流式细胞课题（精选5篇）
流式细胞课题 篇1
流式细胞仪分析技术及应用-------温医细胞生物学技术
流式细胞仪分析技术及应用
第一节 概述
第二节 数据的显示与分析
第三节 流式细胞仪技术要求
一、工作原理
一、参数
一、免疫检测样品制备
二、散射光的测定
二、数据显示方式
二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色
三、荧光测量
三、设门分析技术
三、免疫胶乳颗粒的应用
四、细胞分选原理
四、流式细胞技术的质量控制
第四节 流式细胞仪技术的要求
第五节、流式细胞仪的科研应用
第六节
流式细胞术在临床检测中的主要应用 流式细胞术(flow cytometry, FCM)亦称荧光激活细胞分选器(fluorescence-activated cell sorting, FACS):是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。/是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。/广泛应用于基础研究和临床实践各个方面，包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等。
流式细胞术发展史
1930年Caspersson和Thorell开始致力于细胞计数的研究
1934年Moldaven最早设想细胞检测自动化，用光电仪记录流过一根毛细管的细胞 1940年Coons提出结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白 1949年Wallace Coulter申请了在悬液中计数粒子的方法的专利 1950年Caspersson用显微UV-VIS检测细胞
1953年Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理，成功设计红细胞光学自动计数器 1969年Van Dilla及其同事在Los Alamos, NM发明第一台荧光检测细胞计 1972年Herzenberg研制出细胞分选器
1975年Kohler等提出单克隆抗体技术，为细胞研究提供大量的特异免疫试剂
目前国内主要流式细胞仪厂家：Beckton Dickinson(BD)公司；BACKMAN COULTER公司
流式细胞术的特点：最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量
主要特点 ：1.单个细胞水平分析；2.多参数分析（同时多种荧光素标记）水平分析；3.灵敏度高；4.可分析大量细胞；5.速度快： 5000-10000个细胞/秒；6.统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况；7.分选感兴趣的细胞：血细胞、骨髓、组织培养细胞等。
第一节 概述
流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。分为三大类：(1)类为台式机（临床型）：仪器的光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握。(2)类为大型机（科研型）特点：分辨率高，可快速将所感兴趣的细胞分选出来，并可以将单个细胞或指定个数的细胞分选到特定的培养孔或培养板上，同时可选配多种波长和类型的激光器，适于更广泛更灵活的科学研究应用。(3)类为新型流式细胞仪：15 个参数同时分析。高速分选速度达到50,000 个/秒，并可进行遥控分选，能够满足多种科学研究的要求。流式细胞仪常检测的细胞特性 细胞组成 细胞功能
一、工作原理 大小
细胞表面/胞浆/核--特异性抗原
①采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发 粒度
细胞活性
效率；②利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，DNA, RNA含量
胞内细胞因子
保证检测的灵敏度和特异性；③用计算机系统对流动的单细 蛋白质含量
激素结合位点
胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证 钙离子, PH值, 膜电位 酶活性
了检测速度与统计分析精确性。概括为三个系统结构：（1）液流系统：由样本和鞘液组成。鞘液（PBS或生理盐水）：主要作用是包裹样本流的周围，样品流在鞘液的环包下形成流体力学聚焦，包裹的细胞排列成单行，以每秒5000个-10000个细胞，每秒10米速度流动室喷出，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。鞘液在整个系统运行中流速是不变的。改变样本的进样速率开关，可提高采样分析的速度。
（2）光学系统：大多采用氩离子气体激光器。每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射 流式细胞仪分析技术及应用-------温医细胞生物学技术 的时间和激发光的强度有关，因此细胞必须达到足够的光照强度。激光光束在达到流动室前，先经过透镜形成光斑，这种椭圆形光斑激光能量分布属正态分布，为保证样品中细胞受到的光照强度一致。激光光束与细胞液流呈90°角方向照射，细胞产生散射光和荧光。
主要光学原件是滤光片，主要分成3 类：
1、长通滤片：（LP）：LP500滤片允许500μm 以上光通过，而500μm 以下光吸收或返回。
2、短通滤片（SP）：与长通滤片相反，如SP500 滤片允许500μm 以下光通过，500μm 以上光吸收或返回。
3、带通滤片（BP）：带通滤片可允许相当窄的一波长范围内光通过，一般滤片上有两个数，一个为允许通过波长的中心值，另一为允许通过光的波段范围。如BP500 表示其允许通过波长范围为75μm-525μm。
（3）数据处理系统
流式细胞仪与显微镜的区别
区别
流式细胞仪
显微镜
光源
激光
自然光、灯光 对象
