活性诱导（共6篇）
活性诱导 篇1
γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一种含有4个碳原子的非蛋白质的游离氨基酸,广泛分布于从微生物到哺乳动物的原核和真核生物体中[1]。有许多研究表明,GABA是中枢神经系统中主要的抑制性神经递质,它有许多生理功能,比如对血压的调节作用[2],对心血管系统的调节作用[3],还有研究显示一些基因受到GABA的抑制[4]。鉴于GA-BA的这些生理功能,其作为一种新型食品活性因子,在功能食品中的应用已成为研究热点,越来越多的富含GABA的产品被开发出来,包括糙米[5]、茶、麦麸[6]、大豆[7]、乳酸菌(LAB)发酵食品[8]等。
谷氨酸脱羧酶(Glutamate Decarboxylase,GAD)是唯一一种能够利用磷酸吡哆醛(PLP)作为辅因子不可逆地催化L-谷氨酸(L-GLu)的α位脱羧反应生成重要的抑制性神经递质GABA的酶,因此提高GABA产量的关键是GAD,但有关其分离、纯化及特性研究很少。鉴于GABA的工业效益,GAD已经被高效表达在各种细菌用于提高GABA的产量。例如,在清酒乳杆菌B2-16(Lactobacillus sakei B2-16)中成功高效表达出胚芽乳酸菌ATCC14917谷氨酸脱羧酶基因,获得了1.35倍的GABA含量[9]。也有报道称敲除了GABA转氨酶基因的大肠杆菌菌株经过高效表达的谷氨酸脱羧酶以及谷氨酸的逆向转运由10 g/L的谷氨酸单钠(MSG)获得5.5 g/L的GABA产物[10]。GAD是一种依赖于PLP的脱羧酶,PLP对GAD的活性来说是必须的,同时也可通过增加谷氨酸浓度、Ca2+与钙调和蛋白(Ca M)的比例来增强GAD的活性,H+对GABA的积累有重要作用[11]。试验拟对PLP的影响进行初步的讨论研究。现已经合成的转基因酿酒酵母(S.cerevisiae)YSC4515-98811386可提高GABA的产量,为了解该酿酒酵母GAD的相关情况,本试验对转基因酿酒酵母进行了培养、诱导、谷氨酸脱氢酶的分离纯化及其活性的研究。
1 材料
1.1 菌种
酵母菌(S.cerevisiae,YSC4515-98811386,ORF Name为YOR120W),由日本爱媛大学生化学研究室-70℃超低温冷冻室提供。
酵母提取物及胰蛋白胨(3×YP)+6%棉子糖液体培养基、3×YP+6%半乳糖液体培养基,自制。
1.2 仪器
ProfiniaTM蛋白质纯化系统(Bio-Rad)、紫外分光光度计(岛津的UV-1800型)、离心机、细胞破碎仪、SDS-PAGE电泳仪,均由日本爱媛大学生物化研究室提供。
2 方法
2.1 菌种的活化及生长情况
将S.cerevisiae放入28℃普通培养基中激活培养24 h,然后将激活培养的酵母菌分别接种到3×YP+6%棉子糖液体培养基、3×YP+6%半乳糖液体培养基中培养,并分别测定5,10,19,24,29,34,42,47,52,66小时的OD600值,并绘制生长曲线值。
2.2 S.cerevisiae的收集
取1个培养基中的液体30 m L置于离心管中3 000 r/min离心5 min;吸取上清液,在沉淀中加入生理盐水再次离心(3 000 r/min,5 min),重复3次将酵母菌洗净,备用。
2.3 融合蛋白的纯化
将上步悬浊液粉碎10 min后沉淀离心,通过ProfiniaTM蛋白质全自动高速纯化,获得融合蛋白。
2.4 SDS-PAGE电泳
将分离出的产物即融合蛋白进行SDS-PAGE电泳,90 min TE ORIOLE荧光染色,将凝胶通过紫外线照射仪观察并拍照。
2.5 酶活力的测定
取2支离心管,向其中分别加入0.4 m L纯化水和0.4 m L PLP(10 mmol/L),各加入酵素液(纯化的蛋白质50μL+纯化水150μL)0.2 m L,于37℃培养10 min;再分别加入谷氨酸(10 mmol/L)-酒石酸钠(100 mmol/L)缓冲液(p H值为4.5[12])1.4 m L,于37℃反应0,0.5,1,2,3 h;分别取2.0 m L于离心管中,于4℃、15 000 r/min离心10 min;取上清液1.5 m L,用柠檬酸钠缓冲液(p H值为2.2)稀释10倍,过滤器过滤,置于600μL的氨基酸分析系统进行分析。
3 结果与分析
3.1 S.cerevisiae在不同培养基中的生长情况
S.cerevisiae分别在3×YP+6%棉子糖液体培养基和3×YP+6%半乳糖液体培养基中培养。其中在3×YP+6%棉子糖液体培养基中酵母菌的含量是最高的,所有培养基中的酵母菌在50小时左右都达到了一个生长的高峰,由此可知该种酵母菌最适培养基为3×YP+6%棉子糖液体培养基。见表1。
3.2 GAD的分离纯化结果
以ProfiniaTM低压液相色谱纯化后可知,在3×YP+6%半乳糖液体培养基的酵母菌基因表达产物较3×YP+6%棉子糖液体培养基的显著,见图1、图2。
3.3 棉子糖与半乳糖诱导表达GAD的结果
由棉子糖诱导的S.cerevisiae没有纯化到GAD,见图3。由半乳糖诱导的S.cerevisiae得到GAD,经SDS-PAGE凝胶电泳检测可知分子质量为67 ku,见图4。
3.4 PLP对S.cerevisiae GAD活性的影响
经过600μL的氨基酸分析系统自动分析,表示出L-Glu与GABA含量变化关系来间接反映PLP对S.cerevisiae GAD活性的影响,说明PLP对GAD活性有一定的活化作用,见图5、图6。
A.棉子糖培养原液;B.Wash-1;C.Wash-2;D.纯化物。
