愈伤组织培养

愈伤组织培养（通用12篇）

愈伤组织培养 篇1

银杏是目前地球上最原始的裸子植物之一, 是新生代第四纪冰川期的孑遗植物, 素有“活化石”之称的银杏现仅存一科一属一种, 它原产于我国, 具有及其重要的科学研究意义和药用开发价值。银杏细胞中含有黄酮类和内酯类物质, 对心脑血管疾病疗效显著。利用银杏组织培养技术可以生产这些物质起治疗和预防的作用。自20世纪90年代以来, 一些学者开始对银杏的胚、茎端和配子体等组织培养。近年来, 细胞悬浮培养得到了广泛的研究, 本文章综述了国内外银杏组织培养的研究现状并对其工业应用前景进行了展望。

一、银杏愈伤组织培养

(一) 胚培养

外植体的来源及其发育阶段对胚发生意义重大。一般对于胚来说, 子叶、胚珠、胚等, 都是较理想的外植体。选取实验材料时不宜选取新生的种子, 这样的种子胚过嫩过小, 不宜剥离, 应采用颗粒饱满、未发生霉变且诱导率高的成熟种子。胚的消毒常常采用70%的酒精消毒2~3分钟, 再放人0.1%升汞溶液中减压灭菌20分钟左右, 再用无菌水漂洗3~5次, 然后用刀片挑出胚, 将胚整体或切成两段后用灭菌滤纸吸干水分, 即可用来接种。对于胚的离体培养, 常常采用MS和N6培养基作为基本培养基。若用于诱导胚芽生长, 则可向培养基中添加一定浓度的NAA或BA;若用于诱导生根, 则常向培养基中添加适量得2, 4-D。此外, 少量的还原氮 (如0.1m m ol/LNH4C1) 即可明显的促进胚状体的生成。

(二) 茎培养

剪除银杏枝条的叶片和叶柄, 用漂白粉和升汞溶液进行灭菌, 经无菌水漂洗后, 从芽上切取长约0.5 cm的茎尖, 进行接种。接种的培养基采用改良的White培养基:White+BA0.5—1.0 mg/L+NAA0.5m g/L+NH4Cl5.34 m g/L+白糖4%。光照对于愈伤组织的形成有抑制作用, 可以对材料进行一周的暗处理, 在转移至自然光下促进茎的分化。银杏茎段的组织培养取得一些突破, 有人通过银杏茎段的离体组织培养已得到了丛生芽, 但数量极较少。另外, 活性炭、改良MS培养基和多效唑等都可以促进腋芽萌动和分化。

(三) 配子体培养

也有不少人尝试用银杏花粉作为材料进行离体培养。银杏花粉细胞具有银杏的全套遗传物质, 但是迄今为止尚无成功利用银杏花粉诱导出完整银杏幼苗的报道。Laurain等和陈学森等做了银杏花粉和雌配子体原生质体分离与培养实验, 该实验虽未获得完整再生植株, 但是Laurain等在进行对银杏花粉原生质体培养的过程中, 首次诱导出处于不同时期的胚状体, 是银杏配子体培养的一个重大突破。原生质体培养仍是大部分树木再生植株的难题, 花粉的发育受不同因素影响, 由配子得到完整银杏植株目前只存在理论的可能性, 所以银杏配子体得培养仍是一个未攻克的难题。

二、银杏愈伤组织的诱导

不同银杏外组织的诱导能力有区别, 其诱导率由高到低是子叶、叶片、茎段。银杏愈伤组织诱导及生长状况也与培养基、激素以及无机盐含量有关。例如:茎的最适培养基为N6培养基;叶及叶柄最适培养基为B5培养基;改良的MS培养基对叶、胚、叶柄和茎愈伤组织的诱导具有显著效果, 而根在各种培养基上的诱导效果都不理想。此外, 激素对于愈伤组织的诱导也有重要影响:2, 4-D诱导能力强, 细胞老化速度快;激素NAA活性不高, 诱导力弱;NAA与6-BA按一定浓度配合使用, 最适合于诱导幼叶分化出愈伤组织, 而2, 4-D、KT和KT与6-BA组合, 不能使银杏幼叶产生愈伤组织或者诱导率很低。另外, 高压静电处理和添加椰汁或琼脂糖等也被证明有利用愈伤组织的诱导。

三、银杏愈伤组织培养的利用

(一) 银杏组织培养代替传统方法生产银杏黄酮和内酯

银杏细胞含有黄酮和内酯物质, 具有潜在的药用价值。试验证明, 银杏叶提取物对血管扩张, 加速血液循环, 降低血压效果显著。目前市场上的黄酮化合物多是从银杏叶片中提取, 易受到地理、气候等因素的限制。此外, 而内酯和黄酮化合物在银杏细胞中含量较低, 加上银杏栽培占用大量耕地, 种种因素导致黄酮的产量供不应求, 价格居高不下。所以通过银杏愈伤组织培养生产内酯及黄酮化合物具有广阔的前景, 其优势在于不受季节和地域影响、产量高、成本低、周期短, 并且能够进行自动化控制。

