金银花愈伤组织的诱导

金银花愈伤组织的诱导（精选12篇）

金银花愈伤组织的诱导 篇1

摘要：以南丰蜜桔“杨小—26”花药为外植体, 培养诱导胚性愈伤组织。结果表明:在不同取材时期和培养基条件下, 胚性愈伤组织发生率是不同的。南丰蜜桔花药培养的取材最佳时期是单核靠边期;培养基LP+TDZ3.0mg/L+A1.03.0mg/L+NAA1.0mg/L+10mg/LAgNO3较适于胚性愈伤组织再生, 再生率高达20.3%;培养基配方中AgNO3对胚性愈伤组织再生无显著影响。本研究首次报道了南丰蜜桔花药离体培养, 诱导出胚性愈伤组织。

关键词：南丰蜜桔,胚性愈伤组织,花药离体培养,再生

南丰蜜桔是我国的地方良种, 素享“桔中贡品”之美誉 (胡正月等, 2005) 。它以肉质脆嫩化渣、风味浓甜、少核或无核而深受消费者喜爱。进入20世纪90年代后, 由于感染柑桔碎叶病毒等原因, 单产下降, 果实品质变劣, 发生了种性退化, 市场竞争力下降 (吴德喜等, 1990) 。因此, 应用生物技术手段培育无病毒苗木或改良品种就成为目前南丰蜜桔生产中亟待解决的问题。因此开展以离体培养为基础的生物技术育种研究显得尤为重要, 花培技术就是其重要途径。再者, 愈伤组织保存是柑桔种质资源保存的一条值得探索的途径, 具有节省人力、物力、财力以及避免自然灾害和病虫害等优点 (张俊娥和邓秀新, 2007) 。目前, 国外仅有意大利报道柑桔类花药组织培养再生出不定芽, 但其再生率很低 (Germana et al., 1998) ;国内尚未出现研究成功的报道, 笔者以花药为外植体, 建立南丰蜜桔的胚性细胞系, 为今后进行与其有关的原生质体融合, 转基因研究, 纯系二倍体和无核品种以及种质资源离体保存奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

以南丰蜜桔“杨小—26”为应试品种, 材料取自花蕾发育的各个时期, 并保持花粉无污染。

1.2 方法

1.2.1 材料预处理:

先低温预处理, 将花蕾放于

4℃冰箱72h后, 再振荡培养 (60转/min) , 消毒, 将花蕾接种于液体培养基, 振荡暗培养9d。

1.2.2 消毒:

整个花蕾于25%NaCl溶液中消毒20min, 无菌水冲洗3遍。

1.2.3

将预处理的试验材料剥离花药, 接种固体培养基中, 暗培养28d后, 进行光培养, 每20d继代1次。

1.2.4 培养基:

(1) MT+TDZ 30mg/L+A1.0 3.0mg/L+NAA 1.0mg/L+10mg/L AgNO3; (2) MT+TDZ3.0mg/L+A1.0 3.0mg/L+NAA 1.0mg/L; (3) SH+TDZ 30mg/L+A1.0 3.0mg/L+NAA 1.0mg/L+10mg/L AgNO3; (4) SH+TDZ 3.0mg/L+A1.0 3.0mg/L+NAA 1.0mg/L; (5) LP+TDZ 30mg/L+A1.0 3.0mg/L+NAA 1.0mg/L+10mg/L AgNO3; (6) LP+TDZ 3.0mg/L+A1.0 3.0mg/L+NAA 1.0mg/L。

愈伤组织培养基加蔗糖30g/L, 琼脂6g/L, 继代培养基加蔗糖50g/L。KT、AgNO3和A过滤灭菌。

1.3 培养条件

本文无特殊说明, 培养温度均为26℃, 光照3000Lx, 光周期为16h/d。

2 试验结果与分析

2.1 花药培养

2.1.1 愈伤组织形成。

预处理后的花药离体培养1周左右, 颜色开始由黄色变淡黄至黄褐色, 同时在花药中心线一侧出现淡褐色小点。2周左右某些花药颜色发亮, 经过l～2天, 发亮的花药从缢痕处生出小白点, 逐渐扩大体积, 颜色由白变淡黄或黄绿色 (图1) , 这就是愈伤组织绝大多数在20天左右形成愈伤组织, 从其外形看有紧实和疏松2种, 前者为黄绿色, 后者为黄白色。紧实型中又分表面光滑和不光滑两种。前者颜色较深, 在培养过程中慢慢老化死亡或不分化。后者生长旺盛分裂能力强, 分化能力强。而未经过预处理的花药无愈伤组织形成。

2.1.2

胚性愈伤组织形成, 愈伤组织鲜重达到30g时 (图2) , 继代培养60d, 有胚状体产生 (图3) , 再继代60d生出胚性愈伤组织 (图4) .

2.1.3 花粉发育时期与胚性愈伤组织形成。

只有单核靠边期的花药适于生长出愈伤组织和胚性愈伤组织。

2.1.4 培养基对胚性愈伤组织的影响。

由表1可以看出, 花药在6种培养基均可生出愈伤组织, 平均愈伤组织发生率均在80%以上, 培养基对愈伤组织再生无显著差异。培养基配方对胚性愈伤组织的生长有重要的作用, 1和2培养基上无胚性愈伤组织生长, 3、4、5和6培养基上有利于胚性愈伤组织生长, 5和6培养基较适于生长, 并且5和6培养基的胚性愈伤组织发生率显著高于3和4。培养基配方有否AgNO3对胚性愈伤组织生长无显著差异。

3 讨论

本研究发现, 取花药时的小孢子发育时期很关键, 这关系到是否能产生胚性愈伤组织。南丰蜜桔花药培养的最佳时期是单核靠边期, 而在大多数瓜类花药培养中, 选用的都是花粉单核靠边期 (董艳荣, 2002) (陈振光, 1995) 。

预处理包括离心、低温、高温和热激, 目的是从形态上改变极性分布, 从生理生化上改变细胞生理状态, 而改变其分裂方式和发育途径。本试验采用预处理是低温和震荡培养, “杨小26”的胚性愈伤组织发生率最高达20.3%, 验证了陈英等 (1997) 的研究结果。

本试验结果表明, MT培养基不适合花药组织培养, 这与柑桔类胚性愈伤组织研究结果不符 (张俊娥等, 2003) , 尚需试验进一步验证。LP和SH培养基适合做花药组织培养, 这为高硝态氮培养基较适合于木本果树离体再生研究提供一个佐证 (Khachatourian et al, .2002) 。笔者发现培养基配方中AgNO3对胚性愈伤组织生长无显著影响, 而谭祖国 (1998) 、李韬等 (1997) 分别将Ag NO3应用于红江橙、朋娜、纽贺尔、芦柑、雪柑的胚珠培养中, 克服了难获得胚性愈伤组织的难题, 获得了相应的胚性细胞系, 这或许因为离体器官不同所致。

参考文献

陈英丁海付贵荣黄永芬汪清胤转基因番茄的花粉组织培养哈尔滨师范大学自然科学学报199713 (2) .

陈振光.园艺植物离体培养学.中国农业出版社, 1995.23-25

董艳荣.甜瓜花药再生体系的基础研究.南京农业大学 (硕士论文) , 2002

胡正月罗省根胡冬英实施"金牌"战略提高南丰蜜橘含金量现代园艺2007.1

李韬, 芦柑、雪柑胚性愈伤组织的诱导[J].福建果树, 1997, (101) :11-12.

舒广平吴德喜.柑橘碎叶病毒生物鉴定研究.中国柑橘, 199019 (I) :47-49

谭祖国.红江橙原生质体分离培养以及植株再生的研究[D].江西农业科技, 1998, (4) :28-31.

谭祖国, 万蜀渊.朋娜和纽贺尔脐橙胚珠离体培养获得无病毒珠心苗方法研究[D].湖北农业科学, 1998, (4) :43-45.

张俊娥, 郭文武, 邓秀新.柑橘愈伤组织倍性变化及其与体细胞胚胎发生能力的关系[J].遗传学报 (英文版) , 2006, 33 (7) :647-654.

金银花愈伤组织的诱导 篇2

试验以优化设计结缕草成熟胚愈伤组织诱导的营养因素为目的,采用L9(34)的正交设计,优化选择结缕草成熟胚性愈伤组织诱导的培养基类型、糖类型及浓度、酶水解酪蛋白浓度等营养因素.试验表明:①不同营养因素组合的.各处理对出愈率和出愈时间的影响不具显著差异.②培养基类型和酶水解酪蛋白的含量对愈伤组织大小的影响具有显著的效应.③培养基类型、酶水解酪蛋白相对于糖浓度和糖类型对胚性愈伤组织的形成具有显著作用.试验结论:MS培养基、糖类型S+G、糖浓度40g/L、酶水解酪蛋白1 g/L,为结缕草愈伤组织诱导的最佳营养因素组合.

