辣椒愈伤组织诱导

辣椒愈伤组织诱导（精选12篇）

辣椒愈伤组织诱导 篇1

辣椒(Capsicum annuum L.)是一种重要的茄科蔬菜作物,是我国五大蔬菜作物之一,在生产上有重要的地位[1]。近年来,辣椒病害日益严重,通过转基因来培育辣椒抗病品种越来越受到重视[2]。在愈伤组织体外培养和高频离体植株再生体系基础上开展遗传转化,是选育优质、高抗育种材料和培育优良辣椒品种的有效途径之一,能极大地缩短育种年限,节约人力、物力和财力。

已有研究表明,激素配比、培养方式、是否添加AgNO3、外植体的类型等条件对辣椒愈伤组织的诱导及再生体系的建立均有较大影响[3]。笔者尝试通过选用不同外植体、不同激素配比及不同培养方式探讨长辣七号辣椒愈伤组织诱导的影响因素,以期进一步优化其愈伤组织诱导条件,为辣椒再生体系建立奠定材料和技术基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选择长辣七号为试验材料,种子由长沙市蔬菜科学研究所生产。

1.2 试验方法

1.2.1 无菌苗的培养。

选取颗粒饱满的辣椒种子,用0.1%HgCl2溶液灭菌10 min,无菌水冲洗数次,接种于无激素的1/2MS培养基上[4]。

1.2.2 不同外植体的制备。

(1)选播种15 d后的辣椒无菌苗子叶、胚轴,分别切成0.5 cm×0.5 cm的小块与1 cm小段,接种于2,4-D+IAA及6-BA+IAA组合的培养基上。(2)选无菌苗首次长出的真叶和同时期的茎段,分别切成0.5 cm×0.5 cm的小块与1 cm小段,接种于6-BA+IAA组合的培养基中。(3)取初展子叶,日龄分别为10、20、45 d的子叶,切成0.5 cm×0.5 cm的小块,接种于(1)、(2)中的最优激素配比培养基上。(4)选无菌苗首次长出的真叶,切成0.5 cm×0.5 cm的小块,接种于固体、半固体、液体的愈伤组织诱导培养基上。

1.2.3 培养基配方。

各种培养基的激素种类和浓度见表1~5,所有培养基中的蔗糖浓度均为30 g/L,在固体、半固体、液体培养基中的琼脂浓度分别为7.0、2.5、0 g/L。

1.2.4 接种和培养。

将外植体接种在相应的培养基上,放置在培养室中培养,温度为25~28℃,湿度为75%~80%,光照强度为20~40μmol/(m2·s),光照时间为14 h/d。试验过程中每3 d观察1次结果,记录试验现象并进行数码拍照。30 d后统计愈伤组织诱导率。

2 结果与分析

2.1 不同外植体类型及激素配比对愈伤组织诱导的影响

由表1、2、3可以看出,不同的激素组合愈伤组织诱导效果差异明显。2,4-D+IAA激素组合的诱导效果比6-BA+IAA激素组合好,出愈速度更快,愈伤组织更大;但是愈伤组织质软、疏松,在分化试验中无一分化。而6-BA+IAA激素组合诱导出的愈伤组织质地致密,呈现胚性愈伤组织的特点,具有分化的潜能。

来源于不同类型外植体的愈伤组织也有所不同。试验发现,胚轴或茎段诱导愈伤组织过程中,愈伤组织表面产生了不定根,并随6-BA浓度增加不定根增多,但子叶或真叶愈伤组织诱导过程中没有此现象。此外,培养40 d后观察发现,6-BA为1 mg/L的培养基中的愈伤组织仍能保持翠绿色,而其他试验组的愈伤组织均有褐化现象。因此,6-BA最适浓度为1 mg/L,而6-BA 1 mg/L的试验组中,IAA 1 mg/L褐化现象相对严重,IAA 0.1 mg/L的愈伤诱导结果不如IAA0.5 mg/L,所以IAA最适浓度为0.5 mg/L。综上所述,诱导愈伤组织最佳外植体为子叶或是真叶,最佳培养基配方为MS+6-BA 1mg/L+IAA 0.5 mg/L。

2.2 不同日龄子叶对愈伤组织诱导的影响

由表4可以看出,不同日龄子叶对辣椒愈伤组织的诱导有影响,试验表明长辣七号以初展期或10日龄的子叶愈伤组织诱导速度最快(图1)。培养14 d时,出愈率随子叶日龄的增加逐渐下降,这可能与子叶初展时期细胞发育时期有关,日龄较小的子叶细胞分化程度低,易脱分化恢复分裂能力。因此初展期和10日龄的子叶愈伤组织诱导效果最好。

注:表中+的数量表示愈伤生长状况,主要描述愈伤的大小。数量越多,表示愈伤越大,生长状况越好,“-”表示半个“+”。下表同。

2.3 不同培养方式对愈伤组织诱导的影响

由表5可以看出,培养方式对长辣七号真叶愈伤组织诱导和形成影响较大。液体条件下出愈率低,推测是因为随着愈伤组织的形成,材料重量增加,因而易沉入培养基底部,导致缺氧而不利于愈伤组织的后续增殖生长。半固体条件下,愈伤组织出现最早而且诱导率高,所形成的愈伤组织相比固体条件和液体条件下形成的愈伤组织更大且致密(图2~4)。但是培养28 d左右时,愈伤组织出现褐化,而固体培养基诱导出来的愈伤组织仍然呈现绿色。因此,半固体培养基中的愈伤组织诱导率最高,出愈速度最快,且应及时在褐化前进行继代培养,以保存材料,用于后续培养。

3结论与讨论

在辣椒组织培养中,外植体类型、激素的浓度及类型配比、培养方式、子叶日龄对辣椒愈伤组织的诱导均有影响。王旭英等[5]以彩色辣椒茎尖、子叶、上胚轴、下胚轴为外植体进行离体培养,发现诱导愈伤子叶最高为95%,其他依次为茎尖、上胚轴、下胚轴;李永文等[6]采用不同激素组合对彩色辣椒子叶愈伤组织诱导,发现单用6-BA比6-BA与NAA配合使用效果要好;王迅等[7]用6-BA、KT、IAA 3种激素配制12种培养基,发现均能诱导愈伤组织,但6-BA的效果比KT更好;李永文等[6]分别采用固体、半固体、液体培养基对彩色辣椒子叶愈伤组织诱导的研究,发现在半固体培养方式下愈伤组织出现早而且诱导率高,这与该试验结果一致;但其所形成的愈伤组织呈现绿色且致密,并且极易分化出不定芽。该试验中来自于半固体培养基中的愈伤组织在后期褐化,可能是因为未能及时继代培养而营养衰竭的原因。同时李永文等[6]还研究了不同日龄对彩色辣椒子叶愈伤组织诱导的影响,发现彩色辣椒子叶以初展期效果最好,愈伤组织诱导率随子叶日龄增加而呈现逐渐下降的趋势。

该试验通过探讨不同外植体、不同激素配比、不同培养方式、不同日龄子叶对长辣七号辣椒愈伤组织诱导的影响,进一步完善辣椒愈伤组织的诱导体系。后续试验有待对愈伤组织分化条件进行更深入的研究,以建立长辣七号辣椒愈伤组织的植株再生体系,进而为其遗传转化奠定基础。

摘要：以长辣七号辣椒为材料,以MS为基础培养基,探讨不同外植体、不同激素组合、不同生长日龄子叶、不同培养方式对愈伤组织诱导的影响。结果表明:愈伤组织诱导的最适外植体类型为真叶和子叶;最适的愈伤组织诱导培养基为MS+6-BA 1 mg/L+IAA 0.5 mg/L;初展期子叶或日龄为10 d的子叶,愈伤组织诱导效果最好,诱导率高达100%;在半固体培养方式下的愈伤组织诱导率最高。

关键词：辣椒,愈伤组织,离体培养,子叶

参考文献

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辣椒愈伤组织诱导 篇2

通过不同外植体、基本培养基、暗培养、激素对小红参愈伤组织诱导和分化的试验研究,结果表明诱导小红参愈伤组织产生的最佳条件为:以真叶和顶芽(或侧芽)为外植体,在MS+BA 0.2 mg/L+NAA 3.0mg/L培养基上,进行暗培养,愈伤诱导率达95%.芽形成的`愈伤组织组织在MS+BA 5.0+NAA 1.5～2.0中均能分化出幼苗,分化率达100%,但叶形成的愈伤组织未能分化出苗.

作 者：罗春梅 邱璐 杨清辉 萧凤回 刘爱民 LUO Chun-mei QIU Lu YANG Qing-hui XIAO Feng-hui LIU Ai-min  作者单位：罗春梅,刘爱民,LUO Chun-mei,LIU Ai-min(云南省楚雄农业学校,楚雄,675000)

邱璐,QIU Lu(云南省楚雄师范学院,楚雄,675000)

杨清辉,萧凤回,YANG Qing-hui,XIAO Feng-hui(云南农业大学农学院,昆明,650201)

刊 名：华中农业大学学报  ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF HUAZHONG AGRICULTURAL UNIVERSITY 年，卷(期)：2006 25(2) 分类号：Q943.1 S572 关键词：小红参   组织培养   愈伤组织   不定芽  

金银花愈伤组织的诱导 篇3

关键词：愈伤组织；金银花；组织培养；诱导培养基；配方；IAA；NAA；6-BA；最佳浓度

中图分类号： S567.7+90.43 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）03-0038-03

金银花（Lonicera japonica Thunb）别称银花、双花、忍冬、二宝花，是忍冬科忍冬属多年生半常绿木质藤本植物[1-2]。金银花单叶对生，叶片卵形或长卵形，两面被柔毛；每叶腋内由二花组成一小聚伞花序，花两侧对称，花冠唇形，初开时为白色，2～3 d后变成金黄色，故名金银花[3]，花期为4—6月。金银花喜温暖湿润气候，适应性比较强，对土壤要求不严，耐寒、耐旱、耐涝，除东北、西北等高寒、干旱地区和海南外，全国各地均有分布。金银花全草均可入药，其主要药用成分是绿原酸和异绿原酸，具有清热解毒、除火、消炎等多种功效，主治温病、风热感冒、咽喉肿痛、痛肿溃疡、痢疾、丹毒、肺炎等症[4]。金银花的花蕾含有挥发性芳香油、皂苷、绿原酸、肌醇和黄酮类化合物等，还含有肉桂酸、茉莉醛、橙花醇等；其茎中含有生物碱；其叶中含有忍冬苷、忍冬素和木樨素等。根据药理研究，金银花对大肠杆菌、痢疾杆菌、葡萄球菌和肺炎双球菌等有抑制作用[5-6]，是我国著名的豫产道地中药材之一。尤其是在2003年的“非典”时期，以金银花为重要成分的中草药对“非典”的预防作用十分显著。金银花除了作为用途广泛的中药材外，还具有良好的保健作用。此外，金银花茶香气宜人，对防治盛夏中暑、风热感冒、上呼吸道感染和肠胃疾病有良好的效果，可以制作饮料。尤其是对清除人体自由基、提高人体免疫机能和延缓衰老等具有良好的作用，因而也是高血压和心血管系统患者降低胆固醇的保健佳品。金银花花开清香宜人，黄白相间，繁华密布，也是优良园林绿化植物。目前，金银花仍采用传统的扦插和压条2种繁育方式[7]，但这些传统的繁殖方式繁殖速度慢、繁殖系数低，繁殖的苗木规格不一，商品化程度不高，不能满足金银花优良品种迅速推广种植的需要，因此，如何提高其繁殖速度，增加繁殖系数，并使其迅速推广种植已成为金银花生产中亟待解决的一个重要问题。而国内外对金银花的研究多集中在栽培、管理、加工、药理、制剂等方面，关于其组织培养、离体快繁的研究[8-9]却报道得极少，仅见有凤爪金银花[10]和蒙花1、2号金银花[11]的组培报道，但封丘金银花组培还未见有报道。本试验以新乡学院校园内的封丘金银花品种的叶片为外植体，在不同浓度的MS培养基上进行愈伤组织诱导，通过对照不同的激素组合，以探索金银花的愈伤组织诱导的最佳条件，为金银花的快速繁殖和充分利用打下良好基础。

