流式分析和分选操作的专业软件分别为FACSDiva和FACSSortware,但是目前对上述2款软件使用操作方法的比较尚无报道。该研究旨在对不同流式操作软件的使用方法进行比较,并对应用不同软件检测小鼠骨髓造血干细胞的分析结果进行比较,希望能对流式操作软件的使用有一定借鉴意义。
1材料与方法
1.1材料
BD Aria III流式细胞仪,BD Influx流式细胞仪, Accudrop Beads(美国Becton Dickinson公司),Rainbow Beads(美国Becton Dickinson公司),APC -Cy7标记的抗小鼠Lineage抗体,APC标记的抗小鼠ckit抗体,FITC标记的抗小鼠CD34抗体,PE-Cy7标记的抗小鼠Sca-1抗体,Per CP标记的抗小鼠CD150抗体,PE标记的抗小鼠CD41抗体,1×PBS鞘液,磷酸缓冲液。
1.2方法
1.2.1样品制备
将Rainbow Beads和Accudrop Beads用无菌鞘液稀释备用,取小鼠骨髓细胞,使用流式抗体染色, 避光30 min后,用2 m L磷酸缓冲液洗涤细胞,离心后重悬于PBS溶液,溶液中细胞浓度控制在107个/m L以下,2 h内上机进行流式分析。
1.2.2样品检测
开启BD Aria III流式细胞仪,用Rainbow Beads检测仪器各通道,应用FACSDiva检测软件。在前向角散射光/侧向角散射光(FSC/SSC)散点图中显示细胞群,利用DAPI染料除去死细胞,调节荧光电压等参数,记录总细胞数不少于200 000个。开启BD Influx流式细胞仪,用Rainbow Beads调节光路,检测仪器各通道,应用FACSSortware检测软件。相同方法调节参数,记录总细胞数不少于200 000个。
1.2.3小鼠骨髓造血干细胞流式分析
分别应用FACSDiva和FACSSortware检测软件,对小鼠骨髓造血干细胞进行流式分析,圈选表型为Lin-CD34-c-kit+sca-1+CD150+CD41-的小鼠骨髓造血干细胞,分析细胞群比例。
2结果
2.1 FACSDiva和FACSSortware软件总观
FACSDiva软件总观主要由数据获取、参数调节、 流式图显示、补偿调节、液流显示、流式分选、数据保存等几个模块组成。FACSSortware软件总观主要由数据获取、参数调节、流式图显示、补偿调节、流式分选、数据保存等几个模块组成。2款软件都可以完成多激光、多色的流式分析和高速流式分选,二者在总观方面有如下区别:
(1)FACSDiva软件可全屏显示于2台计算机显示器,操作较为方便,显示空间较大,各模块显示可不重叠;FACSSortware软件只能显示于单台计算机显示器,显示空间较小,各模块显示可能会有重叠, 但节省成本和空间。
(2)FACSDiva软件中有流式细胞仪液流情况界面,显示为“70 micron”2个模块;FACSSort-ware软件中没有这2个模块,而是将它们分别单独显示于计算机显示器上方的Drop显示屏和Stream显示屏。
2.2 FACSDiva和FACSSortware数据获取模块
FACSDiva和FACSSortware软件数据获取模块包括数据获取、记录、刷新、记录时间和细胞个数的 “Acquire”“、Record”“、Restart/Reset”“、Elapsed Time”、 “Rate”选项,二者主要区别如下:
(1)FACSDiva软件数据获取模块包含设置收集数据的“Stopping Gate”和“Storage Gate”;而FACSSortware将这2个选项设置在数据保存模块中。
(2)FACSDiva软件数据获取模块包含上样和调节流速的“Load”和“Flow Rate”选项;FACSSortware中没有上述2个选项,上样和调节流速的按键和旋钮被设置在机器上,这种设置适合于FACSSortware的单屏幕显示方式,将软件的部分功能安排在机器中,节约软件显示所需的空间。