作 者：李艳双 韦善君 阿里穆斯 作者单位：李艳双(中央民族大学中国少数民族传统医学研究院,北京,100081;中央民族大学生命与环境科学学院,北京,100081)

韦善君(中央民族大学生命与环境科学学院,北京,100081)

阿里穆斯(中央民族大学中国少数民族传统医学研究院,北京,100081)

金银花愈伤组织的诱导 篇3

关键词：冬枣；花药培养；愈伤组织；诱导；技术体系；膨大率；出愈率；影响因素

中图分类号：S665.104⁺.3 文献标志码：A

文章编号：1002—1302（2016）01—0060—03

冬枣（Ziziphusjujuba Mill.cv.Dongzao）为鼠李科枣属植物，别称果子枣、雁过红、庙上福、苹果枣、冰糖枣，果皮薄，核小，果肉汁多、细嫩酥脆、色泽鲜艳、甜味浓，富含钙、铁、锌等多种矿物质，维生素C含量颇丰富，素有维生素C之王的称号，其含糖量适中，味美可口，具有清理肠胃，有助于消化之功效，是美容和减肥的佳品。关于冬枣的花药培养研究较少，王娜通过诱导胚胎愈伤组织的途径对冬枣花药进行培养，获得1株单倍体植株；武晓红研究了甘露醇、不同温度条件预处理对枣花药愈伤组织诱导的影响；刘晓光研究了冬枣花药愈伤组织的诱导，悬浮系的建立、培养及愈伤悬浮系原生质体的分离。本试验分析了麦芽糖、激素和低温预处理等多种因素在冬枣花药愈伤组织诱导中的作用，建立一套更适合冬枣花药培养的技术体系，从而推动湖北省孝昌县冬枣产业的快速发展。

1材料与方法

1.1试验材料

冬枣花药采自湖北省孝昌县种植地。

1.2试验方法

1.2.1愈伤组织的诱导 5—6月选取直径为0.3～0.6 cm且花萼尚未张开的未成熟的新鲜花蕾，在70%乙醇中浸泡10 s，用无菌水冲洗3次，用0.1%氯化汞溶液浸泡10 min，再用无菌水冲洗3～4次，将花蕾转移至已经灭过菌、铺有滤纸的灭菌培养皿内，剥取花蕾，取出花药，接种到盛有50 mL固体培养基的100 mL的三角瓶中，每瓶接种30枚，每个处理接种10瓶，放在（26±1）℃培养室黑暗条件下培養，观察不同条件下花药愈伤组织的诱导。

1.2.2继代和分化培养 愈伤组织在培养基上生长一段时间后，营养物枯竭，水分散失，并已经积累了一些代谢产物，此时须要将这些组织转移到新的培养基上，继代培养基使用MS+6-BA 0.2 mg/L+2，4-D 0.2 mg/L+麦芽糖20 g/L+琼脂4g/L。每次继代培养约20 d，1～2次继代后，挑选脆的胚性愈伤组织转移至分化培养基MS+NAA 0.2 mg/L+麦芽糖20g/L+琼脂4 g/L上。

2结果与分析

2.1花药愈伤组织的诱导

花药在诱导培养基上培养2 d后，局部开始发生褐变，4～5 d后大部分的花药开始膨胀，出现不同程度的卷曲，花药在2周后逐渐开裂，3周后在花药花丝断裂处和药壁上长出愈伤组织或胚。从诱导的愈伤组织来看，大部分是淡黄色松散型（图1），这种愈伤组织经过多次继代培养，就更加松散，颗粒小，分散性很好，很难用镊子夹起来，而且胚性细胞多，可较长时期保持其分化能力，分化频率高。小部分是嫩绿色松散型（图2），一般都是从花药开裂处长出，分化频率较低。

2.1.1麦芽糖浓度对冬枣花药愈伤诱导率的影响 将消毒后的花药分别接种在Ms培养基上，附加2，4-D 1.0 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+琼脂4 g/L进行试验，由表1可以看出，冬枣花药膨大率和诱导率有显著影响。没有麦芽糖的培养基里，愈伤组织诱导率非常低，只有3.7%；愈伤诱导率随着麦芽糖浓度的提高而升高，当麦芽糖浓度达到20 g/L时，诱导率最高，为27.6%；当浓度达到30g/L时，会抑制愈伤组织的诱导。20 g/L麦芽糖产生的愈伤组织较好，呈黄绿色或黄色、块状、质地较硬、表面有颗粒状突起。有利于形成胚性愈伤，当麦芽糖浓度高于20 g/L时，绝大部分的愈伤组织容易发生褐化死亡。

2.1.2激素对冬枣花药愈伤诱导率的影响 将消毒后的花药分别接种在Ms培养基上，附加麦芽糖20 g/L+琼脂4 g/L进行不同浓度的激素组合试验，由表2可以看出，花药膨大率与愈伤组织诱导率成正比关系，在培养基中添加不同浓度的生长素和细胞分裂素诱导频率不一样。单独使用1种细胞分裂素6-BA很难诱导出愈伤组织，只有同时添加生长素2，4-D和细胞分裂素6-BA才有利于花药愈伤组织的产生，在6-BA浓度一定的情况下，随着2，4-D浓度的升高，愈伤组织诱导率升高，而当浓度达到1.0 mg/L后呈下降趋势，且2，4-D 1.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L培养基的愈伤诱导率最高，达37.2%。

2.1.3低温预处理对冬枣花药愈伤诱导率的影响 将冬枣的花蕾放人4℃冰箱中处理不同时间，将花药接种在Ms+2，4-D 1.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+麦芽糖20 g/L+琼脂4 g/L培养基上进行培养，50 d后观察低温预处理对愈伤诱导率的影响，结果见表3。4℃低温预处理对花药的愈伤诱导有显著影响，预处理3 d愈伤诱导率达到46.6%，3 d后愈伤组织诱导率即显著降低，且一直持续降低，由诱导后0 d的37.2%最终降为诱导后7 d的9.8%。

2.1.4高温预处理对冬枣花药愈伤诱导率的影响 将冬枣的花蕾放人35℃培养箱中处理不同时间，将花药接种在Ms+2，4-D 1.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+麦芽糖20 g/L+琼脂4 g/L培养基上进行培养，50 d后观察高温预处理对愈伤组织诱导率的影响，结果见表4。高温预处理花药的愈伤诱导率显著降低，由诱导后0 d的37.2%最终降为诱导后7 d的3.7%。

2.2继代培养和分化培养

把直径为0.5 mm左右的愈伤组织放人继代培养基后（图3、图4）再转入分化培养基中，转接2 d后愈伤组织体积慢慢增大，1周后愈伤组织局部变为绿色（图5），2周后开始出现绿色的芽点，进一步分化成小幼苗。但大部分的愈伤组织多次分化后不能分化出小苗（图6），开始衰败，最后死亡（图7、图8）。

3结论与讨论

非洲菊花托愈伤组织的诱导研究 篇4

关键词：非洲菊,花托,愈伤组织

非洲菊 (Gerbera jamesonii Bolus) , 属菊科大丁草属多年生常绿宿根草本花卉, 别名扶郎花、太阳花、灯盏花等, 已成为继世界四大切花之后的第五大切花[1]。非洲菊花色改良有较大的商业价值, 尽管传统杂交育种手段仍是非洲菊遗传改良的主要途径, 但以基因工程技术为基础的花色改良已受到众多关注。植物组织培养技术是生物工程研究的基础, 是遗传转化、植物改良研究的基本环节之一。现对2种非洲菊品种太阳和诺苏娜愈伤组织诱导进行研究, 为基因转化工作奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2010年2月在辽宁省农业科学院创新中心实验室进行。选用太阳和诺苏娜2个非洲菊品种, 株高约30 cm, 花梗长40～50 cm, 温度适宜可周年开花, 适宜于切花生产。

1.2 方法

1.2.1 培养基及培养条件

以MS为基本培养基, 附加30%蔗糖和0.55%的琼脂, 在此基础上添加不同种类和不同浓度的植物生长调节物质。用1 mol·L-1的盐酸或1 mol·L-1的氢氧化钠调节pH至5.8, 每个培养瓶 (200 mL三角瓶) 分装30 mL培养基, 用耐高温聚丙烯塑料薄膜封口。培养基、无菌水、滤纸、培养皿等均经高压蒸汽灭菌, 灭菌压力为1.05 kg·cm-2, 保持20 min。光照培养室温度设定为 (25±2) ℃, 光照强度为2 000～3 000 lx, 每天光照13 h。

1.2.2 外植体的消毒

分别挑选温室中生长健壮、无病虫害的2个品种的优良母株, 切取0.5～1.0 cm大小的花托作外植体, 先用自来水流水冲洗30 min后, 用毛刷蘸40倍的84消毒液清洗一遍, 用无菌水漂洗干净。在超净工作台上, 将花蕾用70%酒精浸泡5 s后, 用0.1%HgCl2消毒6 min, 无菌水冲洗3～5次。接种前沥干水分, 切去花柄、花萼、苞片, 用解剖刀轻轻刮去花托上的管状花及周围的舌状花, 根据花托的大小分切成2～4块直径约0.3～0.5 cm大小的外植体。花托的背面朝下接种于诱导培养基中, 每瓶接种1个花托。

1.2.3 愈伤组织的诱导

将2个品种的外植体, 分别接种在MS+2, 4-D 4 mg·L-1+6-BA0.5 mg·L-1, MS+2, 4-D 4 mg·L-1+6-BA1.0 mg·L-1, MS+2, 4-D 4 mg·L-1+KT0.5 mg·L-1, MS+2, 4-D 4 mg·L-1+KT1.0 mg·L-14种愈伤组织诱导培养基上, 30 d后继代一次, 每处理接种60块外植体, 60 d后统计愈伤组织诱导率。整个愈伤组织诱导过程在黑暗条件下进行。

愈伤组织诱导率/%=产生愈伤组织外植体数/接种外植体数×100

2 结果与分析

2.1 不同培养基对外植体愈伤组织诱导速度的影响

将2个品种的外植体分别接种在各处理培养基中, 二者愈伤组织的诱导速度不同, 太阳的外植体产生愈伤组织的时间明显早于诺苏娜, 且在15 d左右切口表面开始膨大, 35 d左右开始有愈伤组织出现, 首先都是白色柔软的半透明状非胚性愈伤组织, 几天后在此基础上出现浅黄色、疏松、有一定硬度的、颗粒状胚性愈伤组织。白色非胚性愈伤组织生长较快, 颗粒状的胚性愈伤组织分散于其中或集中在愈伤组织块中心, 相对增殖缓慢, 50 d左右各处理都产生愈伤组织。