细胞、生物粒子
细胞、组织等 承载工具 鞘液及流动室
载玻片 检测信号 光学信号
形态及染色 放大方式 PMT、放大电路 目镜×物镜、光学放大 统计
计算机，>5000 人工，200 结果
多参数，综合分析 简单，单参数
二、散射光的测定
散射光信号不依赖任何样品的制备技术（如染色），因此称为细胞的物理参数。（波长与激光相同。）主要分为: ①前向散射光（0°散射）FSC：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。
②侧向散射光（90°散射）SSC：激光束照射细胞时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内精细结构和颗粒属性，即细胞膜、胞质、核膜结构性质。
目前采用FSC（表示细胞大小）SSC（表示细胞内颗粒的复杂程度）这两个参数组合，检测FSC与SSC信号通过计算机处理，可得到FSC-SSC图，可区分裂解红细胞处理后外周血白细胞中淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞三个细胞群体，或在未进行裂解红细胞处理的全血样品中找出血小板和红细胞等细胞群体。
三、荧光信号（FL）测量
当激光光束与细胞正交时，一般产生两种荧光信号：
①一种是细胞自发荧光：细胞自身在激光照射下，发出微弱荧光信号；
②另一种是经过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光信号，由于 90o 方向的散射光信号较弱，容易分离出荧光信号，因此此方向上放置必要的光学元件（滤光片、双色分光镜等），可以获取荧光信号。
通过收集两种以上不同波长的荧光信号FL1、FL2进行检测和定量分析，就能了解所研究细胞参数的存在与定量，反映生物颗粒表面和内部的各种情况。
常配置的激光器波长为488nm。
633nm激光管常用染料有APC、APC-Cy
荧光信号的宽度（如FL2-W）常用来区分双联体细胞，由于DNA 样本极易聚集，当两个G1 期细胞粘连在一起时，其测量到的DNA 荧光信号（FL2-A）与G2M 期细胞相等，这样得到的测量数据G2M 期细胞比率会增高，影响测量准确性。通过设”门”（gate）方法，将双联体细胞排除。其原理是双联体细胞所得到的荧光宽度信号（FL2-W）要比单个G2M 细胞大，因此设”门”后才能得到真正的DNA 含量分布曲线和细胞周期。不过通过荧光强度的高度峰和面积峰也可做同样分析。
四、细胞分选原理（图示见上）
通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。快速精度分选纯度90%-99%，且细胞活性不受影响。
1、细胞分选时，液流在驱动力作用下断成高度均一的液滴。在喷嘴下几毫米处，液滴从液流断开。
2、从颗粒被检测到液滴断开的时间由Accudrop技术直接计算。
3、符合分选条件的颗粒一旦被检测到，包含该颗粒的液滴断开时，液滴被充电。断开后的液滴仍然带电，带电的液 流式细胞仪分析技术及应用-------温医细胞生物学技术
滴通过被充电的偏转板。受到静电吸引或排斥，带电液滴将向左或右偏转。未带电的液滴不偏转而流入废液槽。检测指标：阳性百分率、绝对计数、平均荧光强度
（二）FCM 分选指标
分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。一般要求分选速度至少达5 000个／秒左右，以保证被分选细胞的生物学活性不受影响。
分选纯度：被分选出的细胞所占的百分比，分选纯度与仪器的精密度直接相关，与实验设计的选择密切相关，可达到99%。
分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。
分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。第二节 数据的显示与分析
常用数据显示方式：单参数直方图、双参数散点图、二维等高图、假三维等高图、三参数散点图、设门分析技术
目前FCM 数据存贮的方式：采用列表排队方式。目前FCM 所采用的都是多参数指标，荧光参数标记物如是4 个，采用list mode 方式可大量地节约内存和磁盘容量。当一个细胞被测4 个参数，那么获取10000 个细胞，所占容量为4×10000 个（字或双字）。同时当只检测1 个参数时（如DNA），可灵活的关闭其它3 个参数，节省3/4 的空间数据的显示通常有一维直方图、二维点图、等高线图、密度图等几种。
一、参数
FSC：反映颗粒的大小。SSC：反映颗粒的内部结构复杂程度。FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少。
二、数据显示方式
（一）单参数直方图---------由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度（FSC、SSC、FL1、FL2）四个参数的任何一个值。其单位是信道，横坐标可以是线性的，也可以是对数的，纵坐标一般是细胞数。
（二）双参数直方图---------双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。常用的表达方法有二维点图,等高线图,二维密度图。在二维图中，任选FSC、SSC、FL1、FL2 中二个参数作为X 轴、Y轴，在二维图上每个点代表一个细胞，可以区分细胞性质不同的群体；X 坐标为该细胞一参数的相对含量，而Y 坐标为该细胞另一参数的含量。在双参数图形中可以将各细胞亚群区分开，同时可获得细胞相关的重要信息。
（三）二维等高图---------由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。曲线层次越高(越里面的线)所代表的细胞数愈多。等高线越密集则表示细胞数变化率越大。
（四）三参数直方图---------在三维图中，任选FSC、SSC、FL1、FL2 中二个参数作为X 轴、Y轴，Z轴为细胞数，构成三维图。
