愈伤组织分化

愈伤组织分化（通用8篇）

愈伤组织分化 篇1

摘要：研究半夏外植体愈伤组织诱导、放置方式、外植体的苗龄对分化再生植株的影响,结果表明:块茎的愈伤组织诱导效果最佳,叶片次之,叶柄最差。当MS+6-BA2mg/L+2,4-D2mg/L激素组配时,愈伤组织分化率达100%。外植体的放置方式对分化出苗有很大影响,块茎垂直放置出芽率最高,而叶柄和叶片平放于培养基效果较好。无菌苗苗龄对分化率有较大的影响,最适无菌苗苗龄为10～25d。当6-BA为3mg/L时芽增殖倍数达4倍左右,而当6-BA0.2mg/L+2,4-D0.2mg/L组配时,生根效果最好。

关键词：半夏,组织培养,分化再生,愈伤组织

半夏(Pinelliae ternata)为天南星科多年生草本植物,药用历史悠久,其地下块茎干燥炮制后入药,具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结之功效[1]。近年来,研究发现半夏还有抗早孕、抗肿瘤、降血脂、护肝等功能,因而备受国内外关注[2]。半夏既能进行有性繁殖,又能进行无性繁殖。但半夏结实率低,出苗率低,种子在常温条件下贮藏,生活力较易丧失,因此,通常生产上不直接用种子繁殖[3]。在自然界中,半夏主要由生于叶柄下的珠芽繁殖。由于珠芽采集困难,故不能广泛栽培。因此,药源只能收集野生半夏,野生半夏也因大量采挖而近于枯竭,不能满足药用需求[4]。利用组培技术对半夏进行试管繁殖,不仅可提高繁殖系数,还可显著改良半夏品质[3]。因此,有必要利用半夏组织培养快速繁殖提供植物材料以满足市场需求。

1 材料与方法

1.1 试验材料

来源于云南农业科学院生物技术与种质资源研究所。

1.2 试验方法

1.2.1 激素对愈伤组织形成的影响。

以MS培养基为基本培养基:琼脂9g/L+蔗糖30g/L;p H值5.8,添加不同浓度的2,4-D和6-BA,分装于三角瓶,于121℃(1.1kg/cm2压力)灭菌15min备用。取半夏地下块茎、叶柄和叶片,清洗干净后,用手剥去表皮,用3%次氯酸钠溶液浸泡30min待用。在无菌工作台上先用75%乙醇浸泡10s,再用0.1%升汞浸泡10min,无菌水冲洗3~4次,滤纸吸去表面水分。将半夏块茎、叶柄、叶片切成约3mm3左右的小块,接种于不同种类及浓度激素的MS培养基上,置室内散射光下,室温(16~20℃)下培养。

1.2.2 激素对愈伤组织分化苗的诱导影响。

将以上形成的生长良好的愈伤组织转接到含有不同浓度2,4-D和6-BA的培养基(琼脂9g/L+蔗糖30g/L,p H值5.8)上,常温光照培养。

1.2.3 外植体放置方式对不定芽的影响。

外植体的放置方式分水平放置和块茎、叶柄垂直插入培养基。培养基为MS培养基:琼脂9g/L+蔗糖30g/L,p H值5.8。

1.2.4 无菌苗苗龄对外植体分化的影响。

选不同苗龄无菌苗接种于培养基,培养30d,比较出苗率。

1.2.5 继代培养中激素浓度对不定芽的影响。

将诱导得到的芽丛,4~5个切为1团,接种于含不同浓度6-BA的MS培养基上,于温度(20±2)℃、光强30μmol/m2·s的环境中培养,光照时间12h/d左右,培养30d,调查芽丛增殖倍数。

1.2.6 生根培养。

将以上外植体产生的丛生芽切分转至不同激素配比的生根培养基上,p H值5.8~6.2。培养温度为(24±2)℃,在自然散射光下培养。

2 结果与分析

2.1 激素对愈伤组织形成的影响

接种1周后,外植体边缘开始增厚,2周后形成白色疏松愈伤组织。从表1~3可以看出,植物激素的种类及浓度对半夏的脱分化起重要调节作用,在不加任何激素的培养基上,外植体不能形成愈伤组织。培养基中只加某一种激素时,也不能诱导出愈伤组织,只有当2,4-D与6-BA一起使用时,才能诱导出愈伤组织。

从表1可以看出,在对半夏块茎诱导中以6-BA 2mg/L+2,4-D 2mg/L时的诱导效果最佳,诱导率达92%。当6-BA和2,4-D达到3mg/L时,出现外植体的褐化、坏死。从表2~3可以看出,在对半夏的叶柄和叶片诱导中,所需6-BA有所升高,当6-BA 3mg/L+2,4-D 2mg/L时,诱导效果最好,叶片诱导率达70%,叶柄诱导率达52%,但出现少量外植体褐化现象。可见外植体对激素浓度有一定的适应范围,过高和过低都不利于愈伤组织的诱导。

2.2 激素对愈伤组织分化苗的诱导影响

激素对愈伤组织分化苗的诱导试验结果表明(图1),2,4-D与6-BA对苗的分化都有重要的作用,而6-BA的作用更明显,且2,4-D与6-BA的合理配置是半夏分化苗的关键所在。据试验结果观察,在半夏分化苗过程中,激素配比以6-BA 2mg/L+2,4-D 2mg/L组合效果最好,诱导率可达100%。

在激素浓度对不定芽的研究中,诱导愈伤组织和愈伤组织分化所需的2,4-D有所不同,诱导愈伤组织中偏高,在愈伤组织分化中偏低;6-BA没太大变化。

2.3 外植体放置方式对不定芽的影响

从图2可以看出,外植体的放置方式对出芽有很大影响。块茎垂直放置出苗率高,出芽率达82%,水平放置出芽率达40%。叶柄和叶片平放于培养基效果较好,出芽率分别为52%和70%;叶柄垂直插入培养基,出芽低,仅有20%,且出芽速度慢。

2.4 无菌苗苗龄对外植体分化的影响

从图3可以看出,无菌苗苗龄对半夏外植体的出芽率有很大影响。当无菌苗苗龄为10d时,叶片的分化率仅为40%,叶柄分化率达50%,而块茎的分化率最高,可达94%。无菌苗苗龄为10~25d时,叶片分化率达78%,叶柄分化率达57%,而块茎的分化率有所下降,达83%。无菌苗苗龄为45d以上时,叶片和叶柄分化率近于0,块茎的分化率为58%。

2.5 继代培养中激素浓度对不定芽的影响

从图4可以看出,当6-BA为3mg/L时增殖倍数最高6-BA为2mg/L次之。从芽增殖倍数看,芽增殖所需6-BA浓度较芽分化所需6-BA浓度没太大变化,当不加6-BA时,仅有芽伸长,没有芽增殖,有根长出;当6-BA为3mg/L时增殖倍数达4倍左右,长势良好,植株高于其他处理;当6-BA为4mg/L时,增殖芽数明显下降,植株较矮。

