细胞DNA定量分析

细胞DNA定量分析（共12篇）

细胞DNA定量分析 篇1

摘要：目的:探讨宫颈细胞DNA定量分析结合液基细胞学诊断方法进行宫颈癌筛查的临床意义。方法:对2009年10月～2010年4月参加我院宫颈癌筛查的5 886例妇女, 进行液基细胞学检查和细胞DNA定量分析诊断, 在细胞学诊断≥低度鳞状上皮内病变或细胞DNA分析有≥3个异倍体细胞, 建议做宫颈病理组织学活检, 以病理诊断结果为标准。结果:液基细胞学诊断阳性285例, 阳性率为4.84% (285/5 886) ;细胞DNA异倍体检出阳性486例, 检出率为8.25% (486/5 886) ;细胞DNA定量分析结合液基细胞学诊断检出阳性525例, 总阳性率为8.92% (525/5 886) 。525例患者需做宫颈组织活检, 活检结果:阳性375例, 阳性率为71.4% (375/525) 。结论:细胞DNA定量分析结合液基细胞学诊断方法, 能明显提高宫颈癌筛查阳性检出率。

关键词：细胞DNA定量分析,液基细胞,宫颈癌筛查

宫颈癌发病率占女性生殖道恶性肿瘤的首位, 近年来其发病率有上升趋势, 年轻患者有所增加, 这是值得关注的情况。宫颈癌筛查的主要目的是发现宫颈癌前病变, 而宫颈癌筛查的有利条件在于宫颈癌的发生过程一般有5~10年时间, 其次是宫颈管的解剖结构可进行无创性取材, 再次是宫颈癌前病变和原位癌是可以完全治愈的。传统的巴氏分级法在国内应用近60年, 为宫颈癌普查做出了成绩, 然而因取材制片不良, 造成高达15%~20%[1]的假阳性。近年虽然应用液基薄层制片技术, 极大地克服了取材制片缺陷, 但又受阅片医生水平参差不齐的因素影响。本文采用液基薄层细胞技术, 进行TBS诊断与DNA定量分析, 初步探讨了宫颈癌筛査的临床意义。现报道如下:

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2009年10月~2010年4月参加我院宫颈癌筛查的5 886例妇女作为研究对象, 年龄23~60岁。

1.2 方法

用特制的宫颈刷伸入宫颈管内, 旋转刷取宫颈管及宫颈外口处的脱落细胞, 将毛刷放入盛有细胞保存液的小瓶中, 收集标本后每例制成两张薄层细胞学片, 分别进行巴氏染色做常规细胞学诊断及DNA-Feulgen染色做DNA定量测定。

1.2.1细胞学诊断

采用TBS[1] (the bethesda system) 分级系统, 具体包括:正常范围 (within normal limits, WNL) 、意义不明的不典型鳞状细胞 (atypical squamous cells of undetermined sig-nificance, ASCUS) 、鳞状上皮内病变 (squamous intraepithelial lesion, SIL) 和鳞状细胞癌 (squamous cell carcinoma, SCC) 。其中, SIL包括低度鳞状上皮内病变 (low-grade squamous intraepithelial lesion, LSIL) 和高度鳞状上皮内病变 (high-grade squamous intraepithelial lesion, HSIL) 。腺上皮不正常为意义不明的不典型腺细胞 (atypical glandular cells of undetermined significance, AGUS) 和腺癌。由两名医师分别阅片, 商讨后发出TBS诊断报告。

1.2.2 DNA定量分析

Feulgen染色片用SPICM-DNA全自动细胞肿瘤筛查分析系统进行扫描处理, 根据该系统诊断软件所做的细胞DNA倍体来分析结果和做出建议。见表1。

注:DI=被测细胞DNA的IOD值 (全部受测细胞积分光吸度平均值) /正常细胞DNA[G0/G1期 (正常细胞在G0/G1期为二倍体细胞) ]的IOD平均值

1.2.3 宫颈活检

当细胞学检查回报结果为ASCUS以上病变或细胞DNA分析有≥3个异倍体细胞, 均在阴道镜下行多点活检, 进行病理切片检查。以病理诊断为宫颈上皮内瘤变 (cervical intraepithelial neoplasia, CIN) CIN1及以上病变为阳性。对检出1~2个DNA异倍体细胞或ASCUS者, 3~6个月后复查。

2 结果

2.1 宫颈液基细胞学检查与DNA倍体检测结果

液基细胞学诊断阳性285例, 阳性率为4.84% (285/5 886) ;细胞DNA倍体检出阳性486例, 阳性率为8.25% (486/5 886) ;只有异倍体细胞≥3个, 而细胞形态无改变者 (正常+ASCUS) 240例;检出DNA异倍体细胞<3个[正常+ (1~2个) ]而细胞学诊断为LSIL及以上者 (LSIL+HSIL+SCC) 39例;液基细胞学结合DNA倍体分析检出阳性 (DNA异倍体细胞≥3个及细胞学诊断为LSIL及以上者) 525例, 总阳性率为9.43% (525/5 886) 。见表2。

2.1 宫颈活检结果

在细胞学诊断≥LSIL或有≥3个异倍体细胞者, 行阴道镜下活检。活检结果显示:阳性375例, 阳性率为71.4% (375525) 。活检的525例平均DI为 (1.23±0.18) , 而375例宫颈活检病理阳性者的平均DI为 (1.54±0.27) 。见表3。

3 讨论

3.1 全自动细胞DNA倍体分析系统在技术上的优越性

传统的巴氏涂片法由于其假阴性率较高, 已不再适应于当今医疗服务的需求。20世纪90年代末发明的液基薄层细胞制片技术不仅克服了传统巴氏涂片标本不具代表性的问题, 而且薄层细胞结构清晰, 极大减少了阅片诊断的难度[2]。现今的全自动DNA倍体定量分析系统是在液基薄层制片的基础上, 进行Fenlgen染色, 然后通过全自动扫描系统, 将玻片全部细胞扫描到计算机当中, 进行细胞DNA定量分析。DNA是细胞生长、分化和繁殖的基础, 致癌因子引起基因突变所导致DNA含量的改变, 都可以被全自动细胞DNA倍体定量分析系统检出。细胞恶变过程中, 出现DNA含量的改变较形态学改变要早, 因此, 更能早期诊断癌前病变, 其敏感性更高。本研究结果显示, DNA倍体分析结合液基细胞学检出阳性525例, 其中, 只有异倍体细胞≥3个而细胞形态无改变者240例, 未能检出DNA异倍体而细胞学诊断为LSIC及以上者39例, 活检结果显示:阳性375例, 阳性率为71.4% (375525) 。而且随着DNA异倍体细胞数量的增加, 细胞病变的严重程度相应增加, 说明两者结合不但能及早发现宫颈早期病变, 而且能减少漏诊, 可使患者做到早诊断、早治疗, 从而提高患者的存活率。

3.2 细胞DNA定量分析系统用于宫颈病变的临床意义

DNA异倍体的出现是染色体异常的表现, 在大多数SCC及HSIL病例中均可发现DNA异倍体细胞[3,4], 且随着病变程度的增加, 反映细胞总DNA含量平均水平的DI也逐渐增高。孙小蓉等[5]在研究DNA倍体系统用于对宫颈癌及癌前病变的诊断与预测中发现, CIN1、CIN2到CIN3, 直至浸润性宫颈癌, 相应的DNA含量分布图从正常到异常发生明显改变, 表明DNA异倍体改变是一种细胞癌变的特征指标[6];在AS-CUS和LSIL病变中如出现DNA异倍体细胞, 提示病变有进一步发展趋势或高危型HPV感染的可能[5]。Kashyap等[6]调查发现, 高、中、低分化的鳞状上皮癌及宫颈腺癌DNA异倍体细胞出现的频率均高达60%以上。另一研究表明, 在163例病理诊断为T1bl-T2b的浸润型宫颈癌病例中, 凡出现有DI>1.7或>2.5的大量异倍体细胞患者, 其预后不良[7]。这些资料表明, DNA定量分析可用于评估宫颈癌恶性程度及预后, 异倍体细胞越多, 肿瘤细胞分化程度越低, 恶性程度越高。

3.3 细胞DNA定量分析系统的临床应用

宫颈癌的防治, 关键是应用能检测出癌前病变的有效可行的方法, 及时发现, 及时治疗。DNA定量分析是辅助诊断癌前病变的一个有价值的指标, 尤其是定期检测, 可对病变的性质及发展趋势做出客观估计。影响DNA倍体分析结果的原因主要是妇科取材, 若宫刷取材合格, 提供足够细胞供DNA倍体分析, 那么, 其结果更能反应宫颈病变程度。值得强调的是, 少数晚期癌因癌表面坏死渗出物而影响采集有效细胞, 可致漏诊。二是<3个异倍体细胞的患者, 或因病变范围过小, 活检漏取, 造成病检阴性, 故应行追踪随访。笔者认为, 一方面, 采用宫颈刷取材和液基薄层制片技术进行TBS诊断, 同时使用全自动化的DNA倍体分析系统, 对达到活检标准的进行活检, 根据诊断结果作相应的治疗;另一方面, 通过普及防癌知识, 定期开展宫颈癌的普查普治, 以实现早发现、早诊断和早治疗的目的。

参考文献

[1]Frable WJ, Austin RM, Collins RJ, et al.Medicolegal affairs:IAC taskforce summary[J].Acta Cytol, 1998, 42 (1) :76-119.