A.半乳糖培养原液;B.Wash-1;C.Wash-2;D.纯化物。
4 讨论
试验对S.cerevisiae GAD的纯化以及酶学性质进行了初步的研究,通过反复清洗、离心,利用ProfiniaTM蛋白质纯化系统从酿酒酵母细胞中有效纯化到GAD。结果表明,3×YP+6%半乳糖培养基能够诱导重组酵母表达产生GAD的目的基因。通过SDS-PAGE检测其GAD分子质量为67 ku,该数值相对于GAD氨基酸分子序列的标准值(65.897 ku)偏大,可能是其中存有其他蛋白质导致。GAD是一种依赖于吡哆醛的脱羧酶,PLP对GAD的活性来说是必须的,图5和图6显示了额外的添加PLP对酿酒酵母S.cerevisiae GAD活性的影响,结果表明,PLP对GAD的活性有一定的促进作用,原因可能是S.cerevisiae GAD与辅酶PLP紧密整合形成相对于更加完整的GAD,进而增加其活性[13]。本试验结果为进一步研究酿酒酵母YSC4515-98811386 GAD的构象、酶学性质以及与PLP的相互作用机制打下基础。
M.标准物;1.培养液;2.粗制的GAD;3.纯净水对照;4.纯化的GAD。
M.标准物;1.酵素液;2.培养液;3.粗制的GAD;4.纯净水对照;5.纯化的GAD。
摘要：为了了解酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae,S.cerevisiae)谷氨酸脱羧酶(GAD)的情况,分别用酵母提取物及胰蛋白胨(3×YP)+6%棉子糖液体培养基、3×YP+6%半乳糖液体培养基进行诱导培养,粉碎破碎酵母,采用ProfiniaTM蛋白质纯化系统纯化,并用SDS-PAGE凝胶电泳测定分子质量,同时研究了磷酸吡哆醛(PLP)对酿酒酵母谷氨酸脱羧酶(S.cerevisiae GAD)活性的影响。结果表明:转基因酿酒酵母在28℃振动培养47 h,3×YP+6%棉子糖培养基OD600值为7.4,3×YP+6%半乳糖培养基OD600值为6.8。棉子糖诱导的酿酒酵母没有表达目的基因,没有纯化到GAD;相反,半乳糖诱导的酿酒酵母表达了目的基因,纯化到了GAD,其分子质量为67 ku。PLP对GAD的活化作用较显著。
关键词：酿酒酵母(S.cerevisiae),谷氨酸脱羧酶(GAD),纯化,γ-氨基丁酸,酶活力,磷酸吡哆醛(PLP)
活性诱导 篇2
1 资料与方法
1.1 一般资料
本组42例糖尿病性皮肤溃疡患者, 其中, 男30例, 女12例;年龄43~80岁, 平均58.2岁;糖尿病病程5~20年, 平均11.4年;其中, 骶尾部压疮6例, 髋部压疮3例, 背部深部溃疡2例, 足部溃疡31例。
1.2 治疗方法
在控制血糖、改善血液循环、营养神经、抗感染等综合治疗的基础上, 局部创面有坏死组织及脓性分泌物者, 经外科清创后, 使用无机诱导活性敷料换药。以生理盐水清洁创面, 除干性坏疽外, 局部用红外线照射, 距离30~50 cm, 时间5~20 min, 将无机诱导活性敷料均匀撒布于创面。创面不易撒布时, 可使用喷撒型粉剂, 于喷口距创面10~15 cm处喷涂, 若仍不易喷到 (如指缝间) , 可插上细导管喷涂。以单层消毒油纱布覆盖, 再覆盖消毒纱布, 以胶带或绷带固定, 每天1次。
1.3 疗效判定标准
治愈:溃疡或坏疽创面完全愈合, 已形成痂皮或瘢痕者;好转:溃疡或坏疽创面局部分泌物明显减少, 坏疽、坏死组织大部分脱落或部分肉芽新生, 创面明显缩小;无效:溃疡或坏疽创面无明显缩小, 分泌物无明显减少, 局部无显著变化或恶化者[2]。同时观察治疗前后血常规、肝肾功能等生化指标。
2 结果
42例患者经无机诱导活性敷料治疗后, 其中, 痊愈26例, 占全部病例的61.9%;12例好转, 占全部病例的28.6%;无效4例, 占全部病例的9.5%。患者治疗前后的血常规、肝肾功能等生化指标无显著性差异。无机诱导活性敷料用于治疗糖尿病性皮肤溃疡是安全、有效的。
3 讨论
3.1 糖尿病的基本治疗
根据不同患者的身体状况和血糖水平, 为患者制订个体化的治疗方案, 指导患者采取饮食控制、运动疗法、药物疗法和血糖监测, 使血糖得到良好的控制, 同时仍要在患者接受治疗时观察、监控患者的血糖水平, 这是糖尿病性皮肤溃疡修复的基础。
3.2 局部创面的护理
在对42例患者的治疗过程中, 对合并感染、局部分泌物较多的湿性创面, 除常规清创、控制感染外, 使用红外线烤灯照射, 能促进血液循环和新陈代谢, 更能达到消炎、消肿、减少渗液、促进创面修复再生及加速溃疡愈合的目的[3]。在此基础上, 使用无机诱导活性敷料诱导上皮细胞再生, 有利于创面的快速愈合, 并减少皮肤愈合后瘢痕的形成。
3.3 预防性皮肤护理
足部应用温水擦洗;禁用热水袋、电热毯, 避免烫伤;防止碰撞、摩擦损伤皮肤;选择合适的鞋袜、修剪指甲;每天检查双足。长期卧床、生活不能自理的患者, 建议使用预防压疮专用的电按摩气垫, 保持皮肤清洁、干燥, 经常按摩受压部位, 以促进局部血液循环, 防止压疮形成[4,5]。
3.4 健康教育
通过糖尿病教育, 使患者掌握糖尿病的相关知识, 对糖尿病治疗、自我管理及并发症的预防和护理有足够的认识, 使其能够积极配合治疗、护理, 对疾病的康复起到至关重要的作用。护士根据每位患者的实际情况选择适当的教育手段, 使患者改变不良行为, 并通过合理膳食、适量运动、保持良好的心态及自我监测, 从而达到有效控制疾病、减少或延缓并发症发生和发展的目的[6]。
参考文献
[1]蔡景龙, 李惠斌, 高西美, 等.糖尿病性皮肤溃疡创面的修复[J].实用整形美容外科杂志, 2003, 8 (14) :205.
