土壤中砷氧化细菌的分离及其培养条件研究

土壤中砷氧化细菌的分离及其培养条件研究（精选2篇）

土壤中砷氧化细菌的分离及其培养条件研究 篇1

土壤中砷氧化细菌的分离及其培养条件研究

通过外加砷源驯化肇庆市鼎湖山自然保护区土壤中细菌,采用富集、稀释平板、硝酸盐漫过方法从土壤中分离出2株砷氧化细菌.氧化砷实验表明:As-I、As-Q能高效将As(Ⅲ)氧化为As(Ⅴ),其氧化率可达99%.培养条件研究表明,2菌株最适生长温度为30℃,As-I、As-Q最适生长pH分别为8和7.

作 者：莫于婷 宋卫锋 孙国萍 宾丽英 张倍维 作者单位：莫于婷,宋卫锋,张倍维(广东工业大学环境科学与工程学院,广东,广州,510006)

孙国萍(广东省微生物研究所,广东,广州,510070)

宾丽英(广东工业大学环境科学与工程学院,广东,广州,510006;广东省微生物研究所,广东,广州,510070)

刊 名：广西轻工业英文刊名：GUANGXI JOURNAL OF LIGHT INDUSTRY年，卷(期)：2009“”(2)分类号：Q939.96关键词：土壤 砷 硝酸银 砷氧化菌

★ 脱硫细菌的培育及最佳生长条件的研究

★ 常见肠杆菌属细菌的耐药性研究

★ 高效溶磷菌株Bmp5筛选及活力和培养条件的研究

★ 生防细菌LM-3的鉴定及其抗菌蛋白的研究

★ 活的非可培养状态细菌生物学特性研究进展

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土壤中砷氧化细菌的分离及其培养条件研究 篇2

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

从呼和浩特市三联化工厂采集土壤用于菌种分离。

1.1.2 试剂

细菌16S rDNA PCR试剂盒、DNA回收试剂盒、溶菌酶均购自大连宝生物有限公司;其它试剂均为市售分析纯及生化试剂。

1.1.3 仪器

电热恒温培养箱 (上海一恒科技有限公司) , 显微镜 (尼康50i) , 恒温摇床 (上海欣蕊自动化设备有限公司) , 723可见分光光度计 (上海光谱仪器有限公司) , Delta 320 pH计 (梅特勒-托利多仪器有限公司) , PCR仪 (美国ABI公司) 。

1.1.4 培养基

1.1.4.1 9K培养基:

A液: (NH4) 2SO4 3g, MgSO4·7H2O 0.5g, K2HPO4 0.5g, Ca (NO3) 2 0.01g, KCl 0.1g, 水600mL, pH 2.0。121℃灭菌30min。B液:FeSO4·7H2O 44.2g, 水400mL。用6mol/L H2SO4调节pH为2.0, 过滤除菌。接种前, 将A液和B液按3∶2 (V/V) 混合。

1.1.4.2 平板培养基:

以9K培养基为基础, 添加1.8%的水洗琼脂。

1.2 方法

1.2.1 菌株的富集、分离、纯化及筛选

准确称取5 g土样, 接入50 mL新鲜9K培养基中, 28℃、150r/min振荡培养7d, 至菌液呈红棕色。取0.2mL富集培养液, 均匀涂布于平板培养基, 28℃培养10d, 挑取单菌落转接于50mL新鲜9K培养基中, 28℃、150r/min振荡培养7 d。液体培养和平板分离交替进行, 重复3～4次, 直至平板培养菌落形态完全一致。从纯化平板上挑取单菌落, 转接于50mL新鲜9K培养基中, 28℃、150r/min振荡培养72 d, 测定培养液中亚铁氧化率。

1.2.2 Fe2+氧化率的测定

采用重铬酸钾滴定法[1]测定培养液中Fe2+浓度, 按下式计算亚铁氧化率:

亚铁氧化率undefined

V1:未接种空白培养基消耗重铬酸钾的体积;