（五）流式细胞仪的多参数分析---------多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。
三、设门分析技术
Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。
FCM的分辨率：分辨率是衡量FCM测量精度的指标，通常用变异系数CV表示。一般要求CV<8，最好CV<3。第四节 流式细胞仪技术的要求
一、免疫检测样品制备
细胞样品制备要求：
1、单细胞悬液；
2、细胞最适密度0.5×106-1.5×106个/ml；
3、荧光染色后尽量洗净细胞外多余染料，减少荧光本底；
4、双染色时尽量选择发射光谱不接近的荧光色素，产生易区别的两种荧光颜色；
5、如果细胞分选后继续培养，细胞样品制备和上机应该无菌操作。外周血淋巴细胞样品的制备：分离单个核细胞
培养细胞的样品制备：蛋白酶消化-----机械吹打-----使贴壁细胞脱落-----洗涤-----尼龙网过滤 新鲜实体组织单细胞悬液的三种制备：
单细胞悬液的保存： 流式细胞仪分析技术及应用-------温医细胞生物学技术
机械法（金属网引起细胞破碎）
深低温保存法（一年）酶处理法（选择最适宜消化酶）
乙醇或甲醇保存法（2周）化学试剂处理法（导致细胞成活率降低）
甲醛或多聚甲醛保存法（2月）表面活性剂处理法 注意事项：
1、新鲜组织标本应及时进行处理保存；
2、根据实验目的选择最隹的固定方法；
3、酶学法要注意条件的选择和影响因素，要注意酶的溶剂，消化时间、pH 值、浓度等方面对酶消化法的影响。
4、需注意不同组织，选择相应的方法；如富于细胞的组织——淋巴肉瘤、视神经母细胞瘤、脑瘤、未分化瘤、髓样癌以及一些软组织肉瘤等，不一定采用酶学法或化学法；往往用单纯的机械法就可以获得大量高质量的单分散细胞；
5、在使用酶学方法时，要重视酶的选用，如含有大量结缔组织的肿瘤——食管癌、乳腺癌、皮肤癌等，选用胶原酶较好。
二、常用的荧光染料与标记染色 适用条件: ①有较高的量子产额和消光系数；②荧光强度与光量子产额之间的关系由下式表示：F=Q(I-eεCL)F 表示荧光强度，Q 表示光量子产额，I 表示激发光强度，￡表示消化系数，C 表示染液浓度，L 表示溶液厚度。③对488nm的激发光波长有较强的吸收；④发射光波长与激发光波长间有较大的波长差；⑤易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性 荧光素发射荧光的基本原理：荧光素受到一定波度（激发波长）的激光激发后，其原子核外的电子由于吸收了激光的能量，由原本运动处于基础态轨道跃迁到激发态轨道上运动，然后当电子由激发态重新回到基础态时，释放出能量并发射出一定波长（发射波长）的荧光。
1、要选择正确的激光器：不同荧光素用不同的激发光波长的激发光来激发：
FITC 和PE 等的激发波长均为488nm，用产生可见光的氩离子激光器；APC 和PC5 等的激发波长在红光范围，需使用发射630nm 波长红光的氦-氖激光器。
2、各种荧光素的发射波长也十分重要，据此可以确定其检测所需光电倍增管性质； 如FITC，被激光激发后发射绿光，检测时要使用第一光电倍增管（即PMT1）；PE 则发射橙色光，需用第二光电倍增管（即PMT2）；PC5 和PerCP 等，发射的是深红色光，这时需选择第三甚至第四光电倍增管（即PMT3 或PMT4）,等等
常用的几类荧光染料
（二）免疫荧光标记
名称染料激发发射光溶解性对PH敏感特点荧光染料与细胞成分的四种结合方波长或荧光性式
结构亲和式
颜色
嵌入结合 共价键结合 异硫氰酸荧FITC488绿 易敏感易溶于水，与抗体结光素合不影响特异性52
5荧光标记抗体特异性结合 得州红Texas 568红 不易不敏感稳定，偶联后量子产免疫荧光标记方法
red额低615直标：干扰少,但需购买多种单抗
藻红蛋白PE488橙间标：步骤多,干扰多,不需标记多种575抗体
易不敏感具较多发光基团，消藻青蛋白PC488红组合标记
光系数和量子产额高
别藻青蛋白APC633红 670 能量传递复PEcy5488红易不敏感减少交叉，成本高 合染料670
三、免疫胶乳颗粒技术的应用-----液相芯片技术
是把微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把针对不同检测物的乳胶微球混合后再加入待标本，在悬液中与微粒进行特异性地结合，经激光照射后不同待测特产生不同颜色，并可进行定量分析。因检测速度极快，所以又有“液相芯片”之称。流式细胞仪分析技术及应用-------温医细胞生物学技术
四、流式细胞技术的质量控制
（一）单细胞悬液制备的质控
（二）免疫荧光染色的质控 适当的制备方式（不同标本来源外周血、骨髓、培养细胞等）
温度 试剂选择
pH 样品处理（蛋白质浓度、缓冲液、细胞条件、活性、自发荧光等）
染料浓度 实体组织来源标本用机械法
固定剂 温度25~37℃，pH7.0~7.2
（三）仪器操作的质控
光路与流路校正: 确保激光光路与样品流处于正交状态，减少变异（CV）。PMT（光电倍增管）校准: 保证样品检测时仪器处于最佳灵敏度工作状态。绝对计数校准: 保证计数的准确性。
（四）免疫检测的质控
同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，选用相同源性的未标记单抗作为对照调整和设置电压，以保证特异性。全程质量控制：与待测标本一起标记和检测，结果达靶值，提示本次实验结果可靠。第五节、流式细胞仪的科研应用
1、细胞表型分析
2、胞内蛋白的检测
3、细胞周期和DNA倍体分析
4、流式标准小球定量
5、分选
6、细胞内钙离子测量
第六节、流式细胞术的临床应用
1、细胞周期和DNA含量分析
2、细胞凋亡的检测和分析
3、血小板及血小板活化的FCM 分析
4、造血干细胞（CD34+细胞）的检测
5、白血病和淋巴瘤免疫分型
6、网织红细胞分析
7、残余白血病检测
8、淋巴细胞亚群分析
9、肿瘤耐药基因分析
10、AIDS病检测中的应用
11、自身免疫病相关HLA抗原分析
12、移植免疫中的应用