2.6 激素对不定芽生根的影响

从表4可以看出,当培养基中不加6-BA和2,4-D,或浓度为1.0~2.0mg/L时,不利于生根;当6-BA 0.2mg/L+2,4-D0.2mg/L时,生根效果最好;当6-BA 0.1mg/L+2,4-D 0.3mg/L时,生根效果次之;当6-BA 0.3mg/L+2,4-D 0.1mg/L时,有根长出。

注:-表示差,+表示一般,++表示较好,+++表示好,++++表示很好。

3 讨论

任何植物细胞或组织培养体系的建立,都必须采用适宜的外植体。同一种植物不同的组织和器官其再生能力有很大差异。半夏不同外植体的出芽率也有差异,块茎的分化出苗率较高,叶片其次,叶柄最低。

在影响半夏出芽的外界因素中,外植体的年龄对植株再生有重要影响[5],无菌苗苗龄低,接种过程中容易造成机械损伤,使伤口褐化,导致外植体死亡,出芽率下降,苗龄过高,易形成倒苗,叶片和叶柄老化甚至枯萎,不能用做外植体,生长旺盛期和珠芽成熟期的半夏材料,其外植体的分化率都较高;倒苗期,外植体材料减少,不利于快繁和研究。

半夏外植体在培养基中的放置方式对外植体分化有很大影响,块茎垂直放置出苗率高;叶柄和叶片平放于培养基中效果较好;叶柄垂直插入培养基出芽低,仅有20%,且出芽速度慢。

块茎的分化率与采集时间关系不大。继代过程中,所需6-BA浓度较分化时的浓度变化不大,但值得注意的是芽丛分割的大小对植株成活有较大影响,材料分割应在4个以上,芽的个数少,芽基的萌发相应较少,甚至造成原块茎腐烂[6]。

培养条件是半夏离体培养的重要环节,最佳培养温度为18~20℃,温度过低,诱导时间延长,诱导率下降;温度过高时,切块容易变黑,若形成愈伤组织其颜色呈淡黄色,容易老化,分化成苗率低。在分化出苗期,光的作用比较明显,光照时间应较长[7]。

为了改变野生半夏资源供不应求,人工栽培半夏因繁殖力低及品种退化等原因造成短缺的现状,应用现代生物学手段对其进行组织培养,既可以建立半夏无性系快速繁殖系统,提高其繁殖系数;又可以筛选出具有优良性状的半夏品种。

参考文献

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愈伤组织分化 篇2

紧密型：愈伤组织内无大的细胞空隙，细胞间被果胶质紧密结合，不易形成良好的悬浮系统。

松脆型：愈伤组织内有大量大的细胞空隙，细胞罗列无次序，容易分散成单细胞或少数几个细胞组成的小细胞团，是进行悬浮培养的最合适的材料。

两类愈伤组织通过激素调剂可互相转变。其方法是：加入高浓度的生长物质，可使坚实的愈伤组织变为松脆。反之，减少或除去生长物质，则松脆愈伤组织可以转变为坚实。

愈伤组织用途

藜麦愈伤组织诱导体系优化研究 篇3

关键词：藜麦；组织培养；愈伤组织诱导；增殖率

中图分类号： Q943.1 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）03-0026-04

藜麦（Chenopodium quinoa Willd.）别称南美藜、藜谷、奎奴亚藜等，是1年生藜科草本作物，在安第斯山脉已有5 000多年的种植历史，被印加人称为“谷物之母” “安第斯山的真金”[1-2]。藜麦中蛋白质含量为13%～23%，含有人体必需的9种氨基酸且比例平衡，富含不饱和脂肪酸、类黄酮、維生素E等多种有益化合物，是联合国粮农组织（FAO）推荐的唯一的单体植物就可以满足人体全部基本物质需求的完美全营养食品，被誉为“未来的超级谷物”“营养黄金”“有机谷类之王”[3-4]。藜麦喜热带、亚热带干湿气候，生长适温14.0～18.0 ℃，营养生长阶段可耐轻度霜冻（-1.0～0 ℃），种子结实之后可耐-6.0 ℃低温，对盐碱、干旱、霜冻、病虫害等抗性能力都很强[5]。 1987年西藏自治区农牧学院、西藏自治区农牧科学院开始藜麦引种试验[6]。目前藜麦在陕西省西安市、山西省、青海省、四川省等地区均有规模化种植。目前，关于藜麦的研究主要集中在生物学特性[6-7]、化学成分[8-9]、抗逆性等生理学特性[10-11]方面。有关藜麦组织培养研究尚未见报道。本研究对9个藜麦品种进行适宜外植体筛选，研究不同激素处理组合对藜麦茎段愈伤组织诱导、增殖的影响，旨在为藜麦再生体系构建，以及通过转基因、体细胞杂交等手段获得藜麦新品种奠定生物学基础。

1 材料与方法

1.1 材料

选取大田种植的9个藜麦品种进行试验，包括TEMUCO QUINOA TRADI TIONAL、CQ-TEMVCC（夭玛）、Chenopodium quinoa ‘Red’、PI596498、Tomico Quinoa、cherry vaniua quinoa、DAVE（FOUR-O-SEVEN） Quinoa、浙藜-49、浙藜-51（表1）。所有品种种子均由浙江农林大学提供。

1.2 藜麦无菌苗的培育

挑选饱满种子在38 ℃恒温水浴锅中加热3 h，冷却至室温，用75%乙醇消毒1 min，用0.2% HgCl2溶液消毒5 min，再用无菌水冲洗4～5次。无菌条件下，将消毒过的种子接种到不含激素的MS培养基中，24 ℃暗培养3～4 d，16 h/8 h 光照周期下培养3 d，获得无菌苗备用。

1.3 外植体的处理

将无菌苗的茎段剪成长1.0 cm的小段，子叶切成0.5 cm×0.5 cm大小，分别放入培养基MS+0.5 mg/L 2，4-D中进行愈伤组织诱导，重复3次。在24 ℃、16 h/8 h光照周期下培养28 d，统计每个品种不同外植体愈伤组织的诱导率及生长情况。诱导率计算公式如下：诱导率=形成愈伤组织的外植体数/接种外植体数×100%。

1.4 愈伤组织诱导优化试验

选择TEMUCO QUINOA TRADI TIONAL、浙藜-51、浙藜-49 等3个品种无菌苗茎段，在无菌条件下切成长约 1.0 cm 的片段，接种到MS基本培养基+不同激素处理的培养基上（表2），每个品种接种3个培养基作为重复。

1.5 愈伤组织增殖优化试验

将TEMUCO QUINOA TRADI TIONAL、浙藜-51、浙藜-49这3个品种培养12 d的初代愈伤组织切成0.3 g的小块（m1），接种到表3中的培养基中进行继代培养。每处理接种3瓶，每瓶接种4块愈伤组织，每处理总计12块。20 d后，取出愈伤组织称量鲜质量（m2），以愈伤组织增殖率为指标进行最佳培养基筛选（表3）。