2.2 不同培养基对愈伤组织诱导的影响

2.2.1 对太阳愈伤组织诱导的影响

由表1可知, 2, 4-D与6-BA或KT组合均能诱导太阳的花托球产生愈伤组织, 但6-BA的效果优于KT, 并且6-BA、KT均以低浓度为优;当6-BA、KT浓度为0.5 mg·L-1时、添加6-BA培养基的出愈率比添加KT培养基的高21.7%;当6-BA、KT浓度为1.0 mg·L-1时, 添加6-BA培养基的出愈率比添加KT培养基的高10.0%;2, 4-D 4 mg·L-1+6-BA0.5 mg·L-1是诱导愈伤组织最佳的激素组合, 愈伤组织诱导率最高, 为65.0, 形成的愈伤组织大部分呈淡黄色、质地疏松、生长较快, 非胚性愈伤比例少。各处理愈伤组织生长状况见图1。

A:1号培养基;B:2号培养基;C:3号培养基;D:4号培养基

2.2.2 对诺苏娜愈伤组织诱导的影响

由表2可知, 诺苏娜虽能诱导出愈伤组织, 但愈伤组织诱导率低于太阳, 且愈伤组织产生时间明显晚于太阳。其接种后40 d才出现愈伤组织, 65 d左右各处理都产生愈伤组织, 但愈伤组织诱导率均较低, 相比较MS+2, 4-D 4 mg·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1最好, 为45.0%, 由此分析, 诺苏娜花托中内源细胞分裂素含量可能低于太阳, 所以需较高浓度的6-BA。但诱导2个品种愈伤组织的培养基中均为添加2, 4-D和6-BA最好。

以非洲菊花托为外植体, 诱导其脱分化所需要的时间与其它植物比相对较长, 该试验所采用的2个品种的花托脱分化的时间均是30～40 d才逐渐开始愈伤组织的分化 (见图2) , 而且愈伤组织分化率也相对较低, 太阳的分化率最高为65.0%, 诺苏娜的分化率最高为45.0%。

3 结论与讨论

非洲菊的组织培养研究在国内已有报道, 采用茎尖、叶片、花托、花梗、花萼等外植体进行离体培养都有成功的报道。在众多离体培养的报道中, 采用花托作为外植体的报道较多。有试验结果表明, 幼小的花托是非洲菊最适宜培养的外植体, 用其它部位培养, 如幼叶、幼叶柄及花梗仅诱导产生愈伤组织而难以分化成苗, 培养茎尖时可得到腋芽分化, 但取材受到极大限制, 同时也不易灭菌[2]。

培养基是影响愈伤组织诱导的重要外部因素[3], 尤其是植物生长调节剂的种类及浓度。禾谷类作物组织培养和体细胞胚性诱导过程中, 2, 4-D的应用十分普遍, 主要起脱分化作用。已有的大量研究表明[4], 在玉米幼胚培养中, 添加2, 4-D是诱导愈伤组织形成的关键因子。该试验研究结果也表明, 愈伤组织诱导受其外加激素的影响, 还要考虑到各激素之间的互作效应, 太阳和诺苏娜均是接种在MS+2, 4-D+6-BA培养基中愈伤组织诱导率最高, 说明相比之下MS+2, 4-D+6-BA培养基更适合非洲菊华托为外植体诱导出愈伤组织。

基因型是影响愈伤组织诱导以及分化的主因素, 而培养基中激素配比也是影响愈伤组织诱导率及胚性的关键因素。该试验发现每一种基因型都有其对应的培养基激素配比, 这就需要试验来确定每种材料对应的培养基成分, 才能诱导出高质量的胚性愈伤组织, 太阳接种在MS+2, 4-D 4.0 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1培养基中愈伤组织诱导率最高, 为65.0%, 诺苏娜接种在MS+2, 4-D 4 mg·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1培养基中愈伤组织诱导率最高, 为45.0%, 太阳的外植体35 d左右开始有愈伤组织出现, 诺苏娜愈伤组织诱导率低于太阳, 其接种后40 d才出现愈伤组织。

参考文献

[1]鲁雪华, 郭文杰, 林勇.几种因素对非洲菊离体培养再生植株的影响 (简报) [J].植物生理学通讯, 1999 (10) :372-374.

[2]叶华.非洲菊组织培养和转基因研究概况[J].思茅师范高等专科学校学报.2010 (3) :10-12

[3]何遐义, 张秀文, 石和平, 等.玉米幼胚培养及其影响因素的研究[J].中山大学学报论丛, 1996 (2) :19-25.

金银花愈伤组织的诱导 篇5

中国粗榧愈伤组织诱导及再生体系的建立

以中国粗榧(Chinese cephalotaxus sinensis)茎尖、幼叶为外植体材料进行愈伤组织诱导,分化及再生苗的生根、移栽的主要影响因素,建立了中国粗榧的.再生体系.结果表明,培养基以MS+6BA+NAA+2,4D为佳,培养温度为28℃,相对湿度为70%,光照时间8h/d,3周后开始形成愈伤组织.0.1mg/L 2,4-D在SH培养基上诱导愈伤组织分化成芽,分化率平均每块愈伤可达6.1±0.33个芽,最适生根条件为1/2MS+1.0mg/LNAA.

作 者：黄进勇 岳彩鹏 黄象男 孙延斌 Huang Jinyong Yue Caipeng Huang Xiangnan Sun Yanbin 作者单位：郑州大学生物工程系,郑州,450001刊 名：中国农学通报 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE AGRICULTURAL SCIENCE BULLETIN年，卷(期)：200622(5)分类号：Q81关键词：中国粗榧 愈伤组织 再生体系

金银花愈伤组织的诱导 篇6

关键词：中华卷柏；愈伤组织；诱导

中图分类号： S567.23+9.043文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）01-0039-02

收稿日期：2013-08-12

基金项目：河北省科技支撑计划（编号：06220111D-1）；邯郸市科学技术研究与发展计划（编号：1223109092-10）。

作者简介：付伟（1978—），女，硕士，讲师，主要研究方向为植物生物技术。E-mail：fwximei@126.com。

通信作者：叶嘉，硕士，教授，从事资源植物开发和利用。E-mail：yejia630819@126.com。中华卷柏[Selaginella sinensis （Desv.） Spring]为卷柏科（Selaginellaceae）卷柏属多年生草本植物，别称地柏枝，主要分布于我国东北、华北等温带地区，是我国特有的药用植物。中华卷柏含有穗花杉双黄酮、罗伯斯特杉双黄酮、银杏双黄酮等多种双黄酮类化合物[1-2]。其全草为民间常用草药，有清热利尿、解毒散寒、消炎止血的功效，用于肝炎、胆囊炎、慢性气管炎、慢性肾炎、湿疹、烧伤烫伤等的治疗[3]。目前对中华卷柏的研究多集中在孢子形态学[4-5]、化学成分研究[5-6]、药用价值[7-9]等方面。迄今在国内未见有关中华卷柏愈伤组织诱导的报道。愈伤组织诱导是植物生物反应器规模化生产植物次生代谢产物的重要环节[10]。通过中华卷柏愈伤组织的诱导，可以为利用生物反应器生产中华卷柏黄酮类化合物开辟有效途径。本试验以中华卷柏不同外植体为试验材料，探讨外植体种类、光照、植物生长调节剂、继代时间对愈伤组织的影响，以期为中华卷柏悬浮细胞的培养、诱变、次生代谢产物的生产奠定一定的理论基础。

1材料与方法

1.1试验材料的灭菌及外植体的制备

供试材料采自河北省武安国家森林公园，栽植于邯郸学院生物科学系温室内。选取中华卷柏的茎尖、带叶茎段、幼叶片作为外植体材料。

1.2试验方法

1.2.1外植体对愈伤组织诱导的影響接种前先用洗洁精将外植体表面清洗干净，自来水流动冲洗30 min。然后在超净工作台内用75%乙醇浸泡30 s，无菌水冲洗4次，然后用0.1%的HgCl2消毒5 min，用无菌水洗涤6次，每次3 min，用无菌吸水纸吸干水分。将茎尖和带叶茎段切成0.5～1 cm，剪下单叶，备用。将消毒好的外植体接种在1/2 MS+3%蔗糖+0.6%脂琼+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 1.5 mg/L 的培养基上。每个处理接种24个外植体，重复3次，30 d后统计愈伤组织诱导率。愈伤组织诱导率=诱导出愈伤组织的外植体块数/接种的外植体块数×100%。

1.2.2光照条件对愈伤组织诱导的影响将消毒好的茎尖接种在上述培养基中，培养条件分别为A：光照强度1 500 lx，光照时长12 h/d，温度为 （25±1） ℃；B：暗培养，温度为 （25±1） ℃。每个处理接种60个外植体，20 d后统计愈伤组织诱导情况。

1.2.3植物激素组合对愈伤组织诱导的影响将消毒好的茎尖接种在1/2 MS+3%蔗糖+0.6%琼脂并附加不同浓度的2，4-D和6-BA的愈伤组织诱导培养基上，暗培养于 （25±1） ℃ 的条件下。每个处理接种24个外植体，重复3次，30 d后统计愈伤组织生长情况。

1.2.4继代培养时间对愈伤组织褐化的影响将培养不同时间的愈伤组织切下接种到1/2MS+3%蔗糖+0.6%琼脂+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 2 mg/L 的培养基上。每个处理接种30个愈伤组织，重复3次，75 d后观察愈伤组织生长及褐化情况。