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[3]Haroske G, Baak JP, Danielsen H, et al.Fourth updated ESACP consen-sus report on diagnostic DNA image cytometry[J].Anal Cell Patho1, 2001, 23 (2) :89-95.

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[5]孙小蓉, 汪键, Alfred B.DNA倍体分析系统用于宫颈癌及上皮内瘤变的诊断及预测[J].中华病理学杂志, 2005, 34 (7) :435-437.

[6]Kashyap V, Bhambhani S.DNA aneuploidy in invasive carcinoma of theuterine cervix[J].Indian J Pathol Microbiol, 2000, 43:265-269.

[7]Horn LC, Raptis G, Nenning H.DNA cytometric analysis of surgicallytreated squamous cell cancer of the uterine cervis, Stage pT1bl-pT2b[J].Anal Quant Cytol Histol, 2002, 24:23-29.

细胞DNA定量分析 篇2

马铃薯亚细胞结构线粒体DNA的分离与提取

以马铃薯块茎为材料,通过差速离心分离出线粒体,过垫梯度离心进一步纯化.显微镜下观察所得的线粒体的`纯度、形态;并用数码相机进行照相.线粒体样用SDS、蛋白酶K、核酸酶处理后用饱和酚、苯酚/氯仿及氯仿/异戊醇提取处理,乙醇沉淀,提取得线粒体DNA(mtDNA).紫外分光光度计检测提取浓度、纯度,1%琼脂糖电泳获得清晰、整齐的条带.

作 者：卢太白 韦伟 徐雷 LU Tai-bai WEI Wei XU Lei 作者单位：西北农林科技大学生命学院,陕西杨凌,712100刊 名：西北农业学报 ISTIC PKU英文刊名：ACTA AGRICULTURAE BOREALI-OCCIDENTALIS SINICA年，卷(期)：15(5)分类号：Q503 Q523关键词：线粒体 mtDNA 差速离心 过垫梯度离心

细胞君怎样修复DNA？ 篇3

那么，“细胞君”究竟是怎样修复自身DNA的呢？

复制DNA不出bug吗？

人的几乎每个细胞里都有DNA，它们编码了人全部的遗传信息。一个细胞里的DNA全长超过2米，但人体有数十亿细胞，所有的DNA加起来可以往返地球和太阳之间250次。这么多DNA，全都是从受精卵里那两米长的DNA复制来的。

所有化学进程都是不精确的，这几十亿次的复制之后早就应该错得没边儿了，何况你的细胞还在每天承受活性分子和辐射带来的损伤。但是我们大部分人都活得还挺好，基因并没有变成一堆乱码。这一神奇的成就是怎么实现的呢？

答案是，我们体内有一群蛋白质专门负责看管DNA。它们持续不断地校对基因组，发现损伤就立刻着手修复。2015年的诺贝尔化学奖，表彰的就是发现这一修复机制的人。

细胞对DNA的修复，就像匠人修理木桶，木板拼合的规律是否会让你想起碱基互补配对——G与C间形成三个氢键，A与T间形成两个氢键；而除去破损木板再换上新的，恰与恢复碱基对间的氢键相似。

DNA修复“三板斧”

20世纪60年代，当时人们已经知道DNA是生命的基础，想来这个基础肯定要十分结实，不然生命无法诞生。

但是托马斯·林达尔对此产生了怀疑，他把DNA单独提取出来，发现它其实没有那么稳定。就凭DNA本身的化学属性，人的基因组每天都应该遭受成千上万的严重损伤，根本活不下去。这意味着，一定有什么别的机制阻挡了DNA的衰败。

接下来的几十年里，林达尔找到了“碱基切除修复”：细胞里有一种蛋白质专门寻找一种特定的碱基错误，然后把它从DNA链上切掉，从而修复它。

与此同时，阿齐兹·桑贾尔发现了另一种修复现象：细菌遭受大剂量紫外线照射之后本来应该很快死掉，但是接下来用蓝光照射却能让它们“死里逃生”。后续的研究让他发现了“核苷酸切除修复”：不是剪掉单个的碱基，而是把一小段被紫外线损伤的核苷酸都切掉。

保罗·莫德里奇发现了第三种修复机制：DNA本来是双链，但在复制的过程中会拆成两条，各自作为模板形成新链。问题是，复制的时候可能会出错，让两边的碱基对不上号，那蛋白质要怎么知道哪条是旧的、哪条是新的，应该把谁改正成谁呢？

莫德里奇和同事发现，细胞会对DNA的链进行标记。正常DNA上通常会有修饰基团，但刚刚完成复制的DNA新链还没有这些修饰，蛋白质可以凭此判断哪条是旧有的、哪条是新加上的，从而知道该去修谁，此即“DNA错配修复”。

修复事不小，出错不得了

除了这三种机制之外，还有许多其他修复机制，它们每天纠正成千上万的错误，让我们能活下去。一旦一个机制出了问题，错误就会快速堆积，大大增加癌症的风险。

事实上，许多类型的癌症就依赖于这些机制的失灵——但得是部分失灵。全部机制都完好的话，新的错误就很难产生，癌症就不容易发展；但如果所有机制都坏了，细胞就承受不了错误，会很快死掉。许多癌症药物都是以破坏癌细胞残存修复机制为目标，从而进行治疗的。

因此，2015年诺贝尔化学奖不但增进了我们对细胞的了解，还可能成为许多拯救生命药物的来源。

让我们记住这三个名字，和他们所做的贡献——

阿齐兹·桑贾尔，1946年出生于土耳其萨武尔，2005年当选美国国家科学院院士。他是美国北卡罗来纳大学教堂山分校萨拉·格雷厄姆·基南生物化学教授。

保罗·莫德里奇，1946年出生，美国杜克大学詹姆斯·B·杜克生物化学教授，霍华德·休斯医学研究所研究员。

细胞DNA定量分析 篇4

1 资料与方法

1.1 一般资料

2009年2月-2013年10月到我院妇科门诊进行治疗后随诊的宫颈癌患者共计572人次。其中单纯接受手术治疗者112例, 手术+术后放疗231例, 放疗+同期化疗者229例。所有患者均已达到临床治愈, 首次细胞学检查时间为结束治疗后≥3个月。

1.2 研究方法

1.2.1 标本采集及处理

宫颈取材:将宫颈刷深入宫颈口旋转3~5周采取脱落细胞;阴道残端取材:将宫颈刷垂直于残端瘢痕自左向右刷取3~5次, 注意残端两侧角处要取材到位。然后将刷头置于细胞保存液中, 贴好标签送实验室 (以上器材及试剂由麦克奥迪医疗诊断有限公司提供) 。

1.2.2 细胞DNA定量分析检测

采用Moti Cytometer全自动细胞图像分析系统 (麦克奥迪医疗诊断有限公司) 对Feulgen染色片进行扫描检测, 共收集7000个以上的细胞核, 根据100多个参数特征值对细胞核进行自动分类及排序。以正常二倍体细胞积分光密度值 (intergrated optical density, IOD) 作为参照, 被测细胞的IOD与参照细胞的IOD值比较得到的比值为“DNA指数 (DNA Index, DI) ”。通过DNA指数区分正常的二倍体细胞 (DI=1) 、增生或疑似病变细胞 (DI=1-2.5) 以及病变细胞 (DI>2.5) 。结果判定:1阴性:以正常二倍体细胞为主, 未见DI>2.5的倍体异常细胞。2疑似病变:出现1~2个DI>2.5的倍体异常细胞。3阳性:DI>2.5的倍体异常细胞≥3个[3]。

1.3 统计学方法

统计液基细胞学TBS检查及其联合细胞DNA定量分析的阳性符合率并进行比较。采用SPSS 17.0统计学软件进行分析, 计数资料比较采用χ2检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组阳性结果比较

572份标本中, 液基细胞学TBS检查阳性31例, 发现率为5.42% (31/572) ;液基细胞学TBS检查联合细胞DNA定量分析阳性56例, 发现率为9.79% (56/572) , 两者比较差异无统计学意义 (P<0.05) , 见表1

2.2 两组病理诊断结果比较

以活检病理结果为金标准, 液基细胞学TBS检查阳性符合率为25.8% (8/31) , 液基细胞学TBS检查联合细胞DNA定量分析阳性符合率为48.2% (27/56) , 两者比较差异具有显著性 (P<0.05) 。