[2]陈慧.康惠尔系列敷料治疗糖尿病足溃疡45例疗效观察[J].中华医学杂志, 2008, 25 (2) :232.
[3]章松娟.碘伏治疗糖尿病足的疗效观察及护理[J].护理与康复, 2009, 2 (8) :159.
[4]陈茜, 朱丹, 袁丽.压疮治疗措施有效性的研究进展[J].护士进修杂志, 2008, 23 (11) :231-232.
[5]王建华, 梁志兰, 刘艳红, 等.压疮小组对压疮全程监控的应用[J].中外医学研究, 2009, 7 (4) :123-124.
活性诱导 篇3
1 资料与方法
1.1 一般资料
本组患者12例, 其中, 卵巢癌6例, 食管癌4例, 骨肿瘤2例;年龄32~82岁;均为院外带入且均为Ⅲ期压疮, 压疮面积最小0.5 cm×1.0 cm, 最大约为5.0 cm×5.5 cm。
1.2 方法
治疗前常规用0.5%碘伏消毒压疮周围皮肤, 再用生理盐水冲洗后采用皮肤创面无机诱导活性敷料粉均匀涂敷并予以无菌油纱覆盖创面, 再予以无菌纱布轻轻覆盖创面1次/d, 并采取相应措施避免局部受压, 按时每2小时翻身1次。
1.3 疗效判断
治愈:溃疡疮面结痂并脱落, 局部组织完全修复;好转:压疮创面面积缩小50%以上, 深度变浅50%以上, 渗出减少或基本无渗出;无效:压疮创面无变化或面积加大、加深[2]。
2 结果
本组患者12例治愈, 10例好转, 压疮的治疗时间为4~8 d, 平均治疗时间为6 d。
3 护理
3.1 心理护理
我科为肿瘤专科病房, 收治中晚期肿瘤患者相对较多, 疾病引起疼痛、活动受限使压疮发生因素增加, 然而在压疮的防护过程中存在许多难点, 如患者及其家属不理解或不配合等。肿瘤末期患者随着病情的加重, 其伴随症状如呼吸困难、全身或局部疼痛引起强迫卧位, 加之部分晚期肿瘤骨转移患者自觉气垫床会加重全身疼痛而拒绝安置。部分患者及家属由于相关知识缺乏, 不理解变换体位及其他压疮预防措施的重要性, 认为只要让患者舒服不痛苦就行, 因而不配合医疗及护理工作, 拒绝采取相应的压疮防治措施, 在护理人员做相应的防治措施时, 甚至会引起患者家属的不满或发生纠纷;对于临终患者, 许多家属认为患者有压疮也不要紧, 对于此类患者, 在思想上给予耐心的健康宣教, 主管护士、护士长多与患者及家属沟通, 利用床旁交班、公休座谈会等机会向患者和家属讲述肿瘤患者发生压疮的危害, 介绍与疾病相关的知识, 使患者对疾病的危害有所了解, 并掌握一定的防治措施, 调动了患者的积极性, 使其能更好地配合护理工作, 增强战胜疾病的信心。
3.2 皮肤护理
由于晚期肿瘤患者大多存在不同程度的低蛋白血症、营养不良, 加上疾病本身引起患者活动受限、翻身困难, 而一些基础的防治措施难以预防压疮的发生, 因而易造成压疮。因此, 在压疮预防上应做到保持皮肤清洁干燥, 减少摩擦, 尽量避免皮肤接触大小便, 使用防压疮气垫。便后要及时清洗会阴部和肛周皮肤, 保持肛周皮肤干燥, 保持床单位清洁、干燥。
3.3 监控及防护措施
在晚期肿瘤患者住院期间, 管床护士应评估患者的病情, 对难免发生压疮的患者做好难免压疮申报, 在难免压疮高危患者的床边挂压疮警示牌, 针对该患者的病情制订出相应的压疮防护措施, 做好床旁交班工作, 在入院时和住院期间做好患者和家属的健康教育工作, 取得患者家属的理解和配合。每周基础护理加强日由护士长、组长检查落实情况, 对没有落实好的提出建议并整改。
3.4 加强健康教育, 调动患者的积极性
预见性地进行有效的健康教育是防治压疮的良好手段[3]。晚期肿瘤患者压疮和难免压疮的控制是肿瘤科护理工作的重点和难点, 因此, 护理人员在实施有效的护理措施的同时, 还要做好患者及家属的健康教育, 取得患者的配合, 尤其在家属和患者不理解的情况下, 护士应耐心反复解释, 介绍预防压疮的知识及发生压疮的危害性, 取得患者和家属的理解和积极配合, 使患者参与到压疮防治工作中, 进行有效的自我护理, 避免压疮的发生, 提高肿瘤患者的生活质量。
4 体会
皮肤创面无机诱导活性敷料应用具有上皮细胞再生诱导作用的硅钙无机元素为敷料的生物活性成分, 主动诱导上皮细胞增生, 促进伤口快速愈合。现有的其他外用敷料均不具有这类促进伤口愈合的生物功能。硅钙元素组合还可有效地中和创面的酸性渗出物, 有利于创面的快速愈合。现有的其他外用敷料均不具有此中和酸碱度的作用。无机元素活性物质具有的性能稳定和低价格等优势均明显优于现有技术的任何以生物蛋白作为活性成分的外用敷料。Ⅲ期压疮为浅度溃疡期。表皮水疱逐渐扩大、破溃, 真皮层疮面有黄色渗出液, 感染后表面有脓液覆盖, 致使浅层组织坏死, 形成溃疡, 患者感觉疼痛加重, 创面应用德莫林喷撒型粉剂后能有效地中和创面的酸性渗出物, 减少渗出, 并能保持创面不受感染, 保持创面干燥, 快速结痂[4,5]。皮肤创面无机诱导活性敷料在临床使用过程中, 相比常规药物缩短了压疮治愈时间, 使用方便, 减轻了患者的痛苦, 并为患者减轻了经济负担, 在临床上值得推广应用。
摘要：目的:探讨皮肤创面无机诱导活性敷料在压疮治疗中的临床效果。方法:对12例晚期肿瘤压疮患者采用皮肤创面无机诱导活性敷料局部外涂。结果:皮肤创面无机诱导活性敷料对压疮治疗效果满意。结论:皮肤创面无机诱导活性敷料可用于治疗压疮。
关键词：皮肤创面无机诱导活性敷料,压疮,护理
参考文献
[1]黄一帆, 谢田.护理学基础[M].南昌:江西科学技术出版社, 2008:176.