1.6 数据分析

运用Excel、SPSS软件分析数据。

2 结果与分析

2.1 愈伤组织外植体的选择

将消毒的茎段、子叶接种到培养基上，2 d后外植体切口处变褐，4～5 d后外植体开始膨胀，7 d左右开始有肉眼可见的乳白色、黏稠状的愈伤组织出现，外植体开裂伸长，28 d时未诱导出愈伤组织的外植体不再产生愈伤组织。不同品种之间愈伤组织的诱导率存在差异，相同品种不同外植体的愈伤组织诱导率也不同。由图1可以看出，9个藜麦品种的茎段愈伤诱导率均在78%以上，平均诱导率为90%；子叶愈伤组织诱导率仅在58%以上，平均诱导率为80%。cherry vaniua quinoa、Tomico Quinoa、浙藜-51、chenopodium quinoa ‘Red’茎段的愈伤组织出愈率明显高于子叶。TEMUCO QUINOA TRADI TIONAL、CQ-TEMVCC（夭玛）、chenopodium quinoa ‘Red’茎段愈伤组织诱导率达100%。由此可见，藜麦愈伤组织诱导敏感性存在品种差异。虽然用茎段、子叶均能诱导出愈伤组织，但茎段更适合用作诱导愈伤组织的外植体。

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2.2 愈伤组织诱导优化分析

在藜麦愈伤组织诱导过程中，激素种类、浓度对愈伤组织诱导起重要作用。由表4可以看出，不同组合处理下同一品种愈伤组织诱导率有很大不同，如TEMUCO QUINOA TRADI TIONAL在处理Ⅱ、Ⅵ中愈伤组织诱导率达100%，而在处理Ⅳ、Ⅷ中低于20%。TEMUCO QUINOA TRADI TIONAL在各种处理下的愈伤组织诱导率均明显高于浙藜-49、浙藜-51。随着2，4-D浓度的升高，3个试验品种的诱导率在一定范围内均呈下降趋势。2.0 mg/L 2，4-D处理下浙藜-49、浙藜-51诱导率下降至0。在2，4-D激素基础上施加不同浓度的KT、NAA，结果发现，不同处理下不同藜麦品种的愈伤组织诱导率变化趋势同2，4-D单激素处理类似。3个品种在处理Ⅱ、Ⅵ的愈伤组织诱导率均值为89%～90%，但在前者处理下，3个品种得到的愈伤组织状态均为湿润、乳白色、疏松的，后者处理下3个不同品种均产生干燥、墨绿色、紧密的愈伤组织（图2）。因此在愈伤组织诱导优化试验中，综合诱导率与出愈状态，处理Ⅱ为最理想的培养基。

2.3 愈伤组织生长增殖优化结果分析

将愈伤组织接种到不同激素处理的培养基中培养20 d，称量接种前后的愈伤组织质量，可以获得不同激素处理对愈伤组织增殖的影响。从表5可以看出，不同品种愈伤组织增殖率存在很大差异，增殖率为52%～268%，愈伤组织的增殖率不仅与培养基激素组分有关，也与品种特性有关。TEMUCO QUINOA TRADI TIONAL的愈伤组织生长较快，不同处理下增殖率较高，均值达158%。浙藜-51的愈伤组织生长相对较慢，不同处理下增殖率均值仅为76%。浙藜-51愈伤组织诱导能力优于浙藜49，增殖能力劣于后者。3个藜麦品种在单激素处理Ⅰ（MS+0.5 mg/L 2，4-D）下平均增殖率为71%，在双激素处理Ⅱ（MS+0.5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L NAA）以及Ⅲ（MS+0.5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L KT）下平均增殖率均提高；3个藜麦品种在处理Ⅳ、Ⅴ下愈伤组织的增殖效果最明显，均值分别达161%、134%。TEMUCO QUINOA TRADI TIONAL在处理Ⅳ下愈伤组织增殖率达268.3%，但在处理Ⅴ下增殖率下降到180.8%，可以看出激素浓度的增加对其增殖具有一定抑制作用。因此，相比而言，处理Ⅳ（0.5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L KT+0.5 mg/L NAA）较为适宜。

3 结论与讨论

开展组织培养研究对于藜麦优良种质资源保存、新品种选育以及遗传学特征研究等具有十分重要的意义[12]。本试验中9个藜麦品种均能诱导出愈伤组织，但不同品种对组培条件的敏感性存在一定差异。因此在构建藜麦愈伤组织培养体系时，既要考虑共性问题，又要顾及到各自的基因型特点[13]。藜麦的子叶、茎段均能诱导出愈伤组织，相比而言，后者的诱导效果优于前者，这与安桂花等对高山红景天[14]、芦婕等对盾叶薯蓣[15]、莫英等对盾叶薯蓣[16]、张勃等对紫花苜蓿[17]、肖荷霞等对紫花苜蓿[18]的研究结果一致。植物激素是调控植物器官产生愈伤组织及其分化最主要的影响因素[19-20]。2，4-D是组织培养中常用的植物生长调节剂，主要起诱导愈伤组织形成、促进生根等作用，在植物组织培养中广泛使用[21]。本研究表明，3个藜麦品种在0.5 mg/L 2，4-D处理下，愈伤组织诱导率最高，随着2，4-D浓度的增加，愈伤组织诱导率呈下降趋势。邢小明等研究发现，2，4-D浓度在0.10～1.00 mg/L时，波叶红果树叶片愈伤组织诱导率随着激素浓度升高而升高，2，4-D浓度过高对愈伤组织诱导产生明显的抑制作用[22]。代亮等研究發现，3 mg/L 2，4-D处理下，12个草地早熟禾品种愈伤组织诱导率均值达86%[23]。许明子等在NB培养基上添加2 mg/L 2，4-D，发现水稻愈伤组织诱导率达80%以上[24]。由此可以看出，不同浓度2，4-D对愈伤组织诱导率影响很大。朱祝英等研究发现，MS+2，4-D培养基处理下，香蕉叶片诱导率高达100%，加入其他生长素或细胞分裂素如NAA、KT、6-BA等香蕉叶片诱导率均有所降低[25]。本研究结果表明，处理Ⅵ（MS+05 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L KT+0.5mg/LNAA）和处理Ⅱ（MS+0.5 mg/L 2，4-D）对藜麦愈伤组织的诱导率相近，但是愈伤形态差别较大，后者诱导形成疏松、有光泽、黄白色愈伤组织，因此MS+0.5 mg/L 2，4-D培养基是最佳的愈伤组织诱导培养基。这与前人研究结果[26-27]不一致，可能是由于不同植物愈伤组织形成所需要的激素种类不同。组培体系中，愈伤组织增殖速度关系到组培体系效率，在转基因研究中尤其如此[23]。孙瑞明等研究发现，在增殖阶段，香竹愈伤组织对 2，4-D的依赖程度没有诱导阶段强，但仍须维持一定浓度，低浓度KT、NAA对香竹愈伤的增殖有良好的效果[28]。高丽丽等研究表明，籼稻愈伤组织的增殖不仅与愈伤组织的生长状态以及培养基组分有关，还与品种特性有关[29]。本研究结果表明，处理Ⅳ（MS+0.5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L KT+0.5 mg/L NAA）下，3个藜麦品种愈伤组织增殖率达90.8%～268.3%，TEMUCO QUINOA TRADI TIONAL的愈伤组织增殖率明显高于浙藜51、浙藜49。

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[26]周金梅，宫敬利，陈 磊，等. 合作918番茄愈伤组织诱导技术研究[J]. 吉林农业科学，2013，38（2）：78-80.