1、DNA 含量分析检测原理：DNA 含量常和某种细胞周期相关蛋白同时检测，来分析细胞处于某一特定周期阶段。恶变肿瘤细胞一般多出现异倍体，有很多研究证明DNA 含量分析对人肿瘤的诊断预后有很高的价值。荧光染料和细胞 DNA 分子特异性结合具有一定的量效关系： ① DNA 含量多少与荧光染料的结合成正比；
② 荧光强度与DNA 分子结合荧光素多少成正比；
③ 荧光脉冲与直方图的通道值成正比。因此，FCM-DNA 定量分析1 个细胞增殖群时，可将二倍体DNA 含量分布组方图分为三部分：
即G0/
1、S、G2M ；G0/1和G2M 细胞峰的DNA 分布均为正态分布，S 期可以认为是一个加宽的正态分布。在癌组织DNA 直方图上，异倍体峰前总可以见到1 个或大或小的二倍体峰位的G0/1 细胞峰。另外，显微图象分析仪做异倍体检测时，都采用组织中淋巴细胞做对照。
在同一个肿瘤的不同区域、或原发肿瘤和继发、或转移灶、或随肿瘤病程发展、或经治疗的肿瘤灶，其DNA 倍性可能有所变化，这种倍体类型的差异，称为DNA 倍体异质性。DNA分析的临床意义
DNA分析诊断肿瘤：----DNA非整倍体细胞峰-----突出的四倍体细胞峰
DNA倍体分析：结合临床病理的形态学诊断，对一些恶性肿瘤进行早期诊断，跟踪随访和早期治疗，大大提高一些肿瘤的治愈率和生存率。尤其对一些细胞抽吸物、体液、组织液的脱落细胞的分析，意义尤为重要。增殖状态分析：反映了肿瘤的生长速度和侵袭性 FCM在肿瘤早期诊断和鉴别诊断中的作用
DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标志 在病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信息 DNA非整倍体的交界瘤应按恶性对待
形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可能 DNA指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标 细胞凋亡------（1）、早期细胞凋亡的流式细胞术检测：半胱氨酸蛋白酶3（caspases-3）
-------（2）晚期细胞凋亡的流式细胞术检测：DNA 含量分析法：目前检测凋亡细胞DNA 断裂的方法中，最常用、最简便的就是DNA 含量分析；DNA 直方图上显示在G0/1 峰前出现一个DNA 含量减少的亚二倍体或称亚G0/1 峰，又称凋亡细胞峰
流式细胞课题 篇2
1 故障现象
仪器加压，放好上样管，使控制面板处于RUN模式，但RUN指示灯颜色显示为黄色，仪器未能达到READY状态，仪器无法进样。
2 故障分析及处理
此情况多是由压力问题而造成，导致样本不能顺利进入流动池进行检测。逐步查找故障原因：(1)确保压力阀处于加压位置;(2)确认鞘液筒是否漏气;(3)检查鞘液筒上的蓝色接口是否连接好;(4)检查样本管是否破损;(5)检查上样针上的Bal Sael是否磨损。经过仔细检查发现，在仪器加压状态下，鞘液筒仍可以前后移动，初步分析是由于鞘液筒漏气，导致仪器压力异常，系统无法进样。仪器减压，重新盖紧鞘液筒盖后，仪器加压，RUN指示灯仍显示为黄色，仪器仍无法进样，进而考虑可能为仪器内部管路漏气所致。打开仪器右侧机盖，真空泵正常震动，且仪器内管路连接完好无掉落。拧下鞘液筒盖，盖中的气孔正常有气体冒出。逐一排除以上故障原因后，最终判断是鞘液筒损坏而导致仪器压力异常。更换新的鞘液筒，盖紧鞘液筒盖，仪器加压，RUN指示灯显示为绿色，仪器恢复正常。
3 预防措施
每次开机时要检查鞘液筒是否被正常加压，且关机时要记得给仪器减压，使鞘液筒解除压力。
参考文献
流式细胞术及其应用 篇3
关键词：流式细胞术；工作原理；临床应用
中图分类号：R197.39 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2014）10-0068-02
1 流式细胞仪的结构及工作原理
流式细胞仪主要分为科研型（又称大型机、分析型）和临床型（又称小型机、台式机）两类，科研型的仪器功能齐全，分析灵活，但操作较繁琐，必须由经过培训的专业人员进行操作；临床型的仪器易于操作，稳定性好，分析速度快，适合在临床实验室应用。流式细胞仪主要由以下五部分构成：①流动室及液流驱动系统；②激光光源及光束形成系统；③光学系统；④信号检测与存储、显示、分析系统；⑤细胞分选系统。其主要技术指标有分析速度、荧光检测灵敏度、前向角散射（FSC）光检测灵敏度、分辨率、分选速度等。流式细胞仪的工作原理是将待测标本制成单细胞悬液，经特异性荧光染料染色后放入样品管中，在气体的压力下进入充满流动的鞘液；当鞘液压力和样品压力的压力差达到一定程度时，在鞘液的约束下细胞排列成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱经过激光聚焦区，与入射的激光束垂直相交，经特异性荧光染料染色的细胞被激光激发产生特定波长的荧光；仪器中一系列光学系统，如透镜、光阑、滤片和检测器等，收集荧光、光散射、光吸收或细胞电阻抗等信号；计算机系统进行收集、储存、显示并分析被测定的各种信号，对各种指标做出统计分析。科研型流式细胞仪还可以根据所规定的参量把指定的细胞亚群从整个群体中分选出来，其分选原理是把液滴形成的信号加在压电晶体上使之产生机械振动，流动室即随之振动，使液柱断裂成一连串均匀的液体。一部分液滴中包有细胞，而细胞特征是在进入液滴以前已经被测定了的，如果其特征与被选定要进行分选的细胞特征相符，则仪器在这个被选定的细胞刚形成液滴时给整个液柱充以指定的电荷，使被选定的细胞形成液滴时就带有特定的电荷，而未被选定细胞形成的细胞液滴和不包含细胞的空白液滴不被充电。带有电荷的液滴向下落入偏转板的高压静电场时，按照所带电荷符号向左或向右偏转，落入指定的收集器内，完成分类收集的目的。对分选出的细胞可以进行培养或其他处理，做更深入的研究。
2 临床应用
2.1 在肿瘤学中的应用