[2]王红美, 杨建英, 黄丽萍.压疮护理观察表及其临床应用[J].实用护理杂志, 2003, 19 (6) :40.
[3]王秀妙.应用护理程序对晚期肿瘤压疮防护探讨[J].中国实用护理杂志, 2005, 21 (3) :48-49.
[4]高永清, 杨雪莲.富博力一擦灵治疗压疮体会[J].中国误诊学杂志, 2006, 6 (6) :1155.
活性诱导 篇4
益母草为唇形科益母草属植物, 近年来研究表明, 作为一种传统中药, 益母草的药理作用是多方面的, 除对妇科疾病的治疗外, 益母草还被试用于冠心病及心肌缺血患者的治疗。本实验利用体外培养的新生大鼠心肌细胞, 通过AngⅡ诱导细胞肥大, 观察不同浓度的益母草水苏碱对肥大细胞的作用, 并进一步探讨活性氧 (reactive oxygen species, ROS) 是否涉及其抗细胞肥大的作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物 新生1 d~2 d SD大鼠, 中国科学院上海实验动物中心提供。合格证号:医动字第02-22-2。
1.2 药品与试剂 益母草水苏碱 (Alkaloid of Leonuri) 购自中国药品生物制品检定所, AngⅡ-溴-2-脱氧脲嘧啶 (Brdu) 、Hoechst 33258、MTT均为美国Sigma公司产品, 胶原酶Ⅱ购自Worthington 公司, 2, 7-dichlorofluorescin dictate (H2DCFDA) 荧光购自Molecular Probes公司;络沙坦 (Losartan Potassium) 购自美国LKT公司。
1.3 实验方法
1.3.1 心肌细胞原代培养 新生1 d~2 d的乳鼠, 快速剪取心脏, 将心室剪成1 mm3的组织块, 加入消化液 (0.25%胰蛋白酶, 0.02%胶原酶Ⅱ) , 置37 ℃振荡水浴中消化10 min左右, 重复消化7次或8次, 将悬液收集到含15%血清 (10%马血清和5%胎牛血清) 的DMEM/F12培养基 (D/F12) 的离心管中终止消化, 并离心5 min, 弃上清液。沉淀加入预温到37 ℃的含5%胎牛血清及10%马血清的培养液, 差速贴壁90 min, 除去非心肌细胞, 调整细胞密度为5×105 /mL, 加入Brdu (0.1 mL) 以抑制成纤维细胞, 接种到24孔培养板, 放于37 ℃ CO2培养箱中培养。
1.3.2 实验分组与步骤 心肌细胞原代培养48 h后, 换无血清培养液继续培养, 同时给予不同药物处理48 h, 实验随机分为7组: 正常对照组 (给予生理盐水处理) ;AngⅡ组 (给予10-6 mol/L的AngⅡ处理) ;AngⅡ+不同浓度的益母草水苏碱组 (10-6 mol/L的AngⅡ+10-4mol/L~10-7 mol/L的益母草水苏碱) ;AngⅡ+络沙坦组 (10-6 mol/L的AngⅡ+10-6 mol/L的Losartan) 。
1.4 检测指标及方法
1.4.1 心肌细胞数目测定 用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法 (MTT法) 。
1.4.2 细胞蛋白质含量检测 用BCA法。按照BCA试剂盒说明操作。以OD值为纵坐标, 以标准品浓度为横坐标, 绘制标准曲线, 根据样品的OD值在标准曲线上查出其浓度。
1.4.3 细胞DNA浓度检测 用荧光分光光度计。胰酶消化、PBS洗细胞后, 加TEN缓冲液与Hoechst33258 荧光染液混匀, 放置5 min, 上机测样品荧光强度 (激发波长356 nm, 发射波长492 nm) 。以小牛胸腺DNA作为标准品。
1.4.4 心肌细胞ROS含量检测 用流式细胞仪。分别用生理盐水、AngⅡ (10-6 mol/L) 、AngⅡ+益母草水苏碱 (10-6 mol/L) 、AngⅡ+Losartan (10-6 mol/L) 等药物处理。用FACSCalibur流式细胞仪 (美国Becton Dickinson 公司) 取样测值, WinMDI 2.9流式细胞分析软件分析, 以ROS阳性细胞的比例来反映细胞内ROS 含量的变化。
1.5 统计学处理 数据以均数±标准差
2 结 果
2.1 对心肌细胞数目的影响
MTT结果显示不同药物处理48 h后, 各组间均无统计学意义 (P>0.05) 。详见表1。
2.2 对心肌细胞蛋白含量的影响
与正常对照组比较, AngⅡ作用48 h后可显著提高细胞蛋白含量 (P<0.01) ;10-7~10-4 mol/L浓度的益母草水苏碱呈剂量依赖性对抗AngⅡ导致的蛋白含量增高 (P<0.01) ;络沙坦处理后也能降低细胞蛋白含量 (P<0.01) 。详见表1。
2.3 对心肌细胞DNA含量的影响
不同药物处理48 h后, 各组间DNA含量均无统计学意义 (P>0.05) 。详见表1。
2.4 ROS在益母草水苏碱抗心肌细胞肥大中的作用
与正常对照组比较, 10-6 mol/L的AngⅡ处理24 h后, ROS阳性细胞比例显著提高 (9.36% vs 32.28 %) ;益母草水苏碱 (20.58 %) 和络沙坦 (13.80 %) 均能降低AngⅡ导致的细胞ROS阳性细胞的升高。
3 讨 论
大量研究证实, 在心肌肥大的发生发展过程中, 炎症因子及细胞因子的释放、ROS引发的氧化应激等起着重要的作用。生理情况下, 体内会有少量ROS产生, 主要参与电子转运及细胞信号转导 [1,2]。ROS与体内的抗氧化系统维持在一个平衡状态;某些病理情况下, 过量ROS的生成是导致组织或细胞损伤甚至死亡的直接诱因[3]。许多实验室报道介导心肌肥大反应的多种信号分子及其下游蛋白的激活均直接或间接地涉及ROS的参与, 从而证明了在心肌肥大反应中, ROS是以第二信使的形式参与这一过程的[4,5,6,7,8]。