1 材料与方法

1.1 材料选择

从新乡学院校园内采集健壮的封丘金银花幼茎，剪取叶片为外植体进行培养。取材时间为3月中旬至4月下旬。

1.2 试验方法

1.2.1 配制培养基

试验以MS培养基为基本培养基，以不同的生长调节物质浓度组合共设计采用了50组愈伤组织诱导培养基M1～M50：MS+（0.1～1.5） mg/L IAA/NAA+（0.1～2.0） mg/L 6-BA（表1），每组做3个对照。所有培养基均添加3%蔗糖、0.65%琼脂，调至pH值至5.8，分装于培养瓶内，每瓶25 mL，封口后在121 ℃条件下灭菌20 min，并且将重蒸水、镊子、打孔器、滤纸用聚丙烯薄膜包装后一并灭菌[12]。待培养基冷凝后，放入超净工作台，紫外线表面灭菌 1 h，准备接种。

1.2.2 获得无菌材料

取新鲜的叶片，先用流水冲洗 30 min，然后放到超净工作台上，用75%乙醇灭菌30 s，无菌水冲洗4次，再用0.1% HgCl2灭菌8 min，无菌水冲洗4次[13-14]，用无菌滤纸吸干材料表面的水分。

1.2.3 愈伤组织的诱导

用打孔器将材料切成大小均匀的若干小圆片，将材料接种在M1～M50培养基上，先经暗培养24 h，然后置于25 ℃培养箱中培养。

2 结果与分析

2.1 培养接种30 d后的观察结果

以叶片为外植体，叶片切口处有膨大现象最早是第6天，10 d后大多数成活叶片切口处均有膨大的现象，14 d后有白色颗粒状的愈伤组织出现。这与赵慧贤等的组培报道中以叶片为外植体的形成时间[15]略有差异，这可能与金银花的品种不一样有关。

从愈伤组织组数观察结果（表2）中可以计算出，在愈伤组织在形成过程中，150瓶培养瓶中污染率为6.00%，死亡率为18.67%，诱导率为76.99%（诱导率为诱导数除以除去污染数和死亡数的接种总数）。

2.2 不同浓度的生长素对愈伤组织诱导的效果

试验结果（表3、表4）表明，IAA和NAA都是在0.5～1.0 mg/L 的浓度范围内诱导效果较好。其中又以NAA 浓度为1.0 mg/L 时效果最好，诱导率最高，达91.67%。随着 1.0 mg/L 浓度升高诱导率下降；当浓度低于0.5 mg/L 时，诱导效果也欠佳。IAA浓度为1.0 mg/L时诱导率也较高，达到88.89%。这与刘连芬等的组培报道中金银花愈伤组织形成的最佳生长素浓度结果[16]基本一致。

2.3 不同濃度的细胞分裂素对愈伤组织诱导的效果

试验结果（表5、表6）表明，生长素为IAA或者NAA的情况下，6-BA都是在1.5 mg/L的浓度诱导效果较好，诱导率高达100%。

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2.4 不同生长素/细胞分裂素组合对愈伤组织诱导的效果

接种14 d后，叶片外植体開始变绿且变厚，接触到培养基的外植体表面长出米粒状的白色愈伤组织。30 d后，叶片愈伤组织以深褐色和淡黄色为主，深褐色的愈伤组织结构紧密，质地较硬，呈不透明状；淡黄色的愈伤组织结构松散，质地松软，呈透明状。对比发现M3、M8、M15、M16、M17、M19、M22、M24、M29、M31、M34、M39、M42、M44、M47、M49效果较好（表7），生长速度快且愈伤组织多，其中又以M44（MS+15 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA）效果最好。因此较理想的金银花愈伤组织诱导培养基配方是MS+1.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA。

3 讨论

本试验中叶片的污染率（6.00%）较高，可能是因为叶片与空气接触的时间较长，被空气中的微生物侵染的几率较大，也可能是因为在灭菌过程中，灭菌剂浓度较低或者灭菌时间较短；死亡率（18.67%）较高，这可能是因为叶片脱毒时操作时间过长对叶片组织破坏，也可能是因为接种时镊子在酒精灯上烤烧的时间过长，冷却较慢，容易烫伤叶片。试验观察到的2种不同状态的愈伤组织，哪一种更适合做传代培养[17]，这还需要进一步研究。此外，因试验条件和试验时间的限制，本试验接种组数较少，故其数据不具有普遍推广意义。

参考文献：

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辣椒愈伤组织再生体系研究进展 篇4

1 基因型的影响

基因型是影响辣椒愈伤组织诱导与植株再生的一个重要因素, 不同品种之间愈伤诱导率及其再生率有显著差异[6]。罗素兰等[7]选用4种不同的辣椒进行再生体系的研究, 结果表明不同品种的分化频率有所不同, 最高为83%, 而最低的仅为67%;龙凤等[8]选取9个辣椒品种的子叶、下胚轴接种于芽诱导分化培养基, 结果显示不同品种间分化频率差别较大, 变化范围为50%~90%, 说明辣椒不定芽诱导分化率具有明显的基因型依赖性。

2 外植体的影响

选用不同的外植体, 在愈伤诱导、不定芽的分化以及不定芽生根等各个阶段所得出的结果就有很大差异, 如辣椒的子叶、茎尖、上胚轴、下胚轴、真叶、花药等均可用于愈伤组织的诱导, 但结果却有很大不同。王旭英等[9]以彩色辣椒茎尖、子叶、上胚轴、下胚轴为外植体进行离体培养, 发现在诱导愈伤时, 不同外植体愈伤组织的诱导率不同, 子叶最高为95%, 其他的依次为茎尖、上胚轴、下胚轴;张春芬等[10]同时报道下胚轴和真叶有诱导形成不定根的现象。柳建军等[11]认为带柄子叶的分化显著优于子叶和下胚轴;但崔群香等[12]对试验综合成苗系数与诱导频率进行研究, 认为去根和子叶的苗尖更有利于彩色辣椒离体再生成功。

3 植物生长调节剂的影响

在辣椒组织培养中, 常用植物生长调节剂有IAA、6-BA、NAA、GA3、2, 4-D、ZT、KT、IBA等。在各个不同的培养阶段, 所用的植物生长调节剂种类和植物生长调节剂组合各有不同。辣椒诱导愈伤时, 植物生长调节剂通常选用2, 4-D与细胞分裂素配合使用或细胞分裂素与NAA配合使用, 而在分化培养时, 一般采用细胞分裂素与IAA配合使用, 同时发现添加一定量的AgNO3有利于提高不定芽的分化频率。

3.1 愈伤组织的诱导

合适的激素浓度配比对于诱导产生较好的愈伤组织及其随后的分化至关重要[13]。各种植物生长调节剂组合均能不同程度地诱导出愈伤组织, 但诱导效率和愈伤组织的质量不同。高浓度的2, 4-D最易诱导愈伤组织, 但愈伤组织质地疏松透明, 不能分化芽[8]。这一观点也得到了董兆龙等[14]的证实。李永文等[2]采用不同激素组合对彩色辣椒子叶愈伤组织诱导, 发现单用6-BA比6-BA与NAA配合使用效果要好;王迅等[15]用6-BA、KT、IAA等3种激素设置12种配比, 发现都能诱导愈伤, 但6-BA的效果比KT普遍要好;罗素兰等[7]报道, 当IAA和NAA的质量浓度为1.0、2.0、3.0 mg/L, 而6-BA质量浓度为0.1、0.5、1.0 mg/L时, 子叶外植体只形成愈伤组织, 且伴随生根现象, 但随着6-BA浓度的升高和IAA、NAA浓度的降低, 不定芽分化频率增高, 愈伤组织产生减少。

3.2 愈伤组织的分化

在辣椒愈伤组织分化的过程中, Sadhana等[16]发现6-BA是重要的激素之一;唐亮等[17]认为6-BA在一定范围内 (0~5 mg/L) 浓度越大越有利于诱导分化, 同时配以IAA、NAA、ZT等激素效果更好;Sanatombi等[18]也得出芽的最适培养基为MS+6-BA 8.8μmoL/L+IAA 11.4μmoL/L。李英慧等[19]对不同含量的6-BA、ZT、KT等细胞分裂素对辣椒子叶再生频率的影响进行分析, 结果表明6-BA的诱导效果最好, ZT次之, KT基本上不能诱导不定芽。何晓明等[20]的研究成果也是如此。研究者同时发现, 由2, 4-D诱导产生的愈伤在以后的芽分化培养基中不能产生不定芽, 且2, 4-D对不定芽的分化有明显的抑制作用[20]。在同一6-BA浓度下, 6-BA/IAA组合诱导不定芽的效果明显优于6-BA/NAA组合, 6-BA/IAA的浓度比为10∶1的培养基的分化率高于5∶1的培养基, 并得出最适不定芽诱导培养基为MS+6-BA 5 mg/L+IAA 0.5 mg/L[21], 这一结论也得到了孙丽萍[22]、龙凤等[8]的认可。