[27]张朝军，范术丽，武芝霞，等. 棉花大田植株叶柄组织培养体系的建立[J]. 西北植物学报，2011，31（6）：1257-1263.

[28]孙瑞明，王 娟，陈 芳，等. 香竹愈伤组织诱导研究[J]. 福建林学院学报，2013，33（1）：48-51.

[29]高丽丽，陈远玲，简玉瑜. 提高籼稻愈伤组织诱导率和增殖率的研究[J]. 广东农业科学，2005（4）：28-30.

愈伤组织分化 篇4

1材料与方法

1.1材料

1.1.1

乌龙茶品种黄观音茶树自然杂交未成熟种子。

1.1.2培养基:

以N6或MS为基本培养基外加各种植物生长调节剂。

1.2方法

1.2.1诱导愈伤组织

在超净工作台上,用75%酒精清洗未成熟茶果2min,0.2%Hgcl2浸泡15min,用无菌解剖刀去除未成熟茶果外壳和种壳,无菌的镊子取出幼小的种子,种子大小:直径1-4mm,接种在诱导培养基上,黑暗条件下生长,25oC。

1.2.2愈伤组织继代

诱导所得少量愈伤组织继代培养,放置于光照培养室,26oC,每天光照14h,并观察愈伤组织继代生长情况。

1.2.3愈伤组织分化

继代培养后得到大量愈伤组织,把部分愈伤组织转到不同分化培养基上分化生长,放置于光照培养室,26oC,每天光照14h,并观察愈伤组织分化状况。

2结果与分析

2.1诱导愈伤组织

未成熟幼胚接种在诱导培养基上生长,幼胚慢慢长大,同时从子叶上长出愈伤组织,见(表1和图1a,b)。愈伤组织多生长在子叶边缘或离培养基较近的部位。由于从子叶上直接诱导的愈伤组织比较少,需要把愈伤组织扩大培养才可以获得足够愈伤组织。

2.2愈伤组织继代

愈伤组织继代时最好挑选颜色鲜黄颗粒较硬的愈伤组织,在继代培养基上摆放愈伤组织时间隔要大,有足够的空间让它生长。继代生长情况见(表2)。

注:激素单位(mg/L)

从表3中可以看出大部分分化培养基能使愈伤组织转绿,并有大量的绿色小凸起,见(图1c),还有部分分化培养基能使愈伤组织分化出根,见(图1d,e)。

从表2可以看出愈伤组织在继代培养基上生长状况良好,可得到足够多的愈伤组织。若需要更多愈伤组织,只需把大愈伤组织切成小块扩大培养,多次继代培养就可获得足够多愈伤组织。两次继代间隔时间约40d左右。

2.3愈伤组织分化

获得大量组培苗的最好办法就是直接从愈伤组织分化出苗子,这也是茶树再生体系构建的关键一步,同时也是影响茶树转基因能否成功的关键一步。本实验配置了17种分化培养基进行摸索,分化情况如(表3)。每种分化培养基分装8个三角瓶(100ml的三角瓶里装约50ml分化培养基),每瓶放6-7颗愈伤。

注:a和b未成熟幼胚诱导出的愈伤组织;c愈伤组织分化后转绿变大,表面有大量的绿色小突起;d和e愈伤组织分化出根。

3讨论

本实验对未成熟幼胚愈伤组织诱导和愈伤组织继代都很成功,见(图1a,b),并获得了大量愈伤组织,愈伤组织是茶树再生体系的基础,也是茶树转基因的基础。通过愈伤组织在1 7种不同配方的分化培养基上分化生长,大部分愈伤组织出现大量的绿色小凸起(图1c),还有部分能分化出根,见(图1d,e),遗憾的是不能分化出芽,最后没有获得完整的植株。但通过愈伤组织分化可以看出,不同的激素组合是分化能否成功的关键因素,有些组合可以分化出根,有些组合就不能分化出根,而有些组合分化的根多,生长也快。

枇杷花药培养愈伤组织诱导研究 篇5

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为宜宾职业技术学院农业科技园大五星、早钟6 号及龙泉1 号枇杷栽培品种的花药。从幼树及壮年枇杷植株上取不同直径为0.3~0.8 mm枇杷花蕾,在自来水中冲洗20 min,采用低温、热激、高渗透压与高速离心的方法,对花蕾进行预处理。

1.2 去绒灭菌

用手术刀片将经过预处理的枇杷花蕾表面绒毛刮去,用70%酒精浸泡30 s,后用0.5% Hg Cl2水溶液表面消毒8min,再用无菌水冲洗4~5 次,在无菌条件下拨开花蕾取出花药,同时彻底去除花丝。

1.3 预处理

低温4 ℃分别处理24、48、96、144 h,培养基中附加2.0mg/L 6-BA和0.5 mg/L 2,4-D,添加7%蔗糖和0.6%琼脂。

1.4 培养基

采用MS大量元素、微量元素和有机物。培养基附加2.0mg/L 6-BA和0.5 mg/L 2,4-D,并附加不同浓度的蔗糖(0、3%、5%、7%、9%)、 葡萄糖(0、3%、7%、9%),0.6%琼脂。 不同植物激素水平和浓度(2,4-D:0.01、0.02、0.05、0.10、0.30、0.50mg/L)进行完全组合,添加7%蔗糖和0.6%琼脂。

1.5 试验过程

每个三角瓶接种20 枚枇杷花药,用无菌封口膜密封,在25 ℃下黑暗条件下培养。培养1 周后,将未污染的花药转入新鲜遇上组织诱导培养基上,每个三角瓶转入20 枚枇杷花药。培养4 周以后统计培养效果。

2 结果与分析

2.1 灭菌方式对愈伤组织形成的影响

将花药剥出以后,对花药进行灭菌处理受到的伤害较为严重,在接种后会快速褐变。对整个花蕾进行灭菌,使花药受到的灭菌剂的伤害降低。采用流水下冲洗花蕾1~2 h处理花蕾,然后用75%酒精处理30 s,0.1%升汞灭菌25~30min , 无菌水冲洗5 ~6 次后, 剥出花药, 接种污染率高达90%。将枇杷花蕾表面绒毛刮去,然后再进行处理,会使污染率明显下降5%左右。

2.2 预处理对花药愈伤组织诱导的影响

没有经过预处理的枇杷花药在培养,对培养的反应差,诱导启动率诱导率低,基本产生不了愈伤组织。经过预处理后,诱导率明显提高。其中低温预处理对花药愈伤组织诱导效果最显著,对大五星枇杷诱导率达53%,龙泉1 号达56.33%,早钟6 号74%。低温预处理从24 h增加到48 h,能显著提高诱导率,但再延长,愈伤组织诱导率则会逐步下降。