3 讨论

宫颈/阴道残端细胞学检查是接受手术和/或放化疗后宫颈癌患者定期随访的重要检查项目, 其目的在于及时发现局部复发倾向, 尽早给予相应处理。薄层液基细胞学及其对应的TBS报告系统是目前常规开展的细胞学检测方法。相对于传统宫颈巴氏涂片染色法, 其样本收集技术及涂片质量均有所提高, 异常细胞检出率也得到了明显提高, 但仍存在假阴性病例。而细胞DNA定量分析是近年来应用于临床的细胞学检测技术, 其在超早期宫颈病变筛查中具有客观、准确、快速的优势, 从而避免了人为的疏漏、经验不足和仅从单一的细胞形态改变来诊断的缺陷。

在北美及欧洲, 细胞DNA定量分析已是宫颈癌筛查的常规临床检测方法之一;在国内, 该方面的应用也有很多报道[3,4]。对于细胞DNA定量分析在手术和/或放疗后的宫颈癌患者随访中的应用鲜有报道。

本研究将细胞DNA定量分析与薄层液基细胞学TBS报告系统相结合应用于宫颈癌治疗后随诊, 发现阳性发现率及与活检病理的阳性符合率均高于单纯液基细胞学TBS检查, 二者结合可提高随访结果的准确性。放射治疗本身可导致细胞非整倍体扩增, DNA定量分析是否适合应用于放疗后患者也是本课题探讨的内容之一。本研究中, 首次细胞检测从患者结束治疗3个月后开始, 即在于尽可能排除放疗可能导致的假阳性。对比单纯手术和接受放疗患者的DNA定量分析结果阳性率, 并未见明显差别。

综上所述, 我们得出结论:细胞DNA定量分析联合液基细胞学TBS检查在宫颈癌治疗后随访中的阳性发现率及与活检病理的阳性符合率均高于单纯液基细胞学TBS检查, 二者结合可提高随访结果的准确性。

参考文献

[1]张玉琼, 潘登, 董连.液基细胞学与HPV联合检测在宫颈癌筛查中的临床价值探讨[J].现代实用医学, 2013, 25 (9) :1041-1043.

[2]张文娟, 东燕, 孙绪兰, 等.子宫颈癌筛查方法的应用及研究进展[J].现代生物医学进展ISTIC, 2012, 12 (23) .

[3]张玉, 景彩萍, 霍媛媛, 等.细胞DNA倍体定量分析在宫颈癌与癌前病变中的应用探讨[J].现代肿瘤医学, 2013, 21 (11) :2584-2586.

细胞DNA定量分析 篇5

红掌组培变异株的特异DNA片段分析

利用ISSR引物对红掌亲本及其组织培养后代的形态变异株进行2次PCR扩增分析,回收特异DNA片段,测定其扩增产物的基因序列,并用BLAST方法进行同源性分析.结果表明:变异株的`基因组特异DNA片段为680 bp,在核酸和蛋白质水平均没有发现同源性较高的基因或蛋白质,说明红掌在组织培养过程中可能产生新的遗传重组,出现新的基因型.

作 者：张淑红 陈超 杜宏薇 范永山  作者单位：唐山师范学院,生命科学系,河北,唐山,063000 刊 名：北方园艺  PKU英文刊名：NORTHERN HORTICULTURE 年，卷(期)： “”(8) 分类号：S628.1+4 关键词：红掌   组织培养   变异株   ISSR  

细胞DNA定量分析 篇6

[关键词]DNA RNA 实验 改进建议

一、教材对该实验的处理过程及存在问题

教材对该实验的处理过程为：取人的口腔上皮细胞（或洋葱鳞片叶内表皮细胞）制片，将装片放在酒精灯火焰上烘干固定，放入装有质量分数为8%的盐酸溶液的小烧杯中，再将小烧杯置于装有30℃温水的大烧杯中保温5min，接着用蒸馏水冲洗载玻片10s，吸去水分后滴加甲基绿吡罗红染色剂染色5min，然后盖上盖玻片，用显微镜观察。

学生严格根据教材的设计进行实验，发现实验现象不理想。主要存在问题：人的口腔上皮细胞的细胞核和细胞质均被染成紫红色。洋葱鳞片叶内表皮细胞实验效果较好些，但染色效果不明显，视野内有颗粒杂质。

二、对实验问题的分析及解决方法

（一）实验原理分析

该实验的原理：DNA主要分布在细胞核内，RNA大部分存在细胞质中。碱性染料甲基绿吡罗红对DNA和RNA的亲和力不同，甲基绿使DNA呈现绿色，而吡罗红使RNA呈现红色。利用甲基绿吡罗红混合染色剂将细胞染色，可以显示DNA和RNA在细胞中的分布。该反应对pH敏感，同时染料纯度、结合力、实验温度都会影响到实验效果。

（二）解决方法

1.观察人的口腔上皮细胞DNA和RNA的分布

学生按照教材的实验步骤（制片、水解、冲洗、染色、观察）操作，发现不仅口腔上皮细胞的细胞质被染成红色，连细胞核也被染成紫红色。查阅有关文献，综合分析可能有三个原因：其一，盐酸水解改变口腔细胞细胞膜的通透性，加速染色剂进入细胞，但盐酸使细胞中的DNA变性，因而DNA无法与甲基绿结合发生绿色反应。其二，只有在染液的pH值为4.8时，甲基绿和吡罗红才能对所染的材料都具有亲和力，从而获得最佳的染色效果。[1]遗留的盐酸改变了染色剂的pH，从而使细胞核染色失败。其三，DNA在高温条件下易变性，酒精灯火焰温度在500℃左右，直接将装片置于火焰上烘烤，可能导致DNA变性，从而与吡罗红结合呈现红色。

综上所述，建议将实验改进为：制片，且不用酒精灯烘干，不经过盐酸水解和蒸馏水冲洗，直接染色观察。

2.观察洋葱鳞片叶内表皮细胞DNA和RNA的分布

学生将实验材料换成洋葱鳞片叶内表皮细胞，重复教材中的实验步骤，发现实验效果较人的口腔上皮细胞好些。其优势有：其一，口腔上皮细胞较小，在低倍镜较难观察，而洋葱鳞片叶内表皮细胞较大，在低倍镜下清晰可见，所以实验现象明显，且取材方便。其二，用盐酸水解细胞，能改变细胞膜的通透性，加速染色剂进入细胞，缩短时间，同时使DNA与蛋白质分离，有利于DNA与甲基绿结合。

但整个实验现象还是不明显，有些细胞还出现破裂、质壁分离的现象，同时视野中有颗粒杂质。主要原因有：第一，水解后用蒸馏水冲洗，且只冲洗10s，时间太短，可能使盐酸残留在细胞内，使细胞内的pH低于4.8，甲基绿染色剂不容易着色。所以用蒸馏水冲洗的表皮细胞的细胞核和细胞质均呈现紫红色。第二，质量分数为8%的盐酸浓度过高，破坏了细胞结构，使细胞发生质壁分离，细胞质皱缩。第三，视野中的大量颗粒物质可能是未溶解的染料，所以在实验前要将染料过滤。

综上所述，建议将实验改进为：（1）用质量分数为1%的NaHCO3溶液代替蒸馏水冲洗。用碱性的NaHCO3溶液中和多余的HCl，确保细胞中的pH不会低于4.8。（2）降低盐酸溶液的质量分数，通过实验和文献查阅，配置质量分数为4%的盐酸进行实验，实验效果较佳。[2]（3）将染液过滤，可提高视野内的洁净度，同时不会对细胞产生实质性的改变。[3]

三、改进后的实验步骤及注意事项

（一）观察人口腔上皮细胞DNA和RNA的分布

1.制片：取口腔上皮细胞。用消毒牙签在自己漱净的口腔内侧壁上轻轻地刮几下，把牙签上附有碎屑的一端，在载玻片上旋转地涂抹几下。

2.染色：将甲基绿吡罗红染色剂直接滴一滴在载玻片上，染色5min。

3.观察：盖上盖玻片，放在显微镜下观察。先用低倍镜观察，再换高倍镜观察，观察细胞核和细胞质的颜色变化。

（二）观察洋葱鳞片叶内表皮细胞DNA和RNA的分布

1.取材：用刀片在洋葱鳞片叶内表皮上划出一个“井”字，“井”字中央的正方形边长约为0.5cm，用镊子将其轻轻撕下并平展在载玻片上。

2.水解：在洋葱内表皮上滴加两滴质量分数为4%的盐酸溶液，水解5min。

3.冲洗：用质量分数为1%的NaHCO3溶液冲洗材料3次，直到材料下方不会产生气泡为止。然 后用吸水

纸吸干载玻片上以及材料周围的液体。

4.染色：将甲基绿吡罗红染色剂滴一滴在载玻片上，染色5min。

5.观察：盖上盖玻片，放在显微镜下观察。先用低倍镜观察，再换高倍镜观察，观察细胞核和细胞质的颜色变化。

（三）实验中应注意的其他问题

1.实验前，染液不用当天配置，可以保存在棕色瓶中使用一周。[4]只需在每次使用前过滤，以免视野中出现大量颗粒杂质。

2.在制作人的口腔上皮细胞临时装片时，要尽量将口腔上皮细胞涂抹开，防止细胞重叠。

3.以洋葱细胞为实验材料时，不能选择洋葱最外层和最内层的几层鳞片叶，外层的鳞片叶颜色太深，而内层的颜色太浅，都会影响实验结果。同时，所撕取的材料要尽量大一些，以边长为0.5cm的正方形为宜，撕取的材料过小会影响实验结果。