2.3 FACSDiva和FACSSortware参数调节模块
FACSDiva和FACSSortware软件参数调节模块都包括各激光流式通道显示、电压调节、线性/对数方式选择等选项,二者差别如下:
(1)FACSDiva可以在软件中删除不需要的参数;FACSSortware不能删除。
(2)FACSSortware可以在参数调节模块中为各个通道添加标注,以表示这一荧光素连接的抗体;而FACSDiva需要在另外的“Experiment Layout”界面下实现这一功能。
2.4 FACSDiva和FACSSortware补偿调节模块
FACSDiva和FACSSortware软件补偿调节模块都包括补偿调节的基本功能,二者差别如下:
(1)作为分析软件,FACSDiva只需勾选“Enable Compensation”即可时刻观察调节补偿后的流式图形变化,而FACSSortware有时则需要在每次调节补偿后手动点击“Visualize”才能观察到流式图形的变化, 这是FACSSortware软件的一个小的不便之处。
(2)不同样本的补偿显示方面,FACSDiva只需在数据获取模块选择“Next Tube”,补偿数据会自动显示,而FACSSortware则需依次改变每个流式图显示的样本数据,并在补偿调节模块中的“Data Source” 选择相应的样本,才能显示不同样本的补偿。
2.5 FACSDiva和FACSSortware圈门显示方式
2款软件都可逐级圈门,并在等级图中显示。二者的区别在于:使用FACSDiva软件圈选子门时需在流式图中点击右键“Show Populations”选择显示上一级门,再在上一级门的基础上圈选子门;使用FACSSortware软件圈选子门时需要首先点击图标,使流式图显示上一级门,再用鼠标左键单击上一级门图标,才可以实现圈选子门。若未用鼠标左键单击上一级门图标,则圈选出的子门在等级图中显示为上一级门的平行门。从圈门的角度分析,FACSDiva软件更为便捷。
2.6 FACSDiva和FACSSortware数据保存模块
2款软件都可以实现流式数据的按要求保存。 二者的区别在于:FACSDiva软件需要在获取数据后手动将数据存储到目的文件夹中;FACSSortware软件可将数据的获取和存储同时进行,节省了操作时间。FACSSortware软件中“FCS File”选项下显示的即为存储路径和文件名,用户可以自行选择。
2.7 FACSDiva和FACSSortware流式管分选模块
FACSDiva和FACSSortware软件流式管分选模块都可实现高速二路分选和四路分选,并可在软件中选择分选模式,单细胞分选都可选择“Single Cell”模式。同时,软件可以设置连续分选和固定细胞个数分选,并能进行Accudrop调节等[10]。二者的区别在于:
(1)FACSSortware软件能够自动避免各路分选细胞的重叠所造成的逻辑错误; FACSDiva软件需要操作者自行判断分选设置的门是否存在逻辑错误。
(2)FACSSortware软件通过设置每路分选都有控制开始和停止的选项,可以实现在多路同时分选过程中停止单一路的分选;FACSDiva软件只能统一开始和停止分选。
2.8 FACSDiva和FACSSortware 96孔板分选模块
2款软件都可以实现96孔板分选等微孔板分选和单细胞分选。二者的区别在于:
(1)FACSDiva软件在单击 “Sort”开始分选时,微孔板会自动移动到设置好的分选位置; FACSSort软件需要先单击“Sort Ready”,将微孔板移动到设定的位置。
(2)FACSSort需要用鼠标将微孔板中需要分选的区域选中, 使阴影覆盖这一区域,才可以顺利分选,否则阴影未覆盖的区域不能进行分选;FACSDiva软件无需这项操作,一经开始即可连续分选。
2.9 FACSDiva和FACSSortware微孔板位置设置模块