3.3 不定芽的伸长与生根

缪武等[23]报道辣椒离体培养的主要困难在于芽伸长的诱导, 在芽伸长培养基中添加2 mg/L的GA3可诱导芽的伸长, 但若在芽分化培养基上添加GA3, 则会抑制芽分化, 产生大量愈伤组织;姚明华等[24]也发现6-BA、GA3是不定芽生长的显著影响因子, 6-BA浓度的增加对不定芽的伸长有抑制作用, 当6-BA浓度为5 mg/L以上时, 不论GA3的浓度为多少, 不定芽块只有膨大现象;黄真池等[25]也发现除6-BA、GA3外, 适当增加IAA浓度可促进不定芽的伸长;汤银珠[26]认为2.0 mg/L ZT和2.0 mg/L 6-BA的配合使用能促进不定芽的伸长。张先云等[5]、谢立波等[27]都认为芽伸长的最佳培养基为MS+6-BA 5 mg/L+IAA 0.2 mg/L+GA32 mg/L+AgNO34 mg/L。不定芽的生根普遍认同在基本培养基中添加IAA、NAA即可。余小林等[28]、罗素兰等[7]研究发现, 生根最适培养基为MS+IAA 1 mg/L, 不定根的诱导率高达95%。张春芬等[10]发现相比不附加激素的1/2 MS培养基, 添加了0.1 mg/L、0.3mg/L IAA后, 生根时间缩短3~5 d且根长得粗壮, 若IAA浓度增加为0.5 mg/L时, 根系形成鸡爪根。敬国兴等[29]将不定芽转入1/2 MS+IAA 1 mg/L、NAA 0.5 mg/L的生根培养基, 不定根生根率达85%~100%, 而再生苗置于只添加1/2 MS+IAA 0.8~1.0 mg/L的培养基时, 根多而细长, 成活率低。

4 苗龄的影响

辣椒苗龄对再生频率也有很大影响。一般认为子叶离体培养的最适叶龄为12~16 d[30]。研究者[31]发现随着叶龄增加, 再生能力先升高后降低。柳建军等[32]认为无菌苗苗龄的大小, 对带柄子叶的分化再生能力有很大影响, 3 d的苗几乎不分化, 6~12 d的苗分化率较高, 苗龄达15 d的分化率明显降低, 且分化的芽数也少。罗素兰等[7]、姚明华等[24]、成善汉等[21]也认为12~14 d分化率最强。但周钟信等[33]以30 d叶龄子叶为外植体进行培养, 也获得再生植株, 而且芽分化率、移栽成活率均为100%。

5 AgNO3的影响

一些研究者发现在诱导芽分化时, 外植体切口易产生褐化现象, 从而使芽的诱导受影响, 添加一定浓度的AgNO3可以抑制褐变, 同时可以促进芽的分化。王迅等[15]的试验表明, 与未加硝酸银相比, 加入硝酸银能提高芽分化率的30%, 并大大缩短分化时间, 但他同时指出过高浓度的硝酸银会造成植株茎叶畸形, 最适浓度范围为3~4 mg/L;张先云等[5]的试验显示, 添加硝酸银后, 某些品种的分化率达到了100%。

6 其他因素的影响

辣椒组织培养通常在25℃、光照12~16 h/d、1 200~2 000 lx条件下进行。而进行培养所用的基础培养基大多数为MS培养基, 也有使用MB (MS无机盐+B5有机成分) 为基本培养基的。张先云等[5]的试验指出以真叶作为外植体进行再生体系的建立, 则MB培养基较为合适;黄真池等[25]以子叶为外植体也得到了同样的结论。此外, 余小林等[28]报道LY (氨基酸混合物) 添加物对分化有一定的促进作用, 效果比添加水解酪蛋白的效果好;李永文等[2]指出相比固体培养和液体静置培养, 半固体培养方式下愈伤组织出现早且诱导率高;黄丽华等[34]发现红光、白光有利于辣椒愈伤组织的形成, 蓝光、绿光对芽分化有抑制作用。

7 存在的问题及对策

自20世纪70年代用辣椒子叶和胚轴诱导出再生芽以及用辣椒花药培养获得单倍体植株以来, 辣椒离体培养技术有了很大的改进;离体培养技术的范围也在不断扩大, 但还是存在一定的问题。

7.1 基因型依赖性

辣椒通过愈伤组织再生途径获得再生植株虽已获得成功, 但不同品种及变种间的组织培养效果差别很大。不同基因型材料的子叶、下胚轴在离体培养条件下, 芽分化率在50%~90%不等[8]。可通过查阅前人的研究结论或是通过筛选较适宜离体培养的品种进行进一步试验研究, 以避免由基因型的影响引起的试验结果不理想。

7.2 褐化现象

据报道, 在辣椒诱导芽分化时, 外植体切口易产生褐化现象, 从而使芽的诱导受影响, 影响再生体系的建立。研究发现, 可通过添加一定浓度的AgNO3 (3~4 mg/L) 、VC、活性炭抑制褐变[30], 但高浓度的AgNO3也会导致畸形芽的形成, VC、活性炭对外植体的再生有一定的负面影响。

7.3 不定芽伸长困难

辣椒愈伤组织诱导 篇5

苦荞胚性愈伤组织诱导与植株再生研究

以苦荞子叶和下胚轴为外植体,进行了不同浓度激素组合的`MS和SH固体培养基对胚性愈伤组织诱导及植株再生的研究.结果发现,MS培养基比SH培养基更有利于胚性愈伤组织诱导;2,4-D是诱导愈伤组织的有效激素,KT能有效促进胚状体的形成;下胚轴和子叶都能有效诱导出胚性愈伤组织和再生植株.下胚轴在MS+1.5mg・L-1 2,4-D+1.5 mg・L-1BA培养基,子叶在MS+2 mg・L-12,4-D+0.5～1.5 mg・L-1 BA上能高效诱导出愈伤组织;愈伤组织在MS+2 mg・L-1 2,4-D+0.1 mg・L-1 KT培养基中继代,能有效诱导胚性愈伤组织;来自下胚轴的胚性愈伤组织在1/2 MS+2.0 mg・L-1 BA+0.5 mg・L-1 KT+0.1 mg・L-1 NAA培养基上能够高频再生出芽,来自子叶的胚性愈伤组织在1/2 MS+1.0 mg・L-1 BA+0.1 mg・L-1KT+0.1 mg・L-1 NAA培养基上芽诱导率较高;MS+1 mg・L-1NAA是适宜的再生苗生根培养基.

作 者：李占旗 徐子勤 LI Zhan-qi XU Zi-qin 作者单位：西北大学,生命科学学院,西安,710069刊 名：西北植物学报 ISTIC PKU英文刊名：ACTA BOTANICA BOREALI-OCCIDENTALIA SINICA年，卷(期)：26(6)分类号：Q813.1 S517关键词：苦荞 下胚轴 子叶 胚性愈伤组织 植株再生

辣椒愈伤组织诱导 篇6

关键词：三叶木通；愈伤组织；分化

中图分类号：S567.904.3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）07-0050-03

三叶木通[Akebia trifoliata （Thunb.） Koidz]是木通科（Lardizabalaceae）木通属（Akebia）的一种果实营养价值较高的半落叶藤本野生果树[1]，别称八月瓜、八月扎、炸瓜。主要分布于中国甘肃南部、陕西南部，湖南、湖北、山西、河南等地也有少量分布[2]。研究发现，三叶木通种子脂肪酸含量较高，且主要以不饱和脂肪酸为主[3]；果实味美、营养丰富，蛋白质、氨基酸、可溶性糖、有机酸和矿物质含量也很高，被誉为果中之王[4]，具有较高的经济价值和开发价值。三叶木通是中国传统中药，有清心火、利小便、通经下乳作用[5]。近年来，国内学者对三叶木通的研究主要集中在药用成分分析以及扦插栽培等方面[6-7]，组织培养方面研究较少，目前，只有愈伤组织诱导的研究，且诱导率较低，尚无关于三叶木通愈伤组织分化成苗的相关报道。本试验对三叶木通下胚轴愈伤组织诱导及分化进行了研究，研究不同生长调节剂种类、浓度组合对三叶木通下胚轴再生的影响，以期建立三叶木通下胚轴高效离体再生体系，为其遗传转化体系的建立奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

三叶木通种子由湖南怀化种植基地提供。

1.2 方法

1.2.1 无菌外植体的获取 挑选富有光泽、饱满的种子，置于超净工作台内，无菌水浸泡24 h，使其充分膨胀。75%的乙醇浸泡30 s，无菌水冲洗3次，0.1%的氯化汞浸泡10 min，无菌水冲洗3次，置于无菌滤纸上吸干多余水分，用解剖针划开种皮，将胚取出，分别接种于MS培养基、1/2 MS培养基、MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L和1/2 MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L培养基中诱导种子萌发，24 h光照培养7 d，统计试验结果。

1.2.2 愈伤组织诱导培养基的筛选 切取长度约为5 mm的三叶木通下胚轴，以MS为基本培养基，选用3因素3水平正交试验设计L9（33）方案，观察2，4-D、NAA、KT 3种植物激素的浓度及配比对愈伤组织诱导的影响（黑暗培养），每瓶接5个材料，每组处理10瓶，40 d后统计愈伤组织诱导结果。

1.2.3 光照对愈伤组织诱导影响及抗褐化剂的筛选 切取长度约为5 mm的下胚轴，接种于MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L中，分别进行黑暗、光照、黑暗20 d再光照 20 d 3种处理方案培养，定期观察并记录生长情况，40 d后统计试验结果。将约5 mm大小的外植体接种于愈伤诱导培养基MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L中，分别添加维生素C 10、20、50 mg/L，AC（活性炭）0.5、0.8、1.0 g/L，PVP（聚乙烯吡咯烷酮）0.6、0.8、1.0 g/L的抗氧化剂和吸附剂，以不添加任何抗褐化剂和吸附剂作为空白对照，黑暗处理，40 d后统计愈伤组织的褐化程度及生长状态。

1.2.4 愈伤组织分化培养基的筛选 将长势较好的愈伤组织转移于培养基：（1） MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVP 0.6 g/L；（2） MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA0.2 mg/L+PVP 0.6 g/L；（3） MS+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVP 0.6 g/L；（4） MS+TDZ 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVP 0.6 g/L，每瓶接5个材料，每个处理重复10瓶。黑暗处理 10 d 后，光照培养，50 d后分别观察并记录愈伤组织分化结果。

1.2.5 培养条件 培养基pH值为5.8～5.9，琼脂8 g/L，蔗糖30 g/L，培养温度（24±1） ℃，培养室湿度为60%～70%，光照时间为24 h/d（黑暗处理及光照试验除外），光照度为1 200～1 500 lx。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对无菌外植体获得的影响

观察发现，3 d后接種在MS和1/2MS培养基中的种胚变绿且子叶张开，下胚轴开始伸长；另外2组培养基几乎没有变化。7 d后不同培养基中的下胚轴长度存在差异，子叶形态也不同（表1）。接种于MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L和1/2 MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L培养基中的种胚不能形成健壮幼苗，发育畸形。因此，将MS培养基作为获得外植体的最佳培养基。

2.2 愈伤组织诱导培养基的选择

观察发现，接种7 d左右下胚轴两端切口处开始膨大，40 d 后愈伤组织形成，愈伤组织诱导结果见表2。当激素配比为2，4-D 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L时，愈伤诱导率最高，为96.5%。为进一步观察各控制变量是否对观测变量产生影响，利用SPSS软件进行多因素多水平的方差分析，结果见表3。