心力衰竭病理过程中, 始终伴随着神经内分泌系统的激活, 其中AngⅡ对心力衰竭时心室重构、心肌纤维化、心室肥厚的作用已得到证实[9]。Nakamura等[10]用AngⅡ诱导乳鼠心肌细胞的肥大反应, 发现其可能涉及ROS及p38 MAPK信号途径, 在此反应过程中的ROS主要来源于NAD (P) H 氧化酶。研究结果随后得到了许多实验室的证实。
益母草为唇形科益母草属植物, 始载于《神农本草经》, 其味辛、微苦, 性微寒, 入心包、肝经, 具有活血化瘀、利尿、消肿之功效。《本草纲目》中称之为“血家之圣药”, 作为一种传统中药, 除对妇科疾病的治疗作用外, 被试用于冠心病及心肌缺血患者的治疗, 其作用可能涉及抑制冠心病患者的血小板聚集, 起抗凝、抗血栓形成作用, 从而改善血液流变学参数 [11,12,13,14]。益母草的心肌保护作用可能涉及清除氧自由基、抑制活性氧簇生成而发挥抗氧化作用;缓解缺血心肌Ca2+超负荷, 保护心肌细胞结构和功能, 促进血管生成等[15]。
按照生物碱、黄酮素和挥发性成分提取分离益母草全草, 建立成年大鼠梗死性心室重构模型, 发现益母草的主要活性成分生物碱可有效降低大鼠梗死后心室重构的发生;明显改善大鼠的心室功能;缓解心肌超微结构的损伤[16,17]。本研究采用体外实验, 在预实验中, 发现10-6M的AngⅡ处理可显著提高心肌细胞蛋白含量, 但对心肌细胞DNA含量无影响, AngⅡ刺激可使无血清培养新生大鼠心肌细胞蛋白合成增加, 且在10-8~10-5M范围内呈量效依赖关系[18]。因此选择10-6M浓度的AngⅡ刺激心肌细胞来进行以下的实验。
通过检测细胞活力、Protein含量以及DNA含量等指标, 发现10-7~10-4M的益母草碱呈剂量依赖性对抗心肌细胞肥大。为了研究ROS是否涉及益母草水苏碱抗心肌细胞肥大的作用, 采用H2DCFDA荧光探针标记进行流式细胞仪分析。H2DCFDA可自由扩散进入细胞后被酯酶催化变成DCFH, 在活性氧存在下被氧化为DCF, DCF荧光强度与细胞内活性氧水平呈正相关。结果显示:与正常对照组相比, AngⅡ作用24 h后可提高细胞ROS含量, 益母草水苏碱和络沙坦处理均降低AngⅡ导致的细胞ROS含量的升高, 提示了益母草水苏碱的抗氧化能力。
益母草碱有对抗心肌细胞肥大的作用, 其机制可能涉及ROS信号通路的参与。本研究初步探索益母草碱抗心肌肥大的机制, 从而为开发益母草有效成分的新药提供可靠的实验依据, 最终服务于临床。
摘要：目的利用新生大鼠心肌细胞, 观察益母草水苏碱对血管紧张素Ⅱ (AngⅡ) 诱导的心肌细胞肥大和活性氧 (ROS) 含量的影响。方法培养新生大鼠心肌细胞, 利用AngⅡ诱导心肌细胞肥大, 观察不同浓度的益母草水苏碱对细胞肥大的影响 (细胞数目、蛋白以及DNA含量) , 同时用H2DCFDA荧光探针标记、流式细胞仪检测ROS含量。结果①AngⅡ (10-6mol/L) 使心肌细胞蛋白含量明显增高 (P<0.05) , 对细胞数目和DNA含量无影响 (P>0.05) ;②10-7mol/L～10-4mol/L浓度的益母草水苏碱呈剂量依赖性关系对抗AngⅡ导致的蛋白含量的增高 (P<0.05) ;③AngⅡ可诱导心肌细胞内ROS含量增加, 加入益母草水苏碱抑制了AngⅡ的这一作用。结论益母草水苏碱可抑制AngⅡ诱导的新生大鼠心肌细胞肥大, 抑制ROS含量增加可能是其作用机制之一。
活性诱导 篇5
NF-κB是一类重要的核转录因子,参与多种重要生物学功能的调控,与细胞增殖、凋亡、炎症、肿瘤形成和多种自身免疫性疾病等密切相关。已知NF-κB通路在各种生理或病理条件下,会发生多种相关激酶翻译后修饰依赖的活化,包括泛素化、磷酸化及SUMO化修饰等,进而启动一系列靶基因的转录,调节炎症和肿瘤发生等进程。因此,这些参与调控修饰的酶类在NF-κB通路的活性调控起着重要作用。
UBE2W是一类新的具有UBC结构域的I型泛素结合酶(E2),已知其可与BRCA1的RING结构域相互作用,催化RING结构域的单泛素化,参与双链DNA损伤修复及转录调控[1]。本实验室前期在通量化筛选NF-κB相关泛素调节酶时发现,UBE2W可能与NF-κB的活性调控有关。本工作通过使用双荧光报告系统和Western blot等方法对上述结果进一步深入研究,分别干涉和过表达UBE2W,结果表明UBE2W能显著抑制TNFα诱导的NF-κB转录活性,推测其可能在调节NF-κB通路及相关的生物学功能中发挥重要作用。
1 材料和方法
1.1 材料
细胞:293T细胞(人胚胎肾细胞)和U2OS(人骨肉瘤细胞)为我室保存。
质粒:pCMV-Myc-UBE2W为军事医学科学院生物工程研究所周晓巍教授馈赠。
pCMV-Myc-vector为我室保存。
UBE2W的干涉序列由上海GenePharma公司合成,序列为:
5’-GGAAAUGAGUAGUGAUAUGUU-3’,
荧光定量PCR引物:UBE2W和GAPDH的Real-time PCR primers,由Invitrogen公司
合成(具体见表1)。
抗体:UBE2W多抗为军事医学科学院生物工程研究所周晓巍教授馈赠。Myc鼠单抗以
及?-tubulin抗体购自Santa Cruz公司。
试剂:DMEM培养基购自于GIBCO公司。转染试剂lipofectamine 2000 Reagent购自
Invitrogen公司,逆转录及PCR扩增所需试剂盒为Primerscript kit (DRR 036A
和DRR 081A)购自TaKaRa公司。荧光素酶检测试剂盒购自Promega公司
(E1980)。
1.2 细胞培养
293T细胞和U2OS细胞培养采用DMEM培养基,加入10%胎牛血清(Hyclone公司)和青链霉素(1∶1 000),于37 ℃,5% CO2细胞培养箱中培养。
1.3 实时荧光定量PCR