1.3数据统计

试验数据采用Excel 2003和DPS 软件对愈伤组织诱导培养结果进行统计分析。

2结果与分析

2.1不同外植体对愈伤组织诱导的影响

在相同培养条件下，中华卷柏不同部位作为外植体愈伤组织的诱导率不同，且差异显著（表1）。茎尖比较容易形成愈伤组织，出愈时间较早，培养15 d即产生愈伤组织，形成的愈伤组织呈浅黄色、光滑、半透明，茎尖出愈率最高达23.6%。带叶茎段愈伤组织诱导效果相对较差，出愈时间较晚，比茎尖出愈时间延长1/3，出愈率也较低，为97%。幼叶的诱导效果最差，在培养30 d后全部枯萎死亡，未发现愈伤组织萌动。因此茎尖是中华卷柏愈伤组织诱导最适宜的外植体。

2.2光照对愈伤组织诱导的影响

光照条件对愈伤组织诱导的影响较大（表2）。暗培养更

表1不同外植体对愈伤组织诱导的影响

外植体类型1出愈时间（d）1诱导率（%）茎尖115123.6a带叶茎段12019.7b幼叶1—10c注：同列数据后不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。表3、表4同。

有利于卷柏愈伤组织的形成，相对于光培养，愈伤组织诱导率提高了13.3百分点。愈伤组织形成的时间也有所提前，在诱导愈伤组织的培养基上暗培养6 d后，茎尖开始增厚膨大，11 d 后在茎尖处产生浅黄色愈伤组织（图1-A）。

2.3不同激素浓度对愈伤组织诱导的影响

由表3可知，当6-BA浓度为0.5 mg/L时，愈伤组织的诱导率最高达55.6%；当6-BA为0.1 mg/L，没有诱导出愈伤组织。可见6-BA的浓度是诱导愈伤组织的关键。在一定范围内（0.1～0.5 mg/L），随着6-BA浓度的增高，中华卷柏愈伤组织的诱导率也相应提高；但超过其临界浓度后，诱导率随之下降。在6-BA使用浓度相同时，2.0 mg/L的 2，4-D 比1.5 mg/L的2，4-D更有利于愈伤组织诱导率的提高。不同浓度配比的6-BA和2，4-D对中华卷柏愈伤组织形成时间影响不大，基本出现在11～13 d，形成的愈伤组织颜色以淡黄色为主（图1-A）。诱导愈伤组织的最佳培养基为1/2 MS+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L，该条件下愈伤组织的诱导率最高，达55.6%。

nlc202309041819

2.4不同继代时间对愈伤组织褐化的影响

试验结果表明，不同继代时间对愈伤组织生长情况有明显影响，继代时间过多或过长均不利于愈伤组织的生长（表4）。15 d继代1次，愈伤组织生长较慢且72.2%出现褐化；25 d继代1次，愈伤组织生长较快，由浅黄色变为浅黄绿色，表面呈现油光状（图1-B），褐化率仅为31.1%；35 d继代1次，愈伤组织全部褐化死亡，这可能是由于较长的继代时间会使酚类物质的氧化产物扩散到培养基中，毒害愈伤组织。

表4继代时间对于愈伤组织褐化的影响

继代时间

（d）1愈伤组织生长情况1褐化率

（%）151生长较慢172.2b251生长快131.1c351几乎不生长1100.0a

3讨论

本试验分别以中华卷柏的茎尖、茎段、幼叶片作为外植体诱导愈伤组织，发现外植体类型对能否诱导出愈伤组织影响较大。采用茎尖培养效果最好，诱导率最高，这与王晶等[8]的研究结果一致。以幼叶为外植体没有诱导出愈伤组织，可能是由于叶片切碎后出现的创伤面会引起酚类等次生代谢物质的积累，从而在一定程度上抑制愈伤组织的形成，这与前人在其他植物中的研究结果相吻合[11-12]。

光照对植物胚性愈伤组织诱导的影响因物种而异。本研究发现，在暗培养条件下，中华卷柏愈伤组织诱导阶段的出愈率明显高于光照条件下。可见光照对愈伤组织的形成有一定的抑制作用，抑制原因还有待于进一步研究。

植物愈伤组织的形成是在植物激素的调节控制下进行的[3]。以中华卷柏茎尖为外植体的组培试验表明，诱导率因培养基中激素的配比不同而表现出不同，并且6-BA对愈伤组织的形成起着关键作用，此外选择适宜的激素配方可以提高愈伤组织的诱导率。在试验范围内，以中华卷柏茎尖为外植体诱导培养基的最佳激素配比为6-BA 0.5 mg/L+ 2，4-D 2 mg/L。

参考文献：

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枇杷花药培养愈伤组织诱导研究 篇7

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为宜宾职业技术学院农业科技园大五星、早钟6 号及龙泉1 号枇杷栽培品种的花药。从幼树及壮年枇杷植株上取不同直径为0.3~0.8 mm枇杷花蕾,在自来水中冲洗20 min,采用低温、热激、高渗透压与高速离心的方法,对花蕾进行预处理。

1.2 去绒灭菌

用手术刀片将经过预处理的枇杷花蕾表面绒毛刮去,用70%酒精浸泡30 s,后用0.5% Hg Cl2水溶液表面消毒8min,再用无菌水冲洗4~5 次,在无菌条件下拨开花蕾取出花药,同时彻底去除花丝。

1.3 预处理

低温4 ℃分别处理24、48、96、144 h,培养基中附加2.0mg/L 6-BA和0.5 mg/L 2,4-D,添加7%蔗糖和0.6%琼脂。

1.4 培养基

采用MS大量元素、微量元素和有机物。培养基附加2.0mg/L 6-BA和0.5 mg/L 2,4-D,并附加不同浓度的蔗糖(0、3%、5%、7%、9%)、 葡萄糖(0、3%、7%、9%),0.6%琼脂。 不同植物激素水平和浓度(2,4-D:0.01、0.02、0.05、0.10、0.30、0.50mg/L)进行完全组合,添加7%蔗糖和0.6%琼脂。

1.5 试验过程

每个三角瓶接种20 枚枇杷花药,用无菌封口膜密封,在25 ℃下黑暗条件下培养。培养1 周后,将未污染的花药转入新鲜遇上组织诱导培养基上,每个三角瓶转入20 枚枇杷花药。培养4 周以后统计培养效果。

2 结果与分析

2.1 灭菌方式对愈伤组织形成的影响

将花药剥出以后,对花药进行灭菌处理受到的伤害较为严重,在接种后会快速褐变。对整个花蕾进行灭菌,使花药受到的灭菌剂的伤害降低。采用流水下冲洗花蕾1~2 h处理花蕾,然后用75%酒精处理30 s,0.1%升汞灭菌25~30min , 无菌水冲洗5 ~6 次后, 剥出花药, 接种污染率高达90%。将枇杷花蕾表面绒毛刮去,然后再进行处理,会使污染率明显下降5%左右。

2.2 预处理对花药愈伤组织诱导的影响

没有经过预处理的枇杷花药在培养,对培养的反应差,诱导启动率诱导率低,基本产生不了愈伤组织。经过预处理后,诱导率明显提高。其中低温预处理对花药愈伤组织诱导效果最显著,对大五星枇杷诱导率达53%,龙泉1 号达56.33%,早钟6 号74%。低温预处理从24 h增加到48 h,能显著提高诱导率,但再延长,愈伤组织诱导率则会逐步下降。

2.3糖源种类和浓度对花药愈伤组织诱导的影响

蔗糖浓度从0 增加到5%时,愈伤组织的诱导率也随之增加,其中早钟6 号枇杷的花药愈伤组织诱导率最高。蔗糖浓度从7%到9%时,愈伤组织诱导率出现下降趋势。

2.4激素种类、浓度和组合对花药愈伤组织诱导的影响

在MS培养基上,或者在MS培养基中添加IBA、NAA、IAA、6-BA的不同浓度和组合,均不能诱导出愈伤组织。但添加了2,4-D后,能诱导枇杷花药分化形成愈伤组织。并且2,4-D浓度从0.01 mg/L增加到0.50 mg/L时,诱导率也从2.33%增加到69.33%。但在0.5~1.0 之间,处于不变状态。

3 结论与讨论

植物花药愈伤组织形成受多种因素的制约。该试验中,枇杷花蕾表面的绒毛给消毒造成了较大的困难,刮去绒毛后消毒灭菌能有效防止污染的发生。同时,预处理对花药愈伤组织诱导起决定作用,没有经过预处理的枇杷花药几乎不能诱导脱分化及再分化。花蕾经过预处理后,诱导率显著提高,在所有预处理方法中,低温预处理效果最为显著[3,4]。

糖类种类和浓度对花药愈伤组织的诱导率、愈伤组织发生时间、质地、组织学起源有显著影响。激素种类和糖类浓度均显著地影响到了愈伤组织的诱导率,2,4-D在枇杷花药培养中起着关键作用。但是,预处理对促进花药愈伤组织诱导的机制,以及愈伤组织再分化条件,需要进一步完善。

参考文献

[1]张恢志.中国果树志:枇杷[M].武汉:华中农业大学出版社,1990.

[2]张日清,闻丽,刘友垒,等.低温预处理对油茶花药愈伤组织诱导的影响[J].中南林学院学报,2005,25(6):24-28.

[3]陈红,王永清.枇杷花药培养诱导愈伤组织的研究[J].安徽农业科学.2007,35(27):8453-8454.