由表3可知，2，4-D、NAA 2个因素对愈伤组织诱导率的影响都极为显著，KT则不显著。即2，4-D、NAA 2种激素的3种浓度处理间差异均为显著；KT的3种浓度处理间差异不显著。为了筛选2，4-D、NAA的最佳浓度，对2因素进行Duncan检验，结果见表4、表5。

nlc202309041633

2.2.1 2，4-D 3个浓度水平的Duncan检验 多重分析比较结果见表4，2，4-D 3个浓度间差异显著；2.4-D 3.0 mg/L与 4.0 mg/L 差异极显著，就平均值来看2，4-D 2.0 mg/L的诱导平均值最高，因此，确定三叶木通下胚轴愈伤组织诱导适宜的2，4-D浓度为2.0 mg/L。

2.2.2 NAA 3个浓度水平的Duncan检验 多重分析比较结果见表5，NAA的3个浓度间差异显著；而NAA 0.2 mg/L与 06 mg/L 间差异极显著。 就平均值来看， NAA 0.2 mg/L 平

均值最高，因此，确定三叶木通下胚轴愈伤组织诱导适宜的NAA浓度为0.2 mg/L。

试验结果表明，2，4-D、NAA 2种植物激素及其配比对愈伤组织的诱导率有极显著影响，当2，4-D浓度为2.0 mg/L，NAA浓度为0.2 mg/L时愈伤组织诱导率最高。

2.3 光照时间及不同抗褐化剂对愈伤组织的影响

试验结果表明，黑暗处理条件下愈伤组织诱导率最高，且生长状态好，呈浅黄色；光照条件下的愈伤组织褐化率高达100%，愈伤组织呈深褐色；黑暗20 d再光照20 d培养的愈伤组织开始时呈浅黄色，当进行光照培养5 d后观察到约40%愈伤组织开始慢慢变成褐色，20 d后愈伤组织的褐化率高达60%。表明黑暗条件下培养可很大程度上降低三叶木通的褐化。不同抗褐化剂对愈伤组织的影响见表6。

常用抗氧化剂维生素C 及吸附剂AC 并没有起到很好的抗褐化作用，而PVP 0.6 g/L对防止褐化有相对较好作用，本结果与刘香在超声对三叶木通叶片愈伤组织生长及代谢影响得出的结论[8]一致。

2.4 愈伤组织分化培养基的筛选

将愈伤组织接种于培养基后，定期观察分化情况。培养30 d后观察到2号和4号培养基仍未分化且愈伤组织呈黑褐色，35 d后愈伤组织表面有芽点冒出。接种到1号和3号培养基的愈伤组织也有少量呈黑褐色，但已明显分化，呈团簇状。50 d后愈伤分化情况见表7。由表7可以看出，3号培养基MS+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVP 0.6 g/L的长势最好，芽分化程度最高，为适宜分化培养基，分化情况见图1。

3 结论与讨论

本试验中种胚接种于不同的培养基时下胚轴长度存在很大差异，在添加植物激素的培养基中下胚轴的长度较短，可能是由于外源激素与种胚本身内源激素相互作用抑制了生长。种胚接种于1/2 MS培养基中下胚轴长度也较短，可能是大量元素减半而导致种胚在萌发过程中大量元素不足的原因。

三叶木通中含有丰富的酚类物质，因此在愈伤组织培养过程中易发生褐化现象，从而影响培养的效果[9-11]，丰富的酚类物质还会在三叶木通果汁饮料的加工过程导致果汁色泽褐变[12]。光照对愈伤组织诱导过程中的褐化现象有着很强的诱导作用[13]。试验结果，PVP 0.6 g/L对防止褐化有着较好的作用，褐化程度明显降低，可能是与PVP吸附了酚类氧化物质有关。李然红等在甘蓝组织培养中也发现PVP对褐化抑制作用明显[14]。

在组织培养中，外植体的类型以及适当浓度配比的细胞分裂素和生长素都对愈伤组织形成有着很重要的影响[15-16]，本试验以下胚轴为外植体，通过正交设计筛选出适宜诱导愈伤组织的培养基为：MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L。沈国林等以三叶木通叶片为外植体，筛选出最适宜诱导愈伤组织的培养基为MS+2，4-D 4.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+KT 1.0 mg/L[5]，但愈伤诱导率只有87.5%，低于本研究的96.5%，且没有进行分化研究。

本试验在解决了三叶木通愈伤诱导及褐化问题后，利用得到的愈伤组织进行了分化的初步研究，筛选出适宜的分化培养基为MS+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVP 0.6 g/L，为后续快繁体系的建立奠定了基础。

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南丰蜜桔胚性愈伤组织的诱导 篇7

关键词：南丰蜜桔,胚性愈伤组织,花药离体培养,再生

南丰蜜桔是我国的地方良种, 素享“桔中贡品”之美誉 (胡正月等, 2005) 。它以肉质脆嫩化渣、风味浓甜、少核或无核而深受消费者喜爱。进入20世纪90年代后, 由于感染柑桔碎叶病毒等原因, 单产下降, 果实品质变劣, 发生了种性退化, 市场竞争力下降 (吴德喜等, 1990) 。因此, 应用生物技术手段培育无病毒苗木或改良品种就成为目前南丰蜜桔生产中亟待解决的问题。因此开展以离体培养为基础的生物技术育种研究显得尤为重要, 花培技术就是其重要途径。再者, 愈伤组织保存是柑桔种质资源保存的一条值得探索的途径, 具有节省人力、物力、财力以及避免自然灾害和病虫害等优点 (张俊娥和邓秀新, 2007) 。目前, 国外仅有意大利报道柑桔类花药组织培养再生出不定芽, 但其再生率很低 (Germana et al., 1998) ;国内尚未出现研究成功的报道, 笔者以花药为外植体, 建立南丰蜜桔的胚性细胞系, 为今后进行与其有关的原生质体融合, 转基因研究, 纯系二倍体和无核品种以及种质资源离体保存奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

以南丰蜜桔“杨小—26”为应试品种, 材料取自花蕾发育的各个时期, 并保持花粉无污染。

1.2 方法

1.2.1 材料预处理:

先低温预处理, 将花蕾放于

4℃冰箱72h后, 再振荡培养 (60转/min) , 消毒, 将花蕾接种于液体培养基, 振荡暗培养9d。

1.2.2 消毒:

整个花蕾于25%NaCl溶液中消毒20min, 无菌水冲洗3遍。

1.2.3

将预处理的试验材料剥离花药, 接种固体培养基中, 暗培养28d后, 进行光培养, 每20d继代1次。

1.2.4 培养基:

(1) MT+TDZ 30mg/L+A1.0 3.0mg/L+NAA 1.0mg/L+10mg/L AgNO3; (2) MT+TDZ3.0mg/L+A1.0 3.0mg/L+NAA 1.0mg/L; (3) SH+TDZ 30mg/L+A1.0 3.0mg/L+NAA 1.0mg/L+10mg/L AgNO3; (4) SH+TDZ 3.0mg/L+A1.0 3.0mg/L+NAA 1.0mg/L; (5) LP+TDZ 30mg/L+A1.0 3.0mg/L+NAA 1.0mg/L+10mg/L AgNO3; (6) LP+TDZ 3.0mg/L+A1.0 3.0mg/L+NAA 1.0mg/L。

愈伤组织培养基加蔗糖30g/L, 琼脂6g/L, 继代培养基加蔗糖50g/L。KT、AgNO3和A过滤灭菌。

1.3 培养条件

本文无特殊说明, 培养温度均为26℃, 光照3000Lx, 光周期为16h/d。

2 试验结果与分析

2.1 花药培养

2.1.1 愈伤组织形成。

预处理后的花药离体培养1周左右, 颜色开始由黄色变淡黄至黄褐色, 同时在花药中心线一侧出现淡褐色小点。2周左右某些花药颜色发亮, 经过l～2天, 发亮的花药从缢痕处生出小白点, 逐渐扩大体积, 颜色由白变淡黄或黄绿色 (图1) , 这就是愈伤组织绝大多数在20天左右形成愈伤组织, 从其外形看有紧实和疏松2种, 前者为黄绿色, 后者为黄白色。紧实型中又分表面光滑和不光滑两种。前者颜色较深, 在培养过程中慢慢老化死亡或不分化。后者生长旺盛分裂能力强, 分化能力强。而未经过预处理的花药无愈伤组织形成。

2.1.2

胚性愈伤组织形成, 愈伤组织鲜重达到30g时 (图2) , 继代培养60d, 有胚状体产生 (图3) , 再继代60d生出胚性愈伤组织 (图4) .

2.1.3 花粉发育时期与胚性愈伤组织形成。

只有单核靠边期的花药适于生长出愈伤组织和胚性愈伤组织。

2.1.4 培养基对胚性愈伤组织的影响。

由表1可以看出, 花药在6种培养基均可生出愈伤组织, 平均愈伤组织发生率均在80%以上, 培养基对愈伤组织再生无显著差异。培养基配方对胚性愈伤组织的生长有重要的作用, 1和2培养基上无胚性愈伤组织生长, 3、4、5和6培养基上有利于胚性愈伤组织生长, 5和6培养基较适于生长, 并且5和6培养基的胚性愈伤组织发生率显著高于3和4。培养基配方有否AgNO3对胚性愈伤组织生长无显著差异。

3 讨论

本研究发现, 取花药时的小孢子发育时期很关键, 这关系到是否能产生胚性愈伤组织。南丰蜜桔花药培养的最佳时期是单核靠边期, 而在大多数瓜类花药培养中, 选用的都是花粉单核靠边期 (董艳荣, 2002) (陈振光, 1995) 。

预处理包括离心、低温、高温和热激, 目的是从形态上改变极性分布, 从生理生化上改变细胞生理状态, 而改变其分裂方式和发育途径。本试验采用预处理是低温和震荡培养, “杨小26”的胚性愈伤组织发生率最高达20.3%, 验证了陈英等 (1997) 的研究结果。

本试验结果表明, MT培养基不适合花药组织培养, 这与柑桔类胚性愈伤组织研究结果不符 (张俊娥等, 2003) , 尚需试验进一步验证。LP和SH培养基适合做花药组织培养, 这为高硝态氮培养基较适合于木本果树离体再生研究提供一个佐证 (Khachatourian et al, .2002) 。笔者发现培养基配方中AgNO3对胚性愈伤组织生长无显著影响, 而谭祖国 (1998) 、李韬等 (1997) 分别将Ag NO3应用于红江橙、朋娜、纽贺尔、芦柑、雪柑的胚珠培养中, 克服了难获得胚性愈伤组织的难题, 获得了相应的胚性细胞系, 这或许因为离体器官不同所致。

参考文献

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陈振光.园艺植物离体培养学.中国农业出版社, 1995.23-25

董艳荣.甜瓜花药再生体系的基础研究.南京农业大学 (硕士论文) , 2002

胡正月罗省根胡冬英实施"金牌"战略提高南丰蜜橘含金量现代园艺2007.1

李韬, 芦柑、雪柑胚性愈伤组织的诱导[J].福建果树, 1997, (101) :11-12.