流式细胞术的出现给肿瘤的病理学诊断带来了飞跃，特别是用流式细胞术分析细胞DNA含量，分辨率高、精确度好，可为判断肿瘤的生物学行为提供客观而准确的资料，辅助肿瘤的早期诊断和鉴别诊断。癌前病变是指某些具有癌变潜能的病变，正确识别癌前病变对早期诊断和预防恶性肿癌具有重要的实际意义。有人发现流式细胞术检测肿瘤胸腔积液DNA指数、RNA指数、PCNA的流式细胞术检测结果对于恶性胸腔积液的诊断具有一定的价值，特别是对于部分细胞学检测阴性的恶性胸腔积液的诊断可能具有重要的临床意义。DNA、RNA同时检测对于诊断DNA正常而RNA发生异常改变的恶性胸腔积液具有重要价值，可以弥补单项DNA检测的不足。三者联合检测对于恶性胸腔积液的诊断价值大于单项或两项联合检测，具有较低的漏诊率和误诊率。有人通过研究发现流式细胞术可以准确地对细胞周期蛋白在临床实体瘤中的表达进行定性、定量、定位的分析，较为系统地反映了细胞周期蛋白在临床实体瘤中的表达特性和肿瘤的生物学特性。还有人发现流式细胞术可以提高颈淋巴结隐匿转移的检出率，与半连续切片HE染色法有差异，可以作为口腔鳞癌颈淋巴结隐匿转移的检测方法。隐匿转移与肿瘤原发灶部位、病理分级临床T分期无相关关系。有人应用流式细胞术检测35例多发性骨髓瘤患者的细胞表面的CD38、CD138、CD19、CD56、CD45、CD44抗原的表达情况，可以区分骨髓瘤和良性浆细胞，是多发性骨髓瘤的重要诊断依据。
2.2 在免疫学中的应用
流式细胞术与单克隆抗体结合，对细胞表面和细胞内抗原、癌基因蛋白及膜受体的定量检测取得很大的进展，克服了普通免疫学方法难以准确定量的不足。这一技术对于人体细胞免疫功能的评估有重要意义。此外，用流式细胞术检测红细胞、粒细胞抗体及血小板减少性疾病，均有检测速度快、灵敏度高、特异性强的优点。有人对25例肺癌患者和30例健康人的外周血淋巴细胞亚群的水平检测分析发现肺癌患者CD3+、CD4+细胞及CD3+、CD4+/CD3+、CD8+比值较对照组显著减少，CD3+、CD8+显著增多，因此流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚型抗原表达可作为肿瘤患者免疫监测的手段。还有人应用流式细胞术检测抗中性粒细胞CD16b和CD177抗体是自身免疫性中性粒细胞减少症实验简便、快捷的诊断方法，有助于自身免疫性中性粒细胞减少症的诊断、鉴别诊断和疗效判断。有人用钙离子荧光探针结合流失细胞术检测肉仔鸡肠道B淋巴细胞胞内Ca2+浓度，且二十五碳五烯酸（EPA）极显著降低了B细胞内的Ca2+浓度。此研究建立了肉仔鸡肠道B淋巴细胞胞内Ca2+浓度流式细胞术测定方法，为检测肉仔鸡肠道B淋巴细胞内其它离子成份奠定了基础。由此可以看出，流式细胞术正在逐渐的应用到畜禽中。
2.3 在血液学中的应用
流式细胞术通过对外周血细胞或骨髓细胞表面抗原和DNA的检测分析，对各种血液病的诊断、治疗和预后判断起到重要作用。流式细胞术采用各种抗血细胞表面分化抗原的单克隆抗体，借助于各种荧光染料测定一个细胞的多种参数，以正确地判断出该细胞的属性。各种血细胞系统都有其独特的抗原，当形态学检查难以区别时，免疫表型参数对各种急性白血病的诊断和鉴别就起了举足轻重的作用。流式细胞术还可以应用在白血病免疫分型方面。目前国内外均主张采用FCMCD45/SSC双参数散点图设计方法进行白血病免疫分型，采用此法可将骨髓细胞清晰地分成淋巴细胞、单核细胞、成熟粒细胞、幼稚细胞和有核红细胞群，这样可以排除正常细胞对免疫分型的干扰，从而提高免疫分型的准确性。此外，流式细胞术在网织红细胞的测定及应用、血栓与止血中的应用、微小残留病灶（MRD）的检测等方面均有广泛的应用。
2.4 在其他方面的应用
随着近年来流式细胞术的发展以及与临床工作结合的紧密性日益加强，FCM已广泛应用于临床医学，通过对多药耐药基因、凋亡抑制基因及凋亡活化基因表达的测定、检测器官移植后血液或移植内免疫成分变化、与荧光染料联合应用判断细菌的活力和功能状态等方法，在细胞凋亡和多药耐药基因检测、器官移植、临床细菌学、细胞生物学、优生遗传领域等都得到了充分的应用，有着广阔的前景。念珠菌是人类最常见的条件致病菌，也是院内感染的主要病原菌。近年来随着广谱抗生素、免疫抑制剂、抗肿瘤化疗药物等的广泛应用，其感染率不断上升，菌种也在不断的变迁，因此选择快速、简便的药敏试验方法测定抗真菌药物对病原性真菌的抑制活性，为临床选择用药提供依据，从而有效的预防和控制真菌感染。有人用流式细胞术快速检测30株白色念珠菌分离菌株对伊曲康唑的敏感性，发现本方法具有很好的重复性。流式细胞术具有快速、敏感、可靠的优势，在临床抗真菌药物敏感性检测中具有很大的应用前景。也有人利用流式细胞术检测疟原虫感染患者的血液红细胞，建立了一种新的疟疾辅助诊断技术。还有人应用流式细胞术对36株临床分离已经确定为产超广谱β-内酰胺酶的菌株进行药敏试验检测，发现该方法与传统方法检测结果具有一致性，但是更为快速客观、便于自动化，在联合药敏试验方面有较大的临床应用前景，为流式细胞仪应用到细菌药敏试验奠定基础。
3 结语
流式细胞仪工作原理与临床应用 篇4
流式细胞术(Flow cytometry,FCM)是采用流式细胞仪对处于快速直流中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析和分选的技术。1973年美国BD公司推出全球第一台流式细胞仪,它是集激光技术、电子生物技术、光电测量技术、电子计算机技术以及荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。它通过对流动液体中排列成单列细胞或颗粒进行逐个检测,得到该细胞或颗粒的光散射和荧光指标,分析获得其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理及化学性质,还能对所需要的细胞进行分选等,具有检测速度快、测量指标多、采集数据量大,对所需的细胞或生物颗粒进行分析或分选等特点,其在生物学、临床医学、遗传学、免疫学、药物学等众多研究领域得到广泛应用[1]。
1 流式细胞仪的工作原理
