分化诱导因子（共3篇）
分化诱导因子 篇1
随着干细胞研究的不断深入,学者们已能在体外分离培养出多种组织干细胞,包括由皮肤表皮基底层中分离出的表皮干细胞(epidermal stem cells)和位于表皮之下毛囊隆突处的毛囊干细胞(follilar stem cells)。它们都是具有慢周期性和自我增殖能力的细胞,表面标志角蛋白K19和β1整合素高表达。国内有学者对成年山羊皮肤干细胞进行体外克隆与诱导分化,产生出类毛囊样结构和类星形胶质细胞[1],提示皮肤干细胞具有多向分化潜能,在体外培养条件下也能进行定向分化。因此,为了更好的了解人体皮肤干细胞增殖、分化及调控机制,笔者用新生儿表皮干细胞体外培养进行定向诱导分化研究,得到类似毛发皮质样结构。
1 材料与方法
1.1 材料
标本来源:收集本院产科新生儿脐带标本25份,健康成人头发12份,及新鲜猪软骨10份。
上皮细胞培养液:参照文献[2]配制。在DMEM和F12(V∶V=3∶1)基础培养液中添加如下成分:15%胎牛血清、4 mmol/L谷氨酰胺、0.4μg/mL氢化可的松、5μg/m L转铁蛋白、1.8×10-4mmol/L腺嘌呤、2×10-11mmol/L三碘甲腺原氨酸、5μg/mL胰岛素、10 ng/mL表皮生长因子、100 u/mL青霉素和100μg/mL链霉素。以上试剂中,DMEM和F12培养基购自杭州吉诺生物科技有限公司,胎牛血清购自杭州四季青公司,其余试剂购自美国Sigma公司。
普通消化液:0.25%胰酶以1∶1的比例加入0.02%EDTA(美国Gibco公司);抗人角蛋白19(K19)单抗(美国Biovision公司);Hanks液(杭州吉诺生物科技有限公司);SP试剂盒及DAB试剂盒(北京奥森生物技术有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 制备干细胞悬液
(1)将取得的新生儿脐带纵向剪开,用三蒸水清洗除去血液及脐带中内容物,然后将皮肤组织剪碎,用含2 000 u/L青霉素、200 mg/L链霉素及2.5 mg/L两性霉素B的无钙镁离子PBS液反复冲洗3次;(2)将冲洗干净的皮片组织置于0.25%中性蛋白酶Ⅱ中消化20 min,再置于0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA中,37℃消化30 min,200目金属网过滤,收获细胞悬液,1 000 r/min离心5~10 min,再用无钙镁的Hanks液洗涤离心2次,进行细胞计数;(3)将消化洗涤后的细胞加入含有15%胎牛血清、4 mmol/L谷氨酰胺、0.4μg/mL氢化可的松、5μg/mL转铁蛋白、5μg/mL胰岛素、10 ng/mL表皮生长因子、1.8×10-4mmol/L腺嘌呤、100 u/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM和F12(V∶V=3∶1)培养基中,培养瓶底用Ⅳ型胶原包被,于37℃、5%二氧化碳孵育箱中孵育,次日吸出培养液及未贴壁细胞,再加入新鲜培养液,2、3 d换液1次,细胞长至70%~80%融合时进行诱导分化培养及离心涂片,免疫组化鉴定表皮干细胞。
1.2.2 表皮干细胞的鉴定
取第2代传代培养的表皮干细胞离心涂片烤干,免疫组织化学染色检测表皮干细胞的K19表达,PBS液代替1抗作为阴性对照。
1.2.3 体外诱导分化实验
根据细胞因子及激素等物质对干细胞有诱导分化的影响,将第2代传代培养的表皮干细胞从瓶底消化至单个细胞,离心收集后制成细胞悬液,分别用诱导液A液(10ng/mL M199培养液、15%胎牛血清、100 u/mL青霉素、100μg/mL链霉素、4μg/mL地塞米松、5 ng/mL表皮生长因子、10 ng/mL成纤维细胞生长因子)和B液(10 ng/mL M199培养液、10%胎牛血清、100 u/mL青霉素、100μg/mL链霉素、0.05 mg/mL维生素C)加入24孔培养皿内(孔内放置3、4根毛干组织或猪软骨2、3块)培养,24 h后换液,以后每2天换液1次,观察干细胞的分化情况。