4.用质量分数为1%的NaHCO3溶液清洗经盐酸水解后的洋葱内表皮时，会产生气泡，应该尽量将气泡驱逐干净。但动作要轻，避免损伤洋葱内表皮细胞。

5.用质量分数为1%的NaHCO3溶液冲洗洋葱内表皮后，用吸水纸吸干周围的液体，以免影响染色的速度，使染色现象不明显。

6.染色时间不宜过长，染色时间太长则会使细胞核颜色加深呈现深蓝色，易与细胞质颜色混淆。

四、实验改进后的优点

1.节约材料：配置一瓶染料，可以保存使用一周，不用现配现用。避免了甲基绿吡罗红染液的浪费。

2.简化过程：观察人的口腔上皮细胞中DNA和RNA的分布省略了烘干、水解、冲洗等步骤，简化为三个步骤，节约时间，而且观察效果更佳。

3.精益求精：观察洋葱鳞片叶内表皮细胞中DNA和RNA的分布，改成用质量分数为4%的盐酸溶液水解洋葱鳞片叶内表皮细胞，再用质量分数为1%的NaHCO3清洗，从而使实验效果更加明显。

[ 参 考 文 献 ]

[1]申姜颖，黄庆玉，高慧英等.DNA酸解后甲基绿-派洛宁染色法的改良和应用[J].解剖科学进展，1999，5（3）：272-273.

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[3]马晓艳.“观察DNA和RNA在细胞中的分布”实验的改进及操作建议[J].生物学通报，2015，50（1）：51-52.

[4]贺俊.观察DNA和RNA在细胞中的分布实验的改进[J].实验改进，2014（5）：30-31.

细胞DNA定量分析 篇7

1 资料与方法

1.1 一般资料

研究对象均来自2012年3月至2013年12月期间的病例。细胞DNA定量分析阳性352例, 其中232例同意在我院做活检。患者年龄20~65岁, 平均年龄 (32.4±4.2) 岁。

1.2 方法

DNA定量分析:非月经期进行采样, 先用阴道窥器暴露宫颈, 再将宫颈刷插入子宫颈管, 轻轻旋转收集脱落细胞, 收集于标本固定液中, 送细胞室制片和检验分析。阴道镜检查:采用阴道窥器暴露宫颈, 进行宫颈醋酸白试验和碘试验, 并进行图像分析。病理学检查:采用阴道镜定位, 采集宫颈可疑部位进行四点以上的组织活检。

1.3 结果判断

应用全自动图像分析系统分析细胞染色样本。结果分为“0”、“1~2”、“≥3”三级指数。“0”表示未见异常;“1~2”表示DNA倍体异常细胞数量小于送检细胞总数的10%;“≥3”表示异常细胞数量超过总数的10%。阴道镜检查按阴道镜图谱的标准分为正常、浸润癌。

病理诊断分析分别为正常或炎症;癌前病变:CIN1、CIN2、CIN3;浸润癌 (CC) 。

1.4 统计学方法

将所收集的数据录入电脑, 使用SPSS 19.0软件进行统计分析, P<0.05表示差异有显著性意义。

2 结果

病理诊断发现CIN2及以上级别病变31例, 其中DNA定量分析异常28例 (90.3%) , 阴道镜异常25例 (80.6%) , 二者间差异有统计学意义 (P<0.05) 。详见表1。DNA定量分析在CIN2级别以上病变的敏感性是77.4%。异常细胞“≥3”筛查指标的敏感性是70.9%。

3 讨论

在现代社会, 吸烟、过早性生活、HPV感染等宫颈癌的发病诱因明显增多, 导致宫颈癌的发病率有升高和年轻化的趋势, 严重威胁女性的健康和生命。减少宫颈癌病死率的关键是早期诊断和治疗。当前, 宫颈癌的筛查技术主要有PAP、TCT、HPV等5种[2]。每种方法都有其优缺点, 提高检查准确率的有效途径是综合运用一种以上的方法。

DNA定量分析通过细胞染色体的异常变化以及DNA的含量, 来鉴别正常与病变的细胞。研究已证实DNA异倍体细胞的出现与癌变有关[3]。DNA含量异常增高及细胞数目异常增多是恶性病变的生物学指征[4]。另外, DNA含量在判断细胞良恶性方面有重要意义[5]。研究发现, 异倍体细胞与肿瘤细胞的分化程度呈负相关。异倍体细胞越多, 5年生存率越低;相反的情况下则生存率越高。因此, DNA细胞图像除诊断外, 还能用于预测病程的进展。在国外已作为一种常规的检测方法广泛应用。除此之外, 该方法取样方便, 对患者的损伤很小, 标本便于保存和分析, 能有效避免人为误差, 非常适合临床应用。其主要的缺点是取样较小, 容易出现漏诊的情况。因此, 采用DNA定量分析的方法, 适合与其他检查方法联合应用。

阴道镜检查利用放大技术, 能够将要检查的部位放大10~40倍, 从而较清楚呈现检查部位的生理结构和病理特征, 通过检查发现各种微小病变。另外, 应用阴道镜定位采集活检的样本, 可以使活检样本更准确地来自于病变的部位, 提高所采集的活检样本的代表性, 从而使活检更加敏感可靠, 有利于疾病的诊治。阴道镜检查的局限在于对宫颈管内病变以及宫颈深部癌不敏感, 特别是对于已绝经的患者, 由于鳞柱状交界部位向内里偏移, 使用阴道镜更可能不能发现病变。由于DNA分析以及单独阴道镜检查均有可导致漏诊的缺陷, 因此, 临床上采用两种方法联合应用更为有效。DNA定量分析在CIN2级别以上病变的敏感性是77.4%。异常细胞“≥3”筛查指标的敏感性是70.9%。DNA定量分析联合阴道镜检查, 诊断符合率高于单独应用DNA分析。

摘要：目的 观察DNA定量分析配合阴道镜检查筛查宫颈癌的准确性。方法 收集2012年3月至2013年12月病例, 进行DNA倍体定量分析和阴道镜下取活组织病理检查。结果 DNA定量分析阳性352例, 其中232例进行活检, 病理诊断宫颈癌及CIN 2以上病变31例, 其中DNA定量分析异常28例 (90.3%) , 阴道镜异常25例 (80.6%) , 二者差异显著 (P<0.05) 。DNA定量分析配合阴道镜检查的敏感度高于单独DNA定量分析。结论 细胞DNA定量分析配合阴道镜检查诊断符合率提高。

关键词：细胞DNA定量分析,阴道镜检查,宫颈癌

参考文献

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细胞DNA定量分析 篇8

资料与方法

2011年8月-2013年8月就诊于漳州市中医院妇科门诊及体检中心的妇女4 000例。调查人群入选标准:在漳州地区居住>0.5年的本市及外地户籍妇女, 年龄20~65岁, 有2年以上性生活史的妇女, 目前未妊娠, 无宫颈手术史, 无盆腔放射治疗史, 均未使用避孕药及其他类固醇类药物。研究方法如下。

筛查方法:由妇科医生对调查对象进行常规妇科检查, 按宫颈细胞学检测方法在宫颈管及宫颈外口鳞柱交界处刷取宫颈细胞行液基薄层细胞学检查 (TCT) 及宫颈DNA倍体分析。采用TBS (the Bethesda system) 分类法作为细胞学诊断标准: (1) 正常或良性 (NULM) ; (2) 不明意义的非典型鳞状上皮 (ASCUS) ; (3) 不能排除高级别鳞状上皮内病变的非典型鳞状上皮细胞 (ASC-H) ; (4) 低级别鳞状上皮内病变 (LSIL) ; (5) 高级别鳞状上皮内病变 (HSIL) ; (6) 不典型腺细胞 (AGS) 。 (7) 鳞状上皮浸润癌 (SCC) 。

采用全自动细胞图像分析系统进行宫颈DNA分析, 扫描分析染色片中的每一个细胞核, 根据123个细胞核特征参数值自动分析和计数每个细胞核, 出现DNA指数>2.5的DNA倍体异常细胞则判为筛检阳性。Ao Cell系统诊断软件将细胞DNA倍体分析结果分为: (1) 正常, 即DNA指数<2.5; (2) 少量细胞DNA倍体异常 (DNA倍体>5C的细胞数1~2个) ; (3) 细胞DNA倍体异常 (DNA倍体>5C的细胞数≥3个) ; (4) 少量细胞增生 (增生细胞占检测细胞总数5%~10%) ; (5) 细胞异常增生 (增生细胞占检测细胞总数>10%) 。确定活检原则:宫颈DNA检测和TBS在双盲情况下开展。任一检测为阳性则建议活检;若均为交界性结果, 也建议活检;若其中之一为阴性, 另一检测为交界性结果, 则建议4~6个月复查。若均为阴性, 建议正常筛查。阴道镜活检及病理学检查:在阴道镜的指导下多点活检取材, 病理诊断报告可分为浸润癌、CIN3或原位癌、CIN2、CIN1、宫颈炎及正常。对于第1次活检结果可能有异议的病例, 应再进行细胞学检查 (常规细胞学诊断及细胞DNA定量分析) , 结果仍为阳性, 则再次取活检, 借助麦克奥迪提供的远程病理平台, 请妇科病理专家进行会诊。