金银花愈伤组织的诱导 篇8

关键词：半夏,组织培养,分化再生,愈伤组织

半夏(Pinelliae ternata)为天南星科多年生草本植物,药用历史悠久,其地下块茎干燥炮制后入药,具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结之功效[1]。近年来,研究发现半夏还有抗早孕、抗肿瘤、降血脂、护肝等功能,因而备受国内外关注[2]。半夏既能进行有性繁殖,又能进行无性繁殖。但半夏结实率低,出苗率低,种子在常温条件下贮藏,生活力较易丧失,因此,通常生产上不直接用种子繁殖[3]。在自然界中,半夏主要由生于叶柄下的珠芽繁殖。由于珠芽采集困难,故不能广泛栽培。因此,药源只能收集野生半夏,野生半夏也因大量采挖而近于枯竭,不能满足药用需求[4]。利用组培技术对半夏进行试管繁殖,不仅可提高繁殖系数,还可显著改良半夏品质[3]。因此,有必要利用半夏组织培养快速繁殖提供植物材料以满足市场需求。

1 材料与方法

1.1 试验材料

来源于云南农业科学院生物技术与种质资源研究所。

1.2 试验方法

1.2.1 激素对愈伤组织形成的影响。

以MS培养基为基本培养基:琼脂9g/L+蔗糖30g/L;p H值5.8,添加不同浓度的2,4-D和6-BA,分装于三角瓶,于121℃(1.1kg/cm2压力)灭菌15min备用。取半夏地下块茎、叶柄和叶片,清洗干净后,用手剥去表皮,用3%次氯酸钠溶液浸泡30min待用。在无菌工作台上先用75%乙醇浸泡10s,再用0.1%升汞浸泡10min,无菌水冲洗3~4次,滤纸吸去表面水分。将半夏块茎、叶柄、叶片切成约3mm3左右的小块,接种于不同种类及浓度激素的MS培养基上,置室内散射光下,室温(16~20℃)下培养。

1.2.2 激素对愈伤组织分化苗的诱导影响。

将以上形成的生长良好的愈伤组织转接到含有不同浓度2,4-D和6-BA的培养基(琼脂9g/L+蔗糖30g/L,p H值5.8)上,常温光照培养。

1.2.3 外植体放置方式对不定芽的影响。

外植体的放置方式分水平放置和块茎、叶柄垂直插入培养基。培养基为MS培养基:琼脂9g/L+蔗糖30g/L,p H值5.8。

1.2.4 无菌苗苗龄对外植体分化的影响。

选不同苗龄无菌苗接种于培养基,培养30d,比较出苗率。

1.2.5 继代培养中激素浓度对不定芽的影响。

将诱导得到的芽丛,4~5个切为1团,接种于含不同浓度6-BA的MS培养基上,于温度(20±2)℃、光强30μmol/m2·s的环境中培养,光照时间12h/d左右,培养30d,调查芽丛增殖倍数。

1.2.6 生根培养。

将以上外植体产生的丛生芽切分转至不同激素配比的生根培养基上,p H值5.8~6.2。培养温度为(24±2)℃,在自然散射光下培养。

2 结果与分析

2.1 激素对愈伤组织形成的影响

接种1周后,外植体边缘开始增厚,2周后形成白色疏松愈伤组织。从表1~3可以看出,植物激素的种类及浓度对半夏的脱分化起重要调节作用,在不加任何激素的培养基上,外植体不能形成愈伤组织。培养基中只加某一种激素时,也不能诱导出愈伤组织,只有当2,4-D与6-BA一起使用时,才能诱导出愈伤组织。

从表1可以看出,在对半夏块茎诱导中以6-BA 2mg/L+2,4-D 2mg/L时的诱导效果最佳,诱导率达92%。当6-BA和2,4-D达到3mg/L时,出现外植体的褐化、坏死。从表2~3可以看出,在对半夏的叶柄和叶片诱导中,所需6-BA有所升高,当6-BA 3mg/L+2,4-D 2mg/L时,诱导效果最好,叶片诱导率达70%,叶柄诱导率达52%,但出现少量外植体褐化现象。可见外植体对激素浓度有一定的适应范围,过高和过低都不利于愈伤组织的诱导。

2.2 激素对愈伤组织分化苗的诱导影响

激素对愈伤组织分化苗的诱导试验结果表明(图1),2,4-D与6-BA对苗的分化都有重要的作用,而6-BA的作用更明显,且2,4-D与6-BA的合理配置是半夏分化苗的关键所在。据试验结果观察,在半夏分化苗过程中,激素配比以6-BA 2mg/L+2,4-D 2mg/L组合效果最好,诱导率可达100%。

在激素浓度对不定芽的研究中,诱导愈伤组织和愈伤组织分化所需的2,4-D有所不同,诱导愈伤组织中偏高,在愈伤组织分化中偏低;6-BA没太大变化。

2.3 外植体放置方式对不定芽的影响

从图2可以看出,外植体的放置方式对出芽有很大影响。块茎垂直放置出苗率高,出芽率达82%,水平放置出芽率达40%。叶柄和叶片平放于培养基效果较好,出芽率分别为52%和70%;叶柄垂直插入培养基,出芽低,仅有20%,且出芽速度慢。

2.4 无菌苗苗龄对外植体分化的影响

从图3可以看出,无菌苗苗龄对半夏外植体的出芽率有很大影响。当无菌苗苗龄为10d时,叶片的分化率仅为40%,叶柄分化率达50%,而块茎的分化率最高,可达94%。无菌苗苗龄为10~25d时,叶片分化率达78%,叶柄分化率达57%,而块茎的分化率有所下降,达83%。无菌苗苗龄为45d以上时,叶片和叶柄分化率近于0,块茎的分化率为58%。

2.5 继代培养中激素浓度对不定芽的影响

从图4可以看出,当6-BA为3mg/L时增殖倍数最高6-BA为2mg/L次之。从芽增殖倍数看,芽增殖所需6-BA浓度较芽分化所需6-BA浓度没太大变化,当不加6-BA时,仅有芽伸长,没有芽增殖,有根长出;当6-BA为3mg/L时增殖倍数达4倍左右,长势良好,植株高于其他处理;当6-BA为4mg/L时,增殖芽数明显下降,植株较矮。

2.6 激素对不定芽生根的影响

从表4可以看出,当培养基中不加6-BA和2,4-D,或浓度为1.0~2.0mg/L时,不利于生根;当6-BA 0.2mg/L+2,4-D0.2mg/L时,生根效果最好;当6-BA 0.1mg/L+2,4-D 0.3mg/L时,生根效果次之;当6-BA 0.3mg/L+2,4-D 0.1mg/L时,有根长出。

注:-表示差,+表示一般,++表示较好,+++表示好,++++表示很好。

3 讨论

任何植物细胞或组织培养体系的建立,都必须采用适宜的外植体。同一种植物不同的组织和器官其再生能力有很大差异。半夏不同外植体的出芽率也有差异,块茎的分化出苗率较高,叶片其次,叶柄最低。

在影响半夏出芽的外界因素中,外植体的年龄对植株再生有重要影响[5],无菌苗苗龄低,接种过程中容易造成机械损伤,使伤口褐化,导致外植体死亡,出芽率下降,苗龄过高,易形成倒苗,叶片和叶柄老化甚至枯萎,不能用做外植体,生长旺盛期和珠芽成熟期的半夏材料,其外植体的分化率都较高;倒苗期,外植体材料减少,不利于快繁和研究。

半夏外植体在培养基中的放置方式对外植体分化有很大影响,块茎垂直放置出苗率高;叶柄和叶片平放于培养基中效果较好;叶柄垂直插入培养基出芽低,仅有20%,且出芽速度慢。

块茎的分化率与采集时间关系不大。继代过程中,所需6-BA浓度较分化时的浓度变化不大,但值得注意的是芽丛分割的大小对植株成活有较大影响,材料分割应在4个以上,芽的个数少,芽基的萌发相应较少,甚至造成原块茎腐烂[6]。

培养条件是半夏离体培养的重要环节,最佳培养温度为18~20℃,温度过低,诱导时间延长,诱导率下降;温度过高时,切块容易变黑,若形成愈伤组织其颜色呈淡黄色,容易老化,分化成苗率低。在分化出苗期,光的作用比较明显,光照时间应较长[7]。

为了改变野生半夏资源供不应求,人工栽培半夏因繁殖力低及品种退化等原因造成短缺的现状,应用现代生物学手段对其进行组织培养,既可以建立半夏无性系快速繁殖系统,提高其繁殖系数;又可以筛选出具有优良性状的半夏品种。

参考文献

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[6]唐琼莲.半夏的组织培养[J].云南林业科技,1998(1):80-81.