2 结果
用Ⅳ型胶原黏附法分离得到约5%~10%的快贴附培养细胞,这些细胞被认为是皮肤干细胞[3],免疫组织化学K19阳性表达(图1),随着培养细胞传代数的增加,细胞体外培养增殖的速度会减慢,获得的干细胞数也会下降。原代细胞经2、3周培养会出现较明显的增殖和细胞克隆现象,并可进行传代或诱导分化培养,诱导分化培养2、3 d后发现干细胞向毛根及毛干聚集生长(图2、3),10~15 d细胞缓慢分化为毛干的毛皮质样结构,并同毛皮质融合成一体,部分干细胞围绕毛干形成隆突样物质,原细胞形态逐渐消失(图4)。在含猪软骨块的培养孔中,皮肤干细胞形态变异,形成异型样细胞,众多细胞围拢渐渐融合成片状,但未见聚集成鸟巢状集落(图5)。
A:新生儿皮肤干细胞(×100);B:免疫组织化学K19表达阳性(×100)
A:干细胞密集生长(×400);B:干细胞向毛发聚集生长(×100)
A、B:猪软骨组织诱导后细胞出现异形性改变(×400)
3 讨论
干细胞是一类具有自我更新的原始细胞,能产生至少一种以上高度分化的子代细胞,在细胞的生长和分化过程中起主导作用。表皮中角质形成细胞主要由3种细胞成分组成,包括表皮干细胞、短暂扩增细胞和有丝分裂后分化细胞[4],其中表皮干细胞是角质形成细胞中增殖能力最强的细胞,是潜在的多能干细胞,成为近年来干细胞研究重点之一。TU-DOR等[5]利用表皮干细胞具有快速黏附Ⅳ型胶原的特性将其分离出来,并发现基底细胞中有4%~10%的细胞具有快速黏附性,其中45%能增殖形成大克隆。这些多能干细胞能分化产生构建表皮、皮脂腺等细胞。关于毛囊干细胞与表皮干细胞是否同源是近来科学家们所关注的问题,过去一直认为毛囊和表皮各自有独特的干细胞,现在BLANPAIN等[6]指出:这两种结构中只有一种根本的表皮干细胞,它不仅具有形成皮肤的能力,也有形成毛发、皮脂腺的能力。METALLO等[7]也认为毛囊是角朊干细胞的主要来源,毛囊干细胞不仅能形成毛发,而且可形成表皮。OSHIMA等[8]指出,存在于小鼠触须毛囊外根鞘部上端的多能干细胞,能分化产生构建表皮、皮脂腺和毛囊等所需的各种类型的细胞。从胚胎发育角度,毛囊及汗腺均由外胚层分化来的表皮干细胞产生,所以有学者认为三者是一个共同的干细胞来源,提出表皮-毛囊-皮脂腺单位的概念。黄锦桃等[9]发现胚胎干细胞源性表皮干细胞在小鼠全层皮肤缺损创面可分化为表皮样、汗腺样、毛囊样和皮脂腺样结构。根据上述概念,笔者用成人毛发为诱导物使新生儿皮肤干细胞向毛发组织转变。在实验研究过程中观察到,最初几天新生儿ESCs会向毛干周边移动聚集,随后逐步分化成毛鞘样结构。本组的结果支持METALLO的观点。
本实验中用细胞生长因子及条件培养基,对所分离的干细胞用猪软骨作诱导物进行诱导分化,得到异型样细胞,提示所分离的干细胞具有多向分化潜能,并且可被诱导进行横向分化。试想如果能从成体皮肤、血液、新生儿脐带及脐带血中提取有效的成体或多能干细胞,在微环境的诱导下,在相关细胞及细胞外基质间的作用中调节干细胞增殖及定向分化,这将给皮肤组织工程带来新的治疗途径。总之,皮肤干细胞的研究和应用还处于早期阶段,很多分化机制和体外调控机制尚不明确,但皮肤干细胞对细胞疗法具有重要的意义。
摘要：目的 探讨新生儿皮肤干细胞(ESCs)的培养方法,并研究新生儿皮肤干细胞的增殖及诱导分化。方法 用两步酶消化法分离新生儿脐带获得角质形成细胞,采用Ⅳ型胶原快速黏附法筛选ESCs并培养。在含细胞因子的条件培养基中加入人头发组织或猪软骨组织作为诱导物,对增殖的ESCs进行体外诱导培养,观察ESCs的分化状况。结果 培养的新生儿ESCs有克隆状生长现象,角蛋白K19免疫组化染色阳性,培养初期细胞有向毛发的毛根和毛干为中心聚集生长现象,并逐步分化成类似毛皮质的结构。结论 新生儿ESCs在含毛发组织为诱导物的条件培养基中逐步分化成类似毛干皮质的组织结构,这为体外构建毛发组织工程奠定了一定的理论基础。