2.3糖源种类和浓度对花药愈伤组织诱导的影响

蔗糖浓度从0 增加到5%时,愈伤组织的诱导率也随之增加,其中早钟6 号枇杷的花药愈伤组织诱导率最高。蔗糖浓度从7%到9%时,愈伤组织诱导率出现下降趋势。

2.4激素种类、浓度和组合对花药愈伤组织诱导的影响

在MS培养基上,或者在MS培养基中添加IBA、NAA、IAA、6-BA的不同浓度和组合,均不能诱导出愈伤组织。但添加了2,4-D后,能诱导枇杷花药分化形成愈伤组织。并且2,4-D浓度从0.01 mg/L增加到0.50 mg/L时,诱导率也从2.33%增加到69.33%。但在0.5~1.0 之间,处于不变状态。

3 结论与讨论

植物花药愈伤组织形成受多种因素的制约。该试验中,枇杷花蕾表面的绒毛给消毒造成了较大的困难,刮去绒毛后消毒灭菌能有效防止污染的发生。同时,预处理对花药愈伤组织诱导起决定作用,没有经过预处理的枇杷花药几乎不能诱导脱分化及再分化。花蕾经过预处理后,诱导率显著提高,在所有预处理方法中,低温预处理效果最为显著[3,4]。

糖类种类和浓度对花药愈伤组织的诱导率、愈伤组织发生时间、质地、组织学起源有显著影响。激素种类和糖类浓度均显著地影响到了愈伤组织的诱导率,2,4-D在枇杷花药培养中起着关键作用。但是,预处理对促进花药愈伤组织诱导的机制,以及愈伤组织再分化条件,需要进一步完善。

参考文献

[1]张恢志.中国果树志:枇杷[M].武汉:华中农业大学出版社,1990.

[2]张日清,闻丽,刘友垒,等.低温预处理对油茶花药愈伤组织诱导的影响[J].中南林学院学报,2005,25(6):24-28.

[3]陈红,王永清.枇杷花药培养诱导愈伤组织的研究[J].安徽农业科学.2007,35(27):8453-8454.

南丰蜜桔胚性愈伤组织的诱导 篇6

关键词：南丰蜜桔,胚性愈伤组织,花药离体培养,再生

南丰蜜桔是我国的地方良种, 素享“桔中贡品”之美誉 (胡正月等, 2005) 。它以肉质脆嫩化渣、风味浓甜、少核或无核而深受消费者喜爱。进入20世纪90年代后, 由于感染柑桔碎叶病毒等原因, 单产下降, 果实品质变劣, 发生了种性退化, 市场竞争力下降 (吴德喜等, 1990) 。因此, 应用生物技术手段培育无病毒苗木或改良品种就成为目前南丰蜜桔生产中亟待解决的问题。因此开展以离体培养为基础的生物技术育种研究显得尤为重要, 花培技术就是其重要途径。再者, 愈伤组织保存是柑桔种质资源保存的一条值得探索的途径, 具有节省人力、物力、财力以及避免自然灾害和病虫害等优点 (张俊娥和邓秀新, 2007) 。目前, 国外仅有意大利报道柑桔类花药组织培养再生出不定芽, 但其再生率很低 (Germana et al., 1998) ;国内尚未出现研究成功的报道, 笔者以花药为外植体, 建立南丰蜜桔的胚性细胞系, 为今后进行与其有关的原生质体融合, 转基因研究, 纯系二倍体和无核品种以及种质资源离体保存奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

以南丰蜜桔“杨小—26”为应试品种, 材料取自花蕾发育的各个时期, 并保持花粉无污染。

1.2 方法

1.2.1 材料预处理:

先低温预处理, 将花蕾放于

4℃冰箱72h后, 再振荡培养 (60转/min) , 消毒, 将花蕾接种于液体培养基, 振荡暗培养9d。

1.2.2 消毒:

整个花蕾于25%NaCl溶液中消毒20min, 无菌水冲洗3遍。

1.2.3

将预处理的试验材料剥离花药, 接种固体培养基中, 暗培养28d后, 进行光培养, 每20d继代1次。

1.2.4 培养基:

(1) MT+TDZ 30mg/L+A1.0 3.0mg/L+NAA 1.0mg/L+10mg/L AgNO3; (2) MT+TDZ3.0mg/L+A1.0 3.0mg/L+NAA 1.0mg/L; (3) SH+TDZ 30mg/L+A1.0 3.0mg/L+NAA 1.0mg/L+10mg/L AgNO3; (4) SH+TDZ 3.0mg/L+A1.0 3.0mg/L+NAA 1.0mg/L; (5) LP+TDZ 30mg/L+A1.0 3.0mg/L+NAA 1.0mg/L+10mg/L AgNO3; (6) LP+TDZ 3.0mg/L+A1.0 3.0mg/L+NAA 1.0mg/L。

愈伤组织培养基加蔗糖30g/L, 琼脂6g/L, 继代培养基加蔗糖50g/L。KT、AgNO3和A过滤灭菌。

1.3 培养条件

本文无特殊说明, 培养温度均为26℃, 光照3000Lx, 光周期为16h/d。

2 试验结果与分析

2.1 花药培养

2.1.1 愈伤组织形成。

预处理后的花药离体培养1周左右, 颜色开始由黄色变淡黄至黄褐色, 同时在花药中心线一侧出现淡褐色小点。2周左右某些花药颜色发亮, 经过l～2天, 发亮的花药从缢痕处生出小白点, 逐渐扩大体积, 颜色由白变淡黄或黄绿色 (图1) , 这就是愈伤组织绝大多数在20天左右形成愈伤组织, 从其外形看有紧实和疏松2种, 前者为黄绿色, 后者为黄白色。紧实型中又分表面光滑和不光滑两种。前者颜色较深, 在培养过程中慢慢老化死亡或不分化。后者生长旺盛分裂能力强, 分化能力强。而未经过预处理的花药无愈伤组织形成。

2.1.2

胚性愈伤组织形成, 愈伤组织鲜重达到30g时 (图2) , 继代培养60d, 有胚状体产生 (图3) , 再继代60d生出胚性愈伤组织 (图4) .