舒广平吴德喜.柑橘碎叶病毒生物鉴定研究.中国柑橘, 199019 (I) :47-49

谭祖国.红江橙原生质体分离培养以及植株再生的研究[D].江西农业科技, 1998, (4) :28-31.

谭祖国, 万蜀渊.朋娜和纽贺尔脐橙胚珠离体培养获得无病毒珠心苗方法研究[D].湖北农业科学, 1998, (4) :43-45.

龙脑樟愈伤组织诱导及增殖研究 篇8

右旋龙脑 (d-borneol) 又名天然冰片, 既是一种名贵中药材, 具有开窍醒神、清热止痛、抗菌消炎的功效[6], 又是高级香料, 同时还是重要的化工原料, 我国历来依靠从印尼等国进口[7]。现阶段, 我国对龙脑樟的开发利用也多以提取精油为主, 长期以来的过度采伐势必导致其资源的严重破坏, 尤其是优树资源趋于枯竭[8]。龙脑樟目前的繁育多采用常规的播种繁殖或扦插育苗, 但种子繁殖存在繁殖系数低、且易出现性状分离、后代个体间差异大及母树的优良性状难以保持等缺点、而扦插繁育易受母树枝条数和扦插季节等的限制, 且长期多代的扦插繁殖容易使其品质变差[9]。而采用组织培养技术不仅能解决该品种的繁殖困难, 且细胞培养还可用于批量生产天然龙脑, 为改变其天然资源枯竭状况及维护生态平衡, 具有重要的经济价值和生态效益。因此, 在前期研究的基础上, 本实验对龙脑樟愈伤组织诱导条件进行了初步探索

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料取自吉安市林业科学研究所龙脑樟采穗圃, 采集母树当年生、生长健壮、无病虫害的半木质化新梢。

1.2 试验方法

1.2.1 无菌外植体茎段获得及腋芽诱导。

将采集到的材料带回实验室内, 去掉叶片, 刷子蘸洗衣粉仔细刷洗枝条表面, 并切成长2~3㎝带有叶柄和芽心的茎段, 流水下冲洗10 min, 转入超净工作台[10], 用75%酒精浸泡10~30 s, 再用0.1%升汞添加吐温-20的消毒液剧烈振荡灭菌6~10 min, 无菌水清洗5次, 滤纸吸干表面水分, 接种到MS+BA 2.0 mg/L+NAA 0.1mg/L诱导腋芽萌发 (图1A) 。

图1 A.龙脑樟腋芽诱导;B.小叶愈伤组织诱导;C.愈伤组织增殖Fig.1 A.induction of axillary bud;B.callus induction of young leaf;C.callus proliferation

1.2.2 龙脑樟愈伤组织的诱导。

当腋芽萌发后, 切取腋芽上2~3片完全展开的小叶, 在叶背面沿与主脉垂直方向横切几刀, 但不切断, 叶背面朝下接种到以L4 (23) 正交试验设计方法配置的各愈伤组织诱导培养基。研究不同浓度BA (2、4 mg/L) 、NAA (0.1、0.5 mg/L) 和2, 4-D (0、2 mg/L) 对龙脑樟愈伤组织诱导的影响。

1.2.3 龙脑樟愈伤组织的增殖。

将诱导获得的愈伤组织转移到以MS为基本培养基并添加不同激素种类及浓度的培养基上, 研究不同浓度BA (2、4、5 mg/L) 、NAA (0.1、0.5 mg/L) 和2, 4-D (2 mg/L) 对龙脑樟愈伤组织继代增殖培养的影响。

1.3 生长条件

培养室光照强度2 000 lx, 光周期12 h/d, 温度25±1℃。愈伤组织诱导初期先黑暗培养7 d, 然后再置正常光照条件下培养。如无特殊说明, 各培养基均添加琼脂6.5 g/L, 蔗糖20 g/L, p H 5.8, 121℃高压灭菌20 min。

1.4 结果观察和数据分析

接种后对小叶形态变化和愈伤组织发生情况进行观察记录, 并用数码相机记录外植体各阶段的形态变化, 接种初期先黑暗培养7 d后置正常光照条件, 20 d后统计污染情况;污染率=污染外植体数/接种外植体总数。20 d后统计裸眼可见出愈叶片 (愈伤组织大于2 mm以上的小叶数量) 并计算愈伤组织诱导率;愈伤组织诱导率=生成愈伤组织的外植体数/接种外植体总数。培养30 d左右, 龙脑樟的愈伤组织在不同继代培养基上的生长情况, 包括颜色和生长速度 (根据愈伤组织块的大小将愈伤组织生长速度划分为快速生长、较快生长和缓慢生长3类) 。每个试验处理接种15~20个外植体, 重复3次;应用Excel 2003进行数据处理, 采用SPSS 13.0进行数据的差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同消毒时间对外植体灭菌效果的影响

设计3种不同的消毒时间, 对龙脑樟外植体进行灭菌效果研究 (表1) 。结果表明:灭菌时间越短, 污染率越高;随着灭菌时间的延长, 污染率降低。灭菌时间在8~10 min的外植体平均污染率明显比6 min的低, 显著性检验表明, 灭菌时间在10 min与6 min间的污染率差异达到显著水平。结合不同消毒时间对平均污染率的影响, 结果表明龙脑樟外植体的最佳消毒时间为10 min, 污染率可控制在25%以内。

注:同列字母不同, 表示差异显著 (P<0.05) 。

2.2 不同因素对龙脑樟愈伤组织诱导的影响

腋芽小叶在接种后1周左右开始出现皱褶, 叶边缘向远轴面卷曲翘起, 叶片变硬变脆, 随后切口及叶柄略微膨大, 并逐渐有少量白色愈伤组织形成;为白色的颗粒、细小、质地较疏松、生长旺盛, 愈伤组织多发生在叶柄以及叶脉切口处 (图1B) 。

由表2可以看出, 在供试的4种培养基中, 除了处理2, 其他都可以使叶片诱导出愈伤组织, 最高诱导率达72.7%。极差分析 (KR) 结果表明NAA对愈伤组织诱导的影响最大, 2, 4-D次之, BA的作用最小。从不同植物生长调节剂浓度水平 (k1、k2) 来看, NAA浓度由0.1 mg/L增加到0.5 mg/L, 使龙脑樟愈伤组织诱导率变为原来的33.90%, 而培养基中添加2.0 mg/L 2, 4-D可使平均诱导率由58.4%下降到28.8%, BA浓度从2.0 mg/L增加到4.0 mg/L, 诱导率提高39.84%, 说明2, 4-D对龙脑樟愈伤组织诱导起抑制效应, 而较高浓度的NAA也不利于愈伤组织诱导。综合各因素最优水平, 龙脑樟腋芽小叶愈伤组织诱导较佳培养基组合为MS+BA 4.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。

注:K为各指标因素水平之和, k为各指标因素水平均值, R为各因素水平极差。

2.3 不同培养基对龙脑樟愈伤组织增殖的影响

将上述诱导获得的愈伤组织转移到表3各培养基进行继代增殖培养, 4周后龙脑樟愈伤组织在添加2, 4-D的培养基上完全褐化死亡;在较低的植物生长调节剂 (BA和NAA) 浓度培养基中, 龙脑樟愈伤组织生长较缓慢;而采用较高浓度的BA和NAA组合对龙脑樟愈伤组织增殖效果较好。因此, 本研究筛选出龙脑樟愈伤组织增殖较佳培养基组合为:MS+BA 5.0mg/L+NAA 0.5 mg/L (图1C) 。

注:-:死亡;+:缓慢生长;++:生长较快;+++:快速生长。

3 讨论与小结

陈美兰等[2]采用GC对叶和茎诱导出的愈伤组织进行右旋龙脑的含量测定, 发现茎诱导出的愈伤组织不含右旋龙脑, 并建议生产中以产生龙脑为目的的愈伤组织诱导宜以龙脑樟的嫩叶为外植体为佳。在本试验条件下, 以腋芽小叶为外植体材料成功获得了龙脑樟愈伤组织并进行了大量增殖。

虽然添加适宜浓度的2, 4-D可使多种植物成功诱导出愈伤组织, 但本研究过程中发现2, 4-D对龙脑樟愈伤组织诱导起抑制效应, 这与陈美兰等[2]的结果有所不同, 可能与外植体的状态有关;而适宜浓度的NAA和6-BA配合使用, 可促龙脑樟腋芽小叶出愈率和出愈量增加, 而且诱导出的愈伤组织生活力旺盛, 可以多次继代保存 (表2、表3) 。龙脑樟愈伤组织在诱导及继代培养过程中易产生褐化现象而使细胞死亡, 除了通常采用的添加抗褐化物质、降低培养基无机盐浓度、缩短继代培养时间等, 环境因子特别是光照确实对植物愈伤组织的生长发育和形态构成具有一定的调控作用[11]。此外, 相比于固体培养, 细胞悬浮培养能加快细胞增殖速度, 通过大规模培养, 可提供大量均匀一致的细胞培养物[12]。因此, 针对目前市场上右旋龙脑非常紧缺这种境况, 筛选出右旋龙脑含量相对最高的愈伤组织, 建立龙脑樟愈伤组织细胞悬浮培养体系是下一步研究的重点。

本文通过龙脑樟优良单株嫩茎诱导出腋芽、再以腋芽的小叶为外植体, 通过添加不同种类及浓度的植物生长调节物质进行愈伤组织的诱导及增殖培养等过程。其技术路线为:将外植体茎段接种于MS+BA2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L诱导腋芽萌发, 取腋芽小叶接种于MS+BA 4.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L进行愈伤组织的诱导, 将获得的愈伤组织转入增殖培养基MS+BA 5.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L进行多次继代增殖培养。

本研究为龙脑樟以及其他樟树品种高效愈伤组织的诱导和增殖培养提供了一种思路和技术途径。

摘要：以龙脑樟的茎段作为外植体, 进行腋芽的诱导获得无菌苗, 继而腋芽小叶被用于愈伤组织的诱导并进行增殖培养。结果表明外植体适宜的灭菌方法为:0.1%升汞灭菌10 min, 污染率为21.6%;腋芽小叶愈伤组织诱导最佳培养基配方为:MS+BA 4.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L, 诱导率可达72.7%, 较佳增殖培养基组合为:MS+BA 5.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L。

关键词：龙脑樟,愈伤组织,诱导,增殖

参考文献

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蒲公英愈伤组织诱导条件的研究 篇9

1 材料和方法

1.1 实验材料

本实验所用的蒲公英种子采自黑河学院校园。

1.2 实验步骤

选取生长状态良好的蒲公英种子苗的幼嫩叶片为外植体, 经过常规消毒后 (70%酒精表面灭菌30s、0.1%Hg Cl2溶液振荡3min, 无菌水冲洗4次) , 接种到愈伤组织诱导培养基中。