2款软件都可以进行微孔板位置调节,通过上下左右箭头设置微孔板位置,并单击“Set Home”确定位置。二者的区别在于:FACSSortware软件可以通过数字设定微孔板横纵坐标的位置,这种设置更为精细;FACSDiva软件只能通过大格或小格的移动调节微孔板位置,无数字化设置。
2.10应用FACSDiva和FACS Sortware软件分析小鼠骨髓造血干细胞流式结果
图1(a)和图1(b)分别为FACSDiva和FACSSortware软件分析小鼠骨髓造血干细胞流式结果。P6门内为小鼠骨髓造血干细胞,其表型为Lin-CD34-c-kit+sca-1+CD150+CD41-。FACSDiva和FACSSortware软件分析小鼠骨 髓造血干 细胞群比 例分别为17.3% 和17.9%,分析结果具有较高的一致性。
3讨论
近年来,流式细胞仪在血液学,特别是血液病诊断方面有着较为广泛的应用[11,12],流式软件的功能也更加强大,在分析细胞周期、细胞凋亡等方面发挥着重要的作用[13,14]。2003年,BD推出了第一台FACSAria分析分选型流式细胞仪。后经多次更新换代, 目前主要使用的为BD FACSAriaⅢ。BD FACSDiva软件是BD LSR系列、BD Canto系列、BD Aria系列流式细胞仪通用的流式操作软件,能有效地支配仪器、获取及分析数据、完成质控等。它可以将一个实验方案由一个平台移动到另一个平台,给仪器的使用者和维护者提供了一个高效、便捷的工具,保证了数据的可靠性。BD Influx是当今最高端的、可与Beckman Moflo XDP相媲美的流式细胞分析分选仪。 BD FACSSortware软件提供对流式细胞仪的全面控制,从仪器设置到实验获取的补偿调节、分析和分选, 为操作者提供全方位的帮助。由于FACSSortware软件为单个显示器显示,所以部分功能被设置在机器上,如上样、调节流速、显示液流状态等。从使用角度分析,FACSDiva在参数设置、补偿调节和圈门方面更加方便,FACSSortware软件在数据存储、自动纠正分选中的逻辑错误、开始和停止单一路分选、数字化调节微孔板位置等方面有更多的优势。
实验中发现,FACSDiva软件和FACSSortware软件在使用过程中会出现与机器失去连接或死机的现象,影响软件的正常使用。此外,使用FACSSortware软件存在分选时有时不能显示分选所得细胞数、使用96孔板分选时微孔板不能正确移动等问题,这些都有待进一步改进。同时,FACSDiva软件和FACSSortware软件都应增加上样保护功能,即当样本接近吸空时自动停止上样,避免管路内进入气泡或液流断开,影响后续使用。只有不断改进软件的设置和功能,提高软件对使用者的友好度,软件才能为更多使用者所接受和掌握,更好地发挥其应有的作用。
综上所述,该文分析和比较了两款常用的流式细胞仪操作软件和小鼠骨髓造血干细胞流式结果,为流式操作软件的使用提供了借鉴。流式操作软件是使用流式细胞仪不可或缺的工具,可以预见,在不久的将来,在FACSDiva和FACSSortware软件的帮助下, BD Aria系列和BD Influx分析分选型流式细胞仪在临床和科研领域的应用范围会更加广阔、更为深入, 不断为人类认识疾病、治疗疾病提供帮助和动力。
摘要：目的 :探讨流式细胞术中不同分析软件在小鼠造血干细胞分析中的特点和差异。方法 :使用小鼠骨髓细胞悬液作为实验材料,在BD Aria III和BD Influx流式细胞仪上检测小鼠造血干细胞,分别应用FACSDiva、FACSSortware软件对检测数据进行分析,并比较分析结果。结果:FACSDiva和FACSSortware软件在参数调节、补偿调节、圈门、数据保存和分选设置方面存在细微差异,均可以实现多色流式分析和高速流式分选。结论:FACSDiva和FACSSortware软件分析同一样本所得结果有较高的一致性,均是使用流式细胞仪不可或缺的工具。