2.1.3 花粉发育时期与胚性愈伤组织形成。

只有单核靠边期的花药适于生长出愈伤组织和胚性愈伤组织。

2.1.4 培养基对胚性愈伤组织的影响。

由表1可以看出, 花药在6种培养基均可生出愈伤组织, 平均愈伤组织发生率均在80%以上, 培养基对愈伤组织再生无显著差异。培养基配方对胚性愈伤组织的生长有重要的作用, 1和2培养基上无胚性愈伤组织生长, 3、4、5和6培养基上有利于胚性愈伤组织生长, 5和6培养基较适于生长, 并且5和6培养基的胚性愈伤组织发生率显著高于3和4。培养基配方有否AgNO3对胚性愈伤组织生长无显著差异。

3 讨论

本研究发现, 取花药时的小孢子发育时期很关键, 这关系到是否能产生胚性愈伤组织。南丰蜜桔花药培养的最佳时期是单核靠边期, 而在大多数瓜类花药培养中, 选用的都是花粉单核靠边期 (董艳荣, 2002) (陈振光, 1995) 。

预处理包括离心、低温、高温和热激, 目的是从形态上改变极性分布, 从生理生化上改变细胞生理状态, 而改变其分裂方式和发育途径。本试验采用预处理是低温和震荡培养, “杨小26”的胚性愈伤组织发生率最高达20.3%, 验证了陈英等 (1997) 的研究结果。

本试验结果表明, MT培养基不适合花药组织培养, 这与柑桔类胚性愈伤组织研究结果不符 (张俊娥等, 2003) , 尚需试验进一步验证。LP和SH培养基适合做花药组织培养, 这为高硝态氮培养基较适合于木本果树离体再生研究提供一个佐证 (Khachatourian et al, .2002) 。笔者发现培养基配方中AgNO3对胚性愈伤组织生长无显著影响, 而谭祖国 (1998) 、李韬等 (1997) 分别将Ag NO3应用于红江橙、朋娜、纽贺尔、芦柑、雪柑的胚珠培养中, 克服了难获得胚性愈伤组织的难题, 获得了相应的胚性细胞系, 这或许因为离体器官不同所致。

参考文献

陈英丁海付贵荣黄永芬汪清胤转基因番茄的花粉组织培养哈尔滨师范大学自然科学学报199713 (2) .

陈振光.园艺植物离体培养学.中国农业出版社, 1995.23-25

董艳荣.甜瓜花药再生体系的基础研究.南京农业大学 (硕士论文) , 2002

胡正月罗省根胡冬英实施"金牌"战略提高南丰蜜橘含金量现代园艺2007.1

李韬, 芦柑、雪柑胚性愈伤组织的诱导[J].福建果树, 1997, (101) :11-12.

舒广平吴德喜.柑橘碎叶病毒生物鉴定研究.中国柑橘, 199019 (I) :47-49

谭祖国.红江橙原生质体分离培养以及植株再生的研究[D].江西农业科技, 1998, (4) :28-31.

谭祖国, 万蜀渊.朋娜和纽贺尔脐橙胚珠离体培养获得无病毒珠心苗方法研究[D].湖北农业科学, 1998, (4) :43-45.

辐射徐长卿愈伤组织的研究 篇7

关键词：徐长卿,愈伤组织,60 Co-γ射线,变异

徐长卿(Cynanchum paniculatum)为萝藦科多年生草本植物[1],在我国多地有分布[2-3]。因为徐长卿全草含牡丹酚等多种药用成分,使其全草均可入药,具有镇疼止咳、祛风解毒等功效;能治跌打损伤、毒蛇咬伤、风湿疼和湿疹等多种疾病[4-5]。鉴于徐长卿是一味极为常见的中药,需求量甚大,长期大量的采收出售和药用使徐长卿在大连地区几近濒危。为了保护野生资源,张松岩等对徐长卿进行了组织培养及再生体系建立的研究[6],并获得了能保持徐长卿所有植物学性状,收获的药用全草单株均重比野生植株增加16%的定植试管苗。为探讨60Co-γ射线辐射处理对徐长卿愈伤组织的影响,以获得有利变异植株,在张松岩等研究[6]的基础上,对徐长卿的愈伤组织进行了60Co-γ射线辐射研究。

1材料与方法

1.1材料

试验以徐长卿愈伤组织为材料。

1.2方法

1.2.1培养条件经过60Co-γ射线辐射处理后的愈伤组织,除了培养恒温24℃、光照度2 800lx、固体培养基胨力强250g·cm-2的条件外[7],其它培养条件均参见徐长卿研究[6]。

1.2.2愈伤组织辐射处理将在MS+6-BA0.3mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1+ 2,4-D 0.4mg·L-1培养基上由子叶培养的绿色颗粒状愈伤组织从培养瓶取出后,将其分散成较均匀的块状,之后接种到下部相同成分培养基的培养皿中, 进行愈伤组织的继续生长培养,培养至18d愈伤组织开始旺盛生长时,再分别用0(CK)、4、8、12、 16、20、24、28和32Gy(剂量率为1Gy·min-1)8种剂量的60Co-γ射线进行辐射处理,之后转移到光照培养箱继续进行正常培养。培养到25d时,对其致死率和成活愈伤组织的长势进行详细观察统计,每种辐射剂量处理愈伤组织为100块,试验重复3次。

1.2.3不同剂量γ射线辐射处理对愈伤组织分化不定芽的影响将在MS+6-BA 0.3mg·L-1+ NAA 0.2mg·L-1+2,4-D 0.4mg·L-1培养基上由子叶培养的绿色颗粒状愈伤组织从培养瓶取出后,用镊子分散成均匀块状,然后接种到下部为MS+6-BA 0.8mg·L-1+NAA 0.1mg·L-1的愈伤组织分化培养基中,培养8d后愈伤组织块外观上处于旺盛状态时,再分别用0、4、8、12、16、和20Gy 6种剂量的60Co-γ射线进行处理,进行不同剂量的60Co-γ射线处理对愈伤组织分化及变异的影响试验。在试验培养过程中对愈伤组织的变化进行观察。辐射处理后培养到第58天时对愈伤组织块的分化率、变异率和分化不定芽的长势进行详细观察统计。每种剂量每次处理150个愈伤组织块,试验重复3次。变异率为已分化的不定芽占愈伤组织块总数的百分率。

1.2.4变异不定芽的生根培养以用0Gy辐射处理的不定芽作为对照组,每次试验每种辐射剂量分别生根培养60个不定芽。3次试验,每种处理共用180个不定芽进行生根试验。把用8、12、 16Gy 3种辐射剂量处理分化的所有变异的不定芽均从基部切下,进行不同剂量60Co-γ射线辐射处理对分化的变异不定芽生根培养的影响试验。 以1/2MS+NAA 2.0mg·L-1+蔗糖15g·L-1为生根培养基。3次试验共用于试验的变异不定芽数量分别是:8Gy 12个、12Gy 45个、16Gy 56个。培养到30d时对试验结果进行全面统计观察。

1.2.5变异试管苗的移栽和定植把培养的50株对照试管苗经过剂量分别为8、12、16Gy60Co- γ射线辐射处理后,分化培养的变异不定芽生根培养的所有变异试管苗生根培养到25d时,放到温室的光照下炼苗2d后,将试管苗移栽到上半层是干净河沙、下半层为肥沃园土的温室营养钵中,进行不同剂量60Co-γ射线辐射处理对变异试管苗移栽的影响试验。移栽后前13d保持没有直射光、温度19℃以上、湿度80%~90%的环境条件。移栽试验进行3次。

2结果与分析

2.1不同剂量６０Co-γ射线辐射处理对愈伤组织致死率的影响

培养到25d时观察统计,由表1可知,用不同剂量60Co-γ射线对愈伤组织进行辐射处理,产生明显不同的结果。在所试验的8种剂量内,24、 28、32Gy 3种辐射剂量的愈伤组织死亡率为100%;而在8、12、16、和20Gy 4种辐射处理的范围内,愈伤组织死亡率随着辐射剂量的增加而升高。观察统计还表明,经过剂量为4Gy处理的愈伤组织不仅死亡率比对照组低,而且处理后培养到25d时其长势非常旺盛。培养的前期观察表明,辐射处理后培养的前6d,所有处理的愈伤组织外观上基本没有明显变化,而后迅速变褐,培养到15d时,已经变褐的愈伤组织几乎都变成黑色死亡愈伤组织,重复试验观察统计的结果几乎一致。以上结果说明,对徐长卿子叶愈伤组织进行60Co-γ射线进行处理,致死临界剂量为24Gy; 用4Gy的剂量进行处理,能提高成活率,并促进愈伤组织的生长。

注:+++为非常旺盛;++为长势旺盛;+为长势一般;-为死亡。下同。 Note:+++ means very strong;++ means growing strong;+ means growing generally;- means death.The same below.