关键词：皮肤干细胞,体外克隆,诱导分化
参考文献
[1]YANGXY,CAOBY,FENGXL,etal.Cloningand induced differentiation of adult goat skin stemcell sinvitro[J].Chinese Journal of ReparativeandReconstructiveSurgery,2003,17(2):90-93.Chinese
[2]XUEQS.Theoryand techniqueof cultural in vitro[M].Beijing:Science Press,2001:409-421.Chinese
[3]JI KH,XIONG J,FAN LX,et al.Ex vivo differentiation of multipotent adult progenitor cells to skin epidermal cells[J].Journal of Medical CollegesofPLA,2009,24(2):84-91.
[4]REVOLTELLA RP,PAPINI S,ROSELLINI A,et al.Epithelial stem cells of theeyesur face[J].CellProlif,2007,40(4):445-461.
[5]TUDOR D,CHAUDRY F,HARPER L,et al.The in vitro behaviourand patternsof colony formation of murineepi the lial stem cells[J].Cell Prolif,2007,40(5):706-720.
[6]BLANPAIN C,HORSLEY V,FUCHS E,et al.Epithelial stem cells:turnin governew leaves[J].Cell,2007,128(3):445-458.
[7]METALLO CM,AZARIN SM,MOSES LE,et al.Human embryonic stem cell-derived keratinocytes exhibit an epidermal transcription program and undergo epithelial morphogenesis in engineered tissue constructs[J].TissueEngPartA,2010,16(1):213-223.
[8]OSHIMA H,ROCHAT A,KEDZIA G,et al.Morpho-genesis and renewalofhair follicles from adule multipotenestem cells[J].Cell,2001,104(2):233-245.
[9]HUANG JIT,LIU AJ,ZHU YH,et al.Differention of ES cell-derived epidermal stemcell sinfull thickness skin defects[J].AnatRes,2007,29(1):26-28.Chinese
分化诱导因子 篇2
草莓花药愈伤组织诱导与分化研究
研究了不同激素浓度组合的培养基对草莓花药愈伤组织诱导增殖和不定芽的诱导及分化的影响.结果表明:单核期花药的`诱导率最高,达78.9%左右;MS+NAA 0.2 mg/L+6-BA 1.5 mg/L对愈伤组织的诱导及不定芽的诱导和增殖都是最适合的培养基.