1.3.1 总RNA提取
将细胞用TRIzol裂解,待室温放置15 min充分裂解后转至EP管中。加氯仿震荡30 s,室温放置5 min;4 ℃离心12 000 r/min,15 min;吸上层水相于另一EP管中;加等体积异丙醇,充分混匀后室温放置10 min;4 ℃离心12 000 r/min,10 min,弃上清;加预冷75%乙醇500 μL,反复吹匀;4 ℃离心6 000 r/min,5 min;弃上清,室温干燥15 min,后溶解于20 μL DEPC水中。
1.3.2 cDNA合成
逆转录体系20 μL, 包括总RNA 2 μg、5×Primerscript 4 μL及DEPC水补齐。反应程序:37 ℃ 15 min→85 ℃ 5 s→4 ℃终止。
1.3.3 Real-time PCR
PCR反应体系,包括SYBR premix Ex Taq II(2×)12.5 μL+ ROX Reference Dye(50×)0.5 μL + DEPC 水9 μL+总RNA反转录cDNA 1 μL + Primers 2 μL总体积25 μL。PCR循环(95 ℃ 30 min→95 ℃ 5 s→60℃ 31 s)×40个循环。
1.4 双荧光报告系统检测
293T细胞和U2OS细胞分别种于24孔板,检测过表达UBE2W对NF-κB转录活性影响时,将pNF-κB-luc 0.1 μg及海肾报告基因(Renilla-luc)0.01 μg和质粒pCMV-Myc-UBE2W 0.2 μg或pCMV-Myc-vector 0.2 μg共转入细胞中,6 h后换新鲜培养基,转染24 h加入TNFα(终浓度10 ng/mL),刺激6 h后用冰PBS洗细胞,每孔加入预先稀释好的裂解缓冲液(Passive Lysis Buffer)100 μL,室温裂解15 min,收集细胞裂解液,高速离心30 s,取上清。用荧光素酶检测系统测定NF-κB的转录活性。
检测干涉UBE2W对NF-κB转录活性影响时,共转上述报告基因及siRNA,具体过程与前类似,siRNA终浓度为50 nmol,转染2次,间隔24 h,48 h后加入TNFα(终浓度10 ng/mL)刺激,刺激6 h裂解细胞并利用双荧光报告系统检测NF-κB转录活性。
为证明干涉UBE2W引起的NF-κB转录活性改变为特异敲低该基因引起的效应,在转染报告基因及si UBE2W 48 h后,再外源过表达pCMV-Myc-UBE2W,24 h后加TNFα(终浓度10 ng/mL)刺激,6 h收取样品检测对于NF-κB转录活性的影响。
1.5 Western blot
向将细胞裂解液中加入等量2×蛋白质缓冲液,沸水浴变性10 min;冷却至室温后进行Western blot。电泳时,浓缩胶电压为恒压80 V,分离胶电压为120 V;转印至PVDF膜,转印所需电流为250 mA; 转印完成后,PVDF膜用5%的脱脂奶粉封闭1 h;一抗孵育1 h,TBST洗膜3次,每次5 min;二抗孵育1 h,TBST洗膜3次,每次5 min;最后进行显影。一抗分别为抗Myc鼠单抗(1∶5 000)和抗UBE2W兔多抗(1∶500),α-tubulin为内参。
2 结果
2.1 干涉UBE2W可增强TNFα诱导的NF-κB转录活性
293T细胞中无TNFαB刺激时干涉UBE2W对NF-κB转录活性影响较小,而敲低UBE2W显著增强了TNFαB诱导的NF-κB转录活性(图1a),用荧光定量PCR和Western blot方法检测UBE2W的干涉效果,结果表明在mRNA和蛋白质水平上UBE2W表达均被有效抑制(图1b,1c)。
将这一过程在U2OS细胞中进行验证,结果表明敲低UBE2W也可增强TNFαB诱导的NF-κB转录活性,同时用Western blot 检测UBE2W的干涉效果,证实在蛋白水平上可以抑制UBE2W的表达。(如图2a,2b)
2.2 过表达UBE2W抑制TNFα诱导的NF-κB转录活性
在293T细胞中过表达UBE2W,结果如图3a所示,与转染对照质粒相比,UBE2W的过表达显著抑制了TNFαB引起的NF-κB的转录活性。采用Western blot检测过表达效果,如图3b所示。
在U2OS细胞中验证上述实验,得出类似结果,但由于受转染效率限制,U2OS细胞中过表达UBE2W对于NF-κB转录活性的抑制效应略弱于293T细胞(如图4所示)。
2.3 UBE2W干涉后回转可减弱TNFα诱导的NF-κB转录活性
由于转染UBE2W siRNA产生的生物学效应,可能存在非靶基因干涉引起的细胞表型,即脱靶效应(off-target)造成的假阳性结果。为验证上述结果的可靠性,在转染报告基因及干涉基因后,再外源过表达UBE2W,结果如图5a所示:UBE2W的敲低促进了NF-κB的转录活性,而UBE2W的回转部分程度上逆转了上述效应,证明UBE2W对于NF-KB的抑制是特异的。同时对UBE2W干涉和回转过表达的效果进行Western blot检测(如图5b所示)。
3 讨论
NF-κB是一种广泛分布于真核细胞中的核转录因子,可调控一系列靶基因的表达,包括细胞因子、化学趋化因子、生长因子、粘附分子、某些急性期反应蛋白以及参与免疫识别的受体和抗原递呈的蛋白质等,大多数均参与宿主的免疫、炎症反应,并与细胞增殖和肿瘤形成相关。当受外界信号刺激时,可依次激活TAK1和IKKs,使IκB发生多泛素化修饰,进而导致蛋白酶体依赖的降解,被释放的NF-κB移位至细胞核中调节靶基因的转录。这一复杂过程需要多种泛素酶和磷酸激酶等的参与,才能完成泛素化、磷酸化等蛋白修饰活化[2]。