2.2不同剂量６０Co-γ射线辐射处理对愈伤组织分化不定芽的影响

对辐射处理后的培养结果进行观察统计,3次试验的平均结果见表2,在经过剂量为4、8、12、 16Gy 4种剂量射线处理的愈伤组织的分化率随着处理剂量的增加而降低;而其变异率随着处理剂量的增加而升高。分化出变异类型包括叶片增多、叶片减少并变小、白化、叶色深绿或具紫斑等。 观察还发现,经过剂量为4Gy辐射处理的愈伤组织不仅分化率较高、分化的不定芽长势也非常旺盛,并且未见出现变异性状的不定芽。以上结果说明,用4Gy60Co-γ射线对愈伤组织进行处理, 能提高愈伤组织的分化率,而经过8、12、16Gy 3种剂量辐射处理的愈伤组织,不仅能使分化的不定芽发生变异,而且变异率随着辐射剂量增加而提高。

2.3不同剂量６０Co-γ射线辐射处理对分化的变异不定芽生根培养的影响

由表3可知,在经过8、12、16Gy 3种不同剂量处理并分化的变异不定芽培养的试管苗,其生根率与平均生根数随着辐射剂量增加而降低,并且试管苗的长势都较弱,观察统计还表明,3次重复试验的结果基本一致。结果表明,用8、12、 16Gy 3种剂量的60Co-γ射线对徐长卿的愈伤组织进行辐射处理后,对变异的不定芽生根培养会产生一定的抑制作用。

2.4变异试管苗的移栽和定植

移栽后29d统计观察,经过8、12、16Gy 3种不同剂量γ射线处理的愈伤组织并分化培养的变异试管苗,移栽的成活率随着辐射剂量的增加而降低,其变异试管苗长势也随着辐射剂量的增加而变弱。

移栽后40d进行观察统计(见表4),试验平均结果表明,移栽的150株对照试管苗成活率为96.7%;经过8Gy处理定植7株变异试管苗,成活了5株,成活率为71.4%;经过12Gy处理移栽13株变异试管苗,成活了6株,成活率为45.2%;经过16Gy处理移栽9株变异试管苗,成活了2株,成活率20.2%;经过8、12Gy两种剂量辐射处理移栽成活的试管苗中有5株变异试管苗,为5种变异类型,其中经过8Gy剂量辐射处理的变异试管苗出现了1株生长非常旺盛的变异类型,为有利变异植株。

当这株有利变异试管苗生长到第2年时,以嫩茎为材料,按照张嵩岩的培养方法[6]培养试管苗,并移栽、定植,成活125株试管苗。对其进行观察,结果表明,这种具有有利变异的试管苗不仅保持了野生徐长卿的植物学特征,而且还保持了生长非常旺盛的有利变异性状。10月中旬随机采收了10株这种试管苗的全株和10株野生徐长卿的全株,晒干后10株具有有利变异试管苗的干重比野生植株增重43%,观察的结果也与重量分析结果相同。结果表明,经过8Gy辐射剂量处理获得的有利变异试管苗,其有利变异性状能保持不变,具有遗传性,说明剂量为8Gy的60Co-γ射线辐射处理的徐长卿愈伤组织能选育出有利变异性状的新类型。

3结论与讨论

该研究表明,对徐长卿的愈伤组织进行剂量为8、12、16Gy的60Co-γ射线辐射处理能引起变异,并分化培养出具有变异性状的不定芽和具有有利变异性状的试管苗。这也说明采用一定剂量的60Co-γ射线对徐长卿的愈伤组织进行辐射处理的方法不仅是愈伤组织进行诱变的一条有效途径,也是选育徐长卿新类型的新途径。

辣椒愈伤组织再生体系研究进展 篇8

1 基因型的影响

基因型是影响辣椒愈伤组织诱导与植株再生的一个重要因素, 不同品种之间愈伤诱导率及其再生率有显著差异[6]。罗素兰等[7]选用4种不同的辣椒进行再生体系的研究, 结果表明不同品种的分化频率有所不同, 最高为83%, 而最低的仅为67%;龙凤等[8]选取9个辣椒品种的子叶、下胚轴接种于芽诱导分化培养基, 结果显示不同品种间分化频率差别较大, 变化范围为50%~90%, 说明辣椒不定芽诱导分化率具有明显的基因型依赖性。

2 外植体的影响

选用不同的外植体, 在愈伤诱导、不定芽的分化以及不定芽生根等各个阶段所得出的结果就有很大差异, 如辣椒的子叶、茎尖、上胚轴、下胚轴、真叶、花药等均可用于愈伤组织的诱导, 但结果却有很大不同。王旭英等[9]以彩色辣椒茎尖、子叶、上胚轴、下胚轴为外植体进行离体培养, 发现在诱导愈伤时, 不同外植体愈伤组织的诱导率不同, 子叶最高为95%, 其他的依次为茎尖、上胚轴、下胚轴;张春芬等[10]同时报道下胚轴和真叶有诱导形成不定根的现象。柳建军等[11]认为带柄子叶的分化显著优于子叶和下胚轴;但崔群香等[12]对试验综合成苗系数与诱导频率进行研究, 认为去根和子叶的苗尖更有利于彩色辣椒离体再生成功。

3 植物生长调节剂的影响

在辣椒组织培养中, 常用植物生长调节剂有IAA、6-BA、NAA、GA3、2, 4-D、ZT、KT、IBA等。在各个不同的培养阶段, 所用的植物生长调节剂种类和植物生长调节剂组合各有不同。辣椒诱导愈伤时, 植物生长调节剂通常选用2, 4-D与细胞分裂素配合使用或细胞分裂素与NAA配合使用, 而在分化培养时, 一般采用细胞分裂素与IAA配合使用, 同时发现添加一定量的AgNO3有利于提高不定芽的分化频率。