作 者：孟志卿 MENG Zhi-qing 作者单位：孝感学院,湖北省作物病害监测和安全控制实验室,湖北,孝感,43刊 名：江西农业学报 ISTIC英文刊名：ACTA AGRICULTURAE JIANGXI年，卷(期)：19(9)分类号：S681.9关键词：草莓 花药 组织培养 愈伤组织 诱导 分化
分化诱导因子 篇3
1 材料
1.1 试验材料
本实验根据拉萨市场目前的需求、拉萨人民的消费习惯, 和产品在拉萨地区栽培表现, 我们筛选出目前栽培面积较大的辣椒品种洛椒巨早306特大果作为实验材料。
2 方法
2.1 辣椒无菌苗的培养
将所购买的辣椒种子在超级工作台内用75%酒精浸泡1min~2min, 浸泡2~3次, 然后再用
次氯酸钠消毒10min~15min, 再用无菌水冲洗3次, 将消过毒的种子接种在培养基进行离体培养。无菌苗诱导选用MS培养基, p H值调至5.6~5.8。在25℃和16 h光照/8 h黑暗条件下培养, 光强2000~2500Lx, 10d后培养出可供实验的无菌苗。
2.2 辣椒外植体愈伤组织的诱导
选取健康的无菌苗子叶, 叶片切成面积为1cm2的方块, 每个培养瓶中均匀接种4片切好的子叶, 子叶诱导基础培养基选用MS, 添加6-BA (6-苄基腺嘌呤) 和NAA (α-萘乙酸) 的不同浓度配比, p H值调至5.6~5.8。在25℃和16 h光照/8h黑暗条件下培养, 光强2000~2500Lx。20d后统计愈伤组织分化效果。由表1可以看出, 在添加MS+2mg/L 6-BA的培养基中愈伤组织的分化率比较高, 可达58.6%;由表2可以看出, 在培养基为MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.3 mg/L的情况下, 芽的分化率比较高, 可达10%。
3 讨论
通过本实验研究发现, 辣椒愈伤组织诱导率及其分化率受很多因素的影响, 主要研究了不同浓度激素组合对愈伤组织诱导率及分化率的影响。除此之外辣椒愈伤组织诱导率和分化率还受其它因素的影响, 例如预期的灭菌、生理状态、培养条件等有关。
本实验所加的植物生长物质有:6-BA和NAA。其中6-BA决定芽的分化。NAA低浓度能促进植物的生长, 作生长调节剂。高浓度则会干扰植物体内激素的平衡, 影响光合作用、呼吸作用及蛋白质的合成。6-BA的影响是浓度达到2mg/L时, 出愈率达到最大且愈伤组织的长势最佳。从愈伤组织的质地、大小及颜色来看, 不同的外源激素浓度对它的作用是不一样的。6-BA诱导形成的愈伤组织质地致密, 颜色浅绿, 生长较慢, 愈伤组织持续生长的时间较长, 能够很好的进行不定芽的分化。本实验中对NAA的表现情况与前人研究相符, 即在0.3mg/L的情况下配合2mg/L6-BA的芽的分化率较高, 但总体实验情况并不理想。
参考文献
[1]曹孜义, 刘国民.实用植物组织培养教程[M].兰州:甘肃科学技术出版社, 1996.
[2]潘瑞帜, 董愚得.植物生理学[M].北京:高等教育出版社, 1995.
[3]刘庆昌, 吴国良主编.植物细胞组织培养[M].中国农业大学出版社, 2003:113-116.
[4]董春枝, 张宝玺, 赵开军, 等.辣椒子叶高效植株再生体系的建立[J].园艺学报, 2002, 29 (1) :25-29.
[5]李明军, 燕浈.刘额, 等朝天椒的组织培养和植株再生[J].植袖生理学通讯.2G00, 36 (2) :134-13.
[6]Manoharan M, SreeV C, Lakahmi S.G.et al.Agrobactenium-mediated genetic transformation in hot chili (Capaicumanumun L.var.Pusa jwala) [J]Plant Sci., 1998, 131 (1) :77-83.
[7]Pinto M, Pena L.Hish eficiency organogcnesis in sweetpepper (Capsicum annuum L) tissues from diferent seedinexplants[J].Hant Growth Regulation, 2001, 33:221-229.
[8]邓明华, 邹学校, 周群初, 等.辣椒子叶离体培养植株再生研究[J].长江蔬菜, 2003 (6) :36-39.