统计学方法:以宫颈活检病理诊断为标准计算液基细胞学诊断方法的特异度、灵敏度及DNA倍体分析系统。采用χ2检验比较两组计数资料, P<0.05为差异有统计学意义。

结果

TCT检测及宫颈DNA检测结果:经初步统计, 共检出宫颈细胞学和 (或) DNA倍体异常693例, 其中液基细胞学阳性270例, 阳性率4.5%, 包括ASC-US 148例, ASC-H 23例, LSIL 54例, HSIL 43例, AGC 2例。DNA倍体分析系统检出668例异常, 阳性检出率11.1%, 包括细胞DNA倍体异常227例, 细胞异常增生10例, 少量细胞DNA倍体异常365例, 少量细胞增生66例。见表1。

病理诊断结果:根据活检标准行阴道镜下宫颈多点活检, 其中有病理检查资料232例, 经病理诊断为CIN及宫颈癌患者128例, 其中宫颈癌14例, 原位癌12例, CINⅡ~Ⅲ58例, CINⅠ44例。慢性宫颈炎104例。

以≥3个DNA异倍体出现作为活检标准, 发现宫颈病变的敏感性78.9%, 特异性43.27%, 阳性预期值63.13%, 阴性预期值62.5%。说明细胞DNA定量分析技术具有较高的灵敏度, 但特异度较差。见表2。

以液基细胞学检查LSIL以上作为活检标准, 发现宫颈病变的敏感性43.75%, 特异性79.81%, 阳性预期值72.72%, 阴性预期值53.55%, 见表3。

讨论

寻找更为敏感、特异性强的宫颈癌筛查方法是目前宫颈癌防治研究中的热点。早期的巴氏染色法经济有效、简单易行, 在大面积筛查及基层单位中发挥了重要作用。但该方法假阴性率较高, 受限于主观因素的影响, 包括阅片技术、染色水平、制作方法、取材过程等, 目前已基本被临床淘汰。薄层液基细胞学可制成清晰的薄层涂片, 因其去除了涂片上的杂质, 其与TBS分类系统联合进行诊断的准确性明显高于传统巴氏涂片法[2,3,4], 但是其检查的准确性很大程度上依赖于细胞学医生的技术水平, 主观性较强, 在一定程度上影响了宫颈癌筛查的效果。

细胞DNA定量分析系统采用第三代液基细胞学TCT技术, 进行DNA特异性染色, 克服了巴氏涂片的不足, 通过软件自动记录所有的细胞核并精确分析DNA含量, 利用镜下复合功能鉴别系统产生的错误[5]。细胞核内的遗传物质DNA可自我复制, 其基因编码可通过指导蛋白质合成而调节细胞功能, 细胞DNA定量分析系统能检出由致癌因子引起的基因突变所导致DNA含量的改变。细胞DNA定量分析系统能更早地检测出癌前病变, 因为细胞恶变过程中DNA含量的改变早于形态学改变, 敏感性高。但DNA倍体分析系统对重叠细胞可能存在误判, 因为肿瘤细胞与正常细胞生长增殖时细胞核内DNA含量及结构会发生改变。

本研究亦显示, 细胞DNA定量分析技术具有较高的灵敏度, 但特异度较差。在4 000例合格宫颈样本中, 液基细胞学检查为正常或良性改变的妇女, 以≥3个DNA异倍体出现作为活检标准, 发现宫颈病变的特异性43.27%, 敏感性78.9%, 阳性预期值63.13%, 阴性预期值62.5%, 对比液基细胞学检查以LSIL以上作为活检标准, 发现宫颈病变的敏感性43.75%, 特异性79.81%, 阳性预期值72.72%, 阴性预期值53.55%

总之, 宫颈细胞DNA倍体分析系统以其客观性及较高的敏感性, 可克服基层医疗机构细胞学医生缺乏、经验不足等缺点, 如有条件, 与宫颈液基细胞学检查联合应用, 可减少误诊、漏诊, 提高检查的特异性。

摘要：目的:探讨细胞DNA倍体分析系统在临床宫颈癌筛查中的应用。方法:对宫颈细胞行宫颈DNA倍体分析及液基薄层细胞学检查 (TCT) 。结果:共检出宫颈细胞学和 (或) DNA倍体异常693例, 液基细胞学阳性270例, 阳性率4.5%。DNA倍体分析系统检出668例异常, 阳性检出率11.1%。以≥3个DNA异倍体出现作为活检标准, 宫颈病变的敏感性78.9%, 特异性43.27%, 阳性预期值63.13%, 阴性预期值62.5%。以液基细胞学检查LSIL以上作为活检标准, 宫颈病变的敏感性43.75%, 特异性79.81%, 阳性预期值72.72%, 阴性预期值53.55%。结论:宫颈细胞DNA倍体分析系统具有客观性及较高的敏感性, 与宫颈液基细胞学检查联合应用, 可减少误诊、漏诊, 提高检查的特异性。

关键词：宫颈癌,细胞DNA倍体分析系统,液基薄层细胞学检查

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细胞DNA定量分析 篇9

我院使用宫颈DNA定量细胞学检测联合TCT, 进行宫颈癌筛查, 提高了宫颈癌检出率, 使有病变的妇女早诊断、早治疗, 并对检出的有发病可能的人群及早管理, 杜绝了宫颈病变的发生、发展。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2009年10月至2011年10月在我院妇科门诊进行妇女病体检者3 000名, 年龄21～50岁, 其中21～35岁1 200例, 36～45岁1 360例, 46～50岁440例。所有受检者均无子宫切除、宫颈锥形切除、各种化疗及盆腔放疗史, 取材前3天无性生活、阴道冲洗及用药史等。

1.2 研究方法

对所有研究对象进行宫颈DNA定量细胞学检测及TCT。以病理活检结果为诊断宫颈癌的金标准。

1.2.1 宫颈细胞学检查

标本制液基薄层涂片两张, 一张做巴氏染色, 进行TCT;一张做费兰格染色, 进行DNA定量细胞学检测。

1.2.2 病理检查

选取DNA定量细胞学检测阳性的妇女, 或TCT异常者, 在阴道镜下进行活检, 以病理诊断为金标准, 最后确定宫颈病变程度。

2 结果

2.1 细胞DNA倍体分析结果

正常宫颈细胞的DI大多为1, DI为2者较少见, 宫颈上皮细胞的增殖周期为DNA整倍体, 无异倍体峰出现。而肿瘤细胞的DI常≥2.5, 增殖周期为非整倍体。当宫颈有少数DNA异倍体时, DI仍为1, 但也有少部分DI≥2.5, 形成异倍体单峰;若有大量异倍体出现时, DI≥2.5, 形成异倍体双峰。因此, 测定细胞核DNA含量, 可作为判断宫颈癌前病变及宫颈癌的客观指标。本研究共查出DNA倍体异常者594例 (见表1) 。

2.2 病理诊断

选择317例有异倍体、细胞DNA异倍体≥3个、1个细胞DI≥4.5或细胞学诊断超过CIN1级 (≥LSIL) 者, 在阴道镜下进行活检, 病理检查结果见表2。

注:*为不典型磷状细胞;CI为宫颈上注内瘤癌变

317名患者中, 病理检测为慢性宫颈炎37例 (占11.67%) , AUSCUS 28例 (占8.83%) , CIN 1级148例 (占46.69%) , CIN 2级59例 (占18.61%) , CIN 3级24例 (占7.57%) , 宫颈癌21例 (占6.62%) 。

2.3 统计学分析

运用SPSS 16.0软件进行统计学分析, 采用χ2检验, P>0.05差异无显著性。将AUSCUS以上病变均列为阳性, DNA倍体定量分析以1个病变细胞以上列为阳性。送病理组织学检查者:DNA倍体定量分析3个病变细胞以上、1个细胞DI≥4.5或细胞学诊断≥LSIL者。

两种检测结果比较, 具有显著性差异, 见表3, TCT与DNA定量细胞学检测联合TCT比较见表4, TCT与DNA异倍体分析评估CIN 1级及以上病理改变结果比较见表5。

比较TCT与细胞DNA定量细胞学检测结果可以看出, 后者检测阳性率 (19.80%) 远远高于前者 (6.83%) , 且有显著性差异。两者联合的检测阳性率为22.13%。

TCT与DNA异倍体分析评估CIN 1级及以上病理改变检测结果比较, 后者阳性率为73.82%, 也高于前者 (51.22%) 的诊断, 且P<0.05, 有显著性差异。