流式细胞仪主要由液流系统、光学系统、电子系统、分析系统和细胞分选系统五个部分组成。将待测细胞染色后制成单细胞悬液,用一定压力将待测样品压入流动室,不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出,鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度,这样,鞘液就能够包绕着样品高速流动,组成一个圆形的流束,待测细胞在鞘液的包绕下单行排列,依次通过检测区域。流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束,垂直照射在样品流上,被荧光染色的细胞在激光束的照射下,产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测,这种信号基本上反映了细胞体积的大小;荧光信号的接收方向与激光束垂直,经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离,形成多个不同波长的荧光信号。这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度,经光电倍增管接收后可转换为电信号,再通过模/数转换器,将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机系统将这些数字信号收集、储存,以一维直方图或二维点阵图及数据表或三维图形显示出来,可以用不同的标记物进行双参数、三参数甚至多参数的分析。[2,3,4]
科研型流式细胞仪还可以根据所规定的参量把指定的细胞亚群从整个群体中分选出来,以便对它们进行进一步的研究分析。其分选原理是把液滴形成的信号加在压电晶体上使之产生机械振动,流动室即随之振动,使液柱断列成一连串均匀的液滴,一部分液滴中包有细胞,而细胞性质是在进入液滴以前已经被测定了的,如果其特征与被选定要进行分选的细胞特征相符,则仪器在这个被选定的细胞刚形成液滴时给整个液柱充以指定的电荷,使被选定的细胞形成液滴时就带有特定的电荷,而未被选定细胞形成的细胞液滴和不包含细胞的空白液滴不被充电。带有电荷的液滴向下落入偏转板的高压静电场时,按照所带电荷符号向左或向右偏转,落入指定的收集器内,完成分类收集的目的。对分选出的细胞可以进行培养或其他处理,做更深的研究。
2 流式细胞仪的临床应用
2.1 在肿瘤学方面的应用
利用FCM可以进行细胞周期分析,DNA倍体分析,定量分析检测细胞增殖标志物、细胞表面标志、癌基因蛋白产物、耐药蛋白、细胞凋亡等,从而获得组织形态学方法难以得到的信息,可为肿瘤的临床诊断、治疗、预防和预后提供帮助[5]。DNA非整倍体的出现可能是发生早期癌变的一个重要指标。淋巴瘤、白血病在病理形态学还不能进行早期诊断之前,FCM可以提供确切的诊断信息。流式细胞术对淋巴瘤的早期诊断比形态学检查更为敏感、准确。DNA非整倍体的交界瘤应按恶性肿瘤对待,形态学表现为良性的肿瘤出现非整倍体提示有恶性转变的可能。FCM主要是利用实体瘤标本或穿刺标本、胃镜、食管镜及支气管镜、肿瘤冲洗液、尿液等少量组织进行DNA含量测定,进行包括癌前病变及早期癌变的检出,从而为临床辅助诊断和进一步治疗如放疗中的药物选择、强度、时间等提供较确切、可靠的信息。
2.2 在血液病诊断中的应用
2.2.1 白血病的诊断和治疗
FCM采用各种抗血细胞表面分化抗原(CD)的单克隆抗体,借助于各种荧光染料(异硫氰基荧光素FITC,藻红蛋白PE等)测定一个细胞的多种参数,以正确地判断出该细胞的属性。各种血细胞系统都具有其独特的抗原,当形态学检查难以区别时,免疫表型参数对各种急性白血病的诊断和鉴别诊断有决定性作用[6]。例如干细胞表达CD34,髓系表达CD13、CD14,B细胞系表达CD10、CD19、CD20等,T细胞系表达CD2、CD3、CD5、CD7,利用FCM可以测定出血细胞表达各种抗原的水平,协助临床确诊。
同其他肿瘤的治疗一样,测定DNA倍体和进行细胞周期分析对指导白血病化疗有一定作用,不同的白血病患者或同一患者在不同病期白血病细胞增殖状况不同,定期了解细胞增殖情况采取相应药物可以提高疗效。
目前,临床除化疗药物治疗外还采用造血干细胞移植技术治疗急性白血病和一些疑难性疾病[7]。FCM通过对人白细胞抗原(HLA)配型的测定,可以为异体干细胞移植病人选择出最合适的供体。造血干细胞移植技术主要包括干细胞的鉴别、活性测定、干细胞动员和采集、分离纯化、保存扩增、肿瘤细胞的净化、干细胞回输以及术后保持移植物抗宿主病的低发生率等一系列过程。FCM测定CD34、HLA-DR、CD33等细胞表面标志物,成为干细胞移植技术重要的监测手段。用FCM检测一系列指标观察病人的恢复状态,可以对预后做出早期的判断。
2.2.2 阵发性睡眠性血红蛋白尿的诊断
根据CD59表达将阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)病人分为三型,研究证明不同亚型对补体的敏感程度不同。特异地分析网织红细胞的CD59的表达,对于PNH的诊断及病情评估有非常重要的意义。用流式细胞仪检测并计数缺乏这类膜蛋白的异常血细胞,是目前诊断PNH最直接、最敏感、特异性最强且可以定量的良好手段,比传统的溶血试验具有更高的特异性和灵敏度[8]。
2.2.3 网织红细胞的测定及临床应用
网织红细胞计数是反映骨髓造血功能的重要指标,FCM通过某些荧光染料与红细胞中RNA结合,定量测定网织红细胞中RNA,得到网织红细胞占成熟红细胞的百分比。有作者报道FCM方法比目测法结果精确度更高[9]。此外,FCM还可以测量出网织红细胞的成熟度,对红细胞增殖能力的判断很有意义,为干细胞移植术后恢复的判断、贫血的治疗监测、肿瘤病人放化疗对骨髓的抑制状况等提供了依据。
细胞计数在临床上可以提供评估骨髓相中的红细胞造血功能的信息,在贫血的鉴别诊断中有很重要的作用。贫血患者骨髓功能正常,而网织红细胞增加,多见于内源性溶血性疾病,如镰状细胞溶血性贫血、地中海贫血、球状细胞溶血性贫血、6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺陷、免疫性溶血、脾功能亢进等。失血时网织红细胞亦升高,因此,网织红细胞也可以作为隐性失血的指标。