1.3 愈伤组织诱导

为了得到最佳诱导培养基, 40块为一组, 外植体接种到四种不同的培养基 (见表1) 以诱导愈伤组织, p H为5.8。

整个组培过程中培养条件为25±1℃条件下, 光照强度1500-2000Lx、光照时间为14h/天的条件下培养。暗培养4周。

2 结果与分析

将蒲公英叶片切块接种到愈伤组织诱导培养基上以后, 4-5天后叶片切段开始膨胀, 最快8天后就可见到切口处长出愈伤组织, 以后半个月内都可陆续见到愈伤组织的产生。在MS4的所有诱导培养基中, 均可诱导出愈伤组织, 诱导率达到85%, 且绝大多数愈伤组织状态、长势良好, 呈比较湿润的嫩黄色颗粒状;其他三种诱导培养基中, 愈伤组织发生率较低。

3 结束语

蒲公英的组织培养工作已有报道, 但真正系统的研究并不多见。Song[6]等 (1991) 以MS+0.2mg/LIAA+1mg/LTDZ为培养基, 以叶柄为外植体对蒲公英 (Taraxacum mongolicum Hand-Mazz) 进行组织培养, 建立了快速高效的再生系统。陈华等[7]将药用蒲公英 (Taraxacum officinale F.H.Wigg) 叶片接种于上述培养基上, 也取得了十分理想的结果。

文章的研究结果表明6-BA加适量的NAA对蒲公英愈伤组织的诱导和愈伤组织在继代培养过程中分化能力的保持具有重要的作用。愈伤组织诱导时, 需要相对较高浓度的6-BA和相对浓度高一点的NAA, 而在继代培养和分化诱导时则需降低培养基中6-BA和NAA的浓度。

摘要：以蒲公英幼嫩叶片为外植体, 以MS为基本培养基, 通过添加不同配比的6-BA、NAA、2, 4-D植物激素, 探讨外植体愈伤组织的诱导。研究结果表明:叶片在含0.2mg/LNAA和2mg/L6-BA的MS培养基中培养20天后形成明显的愈伤组织, 诱导率达到86.6%, 且绝大多数愈伤组织状态、长势良好, 呈比较湿润的嫩黄色颗粒状。

关键词：碱地蒲公英,愈伤组织,诱导

参考文献

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5种紫花苜蓿愈伤组织诱导研究 篇10

苜蓿生物技术的应用研究, 国际上始于20世纪60年代末。70年代初, 国外就从苜蓿的愈伤组织成功诱导出了植株, 这一成果成为组织培养技术在苜蓿研究上的里程碑。苜蓿的组织培养最早见于美国科学家Saunders等[4]关于陇东苜蓿的报道, 他们采用的外植体包括花药、胚珠、子叶和胚轴, 首先采用含有2.0mg/L的2, 4-二氯苯氧乙酸 (2, 4-D) 、萘乙酸 (NAA) 和激动素 (KT) 的改良培养基, 使上述器官产生愈伤组织。Bingham等[5]随后发现了生长调节剂对愈伤组织芽分化的影响, 并强调了2, 4-D在愈伤诱导中的效应。也有学者指出诱导培养基上高浓度的2, 4-D和低浓度的KT, 能使产生的愈伤组织转移到再生培养基上后产生大量的无根苗。相反, 在低浓度2, 4-D、高浓度KT的诱导培养基上产生的愈伤组织, 当转移到再生培养基上时则形成了大量的根[6]。我国的苜蓿生物技术研究始于20世纪80年代初, 1981年中国科学院植物生理研究所杨燮荣等[7]首次利用紫花苜蓿叶片、叶柄和茎段为外植体, 采用MS+2, 4-D的培养基成功诱导出了愈伤组织, 并分化出苗, 经过180 d, 获得了苜蓿的再生植株。1985年, 中国农业科学院畜牧研究所的李聪等[8]利用植物细胞组织培养技术, 进行了苜蓿抗盐的细胞筛选, 获得了耐盐细胞系和再生植株, 并从中筛选出耐盐植株。在苜蓿的原生质体培养方面, 1982年中国科学院遗传研究所李望丰等[9]从苜蓿原生质体再生植株成功。1989年中国科学院遗传研究所黄绍兴等[10]成功将GUS基因整合到紫花苜蓿的核基因组上, 并得到了表达。2000年, 吕德扬等[11]得到了苜蓿高含硫氨基酸蛋白转基因植株。

对于苜蓿组织培养的研究, 20世纪70年代以来取得了较多的成果。除上面提到的Saunders等[4]外, 王瑞云等[12]通过调节2, 4-D浓度, 以7个品种子叶为外植体进行的愈伤组织诱导研究。时永杰等[13]对苜蓿子叶、下胚轴、茎、叶、花序、子房、花药等进行离体培养, 并诱导分化成苗。王姝杰等[14]通过调节2, 4-D和KT浓度, 以阿尔贡奎因紫花苜蓿下胚轴为外植体进行愈伤诱导的研究。在诸多再生体系建立和育苗试验中, 愈伤诱导是必要的前期工作。因此, 本研究进行了紫花苜蓿的愈伤组织诱导, 以期为建立紫花苜蓿高频再生组织培养体系提供依据。

1材料与方法

1.1供试材料

1) 紫花苜蓿品种。甘农1号紫花苜蓿、新疆大叶紫花苜蓿、阿尔冈金紫花苜蓿、陇中紫花苜蓿和公农1号紫花苜蓿, 取其无菌苗的下胚轴和子叶。

2) 培养基。添加了2, 4-D和6-苄基氨基嘌呤 (6-BA) 2种激素的MS培养基[15]。

1.2试验设计

以甘农1号紫花苜蓿、新疆大叶紫花苜蓿、阿尔冈金紫花苜蓿、陇中紫花苜蓿及公农1号紫花苜蓿的下胚轴和子叶为外植体, 研究了MSA2、MSB2和MSC23种培养基对愈伤组织诱导的影响。此试验为3因素 (品种、外植体和培养基) 不等水平试验, 共设30个处理, 每个处理重复3次。

1.3外植体来源

1) 挑选饱满的种子 (每个品种约180粒) , 在流水下冲洗30 min, 用70%酒精振荡1 min, 放入0.1%升汞溶液中振荡灭菌12～15 min, 再用无菌水冲洗3～5遍, 最后用灭菌滤纸吸干水分, 备用。

2) 将灭好菌的种子接种到MS基础培养基 (所有培养基的pH值均为5.8) 中, 每个品种做6个重复 (6瓶) , 每个重复30粒种子, 在光周期为16 h/d、昼夜温度均为24℃的条件下培养[16]。

3) 2 d后开始统计发芽数, 共统计7 d, 计算发芽率。

4) 以培养7 d后无菌苗的子叶 (5 mm2) 和下胚轴 (3～5 mm) 切段为外植体, 进行愈伤组织的诱导[17]。

1.4培养基

根据《实用植物组织培养技术教程》[15]中母液配制方法配制母液。配制好的母液应分别贴好标签, 注明母液号、配制倍数、日期及配1 L培养基时应取的量。母液最好储存在2～7℃的冰箱中, 储存时间不宜过长, 无机盐母液最好在1个月内用完 (如发现有霉菌和沉淀产生, 就不能再使用) 。为防止各元素互相作用而产生沉淀, 在配制大量元素的母液时, Mg SO4·7H2O和Ca Cl2·2H2O需要单溶, 微量元素中Co Cl2·6H2O和CuSO4·5H2O一起溶, 其他元素溶解在一起;在配制维生素的母液时, 肌醇需要单溶。

培养基采用MS培养基, 附加各种生长素和细胞分裂素, 使用时按浓度定量吸取。添加不同浓度的6-BA, 制成MSA2、MSB2和MSC23种培养基, 配方见表1。

1.5外植体愈伤组织的诱导

将5种紫花苜蓿的2种外植体分别放置在添加不同浓度6-BA的改良MS培养基中诱导愈伤, 每种培养基的每种外植体各诱导3皿, 每皿30块外植体。

在光周期为24 h的25℃恒温箱中培养, 15 d后统计下胚轴愈伤组织诱导情况;18 d后统计子叶愈伤组织诱导情况, 并记录生长状态。

1.6数据分析

采用SPSS软件对试验数据进行统计分析。

2结果与分析

2.1 5个品种发芽率的比较

甘农1号紫花苜蓿、新疆大叶紫花苜蓿、阿尔冈金紫花苜蓿、陇中紫花苜蓿和公农1号紫花苜蓿5个品种的发芽率的比较, 如表2所示。

%

注:同列不同小写字母数值间差异显著 (P<0.05) , 相同小写字母数值间差异不显著 (P>0.05) , 下同。

由表2可见, 阿尔冈金紫花苜蓿和甘农1号紫花苜蓿发芽率高, 且与其他品种差异显著 (P<0.05) , 其次是陇中紫花苜蓿、公农1号紫花苜蓿和新疆大叶紫花苜蓿。

2.2不同品种间愈伤诱导率的比较

甘农1号紫花苜蓿、新疆大叶紫花苜蓿、阿尔冈金紫花苜蓿、陇中紫花苜蓿和公农1号紫花苜蓿5个品种的愈伤诱导率 (简称出愈率) 的比较, 如表3所示。

注:出愈率=愈伤诱导数/接种外植体总数×100%, 下同。

由表3中对不同品种间愈伤诱导率进行的差异显著性检验可发现, 阿尔冈金紫花苜蓿与其他品种比较, 出愈率最高, 且差异显著 (P<0.05) ;其次是甘农1号紫花苜蓿、新疆大叶紫花苜蓿、公农1号紫花苜蓿和陇中紫花苜蓿, 且4个品种之间无显著性差异 (P>0.05) 。

2.3不同外植体间愈伤诱导率的比较

对不同外植体间愈伤诱导率进行差异显著性检验, 结果如表4所示。

由表4可见, 下胚轴与子叶的出愈率差异显著 (P<0.05) , 下胚轴的愈伤诱导率明显高于子叶。另外, 15 d后统计愈伤组织的出愈情况时, 下胚轴已明显诱导出愈伤组织, 子叶的愈伤组织出愈不明显, 说明下胚轴的愈伤诱导快于子叶;18 d后统计子叶的愈伤诱导情况, 发现子叶的愈伤组织色泽明显不如下胚轴, 说明下胚轴具有很强的脱分化能力。

2.4不同培养基对愈伤组织的影响

比较添加不同浓度6-BA的各处理对不同外植体 (下胚轴和子叶) 愈伤组织的影响, 分别如表5和6所示。

由表5可见, 在添加不同浓度6-BA的各处理中, 在MSB2培养基中培养的下胚轴愈伤组织的出愈率最高, 其次为MSA2, 但二者之间无显著性差异 (P>0.05) ;在MSC2培养基中培养的下胚轴愈伤组织的出愈率最低, 与MSB2和MSA2相比差异显著 (P<0.05) 。说明下胚轴最适合在添加6-BA浓度为0.5 mg/L的培养基中诱导。