金银花愈伤组织的诱导 篇9

1 材料与方法

1.1 材料

笔架茶的嫩叶、嫩茎和花瓣, 均取自清远市笔架山农场。

1.2 方法

(1) 培养基的制备:1/2MS+6-BA2.0mg/l+NAA1.0mg/l, 121℃, 灭菌20分钟, 冷却待用。

(2) 外植体的消毒处理。

取笔架茶刚展开的嫩叶、嫩茎和花蕾用软毛笔蘸取洗洁精稀释液小心清洗, 流水冲洗1h～1.5h后, 用洁净纱布吸干;于超净工作台上经70%酒精处理20s、无菌水漂洗两次后, 置于0.1%HgCl2溶液中浸泡10min～20min;无菌水漂洗4～5次后, 用无菌滤纸吸干表面水分待用。

(3) 接种。

(1) 以嫩叶为外植体:把经上述消毒处理的嫩叶切成1cm2左右具叶脉的小叶块上表面朝上接种于上述制备好的培养基中, 每瓶接种5～6个小叶块, 共接种十瓶重复三次。

(2) 以嫩茎为外植体:把经上述消毒处理的嫩茎节间切成0.5cm长左右的茎段外植体, 接种于上述制备好的培养基中, 每瓶接种5～6段, 共接种十瓶, 重复三次。

(3) 以花瓣为外植体:把经上述消毒处理的花蕾, 剥去外苞片, 取出里面的花瓣, 接种于上述制备好的培养基中, 每瓶接种5～6个花瓣, 共接种十瓶, 重复三次。

(4) 培养。

接种后的外植体均放在25℃下进行两周时间的暗培养后, 转为每天14h散射光下继续培养。

2 结果与分析

培养30d后统计出愈情况, 结果如图1所示。

从图中可以看出, 笔架茶的嫩叶、嫩茎和花瓣均可以诱导出愈伤组织, 但愈伤组织的出愈率和愈伤组织的生长状况均以嫩叶为外植体时最佳。用嫩叶作为外植体的出愈率为86%, 用花瓣作为外植体的出愈率为67%, 而用嫩茎作为外植体的出愈率则是最不理想的, 出愈率只有28%。在诱导愈伤组织的过程中还发现, 用嫩叶作为外植体诱导出的愈伤明显且健壮, 用嫩茎和花瓣诱导的愈伤组织不发达, 且用嫩茎诱导时极易发生褐变。

3 结语

不同器官, 其离体反应能力也不相同。中村顺行[1]报道, 茎段、叶片、子叶、根和花药的愈伤组织启动时间不同。杨国伟[2]报道, 叶和茎能产生愈伤组织, 但诱导的时间不一样, 叶为23d, 茎为11d, 而种子则不能诱导出愈伤组织。袁地顺[3]报道, 叶片愈伤组织诱导率为80%, 高于嫩茎愈伤组织诱导率53%, 嫩茎愈伤组织诱导率又明显高于根尖36%。本实验通过用笔架茶的嫩叶、嫩茎和花瓣作为外植体, 同样发现采用不同的外植体对笔架茶愈伤组织的诱导影响很大, 笔架茶的嫩叶、嫩茎和花瓣均可以诱导出愈伤组织, 其中以嫩叶作为外植体时最佳, 其诱导出来的愈伤组织生长良好, 诱导率为86%, 较嫩茎作为外植体高出58%, 较花瓣作为外植体高出9%。这一结果, 为今后继续研究笔架茶再生植株提供了实验基础。

参考文献

[1]中村顺行.Cultivation and character-istics of tea callus[J].茶叶研究报告, 1984, 60:7～14.

[2]杨国伟, 兰蓉, 王晓杰, 等.茶树愈伤组织诱导和组织培养[J].江苏农业科学, 2006 (4) :122～124.

龙脑樟愈伤组织诱导及增殖研究 篇10

右旋龙脑 (d-borneol) 又名天然冰片, 既是一种名贵中药材, 具有开窍醒神、清热止痛、抗菌消炎的功效[6], 又是高级香料, 同时还是重要的化工原料, 我国历来依靠从印尼等国进口[7]。现阶段, 我国对龙脑樟的开发利用也多以提取精油为主, 长期以来的过度采伐势必导致其资源的严重破坏, 尤其是优树资源趋于枯竭[8]。龙脑樟目前的繁育多采用常规的播种繁殖或扦插育苗, 但种子繁殖存在繁殖系数低、且易出现性状分离、后代个体间差异大及母树的优良性状难以保持等缺点、而扦插繁育易受母树枝条数和扦插季节等的限制, 且长期多代的扦插繁殖容易使其品质变差[9]。而采用组织培养技术不仅能解决该品种的繁殖困难, 且细胞培养还可用于批量生产天然龙脑, 为改变其天然资源枯竭状况及维护生态平衡, 具有重要的经济价值和生态效益。因此, 在前期研究的基础上, 本实验对龙脑樟愈伤组织诱导条件进行了初步探索

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料取自吉安市林业科学研究所龙脑樟采穗圃, 采集母树当年生、生长健壮、无病虫害的半木质化新梢。

1.2 试验方法

1.2.1 无菌外植体茎段获得及腋芽诱导。

将采集到的材料带回实验室内, 去掉叶片, 刷子蘸洗衣粉仔细刷洗枝条表面, 并切成长2~3㎝带有叶柄和芽心的茎段, 流水下冲洗10 min, 转入超净工作台[10], 用75%酒精浸泡10~30 s, 再用0.1%升汞添加吐温-20的消毒液剧烈振荡灭菌6~10 min, 无菌水清洗5次, 滤纸吸干表面水分, 接种到MS+BA 2.0 mg/L+NAA 0.1mg/L诱导腋芽萌发 (图1A) 。

图1 A.龙脑樟腋芽诱导;B.小叶愈伤组织诱导;C.愈伤组织增殖Fig.1 A.induction of axillary bud;B.callus induction of young leaf;C.callus proliferation

1.2.2 龙脑樟愈伤组织的诱导。

当腋芽萌发后, 切取腋芽上2~3片完全展开的小叶, 在叶背面沿与主脉垂直方向横切几刀, 但不切断, 叶背面朝下接种到以L4 (23) 正交试验设计方法配置的各愈伤组织诱导培养基。研究不同浓度BA (2、4 mg/L) 、NAA (0.1、0.5 mg/L) 和2, 4-D (0、2 mg/L) 对龙脑樟愈伤组织诱导的影响。

1.2.3 龙脑樟愈伤组织的增殖。

将诱导获得的愈伤组织转移到以MS为基本培养基并添加不同激素种类及浓度的培养基上, 研究不同浓度BA (2、4、5 mg/L) 、NAA (0.1、0.5 mg/L) 和2, 4-D (2 mg/L) 对龙脑樟愈伤组织继代增殖培养的影响。

1.3 生长条件

培养室光照强度2 000 lx, 光周期12 h/d, 温度25±1℃。愈伤组织诱导初期先黑暗培养7 d, 然后再置正常光照条件下培养。如无特殊说明, 各培养基均添加琼脂6.5 g/L, 蔗糖20 g/L, p H 5.8, 121℃高压灭菌20 min。

1.4 结果观察和数据分析

接种后对小叶形态变化和愈伤组织发生情况进行观察记录, 并用数码相机记录外植体各阶段的形态变化, 接种初期先黑暗培养7 d后置正常光照条件, 20 d后统计污染情况;污染率=污染外植体数/接种外植体总数。20 d后统计裸眼可见出愈叶片 (愈伤组织大于2 mm以上的小叶数量) 并计算愈伤组织诱导率;愈伤组织诱导率=生成愈伤组织的外植体数/接种外植体总数。培养30 d左右, 龙脑樟的愈伤组织在不同继代培养基上的生长情况, 包括颜色和生长速度 (根据愈伤组织块的大小将愈伤组织生长速度划分为快速生长、较快生长和缓慢生长3类) 。每个试验处理接种15~20个外植体, 重复3次;应用Excel 2003进行数据处理, 采用SPSS 13.0进行数据的差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同消毒时间对外植体灭菌效果的影响

设计3种不同的消毒时间, 对龙脑樟外植体进行灭菌效果研究 (表1) 。结果表明:灭菌时间越短, 污染率越高;随着灭菌时间的延长, 污染率降低。灭菌时间在8~10 min的外植体平均污染率明显比6 min的低, 显著性检验表明, 灭菌时间在10 min与6 min间的污染率差异达到显著水平。结合不同消毒时间对平均污染率的影响, 结果表明龙脑樟外植体的最佳消毒时间为10 min, 污染率可控制在25%以内。

注:同列字母不同, 表示差异显著 (P<0.05) 。

2.2 不同因素对龙脑樟愈伤组织诱导的影响

腋芽小叶在接种后1周左右开始出现皱褶, 叶边缘向远轴面卷曲翘起, 叶片变硬变脆, 随后切口及叶柄略微膨大, 并逐渐有少量白色愈伤组织形成;为白色的颗粒、细小、质地较疏松、生长旺盛, 愈伤组织多发生在叶柄以及叶脉切口处 (图1B) 。

由表2可以看出, 在供试的4种培养基中, 除了处理2, 其他都可以使叶片诱导出愈伤组织, 最高诱导率达72.7%。极差分析 (KR) 结果表明NAA对愈伤组织诱导的影响最大, 2, 4-D次之, BA的作用最小。从不同植物生长调节剂浓度水平 (k1、k2) 来看, NAA浓度由0.1 mg/L增加到0.5 mg/L, 使龙脑樟愈伤组织诱导率变为原来的33.90%, 而培养基中添加2.0 mg/L 2, 4-D可使平均诱导率由58.4%下降到28.8%, BA浓度从2.0 mg/L增加到4.0 mg/L, 诱导率提高39.84%, 说明2, 4-D对龙脑樟愈伤组织诱导起抑制效应, 而较高浓度的NAA也不利于愈伤组织诱导。综合各因素最优水平, 龙脑樟腋芽小叶愈伤组织诱导较佳培养基组合为MS+BA 4.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。

注:K为各指标因素水平之和, k为各指标因素水平均值, R为各因素水平极差。

2.3 不同培养基对龙脑樟愈伤组织增殖的影响

将上述诱导获得的愈伤组织转移到表3各培养基进行继代增殖培养, 4周后龙脑樟愈伤组织在添加2, 4-D的培养基上完全褐化死亡;在较低的植物生长调节剂 (BA和NAA) 浓度培养基中, 龙脑樟愈伤组织生长较缓慢;而采用较高浓度的BA和NAA组合对龙脑樟愈伤组织增殖效果较好。因此, 本研究筛选出龙脑樟愈伤组织增殖较佳培养基组合为:MS+BA 5.0mg/L+NAA 0.5 mg/L (图1C) 。