3 讨论

肿瘤病理学研究显示, 细胞癌变时, 其细胞核内的DNA结构和含量都会发生异常变化, DNA含量增多, DNA倍体状况也发生改变。我们发现, 异倍体细胞的数量与宫颈病变程度呈正相关。本次研究用DNA定量细胞学检测共发现异倍体细胞及异倍体细胞峰594例, 占19.80%, 该群体是重点调查跟踪的对象, 我们可以及早对DNA检测阳性的妇女进行进一步的检查, 并把这组妇女纳入妇女病管理系统, 定期复查、跟踪与随访, 做到早发现、早治疗, 预防宫颈癌的发生发展。

发展中国家宫颈癌的发生率为发达国家的6倍, 其中80%的患者确诊时已是浸润癌。从一般的宫颈病变发展为宫颈癌大约需要6～10年。CIN的早期诊断, 对于降低宫颈癌的发生率具有重要价值[5]。从这个角度看, 宫颈癌并不可怕, 因为它是一种可以通过早期预防、早期筛查治愈的疾病。

防治宫颈癌的关键在于定期进行妇科检查及宫颈癌筛查, 及时发现和治疗宫颈癌前病变, 阻止其向宫颈癌发展。如能落实防治措施, 宫颈癌的治愈率很高。切实做好“三早” (早发现、早诊断、早治疗) 是防治的关键。

TCT与DNA异倍体分析评估CIN 1级及以上病理改变结果比较, 其阳性率高于TCT, 且有显著性差异。细胞恶变过程中, 出现DNA含量的改变较形态学改变要早, 提前3～5年查出早癌, 其敏感性更高。DNA倍体分析是超早期诊断宫颈癌前病变及宫颈癌的有效手段。

对宫颈癌的检出率方面, 有关资料报道, DNA定量细胞学检测的检出率从TCT检出率的56%提高到90%以上, 有效降低了漏诊率和误诊率[6], 且DNA定量细胞学检测相对宫颈活检, 具有取样简单、对患者无损伤、操作安全简便[7]等优点, 解决了基层缺乏病理医生的问题, 是一项较好的检测技术。

此外, 采用DNA技术的优越性还体现在对宫颈光滑者的阳性检出率上。一般妇科医生认为宫颈光滑者无需做宫颈癌筛查, 只在出现中、重度宫颈糜烂时才引起重视, 进行TCT。本次研究证实, 宫颈癌前病变的发生与宫颈糜烂程度不成正比。

在检出的21例宫颈癌患者中, 2例腺癌DI较低, 说明DNA检测对腺癌敏感性低。因此应用TCT与DNA定量细胞学检测技术联合诊断的方法可提高宫颈癌前病变及宫颈癌的阳性检出率。

宫颈癌是妇科常见恶性肿瘤之一, 发病率占女性恶性肿瘤的第二位, 严重威胁着妇女健康, 但宫颈癌通过早期筛查和早期干预是可以预防的[8]。我们通过对3 000名门诊体检妇女, 应用TCT与DNA定量细胞学联合检查, 发现TCT对妇科慢性病及腺癌的检出率较高, 而DNA定量细胞学检测对宫颈癌前病变、宫颈原位癌、鳞癌的检出率较高, 同时采用DNA倍体分析系统进行宫颈癌普查有效解决了在基层开展大规模宫颈癌普查缺乏应有的技术和有经验的细胞学医生的问题, 且该方法敏感度较高, 成本效益合理。两种方法的联合应用, 提高了宫颈病变阳性检出率, 可作为一种适合于基层大规模妇女普查宫颈癌的筛查方法予以推广。

摘要：目的 通过对门诊妇科体检妇女进行宫颈新柏氏液基细胞学检测 (TCT) 及DNA定量细胞学检测, 提高宫颈病变检出率, 降低漏诊率, 对降低宫颈癌死亡率具有重要意义。方法 液基制片两张, 一张进行TCT诊断, 一张通过全自动扫描系统进行细胞DNA定量分析, 对两种检查结果阳性的患者, 阴道镜下取宫颈活检确诊。结果 3 000例妇女经宫颈标本TCT及DNA细胞学检测, 妇科疾病患病率为63.00%。查出DNA倍体异常者594例, 异常率19.80%;TCT异常者205例, 异常率6.83%。选取317例DNA异常者或TCT异常者阴道镜下取活检送病理诊断, 确诊慢性宫颈炎37例, 不典型鳞状细胞 (AUSCUS) 28例, 宫颈上皮内瘤变 (CIN) 1级148例, CIN 2级59例, CIN3级24例, 宫颈癌21例。结论 DNA定量细胞学检测阳性率远高于TCT;两者联合检测, 能提高宫颈病变阳性的检出率, 有助于对宫颈癌及其癌变早期诊断, 杜绝了宫颈病变的发生与发展, 为重点人群及早管理提供了机会。

关键词：宫颈癌,DNA定量检测,新柏氏液基细胞学检测

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细胞DNA定量分析 篇10

1 资料与方法

1.1 一般资料

2008年6月—2009年1月在本院妇科门诊就诊的宫颈糜烂或接触性出血患者,年龄23～75岁,自愿接受宫颈细胞学检查和组织学检查者。随机做传统巴氏 涂片176例和DNA-ICM检测446例,并做宫颈活检,其结果作为诊断标准。

1.2 方法

1.2.1 传统巴氏涂片

将宫颈刮板插入子宫颈关内,围绕子宫颈旋转一周,将刮出物涂在玻片上。用95%的酒精固定0.5h,巴氏染色后在光镜下人工阅片,应用巴氏分级分类诊断。

1.2.2 液基薄层制片及染色

用宫颈刷伸入宫颈外口和宫颈管内,旋转325周,取出并拔脱刷头,将刷头向下垂直方向浸泡在样本收集管的固定液内,经化学和物理处理,每例制成2张薄层细胞学片,其中一张巴氏染色做常规细胞学诊断,另一张Feolgen DNA染色做DNA定量测定。

1.2.3 DNA-ICM报告内容的标准与巴氏分级报告内容对比

DNA细胞学诊断根据Rethesda分为5组:(1)正常或良性;(2)不明意义的非典型鳞状上皮细胞(ASC-US);(3)低级别鳞状上皮病变(LSIL);(4)高级别鳞状上皮内病变(HSIL)或原位癌(CIS);(5)鳞状上皮浸润癌。

1.2.4 阴道镜下病理学检查

对DNA-ICM发现非典型异常细胞的182例患者行阴道镜多点化验,以便了解与病理检查结果的符号情况。

2 结果

2.1 巴氏涂片异常结果

巴氏涂片并组织学检查共172例,异常涂片96例,其中非典型细胞64例,HSIL 8例,LSIL 20例,癌4例。与宫颈活检对比见表1。

2.2 DNA-ICM细胞学诊断异常结果

DNA倍体并组织学检查共446例,异常涂片396例,其中癌24例,高度病变30例,低度病变76例,非典型鳞状细胞266例。各类微生物感染206例。阴道镜活检病例与宫颈DNA-ICM诊断对比见表2。

3 讨论

许多国家防癌普查结果证实,用巴氏涂片作为宫颈癌的筛查方法可便宫颈癌死亡率明显下降[7],然而受取材方法、涂片制作、染色技巧、阅片水平等因素影响导致巴氏细胞学方法假阳性率达到15%～40%,巴氏方法与其他常规细胞学病理学诊断方法一样,对宫颈癌前病变的发展趋势无法进行预测评估[8]。DNA-ICM可用于宫颈癌及癌前病变的诊断,DNA异倍体的出现是染色体异常的表现,同时也是一种细胞癌变的特征指标,其次DNA含量在判断细胞的良恶性方面有重要意义。异倍体细胞越多肿瘤细胞分化精度越低,恶性度越高,5年生存率越低。第三DNA-ICM可精确测定DNA含量的改变,作为辅助癌前病变发展趋向的一个有价值指标。第四弥补细胞病理形态学诊断的不足:DNA-ICM是世界最新的定量细胞图像分析系统,其完全自动完成读片,细胞分类,诊断等级过程,具有客观准确及避免认为误差等有点。通过资料中发现对癌的诊断,巴氏涂片约66.66%,而DNA-ICM符合率明显达100%,通过本组对比,证实了DNA-ICM结合阴道镜活检提高了对宫颈早期病变,特别是早期宫颈癌的检查率。因此DNA-ICM有重要的临床应用价值。

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有关DNA复制的考点分析 篇11

例1 DNA复制方式可以通过设想来进行预测，可能的情况是：全保留复制、半保留复制、弥散复制。

[双链DNA分子][全保留复制][半保留复制][弥散复制]

（1）根据上图对三种复制作出可能的假设；①如果是全保留复制，则1个DNA分子形成2个DNA分子，其中一个是 ，而另一个是 ；②如果是半保留复制，则新形成的两个DNA分子，各有 ；③如果是弥散复制，则新形成的DNA分子中 。