V2:接种培养基消耗重铬酸钾的体积。

1.2.3 16S rDNA序列分析及系统发育树的构建

1.2.3.1 基因组DNA的提取

参考文献[2]方法对菌体基因组DNA进行提取。

1.2.3.2 PCR扩增

使用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit扩增菌株的16S rDNA序列。正向引物:5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′, 反向引物:5′-CGCCAGGGTTT TCCCAGTCACGAC-3′。PCR反应体系为:总体积50μL, 基因组DNA 2μL, PCR Premix 25μL, 引物各0.5μL, 16S-free H2O 22μL。PCR反应条件为:94℃ 5min;94℃ 1min, 55℃ 1min, 72℃ 1.5min;72℃ 5min。

1.2.3.3 16S rDNA测序、分析及系统发育树的构建

PCR扩增产物使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2.0进行纯化, 由大连宝生物工程有限公司完成测序。将菌株N16的16S rDNA序列输入Genbank中进行序列比对, 将该菌株序列与比对结果中同源性最高的序列一起输入Clustal X 1.83进行全序列比对。利用软件MEGA 3.1分析该序列碱基组成, 并以Kimura-2参数计算遗传距离, 采用Nj邻接法构建系统发育树, 在分支上标记1 000次重复获得的自展检验Bootstrap值。

1.2.4 菌株培养基优化

取5 mL种子液 (亚铁氧化率达80%的培养液) , 转接于装有50 mL培养基的250 mL三角瓶中, 28℃、150 r/min振荡培养36 h, 测定培养液的亚铁氧化率。

1.2.5 菌株培养条件优化

对初始pH、温度、接种量、装液量4个因素进行优化, 分别记为变量X1、X2、X3、X4, 每个因素取3个水平;以亚铁氧化率作为响应值, 记为Y;利用SAS软件中的Box-Behnken设计法设计实验方案[3], 按照实验方案, 在不同培养条件下以最适培养基培养菌株N16, 150r/min振荡培养36h, 测定培养液的亚铁氧化率。

2 结果与分析

2.1 菌株的富集、分离、纯化及筛选

从土样中共分离得到19株细菌, 菌落形态共6种 (见表1) 。分别测定各菌株亚铁氧化能力, 只有N16、ND1和ND3具有亚铁氧化能力, 其中N16亚铁氧化率可达90%。因此对N16进行进一步研究。

注:菌落特征:a:白色, 较大, 边缘不整齐, 与培养基结合不牢固;b:白色, 较大, 边缘整齐, 与培养基结合不牢固;c:黄色, 较小, 边缘整齐, 与培养基结合牢固;d:白色, 较小, 边缘整齐, 与培养基结合不牢固;e:白色, 较小, 边缘整齐, 与培养基结合牢固;f:红褐色, 极小, 边缘整齐, 与培养基结合牢固。

2.2 菌种鉴定

2.2.1 菌株形态及培养特征

菌体呈短杆状, 单生, 能运动, 革兰氏染色呈阴性, 菌体大小约为0.5 μm×1.0 μm。在9K液体培养基中培养, 培养液由浅绿色变为红棕色, 并且混浊, 产生了黄钾铁钒沉淀。在9K固体培养基培养10 d, 平板上形成针尖大小的褐色菌落, 菌落周围有黄色沉淀 (见图1) 。

2.2.2 16S rDNA序列分析及系统发育树的构建

该菌株16S rDNA序列长度为1 450 bp, GenBank登录号为GQ329842。将该序列输入NCBI, 以Blast进行序列同源性比对, 结果显示菌株N16与嗜酸性氧化亚铁硫杆菌属 (Acidithiobacillus ferrooxidans) 的多株细菌具有较高的同源性 (>98%) , 其中与Acidithiobacillus ferrooxidans strain 2、Acidithiobacillus ferrooxidans strain YTW和Acidithiobacillus ferrooxidans strain D2等的相似性为100%, 与标准株Acidithiobacillus ferrooxidans strain ATCC 23270和ATCC 53993的相似性为98%。根据16S rDNA序列构建系统发育树 (图2) , 菌株N16与嗜酸性氧化亚铁硫杆菌属在系统发育树上处于同一分支, 结合其生物学特性, 可以确定菌株N16为嗜酸性氧化亚铁硫杆菌 (Acidithiobacillus ferrooxidans) 。

2.3 菌株培养基优化

2.3.1 FeSO4·7H2O浓度对菌株亚铁氧化率的影响

以9K培养基为基础, 分别添加20g/L、44.2g/L、60g/L、80g/L、100g/L FeSO4·7H2O, 测定亚铁氧化率, 结果见图3。由图可见, FeSO4·7H2O浓度为60g/L时, N16的亚铁氧化率最高, 可达99.8%。