由表6可见, 在添加不同浓度6-BA的各处理中, 在MSA2培养基中培养的子叶愈伤组织的出愈率最高, 其次为MSB2, 但二者之间无显著性差异 (P>0.05) ;在MSC2培养基中培养的子叶愈伤组织的出愈率最低, 与MSB2和MSA2相比差异显著 (P<0.05) 。说明子叶最适合在添加6-BA浓度为0.25mg/L的培养基中诱导。

2.5品种、外植体和培养基之间的交互作用

从表7可看出, 品种与培养基、品种与外植体之间以及三者之间P值均大于0.05, 说明品种与其他因素之间不存在交互作用;而不同培养基与不同外植体之间存在交互作用, 可进一步证明不同外植体在不同培养基上的出愈率是不同的。

3讨论

3.1无菌苗的选择

在无菌苗选材中, 阿尔冈金紫花苜蓿和甘农1号紫花苜蓿发芽率较高, 且与其他品种差异显著 (P<0.05) , 无菌苗的培养最好, 最适合用作愈伤组织培养的材料。

3.2最佳愈伤诱导品种

比较5种紫花苜蓿愈伤诱导的效果发现, 阿尔冈金紫花苜蓿品种愈伤诱导率最高, 而且愈伤效果好。同时, 在多因素分析中, 发现品种与培养基之间无交互作用, 品种间比较不受其他因素影响, 可进一步确定阿尔冈金紫花苜蓿的愈伤组织诱导最好。因此, 建议在今后的苜蓿再生体系建立研究中选择品种时选用阿尔冈金紫花苜蓿。

3.3不同外植体间比较

细胞和愈伤组织的形态发生受材料本身的影响, 不同植物器官明显不同, 而相同植物不同器官、相同器官的不同时期也不同[3]。本研究发现, 紫花苜蓿幼嫩的子叶、下胚轴是理想的外植体, 下胚轴更优于子叶, 并且二者之间差异显著 (P<0.05) 。杨起简等[3]在对紫花苜蓿愈伤组织进行诱导时, 比较了不同外植体的愈伤诱导情况, 得出同一培养基上下胚轴愈伤诱导优于子叶的结论。王友生等[17]进行紫花苜蓿外植体愈伤组织诱导, 也得出了同样结论。均与本研究所得的下胚轴愈伤组织诱导优于子叶的结论一致。

3.4因素之间的交互作用

品种与培养基两因素之间, 品种与外植体两因素之间, 品种、培养基和外植体三因素之间均无显著性差异, 说明品种与其他因素之间无交互作用, 愈伤诱导率在品种间的差异不受其他因素影响。而培养基与外植体之间存在互作效应, 说明外植体的愈伤诱导率受添加不同浓度6-BA的培养基的影响。

3.5不同外植体适宜的激素添加水平

辣椒愈伤组织诱导 篇11

关键词：杜仲；胚乳培养；三倍体愈伤组织；赤霉素

中图分类号： Q943.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0090-03

杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）别称思仙，主产于河南、四川、江苏等地，为杜仲科杜仲属植物，且杜仲科仅1属1种，为我国特有的一种名贵药用植物，资源稀少，具有补肾壮腰、抑制肿瘤生长、双向调节血压等作用[1-3]；它也是温带最具开发利用前景的胶源植物，在它的叶片、树皮、根皮和果皮中都含有杜仲胶，经济价值很高[4-6]。杜仲为二倍体（2n=2x=34）落叶乔木，以种子繁殖为主，以收获树皮、树叶等营养体为主要栽培目的。杜仲种子中的胚乳是双受精的产物，因此是三倍体，鉴于多倍体植物具有器官巨大、抗逆性强和生化物质含量高等特点，结合杜仲的药用和经济价值，多倍体育种应成为杜仲遗传改良的主要途径之一[7-9]。因此，通过组织培养的方法，诱导杜仲胚乳产生三倍体愈伤组织，可以为后续再分化获得三倍体植株提供物质基础，而且利用三倍体植株细胞体积增大的特点可以提高杜仲单株产胶量或细胞次生代谢产物含量[10-14]。

1材料与方法

1.1供试材料

杜仲成熟种子采自天津农学院。

1.2试验方法

1.2.1材料的前处理将新采收的成熟饱满的杜仲翅果晾干，剥去果皮，取出种子，洗净。做以下5种处理：A：将种子沿背腹线切成两半，剔除其中种胚，留胚乳备用；B：按上述方法取得胚乳，用无菌水浸泡24 h；C：按上述方法取得胚乳，置于GA3中浸泡24 h（设置GA3的浓度分别为C1处理：400 mg/L、C2处理：600 mg/L、C3处理：800 mg/L、C4处理：1 000 mg/L）；D： 将完整的种子置于无菌水中浸泡24 h；E：将完整的种子置于GA3中浸泡24 h（设置GA3的浓度分别为E1处理：400 mg/L、E2处理：600 mg/L、E3处理：800 mg/L、E4处理：1 000 mg/L）。将处理好的材料，用70%乙醇浸泡15 s，无菌水冲洗3次，再用0.1%Hgcl2处理6 min，无菌水冲洗5次后备用。

1.2.2愈伤组织的诱导将灭菌后的胚乳置于无菌的培养皿中，在超净台中切除每扇胚乳子叶端的3/4，将占种子全长1/4的胚根端胚乳接种到愈伤组织诱导培养基中；灭好菌的完整种子，先在无菌的环境下剥离种胚，取得胚乳，再按上述方法切割后接种。愈伤组织诱导培养基见表1。

1.2.3愈伤组织的继代与改造将诱导产生的愈伤组织切下，接种到继代培养基中，继代培养基配方见表2。

表2愈伤组织继代培养基

处理酵母提取物

（mg/L）水解酪蛋白

（mg/L）G100G28000G30800注：培养基为MS+ZT 0.8 mg/L + NAA 0.8 mg/L +琼脂6.3 g/L+蔗糖30 g/L。

2结果与分析

2.1取材部位与前处理方法对愈伤组织诱导的影响

经不同方式处理后的材料接种于诱导培养基2周后，大部分胚乳开始膨大（图1）。为避免褐化现象加重，将膨大的部分切下，继续接种于相同成分的培养基中，再经35 d左右的培养，部分膨大的胚乳会形成疏松白色的愈伤组织（图2）。统计愈伤组织形成的数量发现，水和GA3的浸泡对于胚乳脱分化形成愈伤组织具有促进作用，且GA3的促进作用优于水，愈伤组织诱导率最高可达20.2%；GA3的促进作用会随着浓度的增大而增大，浓度为800 mg/L时，愈伤组织的诱导效果最好，当浓度达到1 000 mg/L时GA3的促进作用又开始下降（表3、图3）；完整种子中的胚乳相对于剥离出来的胚乳，脱分化形成愈伤组织的能力更强（表3）。

2.2培养基对愈伤组织诱导的影响

研究发现，在不添加激素的培养基中，胚乳虽然可以膨

大，但是不能形成愈伤组织。因此，向培养基中添加了3种不同浓度配比的激素。统计愈伤组织形成的数量发现，NAA在一定浓度范围内，具有促进杜仲胚乳形成愈伤组织的作用；虽然2，4-D在很多植物中具有促进愈伤组织形成的作用，但是在杜仲胚乳形成愈伤组织的过程中，2，4-D起了抑制作用，且这种抑制作用会随着培养基中其他激素浓度的增大而增大；诱导杜仲胚乳产生愈伤组织的最佳激素种类及浓度配比为：6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L，诱导率最高可达114%（表4）。

2.3外源添加物对愈伤组织生长的作用

经诱导后初生的疏松白色的愈伤组织生长慢且不具备分化能力，需将其转移到继代培养基中进行继代培养。在继代1～2次之后，部分会转变成绿色且质地紧密、具有分化能力的愈伤组织（图4、图5），未转变的愈伤组织继续在相同的培养基中进行继代，会逐步转变。研究发现，激素种类及浓度配比为ZT 0.8 mg/L + NAA 0.8 mg/L时，对愈伤组织的继代与改造效果最佳；适当添加外源有机物对愈伤组织的改造具有促进作用，其中酵母提取物（YE）的促进效果最佳，愈伤组织改造率可达41.5%，新生的愈伤组织颜色绿且质地紧密，经2周继代培养后，增殖效果也较好（表5、图4）。

3讨论

Srivastava[8]在罗氏核实木胚乳培养研究中指出，利用成熟胚乳培养诱导愈伤组织时，必须有原位胚的参与或用GA3进行处理。本研究支持了Srivastava这一观点，水的浸泡对完整种子中的胚乳诱导愈伤组织有促进作用而对剥离的胚乳没有作用，说明了完整种子经水浸泡后休眠被打破，种子中的胚被活化，从而影响胚乳的诱导。而GA3具有打破种子休眠、促进发芽的作用，因此会对胚乳产生类似种胚在萌发过程中对其产生的影响， 从而促进了胚乳愈伤组织的诱导。但GA3表5不同外源添加物对愈伤组织生长的作用

处理接种愈伤组织数

（个）愈伤组织变化数

（个）改造率

（%）愈伤组织质地愈伤组织颜色继代2周后愈伤

组织大小G11382618.8稍疏松浅绿色较大G21476141.5紧密绿色较大G31334332.3较紧密浅绿色大

为植物生长调节剂，须在一定浓度范围内使用，浓度过高，反而会对胚乳诱导愈伤组织产生抑制作用。

2，4-D作为植物生长调节剂，可以促进植物组织的膨大，但它对胚乳愈伤组织诱导的抑制作用可能是由于其可以干扰植物体内激素的平衡，破坏核酸和蛋白质的代谢，从而抑制胚乳向生长旺盛的愈伤组织进行脱分化。在培养基中添加酵母提取物、水解酪蛋白等外源有机物，可以在继代培养时有效促进愈伤组织的改造与增殖，这是由于它们富含多肽、氨基酸、核苷酸、维生素、微量元素等营养成分，且比例协调，尤其是其所含的一些生长因子成分，可以对愈伤组织的生长、改造、再分化等具有较好的促进作用[19]。

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辣椒愈伤组织诱导 篇12

野生鸡屎藤资源由于受到人为的过度开发和破坏, 面积逐渐缩小, 而植物组织细胞培养是解决资源匮乏的有效途径。国内外对鸡屎藤组织培养的报道较少, 仅见李任珠等[12]对海南野生鸡屎藤的愈伤诱导、植株快繁进行了研究, 对于鸡屎藤愈伤组织的继代增殖培养、细胞悬浮培养未见相关报道。本试验研究了鸡屎藤愈伤组织诱导、增殖培养条件, 建立了鸡屎藤悬浮培养细胞系。

1 材料与方法

1.1 材料

(1) 外植体:鸡屎藤采自四川省绵阳市西南科技大学校园, 经绵阳师范学院罗明华教授鉴定为茜草科鸡屎藤 (P.scandens) 。采集时间为4—5月, 取生长健壮的幼嫩茎段、带腋芽茎段、叶片为外植体接种。