（2）究竟是哪种复制方式呢?请同学们设计实验来证明DNA的复制方式。

实验步骤：

Ⅰ．在氮源为14N的培养基上生长的大肠杆菌，其DNA分子均为14N—DNA（对照）。

Ⅱ．在氮源为l5N的培养基上生长的大肠杆菌，其DNA分子均为15N—DNA（亲代）。

Ⅲ．将亲代15 N大肠杆菌转移到含14N的培养基上，再连续繁殖两代（Ⅰ和Ⅱ），用密度梯度离心方法分离。

实验预测：

①如果与对照（14N／14N）相比，子代I能分辨出两条带 和 则可以排除 ；

②如果子代Ⅰ只有一条 ，则可以排除 但不能肯定是 ；

③如果子代Ⅰ只有一条中等密度带，再继续做子代ⅡDNA密度鉴定，若子代Ⅱ可以分出 和 ，则可以排除 ，同时肯定 ；

④如果子代Ⅱ不能分出 密度两条带，则排除 ；

⑤有人提出，第一代（I）的DNA用解旋酶处理后再离心。就能直接判断DNA的复制方式，如果轻带和重带各占一半，则一定为半保留复制。你认为这个说法是否正确 。原因是 ；

⑥实验结果：用图例表示。

解析 全保留复制模型：在全保留复制模型中，母链DNA分开，分别复制形成两条子链DNA，此后两条母链DNA彼此结合恢复原状，新合成的两条子链彼此互补结合形成一个新的双链DNA分子。

弥散复制模型：在弥散（分散）复制模型中，亲代双链被切成双链片段，而这些片段又可以作为新合成双链片段的模板，新、老双链片段又以某种方式聚集成“杂种链”。

半保留复制模型：DNA复制的最主要特点是半保留复制、半不连续复制。在复制过程中，原来双螺旋的两条链并没有被破坏，它们分成单独的链，每一条旧链作为模板再合成一条新链。这样在新合成的两个双螺旋分子中，一条链是旧的，而另外一条链是新的，因此这种复制方式被称为“半保留复制”。

该题对DNA复制的可能方式进行逐一假设，并推理实验的可能结果。解题的关键是要明确14N和15N标记的DNA密度不同，所以进行密度梯度离心后，会在离心管不同位置出现轻（14N／14N）、中（14N／15N）、重（15N／15N）三种带。不同的复制方式离心以后出现的各带情况不同，从而判断复制方式。

答案 （1）亲代的；新形成的；一条链来自亲代DNA分子，另一条链是新形成的；每一条链中一些片段是母链片段而另一些则是子链片段

（2）①一条轻带（14N／14N）、一条重带（15N／15N）；半保留复制和分散复制 ；②中等密度带；全保留复制；半保留复制；③1／2中等密度带和l／2轻密度带；分散复制；半保留复制； ④中、轻；半保留复制；⑤不正确；因为不论是全保留复制还是半保留复制，其第一代用解旋酶处理后，都有一半的单链含14N，一半的单链含15N，离心后都有一半单链在重带，一半单链在轻带 ⑥实验结果见下图。

[轻中重][全轻][全重][全中][1/2轻1/2中][Ⅰ][Ⅱ]

二、DNA精确复制的原因

例2 保证准确无误地进行DNA复制的关键步骤是（ ）

A．解旋酶促使DNA的两条互补链分离

B．游离的脱氧核苷酸与母链碱基进行互补配对

C．配对的脱氧核苷酸之同连接成与母链互补的子链

D．模板母链与互补子链盘绕成双螺旋结构

解析 DNA复制准确无误的关键有两点：①复制时严格地以两条母链为模板进行复制；②合成子链时严格地遵守碱基互补配对原则。从而保证合成的子代DNA与亲代DNA携带完全相同的遗传信息，保证了遗传信息的准确传递。

答案 B

三、DNA高效复制的原因

例3 下图为真核生物染色体上DNA分子复制过程示意图，有关叙述错误的是（ ）

[复制起点]

A．图中DNA分子复制是从多个起点同时开始的

B．图中DNA分子复制是边解旋边双向复制的

C．真核生物DNA分子复制过程需要解旋酶

D．真核生物的这种复制方式提高了复制速率

解析 真核生物的DNA分子可以从多个起点发动复制，但不是同时开始的，其先后顺序受内部各因素的严格调控，复制时在解旋酶的作用下边解旋边双向复制，这种方式提高了复制效率。且每个复制起点在全部复制完成之前不再从新发动复制。另外原核生物DNA分子只有一个复制起点且可以连续发动复制。

答案 A

四、DNA复制的条件

例4 下列试管中可模拟遗传信息的流动，其中模拟DNA复制过程的是（ ）

解析 解答本题首先应明确DNA复制条件，再逐个选项分析。DNA复制条件需要以下条件：模板—DNA；原料—脱氧核苷酸为原料；酶—解旋酶、DNA聚合酶等；能量—ATP等条件；同时还要保证适宜的温度PH值及正常细胞的内环境等。

由图中的信息可知只有A模拟DNA复制过程。

答案 A

五、与DNA复制相关的酶

例5 下列哪些酶与DNA复制无关（ ）

A．解旋酶 B．DNA聚合酶

C．DNA连接酶 D．限制性内切酶

解析 本题重点考查与DNA复制相关的酶的知识，与DNA复制相关的酶有：解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶。限制性内切酶是基因工程技术中提取目的基因时常用到的酶。

几种酶的作用及作用部位列表比较如下：

答案 D

六、DNA复制的有关计算

例5 已知某DNA分子含有1000个碱基对，其中一条链中A：G：T：C=1:2:3:4；该DNA分子连续复制了3次，下列说法正确的是（ ）

A．共形成了8个DNA分子，其中有7个DNA分子中的脱氧核苷酸长链完全是新合成的

B．新合成的子代DNA分子中，A：G：T：C＝l：2：3：4

C．第3次复制时，需要周围环境中1600个含A的脱氧核苷酸

D．3次复制共需周围环境中4800个含G的脱氧核苷酸

解析 解答本题时，应先求出每个DNA分子中各类碱基的数量。再结合半保留复制的特点，逐项计算。

假设将1个全部被15N标记的DNA分子（0代）转移到含14N的培养基中培养n代，则DNA分子数：子代DNA分子总数=2n个；含15N的DNA分子数=2个；含14N的DNA分子数=2n个；只含15N的DNA分子数=0个；只含14N的DNA分子数=（2n-2）个。脱氧核苷酸链数：子代DNA分子中脱氧核苷酸链数=2n+1条；含15N的脱氧核苷酸链=2条；含14N的脱氧核苷酸链=（2n+1-2）条。

设亲代DNA分子中含有某种脱氧核苷酸m个，则经过n次复制，共需消耗游离的该脱氧核苷酸（2n-l）m个；在第n次复制时，共需消耗游离的该脱氧核苷酸m•2n—1 个。

答案 C

[【练习】

1．指出以下哪项不是DNA复制的条件（ ）

A．解旋酶、聚合酶等酶；

B．聚合成多核苷酸的原料——单核苷酸

C．DNA模板和能量；

D．逆转录酶

2．DNA分子复制时，解旋酶作用的部位应该是（ ）

A．腺嘌呤与鸟嘌呤之间的氢键；

B．腺嘌呤与胸腺嘧啶之间的氢键

C．脱氧核糖与含氮碱基间的化学键

D．脱氧核糖与磷酸间的化学键

3．一个由l5N标记的DNA分子，放在没有标记的环境中培养，复制5次后含15N标记的DNA分子占DNA分子总数的（ ）

A．1/10 B. 1/5 C. 1/16 D. 1/25

4．保证准确无误地进行DNA复制的关键步骤是（ ）

A．解旋酶促使DNA的两条互补链分离

B．游离的脱氧核苷酸与母链碱基进行互补配对

C．配对的脱氧核苷酸之闯连接成与母链互补的予链

D．模板母链与互补子链盘绕成双螺旋结构

5．实验室内模拟生物体DNA的复制必需的一组条件是（ ）

①酶 ②游离的脱氧核苷酸 ③ATP ④DNA分子 ⑤mRNA ⑥tRNA ⑦适宜的温度 ⑧适宜的酸碱度

A．①②③④⑤⑥ B. ②③④⑤⑥⑦

C．②③④⑤⑦⑧ D. ①②③④⑦③

6．DNA复制过程很快，大肠杆菌含有一个DNA分子， 约有500万个碱基，条件合适，0.5小时内即可完成一个复制过程，细胞也分裂为二。人的细胞有46个DNA分子，碱基对多达40亿个，复制一次也不超过几小时，并且很少出现错误。这是因为DNA的复制是（ ）

A．边解旋边复制

B．每个复制点双向复制，使子链迅速蔓延

C．以半保留方式复制

D．复制起点多，分段同时复制，遵循碱基互补配对

7．DNA聚合酶是DNA复制过程中必需的酶，下图中的曲线a表示脱氧核苷酸含量，曲线b表示DNA聚合酶的活性。由图可以推知（ ）

[含量或活性][间期][a][b]