其中,泛素化作为蛋白质修饰的一种常见形式,在许多细胞通路中发挥重要作用,参与了信号转导和DNA损伤等多种生物过程。泛素结合到底物的过程是一个依赖ATP的酶促反应过程,涉及泛素活化酶(E1),泛素结合酶(E2)及泛素连接酶(E3)三种酶。UBE2W是一种新的E2酶,具有保守的UBC结构域,催化泛素与靶蛋白的结合,在人类和鼠的组织中有广泛表达[3,4]。研究表明,UBE2W可调节CHIP的单泛素化修饰,和CHIP的去泛素化蛋白ataxin-3共同维持UBE2W泛素化和去泛素化状态间的平衡[5]。另有研究发现,UBE2W通过与FANCD2的FANCL结合,催化PHD结构域单泛素化,参与FA-BRCA通路的调控[6],而后者与DNA复制和细胞分裂相关,为维持基因组稳定所必需。本研究显示,UBE2W对于NF-κB的转录活性有明确的调控作用,过表达UBE2W抑制NF?B转录活性,而敲低UBE2W则促进NF?B转录活性,提示UBE2W参与了NF-κB的转录活化过程,推测可能在NF-κB相关的炎症和肿瘤形成中发挥作用;但UBE2W调控NF-κB通路活性的具体分子机制目前仍不清楚,还需进一步研究探讨。
摘要：UBE2W(ubiquitin-conjugating enzyme E2W)是一新的泛素结合酶,关于其功能研究甚少。采用双荧光报告系统和Western blot等方法,分别干涉和过表达UBE2W,分析UBE2W对TNF(刺激下NF-(B转录活性的影响。结果显示UBE2W能够显著抑制TNFα诱导的NF-κB的转录活性,提示该基因可能参与NF-κB相关功能的调控。
关键词：UBE2W,NF-κB,TNFα
参考文献
[1] Christensen D E,Brzovic P S,Klevit R E.E2-BRCA1 RING inter-actions dictate synthesis of mono-or specific polyubiquitin chain linka-ges.Nat.Struct.Mol.Biol,2007;14(10):941—948
[2]周柔丽.医学细胞生物学,第2版.北京:北京大学医学出版社,2006;559—560
[3] Yin G,Ji C,Wu T,et al.Cloning,characterization and subcellularlocalization of a gene encoding a human Ubiquitin-conjugating enzyme(E2)homologous to the Arabidopsis thaliana UBC—16 gene prod-uct.Front Biosci,2006;11(5):1500—1507
[4] Zhang Y,Zhu H,Zhao L,et al.Generation of mouse UBE2W anti-body and analysis of UBE2W expression in mouse tissues.Chin J Bio-technol,2008;24(4):547—552
[5] Scalione K M,Zavodszky E,Todi S V,et al.UBE2W and ataxin-3 coordinately regulate the ubiquitin ligase CHIP.Mol Cell,2011;43(4):599—612
活性诱导 篇6
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
人脐静脉内皮细胞株 (HUVECs) CRL-1730为ATCC公司产品;胎牛血清 (天津灏洋) ;DMEM-F12培养基和胰酶 (Gibco公司) ;表皮生长因子 (EGF) 和碱性成纤维细胞生长因子 (b FGF) 购自Peprotech公司;米诺环素、LPS (Sigma公司) ;兔抗人NF-кB p65单克隆抗体 (Abcam公司) ;羊抗兔FITC二抗 (KPL公司) ;碘化丙啶 (propidium iodide, PI) 购自晶美公司;Triton X-100购自深圳华美公司。
1.2 仪器与设备
流式细胞仪 (FACS Calibur, BD, USA) ;激光扫描共聚焦显微镜 (AOBS SPII 5.0, Leica, Germany) 。
1.3 实验方法
1.3.1细胞培养
用含10%胎牛血清的DMEM-F12培养液复苏CRL-1730细胞株, 复苏后的细胞按2.5×103个/cm2的密度接种在25 m L培养瓶中, 用适量完全DMEM-F12培养液 (含10%胎牛血清、100 u/m L青霉素、100 mg/m L链霉素、10 ng/m L EGF、5 ng/m Lb FGF) 培养, 置37℃、5%二氧化碳 (CO2) 常氧恒温培养箱, 次日更换一次培养基。4~5 d后待细胞单层长满瓶底, 融合达80%~90%, 进行细胞传代, 加入适量的0.25%胰蛋白酶溶液, 于37℃孵育2~5 min, 显微镜下观察, 待大部分细胞变圆后弃去消化液, 用含血清的培养液终止胰蛋白酶作用, 制成单细胞悬液, 再根据1︰2或1︰3加入适量的完全培养基混匀后分别装入培养瓶, 置37℃、5%CO2常氧恒温培养箱常规培养。实验用细胞均为传3~5代的细胞, 当生长至80%以上融合度时, 收集细胞, 用于实验。
1.3.2流式细胞仪检测血管内皮细胞NF-кB p65表达
收集处于对数生长期的CRL-1730细胞, 记数后按5×105个/m L的细胞数种于6孔板中, 培养24 h左右, 换用含0.5%胎牛血清的培养液培养24h, 使细胞同步后用于实验。实验设为对照组 (与药物组等体积DMEM/F12培养液) 、LPS组 (1μg/m L) 、MC+LPS组:MC1 (1μmol/L) 、MC2 (10μmol/L) 、MC3 (100μmol/L) 分别与细胞孵育1 h后再加入LPS (1μg/m L) 共同孵育。LPS组分别于0.5、1.0、2.0和4.0 h收集细胞, 米诺环素3个剂量保护组于作用后2 h收集细胞, 将收集的细胞用PBS洗涤后, 加入0.1%Triton X-100 PBS液作用10 min后, 依次加入1︰100兔抗人NF-кB p65抗体及FITC标记的羊抗兔二抗, 避光, 4℃孵育45 min, 洗涤后上机检测。