2.3 在血栓与出血性疾病中的应用
2.3.1 血小板功能的测定
血小板膜糖蛋白(GP)是参与止血、血栓形成的重要分子基础,这些膜糖蛋白是一类重要的黏附分子。利用针对GP的单克隆抗体对血小板进行免疫荧光标记,并用流式细胞仪分析单个血小板或血小板亚群的GP,是血小板膜糖蛋白检测分析方法的重大发展。其方法简便、快速、标本用量少、灵敏度高、结果准确。与血小板有关的抗原的临床意义有以下两点:(1)诊断遗传性血小板功能缺陷疾病,如GPⅠb/Ⅸ复合物先天缺陷导致巨大血小板综合征;GPⅡb/Ⅲa复合物先天缺陷导致血小板无力症[10]。(2)血栓性疾病和血栓前状态,活化血小板的检测。由于活化血小板是血栓的主要成分之一,也是引起血栓形成的主要原因,所以血小板活化程度增高与疾病发生发展有关。如心绞痛和心肌梗死、冠状动脉血管成形术、脑动脉硬化病人活化血小板百分率和绝对数显著高于正常人[10,11]。
2.3.2 血小板相关抗体的测定
免疫性血小板减少性紫瘢病人血浆中可产生血小板自身抗体,结合在血小板表面,称为血小板相关抗体,其分子可以是Ig G、Ig A或Ig M,用鼠抗人Ig G、Ig A、Ig M荧光抗体标记被测血小板,FCM可以测定血小板相关抗体含量。直接法检测血小板表面的相关抗体,间接法可测定血清中的相关抗体。该方法用于该病的诊断及治疗监测,具有检测速度快、灵敏度高的优点。
2.4 流式细胞术在免疫学中的应用
淋巴细胞分为T淋巴细胞(CD3)、B淋巴细胞(CD19)和NK细胞三大群。T淋巴细胞又分为辅助性T细胞(CD4)、细胞毒性T细胞(CD8)。流式细胞术检测T淋巴细胞和B淋巴细胞百分数可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病。CD4和CD8T淋巴细胞的百分数有助于监测患有免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病或有免疫反应的病人的免疫状态。正常人T淋巴细胞CD4/CD8比值大约为2/1,比值升高表明机体免疫机能亢进,见于自身免疫性疾病,如SLE、类风湿性关节炎、自身免疫性溶血等;比值降低表明机体免疫机能下降,如艾滋病、病毒感染、肿瘤、活动性肝硬化、AA等[12]。当人体感染HIV后,CD4T淋巴细胞的百分比和数量减低,可辅助HIV监控治疗。若比值<0.2,应停用免疫抑制剂,以免发生感染而导致移植失败。CD19与机体免疫球蛋白呈正相关。NK细胞反映机体对病毒感染的细胞和肿瘤细胞的杀伤能力及巨噬细胞的杀菌活性。
2.5 在造血干细胞移植中的应用
造血干细胞移植加强烈化疗是治愈某些难治疾病的有效方法。骨髓移植(BMT)或外周血造血干细胞移植(PBSCT)的成功与否,除与是否合并并发症有关外,移植物中CD34+细胞的数量和质量是重要因素。随着近年来外周血造血干细胞移植病例的日益增多,外周血造血干细胞的流式准确定量越来越成为关键问题。1995年,血液病治疗及移植国际联合会成立了干细胞绝对计数(Enumeration)小组,致力于寻求一种简单、快速、灵敏的流式细胞仪检测方法去定量外周血中造血干细胞的数量。这一方法对于临床实验室中不同的流式细胞仪都有效,而且在不同的移植中心具有可比性。这一方案即为1996年问世的ISHAGE方案,迄今为止,其他各种改进方案均是以此方案为基础的。精确测定CD34对于判断移植后的植活和选择G-CSF动员外周血造血干细胞的采集时间有着重要的指导意义。
2.6 流式细胞术在临床细菌学中的应用
FCM泛用于细菌、病原体、毒素、血清抗体及药敏试验。在免疫荧光方法中的流式微球捕获芯片技术(Cytometric Bead Array,CBA)是流式细胞术的一个新应用,它将近似于细胞大小的微珠作为捕获载体,使其携带已知荧光抗原或抗体,来捕获检测物中的相关抗体或抗原。由于遮蔽效应可以使荧光微球的发散光减弱,应用不同大小的荧光微球,可同时检测同一标本的多种抗原或抗体。这种方法能同时检测单一液相样本中多个目的蛋白(如同时测定多种细胞因子、多种自身抗体),检测需用标本量少,灵敏度高,重复性好,直接荧光标记易于使用,检测线性范围宽,避免酶联反应所致的人工假象,可用于单细胞分子水平的多参数检验,也可用于真菌、寄生虫、病毒或混合感染的检测。
2.7 流式细胞术在器官移植中的作用
FCM在器官移植中也占有重要地位,它被用来判断供者与受者之间配型是否合适。其检测手段是检测受者血清中抗供者的抗HLA的抗体。根据抗体的种型、效价、靶抗原和器官移植的类型不同,抗体介导的排斥反应也有所不同。FCM与传统方法相比更灵敏、操作时间短并可同时检测细胞亚型、分辨出Ig G和Ig M抗体。FCM所分析的靶细胞不只局限于淋巴细胞,为移植的配型提供更有利的支持。移植术后,免疫表型的监测也很重要。移植后CD4/CD8比值低下的病人排斥反应发生较多;受者血清中产生抗供体细胞抗体者预后较差,应及时监测以便进行抗排斥的预防和治疗。
3 结语
总之,流式细胞仪应用极为广泛,本文所介绍的只是其中的一部分,随着科学技术的迅猛发展,流式细胞仪在临床上会有更广阔的应用前景。
参考文献
[1]左连富.流式细胞术与生物医学[M].沈阳:辽宁人民出版社,1996:129-422.
[2]Grogan WM.Guide to flow cytometry methods[M].NewYork:MarcelDekker Inc,1990:1-20.
[3]沈关心,周汝麟.现代免疫学实验技术[M].武汉:湖北科学技术出版社,2002:226-230.
[4]王书奎,周振英.实用流式细胞术彩色图谱[M].上海:第二军医大学出版社,2004:1-56.
[5]李元堂.流式细胞术在血液系统肿瘤诊断、治疗中的应用[J].黑龙江医药科学,2005,28(2):93-95.
[6]肖志坚,郝玉书.免疫表型分析与急性白血病诊断[J].中华血液学杂志,1997,18:53-55.
[7]韩忠朝,冯四洲,韩明哲.造血干细胞移植技术及其应用[J].中华血液学志,1998,19:663-666.