注:-:死亡;+:缓慢生长;++:生长较快;+++:快速生长。

3 讨论与小结

陈美兰等[2]采用GC对叶和茎诱导出的愈伤组织进行右旋龙脑的含量测定, 发现茎诱导出的愈伤组织不含右旋龙脑, 并建议生产中以产生龙脑为目的的愈伤组织诱导宜以龙脑樟的嫩叶为外植体为佳。在本试验条件下, 以腋芽小叶为外植体材料成功获得了龙脑樟愈伤组织并进行了大量增殖。

虽然添加适宜浓度的2, 4-D可使多种植物成功诱导出愈伤组织, 但本研究过程中发现2, 4-D对龙脑樟愈伤组织诱导起抑制效应, 这与陈美兰等[2]的结果有所不同, 可能与外植体的状态有关;而适宜浓度的NAA和6-BA配合使用, 可促龙脑樟腋芽小叶出愈率和出愈量增加, 而且诱导出的愈伤组织生活力旺盛, 可以多次继代保存 (表2、表3) 。龙脑樟愈伤组织在诱导及继代培养过程中易产生褐化现象而使细胞死亡, 除了通常采用的添加抗褐化物质、降低培养基无机盐浓度、缩短继代培养时间等, 环境因子特别是光照确实对植物愈伤组织的生长发育和形态构成具有一定的调控作用[11]。此外, 相比于固体培养, 细胞悬浮培养能加快细胞增殖速度, 通过大规模培养, 可提供大量均匀一致的细胞培养物[12]。因此, 针对目前市场上右旋龙脑非常紧缺这种境况, 筛选出右旋龙脑含量相对最高的愈伤组织, 建立龙脑樟愈伤组织细胞悬浮培养体系是下一步研究的重点。

本文通过龙脑樟优良单株嫩茎诱导出腋芽、再以腋芽的小叶为外植体, 通过添加不同种类及浓度的植物生长调节物质进行愈伤组织的诱导及增殖培养等过程。其技术路线为:将外植体茎段接种于MS+BA2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L诱导腋芽萌发, 取腋芽小叶接种于MS+BA 4.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L进行愈伤组织的诱导, 将获得的愈伤组织转入增殖培养基MS+BA 5.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L进行多次继代增殖培养。

本研究为龙脑樟以及其他樟树品种高效愈伤组织的诱导和增殖培养提供了一种思路和技术途径。

摘要：以龙脑樟的茎段作为外植体, 进行腋芽的诱导获得无菌苗, 继而腋芽小叶被用于愈伤组织的诱导并进行增殖培养。结果表明外植体适宜的灭菌方法为:0.1%升汞灭菌10 min, 污染率为21.6%;腋芽小叶愈伤组织诱导最佳培养基配方为:MS+BA 4.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L, 诱导率可达72.7%, 较佳增殖培养基组合为:MS+BA 5.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L。

关键词：龙脑樟,愈伤组织,诱导,增殖

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金银花愈伤组织的诱导 篇11

关键词：三叶木通；愈伤组织；分化

中图分类号：S567.904.3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）07-0050-03

三叶木通[Akebia trifoliata （Thunb.） Koidz]是木通科（Lardizabalaceae）木通属（Akebia）的一种果实营养价值较高的半落叶藤本野生果树[1]，别称八月瓜、八月扎、炸瓜。主要分布于中国甘肃南部、陕西南部，湖南、湖北、山西、河南等地也有少量分布[2]。研究发现，三叶木通种子脂肪酸含量较高，且主要以不饱和脂肪酸为主[3]；果实味美、营养丰富，蛋白质、氨基酸、可溶性糖、有机酸和矿物质含量也很高，被誉为果中之王[4]，具有较高的经济价值和开发价值。三叶木通是中国传统中药，有清心火、利小便、通经下乳作用[5]。近年来，国内学者对三叶木通的研究主要集中在药用成分分析以及扦插栽培等方面[6-7]，组织培养方面研究较少，目前，只有愈伤组织诱导的研究，且诱导率较低，尚无关于三叶木通愈伤组织分化成苗的相关报道。本试验对三叶木通下胚轴愈伤组织诱导及分化进行了研究，研究不同生长调节剂种类、浓度组合对三叶木通下胚轴再生的影响，以期建立三叶木通下胚轴高效离体再生体系，为其遗传转化体系的建立奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

三叶木通种子由湖南怀化种植基地提供。

1.2 方法

1.2.1 无菌外植体的获取 挑选富有光泽、饱满的种子，置于超净工作台内，无菌水浸泡24 h，使其充分膨胀。75%的乙醇浸泡30 s，无菌水冲洗3次，0.1%的氯化汞浸泡10 min，无菌水冲洗3次，置于无菌滤纸上吸干多余水分，用解剖针划开种皮，将胚取出，分别接种于MS培养基、1/2 MS培养基、MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L和1/2 MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L培养基中诱导种子萌发，24 h光照培养7 d，统计试验结果。

1.2.2 愈伤组织诱导培养基的筛选 切取长度约为5 mm的三叶木通下胚轴，以MS为基本培养基，选用3因素3水平正交试验设计L9（33）方案，观察2，4-D、NAA、KT 3种植物激素的浓度及配比对愈伤组织诱导的影响（黑暗培养），每瓶接5个材料，每组处理10瓶，40 d后统计愈伤组织诱导结果。

1.2.3 光照对愈伤组织诱导影响及抗褐化剂的筛选 切取长度约为5 mm的下胚轴，接种于MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L中，分别进行黑暗、光照、黑暗20 d再光照 20 d 3种处理方案培养，定期观察并记录生长情况，40 d后统计试验结果。将约5 mm大小的外植体接种于愈伤诱导培养基MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L中，分别添加维生素C 10、20、50 mg/L，AC（活性炭）0.5、0.8、1.0 g/L，PVP（聚乙烯吡咯烷酮）0.6、0.8、1.0 g/L的抗氧化剂和吸附剂，以不添加任何抗褐化剂和吸附剂作为空白对照，黑暗处理，40 d后统计愈伤组织的褐化程度及生长状态。

1.2.4 愈伤组织分化培养基的筛选 将长势较好的愈伤组织转移于培养基：（1） MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVP 0.6 g/L；（2） MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA0.2 mg/L+PVP 0.6 g/L；（3） MS+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVP 0.6 g/L；（4） MS+TDZ 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVP 0.6 g/L，每瓶接5个材料，每个处理重复10瓶。黑暗处理 10 d 后，光照培养，50 d后分别观察并记录愈伤组织分化结果。

1.2.5 培养条件 培养基pH值为5.8～5.9，琼脂8 g/L，蔗糖30 g/L，培养温度（24±1） ℃，培养室湿度为60%～70%，光照时间为24 h/d（黑暗处理及光照试验除外），光照度为1 200～1 500 lx。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对无菌外植体获得的影响

观察发现，3 d后接種在MS和1/2MS培养基中的种胚变绿且子叶张开，下胚轴开始伸长；另外2组培养基几乎没有变化。7 d后不同培养基中的下胚轴长度存在差异，子叶形态也不同（表1）。接种于MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L和1/2 MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L培养基中的种胚不能形成健壮幼苗，发育畸形。因此，将MS培养基作为获得外植体的最佳培养基。

2.2 愈伤组织诱导培养基的选择

观察发现，接种7 d左右下胚轴两端切口处开始膨大，40 d 后愈伤组织形成，愈伤组织诱导结果见表2。当激素配比为2，4-D 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L时，愈伤诱导率最高，为96.5%。为进一步观察各控制变量是否对观测变量产生影响，利用SPSS软件进行多因素多水平的方差分析，结果见表3。

由表3可知，2，4-D、NAA 2个因素对愈伤组织诱导率的影响都极为显著，KT则不显著。即2，4-D、NAA 2种激素的3种浓度处理间差异均为显著；KT的3种浓度处理间差异不显著。为了筛选2，4-D、NAA的最佳浓度，对2因素进行Duncan检验，结果见表4、表5。

nlc202309041633

2.2.1 2，4-D 3个浓度水平的Duncan检验 多重分析比较结果见表4，2，4-D 3个浓度间差异显著；2.4-D 3.0 mg/L与 4.0 mg/L 差异极显著，就平均值来看2，4-D 2.0 mg/L的诱导平均值最高，因此，确定三叶木通下胚轴愈伤组织诱导适宜的2，4-D浓度为2.0 mg/L。

2.2.2 NAA 3个浓度水平的Duncan检验 多重分析比较结果见表5，NAA的3个浓度间差异显著；而NAA 0.2 mg/L与 06 mg/L 间差异极显著。 就平均值来看， NAA 0.2 mg/L 平

均值最高，因此，确定三叶木通下胚轴愈伤组织诱导适宜的NAA浓度为0.2 mg/L。

试验结果表明，2，4-D、NAA 2种植物激素及其配比对愈伤组织的诱导率有极显著影响，当2，4-D浓度为2.0 mg/L，NAA浓度为0.2 mg/L时愈伤组织诱导率最高。

2.3 光照时间及不同抗褐化剂对愈伤组织的影响

试验结果表明，黑暗处理条件下愈伤组织诱导率最高，且生长状态好，呈浅黄色；光照条件下的愈伤组织褐化率高达100%，愈伤组织呈深褐色；黑暗20 d再光照20 d培养的愈伤组织开始时呈浅黄色，当进行光照培养5 d后观察到约40%愈伤组织开始慢慢变成褐色，20 d后愈伤组织的褐化率高达60%。表明黑暗条件下培养可很大程度上降低三叶木通的褐化。不同抗褐化剂对愈伤组织的影响见表6。

常用抗氧化剂维生素C 及吸附剂AC 并没有起到很好的抗褐化作用，而PVP 0.6 g/L对防止褐化有相对较好作用，本结果与刘香在超声对三叶木通叶片愈伤组织生长及代谢影响得出的结论[8]一致。