(2) 培养基:愈伤组织诱导及继代培养基是在MS培养基中添加不同浓度的NAA、6-BA、2, 4-D;细胞悬浮培养基除了不添加琼脂外, 其余成分组成和愈伤组织继代培养基相同。每配制1 L培养基加入8 g琼脂和30 g蔗糖, 除愈伤组织继代培养正交试验外, 均调p H至5.8, 在121℃, 1.05×105 Pa压力下灭菌20 min。

(3) 仪器与设备:电子天平 (TP-213, 德国塞多利斯公司) , 高压灭菌锅 (LDZX-75KBS, 上海申安医疗器械厂) , 单人双面超净工作台 (SWCJCO, 苏州净化设备有限公司) , 全温振荡培养箱 (HZQ-160F, 上海齐欣科学仪器有限公司) , 光照培养箱 (LRH-70, 上海蓝豹试验设备有限公司) 。NAA、6-BA、和2, 4-D均购自上海伯奥生物科技有限公司, 其余试剂为分析纯。

1.2 方法

(1) 鸡屎藤愈伤组织诱导:将叶片与茎段、带腋芽茎段分开, 用自来水反复冲洗干净后, 用体积分数为70%的乙醇浸泡30 s, 无菌水冲洗2次。用0.1%的HgCl2进行表面灭菌处理, 所有材料灭菌时间均设6、8、10、12 min四个处理, 无菌水冲洗5～6次。将茎段和带腋芽茎段切成长约1 cm的小段, 叶片切成0.5 cm×0.5 cm左右的小块, 无菌接种至培养基上。根据接种8 d后外植体变化情况确定最佳灭菌处理时间。

确定最佳灭菌时间后, 叶片、茎段和带腋芽茎段按照最佳灭菌时间处理。接种于含有不同植物激素的MS培养基中, 恒温培养箱中 (25±0.5) ℃培养, 愈伤组织诱导与增殖过程中光照强度1000～1500 lx, 光照时间12 h/d。统计分析各种诱导培养基的愈伤组织诱导率及愈伤组织生长情况。

(2) 鸡屎藤愈伤组织的继代培养:采用诱导愈伤组织的最佳激素组合, 以诱导培养基对愈伤组织进行增殖继代培养。愈伤组织大量增殖后, 进行愈伤组织的继代培养基筛选。采用4因素3水平正交试验设计L9 (43) (表1) , 每处理接种8瓶, 每瓶接种量0.50～0.60 g, 30 d后测定愈伤组织鲜重, 换算成每克接种量的净增重, 对结果进行极差分析。

(3) 鸡屎藤悬浮细胞系的建立:选取继代培养后质地松散、生长良好的愈伤组织约10 g, 转接于MS液体培养基中, 500 mL三角瓶装量150 mL, 于 (25±0.5) ℃, 120 r/min条件下振荡暗培养。20 d继代培养1次, 继代时用100目尼龙网过滤除去大块愈伤组织, 培养液按照与新鲜培养液1∶3的比例进行混合再培养。筛选分散度好、较均匀、生长快的细胞作为种子, 传代5～6次后得到性能良好的悬浮细胞系。生长曲线的测定参照江曙等[13]稍作修改, 测定细胞鲜重, 用250 mL三角瓶培养, 培养液体积为100 mL。

2 结果与分析

2.1 灭菌处理时间对外植体的影响

对外植体灭菌时间进行预试, 叶片、茎段及带腋芽茎段处理时间12 min后可见外植体材料出现不同程度的褐变, 均较为严重。因此, 对叶片、茎段及带腋芽茎段采用6、8、10、12 min的灭菌时间处理。接种8 d后观察发现, 12 min灭菌处理的叶片死亡率高达90%, 茎段及带腋芽茎段为80%;随着处理时间降低至8 min时, 三种外植体的死亡率均低于10%, 成活率均高于80%, 污染率均低于20%, 外植体在培养8 d后仍保持绿色;处理时间为6 min时, 污染率可达70%以上。因此, 确定叶片、茎段和带腋芽茎段用0.1%Hg Cl2处理时间均为8 min。

2.2 愈伤组织的诱导

(1) NAA与6-BA不同浓度组合对愈伤组织诱导的影响

将叶片、茎段和带腋芽茎段三种外植体接种到MS添加6-BA和NAA的6种培养基上进行愈伤组织诱导。表2为培养20 d后三种外植体的愈伤组织诱导情况。可以看出, 不同外植体均能诱导产生愈伤组织, 但诱导率存在较大差异。其中6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L对叶片诱导率最高, 诱导率为100.0%;6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L茎段诱导率最高为83.3%。叶片在接种10 d后可见卷曲, 切口组织开始膨大, 15d后有少量浅黄绿色颗粒状愈伤出现, 以后随时间延长, 愈伤组织逐渐增多。茎段接种8 d后愈伤萌动, 愈伤形成于茎段切口, 后四周形成浅黄绿色愈伤, 但形成的愈伤组织质地坚硬, 且连成一片。培养30 d后可见大量的不定根长出, 随着培养的延续, 不定根不断分支。6种处理对带腋芽茎段愈伤组织诱导效果较差, 最高诱导率仅为50.0%, 但带腋芽茎段在愈伤组织诱导过程中部分处理可见有芽产生, 6-BA 1.0 mg/L与NAA三种组合均有芽出现, 最高诱导率达60%。带腋芽茎段在接种10 d后可见芽的萌动, 30 d后可见芽长约3.0～5.0 cm, 平均出芽数可达2.5个。

(2) 2, 4-D与6-BA不同浓度组合对愈伤组织诱导的影响

2, 4-D与6-BA不同浓度组合对外植体愈伤组织诱导效果不同, 表3为诱导培养20 d的结果。由表可见, 6-BA与2, 4-D组合中, 6-BA 1.0 mg/L+2, 4-D 1.0 mg/L和6-BA 1.0 mg/L+2, 4-D 2.0 mg/L对三种外植体的诱导较好。叶片愈伤组织起于切口边缘, 后在叶片表面有颗粒状愈伤组织产生, 愈伤颜色为乳白色、水渍状。茎段愈伤组织起于膨大的切口边缘组织, 后茎段上亦可见浅白色的愈伤出现。带腋芽茎段愈伤组织的出现同茎段, 在诱导10 d后可见节间叶柄处组织膨大, 有少量愈伤出现, 培养30 d后均无芽的诱导。

由表2和表3比较可知, NAA和2, 4-D对外植体的诱导效果有一定的差异, NAA对叶片诱导率较高且产生的愈伤组织呈颗粒状, 疏松、易碎适合悬浮培养体系的建立。NAA和2, 4-D对茎段的诱导产生的愈伤组织颜色和质地有差异。2, 4-D对带腋芽茎段的愈伤组织诱导率较高, 且没有芽的产生。NAA适合对叶片愈伤组织诱导及带腋芽茎段的快繁。

2.3 愈伤组织的继代培养

(1) 叶片愈伤组织的继代培养

为建立良好的细胞悬浮系, 根据诱导阶段愈伤组织状态, 选择MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L诱导的叶片愈伤组织进行增殖培养, 培养基为MS+NAA0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L。继代的愈伤组织5 d后可见新的愈伤产生, 颜色为浅黄绿色, 随着培养, 愈伤组织的量逐渐增多, 到30 d左右生长达到顶峰。愈伤组织继代培养过程中, 接触培养基部分的愈伤组织逐渐褐化, 但随着培养的时间延长并不加重褐化。这可能是刚接种的愈伤组合与培养基有适应的过程。

注:叶片、茎段每处理接种32块, 带腋芽茎段接种12块, 表中的接种数为统计的未污染外植体数, 下同。

(2) 不同培养条件对叶片愈伤组织生长的影响

将MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L诱导的叶片愈伤组织在诱导培养基上增殖培养3次, 得到的愈伤组织进行如表1的正交试验。表4为继代接种30 d后各处理的平均鲜重增长情况, 处理7和8的每克接种量净增重明显高于其它处理, 分别为5.500 g和5.054 g, 其次为处理2, 为4.318 g。极差分析结果表明, 对愈伤组织生长影响程度最大的因素是6-BA, 其次是pH和2, 4-D, 而NAA的影响最小, 最佳培养基为MS+2, 4-D0.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L+6-BA 0.5 mg/L, pH 5.8。

处理间愈伤组织的颜色、质地未见明显差异, 但在长势上表现出一定的差异, 处理7的愈伤组织长势最好, 愈伤组织颜色为浅黄绿色, 且基本成颗粒状、疏松、易分散。这可能是处理的材料均来自于叶片愈伤组织且继代次数较少有关。

2.4 鸡屎藤悬浮细胞培养体系的建立

根据愈伤组织诱导及继代培养过程的试验结果, 选择叶片愈伤组织进行细胞悬浮培养。继代时过滤除去大的愈伤组织及细胞团, 经过5代液体摇瓶振荡暗培养, 筛选得到均一性好、生长性能优良的鸡屎藤悬浮细胞系。通过试验表明:适当降低NAA的浓度为0.1 mg/L而其它激素不变时, 悬浮细胞系更稳定。故悬浮培养基为MS+2, 4-D 0.5 mg/L+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.5 mg/L, pH 5.8。

2.5 生长曲线测定

从鸡屎藤细胞悬浮培养的生长曲线 (图1) 来看, 符合“S”型曲线特征。0～16 d是延迟生长期, 16～20 d是对数生长期, 20～24 d是稳定生长期, 24～32d是衰亡期, 24 d可达到最大生长量。悬浮细胞培养继代时宜选择培养了18～20 d处于对数生长期的悬浮细胞, 此阶段的细胞生长旺盛、适应能力强。

3 讨论

鸡屎藤的叶片、茎段和带腋芽茎段均可诱导出愈伤组织。叶片的愈伤组织诱导效果和长势较好, 最高诱导率可达100%。茎段和带腋芽茎段诱导产生的愈伤组织较叶片愈伤组织质地坚硬、长势差。此外, 带腋芽的茎段在出愈的同时有芽的生长, 适合作植株快速繁殖的外植体。

MS为基本培养基, 6-BA与NAA, 6-BA与2, 4-D两类激素组合对三种外植体均能诱导产生愈伤组织, 不同处理间的诱导率差异较大。NAA与6-BA组合对叶片愈伤组织诱导效果最好, 最佳培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L, 而李任珠等[12]对海南鸡屎藤嫩叶愈伤组织诱导最佳培养基为MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.8 mg/L, 愈伤组织诱导率100%。这可能与植株不同生境、不同取样时间等有关。

愈伤组织的增殖继代培养是细胞悬浮培养的关键步骤, 筛选得到生长旺盛、疏松易分散的愈伤组织是重点。通过正交试验的方法筛选得到MS+2, 4-D 0.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L+6-BA 0.5 mg/L, pH 5.8为愈伤组织最佳的增殖继代培养基, 得到的愈伤组织颜色为浅黄绿色、疏松易碎。而李任珠等[12]直接采用诱导培养基MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.8 mg/L即得到颜色为淡绿色、显粗粒状愈伤。这说明两种处理均适合愈伤组织的增殖培养。