2.3.2 (NH4) 2SO4浓度对菌株亚铁氧化率的影响

以9K培养基为基础, 分别添加0g/L、1g/L、3g/L、5g/L (NH4) 2SO4, 测定亚铁氧化率, 结果见图4。 (NH4) 2SO4浓度为1g/L和3g/L时, N16的亚铁氧化率均为99.6%, 因此 (NH4) 2SO4浓度采用1g/L。同时实验发现在无氮源条件下, 该菌也有一定的亚铁氧化能力, 推测菌株N16可能具有固氮能力。

综上所述, 实验确定菌株N16的最适培养基配方为: (NH4) 2SO4 1g/L, MgSO4·7H2O 0.5g/L, K2HPO4 0.5g/L, KCl 0.1 g/L, Ca (NO3) 2 0.01g/L, FeSO4·7H2O 60g/L。

2.4 菌株培养条件优化

实验对初始pH、温度、接种量、装液量4个因素进行优化, 分别记为变量X1、X2、X3、X4, 各因素水平的取值见表2;以亚铁氧化率作为响应值, 记为Y。实验方案及结果见表3。

通过SAS 统计软件的响应面回归过程对数据进行分析, 建立回归模型为:Y1=80.74333-5.100833*X1+4.448333*X2+24.18833*X3+0.314167*X4-1.985417*X1*X1-6.295*X1*X2+2*X1*X3-1.6525*X1*X4-27.26917*X2*X2-2.9725*X2*X3-0.1375*X2*X4-11.13167*X3*X3-0.2625*X3*X4+ 0.319583*X4*X4。

由表4模型可信度分析可以看出, 复相关系数R2=0.9111, 说明回归方程的拟合度较好。由回归模型可知一次项和平方项, 特别是X3、X2*X2、X3*X3对响应值的影响显著, 但交互项的影响不显著。因此, 可以得出:本实验的4个因素之间的关系不是简单的线性关系, 而是二次关系, 并且各个因素之间的交互作用较小, 在以后的实验中可以不考虑各个因素之间的交互作用。

根据回归方程, 可由SAS软件作出响应面立体图, 见图5～10。由SAS响应面优化图可以看出:培养温度和接种量对亚铁氧化率具有显著影响;pH和装液量对亚铁氧化率也有一定影响, 但并不显著。

由SAS软件分析可知, 该回归模型存在稳定点, Y的最大估计值为94.52, 稳定点 (X1, X2, X3, X4) 为 (-0.41, 0.08, 1.05, -1.11) , 即初始pH 1.8, 温度28℃, 接种量15%, 装液量30mL。实验验证与模型预测值基本一致, 所以确定该条件为最优培养条件。

2.5 菌株N16的培养曲线

采用优化后的最适培养基配方和最佳培养条件, 150r/min振荡培养菌株N16。在培养过程中定时对菌体核酸量、培养液pH值、亚铁氧化率进行测定, 可得图11。由图可见, 菌株培养13h即进入对数生长期, 34h进入稳定期;培养过程中, 培养液的pH值不断下降, 培养结束时降为2.10;菌株进入对数期后, 其亚铁氧化能力明显提高, 培养至28h时, 亚铁氧化率已达到最高值99.78%, 此后基本不再变化。

3 讨论

近几年国内许多学者对氧化亚铁硫杆菌的分离、培养基、培养条件进行了研究[4,5,6,7,8,9,10], 但多为单因素实验或正交实验。另外, 氧化亚铁硫杆菌属严格化能自养微生物, 生长较缓慢。本文分离纯化出一株嗜酸性氧化亚铁硫杆菌N16, 在采用单因子实验对其培养基进行优化的基础上, 采用响应面分析法对其培养条件进行了优化。当培养28h时, 该菌的亚铁氧化率就可达99.78%。菌株N16的生长时间明显短于其它报道中的菌株, 而亚铁氧化能力却达到了非常高的水平, 因此该菌株在烟气脱硫中具有广阔的应用前景, 进一步研究将其应用于烟气脱硫具有重要的理论和实践意义。

参考文献

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