2.4 愈伤组织分化培养基的筛选

将愈伤组织接种于培养基后，定期观察分化情况。培养30 d后观察到2号和4号培养基仍未分化且愈伤组织呈黑褐色，35 d后愈伤组织表面有芽点冒出。接种到1号和3号培养基的愈伤组织也有少量呈黑褐色，但已明显分化，呈团簇状。50 d后愈伤分化情况见表7。由表7可以看出，3号培养基MS+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVP 0.6 g/L的长势最好，芽分化程度最高，为适宜分化培养基，分化情况见图1。

3 结论与讨论

本试验中种胚接种于不同的培养基时下胚轴长度存在很大差异，在添加植物激素的培养基中下胚轴的长度较短，可能是由于外源激素与种胚本身内源激素相互作用抑制了生长。种胚接种于1/2 MS培养基中下胚轴长度也较短，可能是大量元素减半而导致种胚在萌发过程中大量元素不足的原因。

三叶木通中含有丰富的酚类物质，因此在愈伤组织培养过程中易发生褐化现象，从而影响培养的效果[9-11]，丰富的酚类物质还会在三叶木通果汁饮料的加工过程导致果汁色泽褐变[12]。光照对愈伤组织诱导过程中的褐化现象有着很强的诱导作用[13]。试验结果，PVP 0.6 g/L对防止褐化有着较好的作用，褐化程度明显降低，可能是与PVP吸附了酚类氧化物质有关。李然红等在甘蓝组织培养中也发现PVP对褐化抑制作用明显[14]。

在组织培养中，外植体的类型以及适当浓度配比的细胞分裂素和生长素都对愈伤组织形成有着很重要的影响[15-16]，本试验以下胚轴为外植体，通过正交设计筛选出适宜诱导愈伤组织的培养基为：MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L。沈国林等以三叶木通叶片为外植体，筛选出最适宜诱导愈伤组织的培养基为MS+2，4-D 4.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+KT 1.0 mg/L[5]，但愈伤诱导率只有87.5%，低于本研究的96.5%，且没有进行分化研究。

本试验在解决了三叶木通愈伤诱导及褐化问题后，利用得到的愈伤组织进行了分化的初步研究，筛选出适宜的分化培养基为MS+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVP 0.6 g/L，为后续快繁体系的建立奠定了基础。

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金银花愈伤组织的诱导 篇12

但由于辛夷植物两性花中雄蕊早落或雌雄花花期不同等原因,使得其自然繁殖能力很差。在我国自然分布或引进的30多个树种中,除望春玉兰(biondii M.)、玉兰(denudanta M.)、紫玉兰(liliflora M.)等少量树种被较多应用外,大多数树种因种源稀缺等原因而未被妥善经营和利用。同时,由于对该类植物的开发和利用研究起步较晚,加之某些种的分布地域狭窄,采种困难等诸多因素,致使该类植物繁殖研究滞后,开展辛夷植物无性繁殖技术研究,不但可有效增加这些树种的资源存量,为经营和利用打下物质基础,而且对这些树种的物种保护和永续利用均有重要意义。因此,加强辛夷树种的无性繁殖工作具有重要的生态意义和经济价值[4]。

当前,对辛夷植物进行的无性繁殖研究中,主要包括扦插、嫁接和组织培养,在生产实践中,由于该类植物扦插生根困难,人们常常采用高枝压条来进行无性繁殖,成株率高,但繁殖系数小。因此,对辛夷树种的组织培养工作正在受到众多科研工作者的重视,建立优良的无性系,对保存珍贵的辛夷种质资源具有重大意义。但就目前的具体情况来看,有关辛夷的组织培养的报道并不多,大部分处于初步探索的阶段。其中,广东周丽华等1999年5月从以黄兰为砧木的紫玉兰嫁接苗上采其当年生的嫩梢作外植体进行了组织培养工作,得出紫玉兰芽的增殖和继代的最适宜的培养基为MS+6-BA2.0 mg·L-1+IAA 0.1 mg·L-1+3%蔗糖,紫玉兰再生无根苗生根的适宜培养基为1/2MS+IBA 2.0 mg·L-1+NAA0.2 mg·L-1+1.5%蔗糖,为辛夷组织培养提供了宝贵的经验[5]。本实验通过以辛夷幼嫩花瓣为外植体,利用不同激素及其不同浓度配比对其愈伤组织诱导进行研究,为辛夷的组织培养提供有效的方法,从而为辛夷的快速繁殖提供新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料

河南南召辛夷,以未开放的花蕾为实验材料。

1.2 方法

1.2.1 无菌材料的获得

2月下旬采集辛夷花蕾,放在冰箱中保存。实验时取辛夷的幼嫩花蕾,在自来水下冲洗25 min,去除其表面黏附物。在超净工作台上,用75%的酒精浸泡50 s,并不断摇晃,然后放入0.1%的升汞溶液中浸泡6 min(通过预实验可得消毒时间为6 min时外植体污染率最低。当缩短灭菌时间时,外植体污染率较高;当增加灭菌时间时,外植体死亡率升高),再用无菌水冲洗4次。将灭菌后的外植体放在灭过菌的滤纸上,吸干其表面的水分,再将辛夷花蕾近基部1/4处切除,剥去苞片,取出幼嫩花瓣并横切成两块作为外植体备用。

1.2.2 外植体接种及培养

将切好的花瓣接种于愈伤组织诱导培养基中,正交设计如表1:6-苄氨基嘌呤(6-BA)浓度(0.5、1.0、2.0、3.0 mg·L-1),萘乙酸(NAA)浓度(0.5、1.0、2.0、3.0 mg·L-1),每组合接种三皿,接种密度都为每皿(直径为7.5 cm的培养皿)10块花瓣,再用封口膜封口,将其放在温度为(23±2)℃的培养室

中进行暗培养。接种后每隔5~10 d观察,20 d后统计诱导率。本实验设计3次重复,每次重复采用30个外植体(3个培养皿,10个外植体·皿-1)。

2 结果与分析

2.1 不同激素组合对辛夷花瓣愈伤组织诱导的影响

外植体接入附加不同激素组合的培养基上,第5天花瓣开始长大,随着培养的时间加长,花瓣越长越大,有些花瓣的颜色变浅。培养14 d后花瓣开始膨大、变厚,并逐渐产生愈伤组织,但不同激素组合对辛夷幼嫩花瓣愈伤组织的诱导作用不同(见表2)。

2.2 不同激素组合对辛夷花瓣愈伤组织诱导影响的比较

由表3可以看出,当6-BA浓度相同时,随着NAA浓度的增大,辛夷幼嫩花瓣愈伤组织的诱导率逐渐减小;由表4可以看出,当NAA浓度相同时,随着6-BA浓度的增大,辛夷幼嫩花瓣愈伤组织的诱导率先增大后减小。就整体而言,不同激素组合对辛夷幼嫩花瓣愈伤组织诱导的影响不同,高浓度的6-BA和NAA都不利于辛夷幼嫩花瓣愈伤组织的诱导,当6-BA和NAA的浓度都为3.0 mg·L-1时,没有愈伤组织产生,可见高浓度的外源激素对愈伤组织的诱导有抑制作用。结果表明:辛夷幼嫩花瓣愈伤组织诱导的最佳培养基为MS+6-BA1.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1,诱导率为31.1%。

3 讨论

作为建立再生体系的前提和基础,愈伤组织的诱导是非常关键的。愈伤组织的形成过程一般分为三个阶段:诱导期、分裂期和形成期。大量的研究表明,几乎所有高等植物的各种器官(如根、茎、叶和花等)以及各种组织(如皮层、茎髓和形成层等)离体后在适合条件下都能产生愈伤组织。愈伤组织诱导的成败关键不是外植体的来源和种类,而是培养条件,其中植物生长调节剂的种类和浓度最为重要。诱导愈伤组织的培养基中植物生长调节剂的配比,一般为生长素类和细胞分裂素类间的配比。用于诱导愈伤组织的植物生长调节剂有2,4-D、6-BA、KT、ZT、NAA等[6]。

在植物愈伤组织的诱导中,虽然对NAA的利用不是很多,但NAA对愈伤组织的诱导也有很重要的作用。林娅等研究表明,NAA诱导愈伤组织的效果优于2,4-D,NAA与任何一种细胞分裂素类物质结合使用,愈伤组织诱导率都为100%。龙雯虹等对萝卜愈伤组织的诱导研究也指出,不同的生长素类物质对萝卜愈伤组织的诱导效果不同,诱导效果为NAA>2,4-D>IBA,但植物生长调节剂对不同植物的诱导效果不同,在诱导植物愈伤组织时,NAA的使用浓度范围一般为0.05~20 mg·L-1[7]。

不同激素组合对辛夷幼嫩花瓣愈伤组织诱导的影响不同,司怀军等对菊花幼嫩花瓣愈伤组织的诱导研究表明,菊花幼嫩花瓣是诱导愈伤组织的良好材料,在MS+6-BA2.0 mg·L-1+NAA1.0 mg·L-1的培养基上诱导率可达100%[8]。本实验中,辛夷幼嫩花瓣愈伤组织诱导的最佳培养基为 MS+6-BA1.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1,诱导率为31.1%。但总体来看,辛夷幼嫩花瓣愈伤组织的诱导率偏低,因此提高其愈伤组织诱导率还有待于进一步探索。

参考文献

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[2]朱雄伟,杨晋凯,胡道伟.辛夷成分及其药理应用研究综述[J].海峡药学,2002(5):5-7.

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[7]黎明,马焕成.木兰科植物无性繁殖研究概况[J].西南林学院学报,2003(2):92-96.