1.3.3 CLSM检测NF-кB p65活性
利用CLSM结合荧光双标技术对NF-кB p65活性进行定位和定量分析。收集处于对数生长期的HUVECs, 调整细胞浓度为1×105个/m L转种于放有无菌盖玻片的12孔板中, 待细胞爬片后, 换用含0.5%胎牛血清的培养液培养24 h, 使细胞同步后用于实验。实验分为对照组、LPS组 (1μg/m L) 、MC1+LPS组、MC2+LPS组、MC3+LPS组, 药物处理方法同上, 各组均收集LPS作用2 h后的细胞。将收集的细胞先用4%的多聚甲醛固定, 依次滴加1︰250的兔抗人NF-κB p65抗体, 1︰50 FITC标记的羊抗兔二抗, 37℃避光孵育30 min, 再加PI染液 (5μg/m L碘化丙啶+100μg/m LRNase A酶) , 闭光10 min复染细胞核后上机检测选用40倍物镜, 氩、氖、氦离子激光器做为光源, 同时发射488 nm和561 nm激光, 分别激发绿色和红色荧光, 光电倍增管1 (PMT1) 选择560 nm的发射滤光片, 探测PI的红色荧光, 光电倍增管2 (PMT2) 选择505~530 nm的发射滤片, 探测FITC的绿色荧光, 用核区绿色荧光与胞浆区绿色荧光的比值 (FN/FC) 来定量分析, 记数20个细胞的FN/FC。
1.4 统计学方法
采用SPSS 13.0软件包进行数据分析, 所有的计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 单因素方差分析组间多重比较, 检验水准为α=0.05。
2 结果
2.1 流式细胞仪检测NF-кB p65表达
NF-кB p65在人脐静脉内皮细胞中的基础表达率为 (9.6±0.5) %, 经LPS刺激后, NF-кB p65的表达在0.5 h即有明显增高, 1~2 h达高峰, 其后逐步下降 (见表1) 。不同浓度的米诺环素单独与人脐静脉内皮细胞孵育, 对细胞NF-κB p65的基础表达无明显影响, 与LPS共同作用后抑制NF-кB p65的表达, 其抑制率呈现剂量依赖性 (见表2) 。
2.2 CLSM检测NF-кB p65活性
PMT1显示PI标记的细胞核区为红色荧光图像 (见附图1a~5a) ;PMT2显示代表NF-кB p65的绿色荧光 (见附图1b~5b) , 合成的两种荧光细胞图像, 可见细胞核为红色, 胞浆为绿色。经LPS诱导后的血管内皮细胞NF-кB p65被明显激活, CLSM检测显示红色荧光的细胞核中出现代表NF-кB p65的绿色荧光, 两种荧光叠加时显黄色 (见附图2c) , FN/FC为 (1.334±0.190) ;在药物处理组, CLSM检测显示细胞核中的绿色荧光较LPS组减少, FN/FC的减少呈剂量依赖型, 而未经LPS诱导的对照组, 绿色荧光主要分布在胞浆区, 核区内未出现绿色荧光 (见附图1c) , FN/FC明显小于经LPS刺激的HUVECs (P<0.05) (见表3) 。
注:1) 与对照组比较, P<0.05;2) 与1.0 h LPS组比较, P>0.05
注:不同浓度米诺环素组与LPS组比较, P<0.05
注:不同浓度米诺环素组与LPS组比较, P<0.05
3 讨论
炎症反应的强弱与编码炎症介质基因表达的高低有关系, 这些基因表达受转录因子的调节, NF-кB在炎症病理过程许多炎症介质的表达中起关键性调控作用。NF-кB由5种亚基组成, 其中由p50和p65亚基形成同源性或异源性二聚体是最主要的结构形式。细胞处于静息状态时, NF-кB以二聚体与抑制因子IкB结合形成无活性的三聚体存在于细胞浆中, 当细胞受到炎症刺激时, 刺激信号转化为炎症信号通过细胞膜传入细胞内, IкB磷酸化, 从三聚体复合物中释出并降解, NF-кB二聚体激活, 由胞浆移入至胞核, 与其靶基因中启动子或增强子的кB序列结合, 从而诱导许多因子的转录, 合成炎症细胞因子或其他与炎症相关的生物活性蛋白[15,16]。细菌内毒素LPS是血管内皮细胞的强烈激活剂, 可以不依赖其他的炎症细胞和炎症介质直接活化内皮细胞NF-кB的表达[17,18]。本实验通过流式细胞仪同样检测到, 经LPS刺激后, NF-кB p65的表达在0.5 h即有明显的增高, 在1~2 h达高峰。
随着对米诺环素抗炎、抗氧化、抗凋亡机制的研究, 越来越多的研究已进一步明确米诺环素多重功效的作用机制, 蔡志友等人[19]发现, 米诺环素能抑制脑缺血再灌注后NF-кB的表达。MARIA等[20]研究发现, 米诺环素能减弱LPS诱导的小胶质细胞IкB的降解, 提示米诺环素可能通过减少NF-кB由胞浆向胞核的转移来抑制NF-кB的转录活性。本实验通过流式细胞仪检测到, 在LPS诱导血管内皮细胞2 h后, NF-кB p65的表达达高峰, 而米诺环素能显著抑制LPS诱导的人血管内皮细胞NF-кB的表达, 且抑制率呈浓度依赖性。
与普通荧光显微镜相比, CLSM的敏感性、分辨率及清晰度都有较大的提高, 并且能对同一标本中不同荧光标记的不同物质进行精确的定位和定量分析。本实验通过荧光双标法更直观地观察到了NF-кB的活性状态, 通过测定荧光强度间接反映了NF-кB的活性强度。在LPS组中, CLSM显示红色的核区中出现代表NF-кB的绿色荧光, 在不同浓度的米诺环素预处理组中, 核区中的绿色荧光均不同程度地减少, 米诺环素预处理组与LPS组FN/FC比较, 差异具有统计学意义 (P<0.05) , 不同浓度的米诺环素组FN/FC显示, 其对NF-кB活性的抑制呈浓度依赖型, 与流式细胞仪的检测结果是一致的。