A．同期是新的细胞周期的开始

B．间期细胞内发生蛋白质的合成

C．间期细胞内RNA复制

D．间期细胞内发生DNA复制

8．1958年，梅塞尔森和斯塔尔做了如下实验：将大肠杆菌放在含15NH4C1的培养基中繁殖几代，其DNA由于l5N的加入，而比普通大肠杆菌的DNA重l％，再将含15N的DNA大肠杆菌移到含14NH4CI的培养基中繁殖一代。其DNA的重量为中间类型。如果再继续繁殖一代，结果出现两种重量的DNA，即中间型和轻型。提取所有这些不同重量的DNA分子放在离心机内离心3 h（如下图所示），结果这些DNA在试管内分成三条带。请分析说明：

DNA分离情况]

（1）a带的DNA是（ ），b带的DNA是（ ）

A．两条单链都含15N

B．两条单链都含14N

C．一条单链含l5N，另一条单链含14N

（2）以上实验证明了 。

【参考答案】

1~7．DBCBDDD

细胞DNA定量分析 篇12

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取笔者所在医院2011年1月-2013年12月自愿接受宫颈癌筛查的276例女性为研究对象, 年龄24~51岁, 平均 (39.2±3.5) 岁, 排除肝肾功能严重障碍、妊娠哺乳期、精神异常等患者。文化程度:大专及以上学历者100例 (36.23%) , 中学学历者132 (47.83%) , 小学及以下学历者44例 (15.94%) 。

1.2 方法

276例自愿接受宫颈癌筛查的女性分别行HPV-DNA亚型检测、液基细胞学检查及HPV-DNA亚型检测联合液基细胞学检查。其中HPV-DNA亚型检测通过导流杂交基因芯片技术实现, 检测仪器选用美国ADI型号扩增仪, 严格按照仪器操作说明书及试剂盒使用说明书操作, 先进行宫颈细胞取样, 然后通过杂交捕获法检查HPV-DNA。液基细胞学检查通过薄层液基细胞学技术实现, 检测仪器选用Thin Prep采样器, 严格按照取样步骤及要求对宫颈外口及宫颈管脱落细胞取样, 并保存在Thin Prep标本瓶中, 然后进行检查、阅片及诊断。另外HPV阳性或TCT为ASCUS用阴道镜活检:帮助女性选取正确的卧位, 科学插入阴道镜, 观察宫颈移行上皮及血管变化情况, 之后进行碘溶液试验, 并将其试验部位宫颈组织活检, 并做好病理检查结果记录。

1.3 检测评定标准

HPV-DNA亚型检测标准:检测值在1.0 pg/ml以上为阳性, 测定值在1.0 pg/ml以下时为阴性;液基细胞学检查标准:以TBS分级评价系统为主, 包括LSIL (低级别鳞状上皮内病变) 、NILM (恶性病变或无上皮病变) 、HSIL (高级别鳞状上皮内病变) 、SCC (鳞状细胞癌) 、ACS·US及ASC-H (不典型鳞状上皮细胞) 。其中病变组织为高级别鳞状上皮内病变、低级别鳞状上皮内病变、不典型鳞状上皮细胞及鳞状细胞癌。

1.4 统计学处理

采用SPSS 14.0软件对所得数据进行统计分析, 计量资料用均数±标准差 (±s) 表示, 比较采用t检验, 计数资料采用χ2检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPV-DNA亚型检测结果

HPV16、HPV18检出阳性人数明显高于其他HPV亚型, 比较差异均有统计学意义 (P<0.05) 。详见表1。

例

2.2 液基细胞学检查结果

ASC、LSIL、HSIL检出率分别为第1位、第2位及第3位, 与病理学检测符合率比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。详见表2。

例

2.3 HPV-DNA、液基细胞学、HPV-DNA亚型检测联合液基细胞学检查情况比较

HPV-DNA亚型检测联合液基细胞学阳性检出32例, 阳性检出率为率74.42% (32/43) , 单独HPV-DNA阳性检出人数为28例, 阳性检出率为68.29% (28/41) , 单独液基细胞学阳性检出人数22例, 阳性检出率为68.75% (22/32) 。详见表3。

例

3 讨论

相关报道表明全球每年新增宫颈癌发患者数为56.6万, 其中中国宫颈癌患者数所占比例为32.12%, 且宫颈癌死亡率为16.53%[5]。相关研究表明宫颈癌发病的最主要因素之一是HPV (高危型人乳头状瘤病毒) , 它是一个不断发展变化的过程, 从不典型病变到癌变大概需要8-10年的时间[6]。早期症状不明显, 但一旦出现癌变则生长快速, 这就是很多患者临床就诊时多为宫颈癌中晚期的主要原因[7]。因此定期进行身体检查, 早期筛查宫颈癌具有十分重要的临床意义及现实意义。

2004年美国癌症协会制定了一份宫颈癌普查指南, 认为性交史超过3年的女性要进行宫颈癌普查, 超过30岁的女性每年要进行宫颈癌细胞学检查;若3次细胞学检查结果为阴性 (或正常) 且70岁以前无异常时间超过10年以上者便可停止筛查[8]。随着现代医疗技术的不断发展和进步, HPV-DNA亚型检测与液基细胞学逐渐成为宫颈癌筛查的主要手段。其中HPV-DNA检测方法主要是对人乳头状瘤病毒进行检查, 这是因为众多文献表明人乳头状瘤病毒感染是引发宫颈癌的首要因素[9]。当下临床上确定的人乳头状瘤病毒类型有110多种, 其中与生殖道病变密切相关的有30余种, 与肿瘤有关的有20种左右, 有99.7%的宫颈癌均能检测到高危人乳头状瘤病毒基因, 如人乳头状瘤病毒基因16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68, 而这些高危型人乳头状瘤病毒不间断感染是引发宫颈癌的最主要原因[10,11]。本研究HPV-DNA亚型检测出的高危型人乳头状瘤病毒主要有HPV58、HPV33、HPV31、HPV18、HPV16, 检测出的阳性人数分别为1、2、0、9、17例, 由此可见HPV16、HPV18检出阳性人数明显高于其他HPV亚型, 比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。而液基细胞学是传统巴氏涂片的发展和延伸, 具有涂片更薄、细胞无重叠、染色清晰、白/红细胞影响小、操作方便、快速等优点。HPV-DNA亚型检测联合液基细胞学检查结果相比单独检测有显著差异, 表明两组检测对宫颈癌筛查效果更佳。

芮平[12]对1462例自愿接受宫颈癌筛查的女性分别行HPV-DNA亚型检测及液基细胞学检查, 且对出现阳性的患者进行病理组织学检查, 结果表明HPV+TCT对宫颈癌早期病变及癌变检查率为69.67%, HPV检出率为56.28%, TCT检出率为63.89%。张瑞雪[13]将120例宫颈上皮内瘤变及宫颈癌患者分为接受HPV-DNA亚型检测联合液基细胞学检查的观察组及单纯接受液基细胞学检查的对照组, 人数分别为68例和52例, 观察组HPV-16阳性检出率为79.41%, HPV-18阳性检出率为67.65%, 明显高于对照组, 两组比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。虽然具体分组情况不一样, 但均表明HPV-DNA亚型联合液基细胞学检测对宫颈癌早期发现及诊断有较大的临床价值。本研究在前人的基础上对自愿接受宫颈癌筛查的276例女性分别行HPV-DNA亚型检测、液基细胞学检查及HPV-DNA亚型检测联合液基细胞学检查, 亚型检测联合液基细胞学对宫颈癌早期病变及癌变检出率74.42%, 单独HPV-DNA检出率为68.29%, 单独液基细胞学检出率为68.75%。另外, HPV-DNA亚型检测联合液基细胞学对CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、癌的检出率分别为88.24%、75.00%、85.61%、100%。由此可见相比单独PV-DNA亚型检测、单独液基细胞学检查, HPV-DNA亚型检测联合液基细胞学对宫颈癌筛查检出率更准确、可靠。

综上所述, 亚型检测联合液基细胞学早期筛查癌变检出率较高, 为临床诊断及治疗提供重要依据。

摘要：目的:探讨HPV-DNA亚型检测联合液基细胞学对宫颈癌筛查的应用价值。方法:选取笔者所在医院2011年1月-2013年12月自愿接受宫颈癌筛查的276例女性为研究对象, 对其分别采取HPV-DNA亚型检测、液基细胞学检查及HPV-DNA亚型检测联合液基细胞学检查, 对阳性患者行病理组织学检查。结果:HPV-DNA亚型检测联合液基细胞学对宫颈癌早期病变及癌变检出率74.42%, 单独HPV-DNA检出率为68.29%, 单独液基细胞学检出率为68.75%。另外, HPV-DNA亚型检测联合液基细胞学对CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、癌的检出率分别为88.24%、75.00%、85.61%、100%。结论:HPV-DNA亚型检测联合液基细胞学检查癌前病变检出率较高, 且安全、简便, 可作为宫颈癌筛查的重要手段。