3.1 愈伤组织的诱导

合适的激素浓度配比对于诱导产生较好的愈伤组织及其随后的分化至关重要[13]。各种植物生长调节剂组合均能不同程度地诱导出愈伤组织, 但诱导效率和愈伤组织的质量不同。高浓度的2, 4-D最易诱导愈伤组织, 但愈伤组织质地疏松透明, 不能分化芽[8]。这一观点也得到了董兆龙等[14]的证实。李永文等[2]采用不同激素组合对彩色辣椒子叶愈伤组织诱导, 发现单用6-BA比6-BA与NAA配合使用效果要好;王迅等[15]用6-BA、KT、IAA等3种激素设置12种配比, 发现都能诱导愈伤, 但6-BA的效果比KT普遍要好;罗素兰等[7]报道, 当IAA和NAA的质量浓度为1.0、2.0、3.0 mg/L, 而6-BA质量浓度为0.1、0.5、1.0 mg/L时, 子叶外植体只形成愈伤组织, 且伴随生根现象, 但随着6-BA浓度的升高和IAA、NAA浓度的降低, 不定芽分化频率增高, 愈伤组织产生减少。

3.2 愈伤组织的分化

在辣椒愈伤组织分化的过程中, Sadhana等[16]发现6-BA是重要的激素之一;唐亮等[17]认为6-BA在一定范围内 (0~5 mg/L) 浓度越大越有利于诱导分化, 同时配以IAA、NAA、ZT等激素效果更好;Sanatombi等[18]也得出芽的最适培养基为MS+6-BA 8.8μmoL/L+IAA 11.4μmoL/L。李英慧等[19]对不同含量的6-BA、ZT、KT等细胞分裂素对辣椒子叶再生频率的影响进行分析, 结果表明6-BA的诱导效果最好, ZT次之, KT基本上不能诱导不定芽。何晓明等[20]的研究成果也是如此。研究者同时发现, 由2, 4-D诱导产生的愈伤在以后的芽分化培养基中不能产生不定芽, 且2, 4-D对不定芽的分化有明显的抑制作用[20]。在同一6-BA浓度下, 6-BA/IAA组合诱导不定芽的效果明显优于6-BA/NAA组合, 6-BA/IAA的浓度比为10∶1的培养基的分化率高于5∶1的培养基, 并得出最适不定芽诱导培养基为MS+6-BA 5 mg/L+IAA 0.5 mg/L[21], 这一结论也得到了孙丽萍[22]、龙凤等[8]的认可。

3.3 不定芽的伸长与生根

缪武等[23]报道辣椒离体培养的主要困难在于芽伸长的诱导, 在芽伸长培养基中添加2 mg/L的GA3可诱导芽的伸长, 但若在芽分化培养基上添加GA3, 则会抑制芽分化, 产生大量愈伤组织;姚明华等[24]也发现6-BA、GA3是不定芽生长的显著影响因子, 6-BA浓度的增加对不定芽的伸长有抑制作用, 当6-BA浓度为5 mg/L以上时, 不论GA3的浓度为多少, 不定芽块只有膨大现象;黄真池等[25]也发现除6-BA、GA3外, 适当增加IAA浓度可促进不定芽的伸长;汤银珠[26]认为2.0 mg/L ZT和2.0 mg/L 6-BA的配合使用能促进不定芽的伸长。张先云等[5]、谢立波等[27]都认为芽伸长的最佳培养基为MS+6-BA 5 mg/L+IAA 0.2 mg/L+GA32 mg/L+AgNO34 mg/L。不定芽的生根普遍认同在基本培养基中添加IAA、NAA即可。余小林等[28]、罗素兰等[7]研究发现, 生根最适培养基为MS+IAA 1 mg/L, 不定根的诱导率高达95%。张春芬等[10]发现相比不附加激素的1/2 MS培养基, 添加了0.1 mg/L、0.3mg/L IAA后, 生根时间缩短3~5 d且根长得粗壮, 若IAA浓度增加为0.5 mg/L时, 根系形成鸡爪根。敬国兴等[29]将不定芽转入1/2 MS+IAA 1 mg/L、NAA 0.5 mg/L的生根培养基, 不定根生根率达85%~100%, 而再生苗置于只添加1/2 MS+IAA 0.8~1.0 mg/L的培养基时, 根多而细长, 成活率低。

4 苗龄的影响

辣椒苗龄对再生频率也有很大影响。一般认为子叶离体培养的最适叶龄为12~16 d[30]。研究者[31]发现随着叶龄增加, 再生能力先升高后降低。柳建军等[32]认为无菌苗苗龄的大小, 对带柄子叶的分化再生能力有很大影响, 3 d的苗几乎不分化, 6~12 d的苗分化率较高, 苗龄达15 d的分化率明显降低, 且分化的芽数也少。罗素兰等[7]、姚明华等[24]、成善汉等[21]也认为12~14 d分化率最强。但周钟信等[33]以30 d叶龄子叶为外植体进行培养, 也获得再生植株, 而且芽分化率、移栽成活率均为100%。

5 AgNO3的影响

一些研究者发现在诱导芽分化时, 外植体切口易产生褐化现象, 从而使芽的诱导受影响, 添加一定浓度的AgNO3可以抑制褐变, 同时可以促进芽的分化。王迅等[15]的试验表明, 与未加硝酸银相比, 加入硝酸银能提高芽分化率的30%, 并大大缩短分化时间, 但他同时指出过高浓度的硝酸银会造成植株茎叶畸形, 最适浓度范围为3~4 mg/L;张先云等[5]的试验显示, 添加硝酸银后, 某些品种的分化率达到了100%。

6 其他因素的影响

辣椒组织培养通常在25℃、光照12~16 h/d、1 200~2 000 lx条件下进行。而进行培养所用的基础培养基大多数为MS培养基, 也有使用MB (MS无机盐+B5有机成分) 为基本培养基的。张先云等[5]的试验指出以真叶作为外植体进行再生体系的建立, 则MB培养基较为合适;黄真池等[25]以子叶为外植体也得到了同样的结论。此外, 余小林等[28]报道LY (氨基酸混合物) 添加物对分化有一定的促进作用, 效果比添加水解酪蛋白的效果好;李永文等[2]指出相比固体培养和液体静置培养, 半固体培养方式下愈伤组织出现早且诱导率高;黄丽华等[34]发现红光、白光有利于辣椒愈伤组织的形成, 蓝光、绿光对芽分化有抑制作用。

7 存在的问题及对策

自20世纪70年代用辣椒子叶和胚轴诱导出再生芽以及用辣椒花药培养获得单倍体植株以来, 辣椒离体培养技术有了很大的改进;离体培养技术的范围也在不断扩大, 但还是存在一定的问题。

7.1 基因型依赖性

辣椒通过愈伤组织再生途径获得再生植株虽已获得成功, 但不同品种及变种间的组织培养效果差别很大。不同基因型材料的子叶、下胚轴在离体培养条件下, 芽分化率在50%~90%不等[8]。可通过查阅前人的研究结论或是通过筛选较适宜离体培养的品种进行进一步试验研究, 以避免由基因型的影响引起的试验结果不理想。

7.2 褐化现象

据报道, 在辣椒诱导芽分化时, 外植体切口易产生褐化现象, 从而使芽的诱导受影响, 影响再生体系的建立。研究发现, 可通过添加一定浓度的AgNO3 (3~4 mg/L) 、VC、活性炭抑制褐变[30], 但高浓度的AgNO3也会导致畸形芽的形成, VC、活性炭对外植体的再生有一定的负面影响。

7.3 不定芽伸长困难