[8]Krauss J S.Laboratory diagnosis of paroxysmalnocturnal hemoglobinuria[J].Ann Clin Lab Sci,2003,33(4):401-406.
[9]刘小林,周彦,孙林.流式细胞仪检测网织红细胞百分比性能评价[J].蚌埠医学院学报,2010,08:828-830.
[10]王志杰.流式细胞术在血小板疾病中的应用[J].血栓与止血学,2004,10(1):39-41.
[11]Linden MD,Frelinger A L 3rd,Barnard MR,et al.Application of flow cytometry to platelet disorders[J].Semin Thromb Hemost,2004,30(5):501-511.
流式细胞课题 篇5
方法：应用流式细胞术（FCM）分析GSTπ蛋白的表达。
结果：乳腺癌组织GSTπ表达显著高于癌旁组织（P<0.06）。这种耐药相关蛋白在不同性别、不同年龄、不同病理类型、不同病理类型、不同临床分期和雌、孕激素受体阴性与阳性患者间的表达，经实验和对照组研究均无显著差异（P>0.05）。实验结果研究提示有淋巴结转移组患者GST-π表达在实验中显著高于无淋巴结转移组患者（P<0.05）。
结论：实验研究结果表明，GST-π表达与淋巴结转移状况有关，因而极有可能成为预测乳腺癌预后的另一重要指标。
关键词：GST-π 乳腺肿瘤 流式细胞术
【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1008-1879（2012）09-0014-01
谷胱苷肽S-转移酶-π（GST-π）是GSTs家族的主要成员，是一组具有多种生理功能、参与机体解毒作用的肿瘤细胞和组织中最常见的同工酶，其变化远远早于细胞的形态改变，因而成为许多肿瘤转化的系列化标志物，而且GSTs还具有细胞抗损伤、抗癌变的作用，在许多耐药细胞特别是多药耐药表型的细胞系中高水平表达，故认为GST-π的高表达可能是多药耐药标志之一。为进一步明确GST-π在乳腺癌中的表达意义，本实验研究检测了其在乳腺癌组织中的表达情况，并探讨与患者临床病理特征等因素间的密切关系。
1 资料与方法
1.1 临床资料。120例乳腺癌患者为厦门市立医院肿瘤科和漳州市立医院肿瘤科2004年12月～2008年12月的住院病例。患者女性，年龄均在26-78岁，中位年龄55.5岁，全部行乳腺癌改良根治术或根治术治疗。肿瘤直径>1.2cm，留取癌组织和距癌边缘1cm以上的癌旁腺体组织。患者全部经病理证实且术前未接受任何放、化疗治疗及其他治疗。组织学分类按照2003年WHO分类，包括浸润性导管癌99例，其他类型21例。临床分期根据1997年UICC分期标准：Ⅰ、Ⅱ期90例，Ⅲ期30例。有腋淋巴结转移者78例，无腋淋巴结转移42例。
1.2 细胞免疫荧光染色的样品制备。首先用组织搓网法制成单细胞悬液，70%冷乙醇4℃固定24h，用含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS洗涤2次，调浓度为1×106/ml。二步法进行免疫荧光染色，100μl细胞悬液先加MGMT单抗（Chemicon，1∶40）或GST-π单抗（B-D Pharmingen，1∶10）10μl。室温避光反应30min后加二抗FITC-IgG1（B-D Pharmingen，1∶10）5μl，室温避光反应30min后上机检测。
1.3 FCM条件。B-D公司FACS Calibur型流式细胞仪，蛋白表达以相对荧光强度（RFI）表示。RFI=加单抗管细胞平均荧光强度/同型对照管细胞平均荧光强度。
1.4 统计学分析。采用SPSS10.0软件，组织耐药相关蛋白表达呈非正态分布，表达用中位数（Median），比较用秩和检验。相关性采用Pearson相关分析。
2 结果
乳腺组织中MGMT和GST-π蛋白表达。乳腺癌组织MGMT和GST-π表达分别为1.00～9.24和0.19～19.67，中位数分别为3.01和0.99；相应癌旁组织2种蛋白表达分别为0.70～2.09和0.30～1.22，中位数分别为1.30和0.72。经秩和检验，乳腺癌组织耐药相关蛋白表达与相应癌旁组织比较差异均有显著意义（P<0.05）。GST-π耐药相关蛋白在不同年龄、不同肿瘤大小、不同病理类型、不同临床分期和雌、孕激素受体阴性与阳性患者间的表达均无显著差异（P>0.05），GST-π表达在有淋巴结转移组患者显著高于无淋巴结转移组患者（P<0.05）。
3 讨论
GST-π在乳腺癌中的表达意义。本研究发现乳腺癌组织GST-π表达高于相应癌旁组织，与有关报道一致，提示GST-π表达增加可能与乳腺癌发生及发展进程有关。同时，GST-π表达与患者的年龄、肿瘤大小、临床病理类型、临床分期和ER、PR表达状况均无关，但与淋巴结转移有关，与文献[8]相似。但国内也有相反研究结果，如Huang等发现GST-π与任何临床病理因素均无关，但GST-π阳性肿瘤却更具侵袭性，患者无瘤生存期短、预后很差。Gilbert等发现GST-π表达与淋巴结转移、肿瘤大小及核分级、组织学类型及年龄均无关，但与ER、PR表达状况呈负相关性。对部分淋巴结转移阴性乳腺癌患者的研究显示，GST-π表达增加与无瘤生存期和总生存期降低有关。
参考文献
[1] Musarrat J，Wilson JA，Wani AA.Localization of O6-alkylguanine transferase in cancer susceptible cells of human female breast[J].Cancer Lett，1996，108（1）：111-118
[2] Wani G，D'Ambrosio SM.Expression of the O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase gene is elevated in human breast tumor cells[J].Anticancer Res，1997，17（6D）：4311-4315
[3] Clemons MJ，Bibby MC，El Teraifi H，et al.Heterogeneity of O6-alkylguanine DNA-alkyltransferase expression in human breast tumours[J].Br J Cancer，2002，86（11）：1797-1802