(二) 利用发根农杆菌遗传转化生产银杏黄酮和银杏内酯

虽然银杏愈伤组织培养技术已经趋近成熟, 但离体分化过程难以控制, 至今尚未有建立起完善的再生培养体系, 所以针对银杏遗传转化研究课题较为单一, 难度也较大。目前对银杏遗传转化的报道都是利用一些菌株, 如发根农杆菌通过遗传转化生产银杏黄酮化合物和内酯, 此方法现已发展成为继细胞培养技术之后的又一新的培养技术。Laurain等首次利通过侵染胚实验, 成功进行了发根培养, 证明了银杏组织培养过程中产生银杏内酯。随后, 张伦等利用不同的发根农杆菌菌株:R15834, R1000和A4, 对银杏幼叶、芽和茎端进行转化, 除A4外, 均能诱导获得了毛状根, 并检测到农杆菌Ri质粒的部分遗传物质已整合到银杏细胞的基因组中。实验证明通过发根农杆菌进行基因转化是可能的, 但毛状根培养系统的建立至今尚未成功。

四、银杏愈伤组织培养的发展前景

银杏植株物种价值高, 用途广泛。如今心脑血管疾病成为人类健康的一大隐患, 而利用银杏组织生产促进血液循环的银杏黄酮类化合物、银杏内酯等次生物质的生产上也就越来越受到重视。此外, 银杏繁殖能力差, 如何利用体外离体组织培养对银杏这一古老的裸子植物就行快速的繁殖也是一个研究课题。当然银杏细胞培养也存在一系列问题, 如细胞褐化现象, 未建立完整的再生体系以及遗传转化困难等。总的说来, 银杏细胞培养为内酯和黄酮化合物的生产以及银杏这一古老植物的保护提供了一种经济而有效的途径。

摘要：从银杏组织培养外植体入手, 综述了银杏的器官、胚、组织、细胞培养的研究进展以及银杏细胞培养的意义及发展前景。

关键词：银杏,愈伤组织,研究进展

参考文献

[1]于震宇, 李艳菊, 郭军战, 代晓龙.银杏组织培养研究进展[J].西北林学院学报, 2004.

[2]郭长禄, 陈力耕, 胡西琴, 何新华.银杏组织培养及其利用研究进展[J].果树学报, 2003.

[3]陈学森, 邓秀新, 章文才等.银杏雌配子体发育及原生质体分离与培养的研究[J].实验生物学报, 1998.

愈伤组织培养 篇2

激素对银杏愈伤组织诱导及继代培养的影响

为了探讨激素对银杏愈伤组织诱导及继代培养的影响,以银杏优良品种“佛手”无菌苗的叶片和根段为材料,以MS为基本培养基,研究了5种不同激素配比和光照条件对愈伤组织诱导及长期继代培养的`影响.结果表明,所有激素配比都能诱导两种外植体形成愈伤组织,完全黑暗培养条件不利于愈伤组织继代培养;NAA和KT及2,4-D和KT两种激素组合分别有利于叶片和根愈伤组织诱导.在激素配比为3.0 mg/L 2,4-D+5.0mg/L KT中生长的两种愈伤组织鲜重显著高于其它处理;NAA和KT组合适合愈伤组织长期继代保存,叶片诱导的愈伤组织最佳继代培养基为NAA 1.0 mg/L+KT 1.0 mg/L,根段诱导的愈伤组织则为NAA 1.0 mg/L+KT1.0 mg/L,分别在这两种激素组合下继代的愈伤组织始终为绿色,叶绿素含量变化不显著.

作 者：朱红威 邵菊芳 陶秀祥 李庆 王丹 ZHU Hong-wei SHAO Ju-fang TAO Xiu-xiang LI Qing WANG Dan 作者单位：中国矿业大学化工学院,徐州,221008刊 名：天然产物研究与开发 ISTIC英文刊名：NATURAL PRODUCT RESEARCH AND DEVELOPMENT年，卷(期)：20(3)分类号：Q943.1 R931关键词：银杏 愈伤组织 继代培养 叶绿素含量

愈伤组织培养 篇3

关键词：大豆；愈伤组织；激素；继代培养

中图分类号： S565.104 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）04-0040-02

收稿日期：2013-08-19

基金项目：吉林省科技发展计划（编号：201101111）；吉林省教育厅科学技术研究项目（编号：2011-41）；吉林省科技厅项目（编号：20120215）；吉林省科技成果转化补助项目（编号：20095044）；吉林农业大学科研启动基金（编号：201242）。

作者简介：刘思言（1979—），女，吉林四平人，硕士，讲师，主要从事作物生物技术研究。E-mail：siyan_2001@163.com。

通信作者：王丕武，教授，博士生导师。E-mail：peiwuw@yahoo.com.cn。大豆是全世界重要的粮食和经济作物，也是人类主要的食用蛋白和工业原料来源，与人们的日常生活息息相关[1-2]。大豆的组织培养技术起步较晚，直到20世纪80年代的中后期大豆组织培养技术才取得了突破性的进展，大豆的原生质体培养、子叶节培养和胚尖培养相继取得了成功[3-13]。但大豆愈伤组织诱导的研究相对较少，而愈伤组织诱导具有外植体来源广泛，扩繁量大等优点[14]。尤其是随着近些年来大豆遗传转化的研究越来越多，能通过愈伤组织诱导建立一个高效的遗传转化受体系统更具有重要的意义。本试验以TDZ、NAA、6-BA、2，4-D为供试激素作为生长调节剂，以吉农28、吉农27、吉农17 3种基因型为材料，进行大豆愈伤组织的诱导和继代培养，以期找到最适合诱导和继代培养大豆愈伤组织的培养基，为建立一个高效的大豆愈伤组织遗传转化受体系统奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

吉农28、 吉农27、 吉农17的种子均由吉林农业大学生物技术中心提供。

1.2试验方法

1.2.1种子的萌发挑取成熟饱满的大豆种子，先用75%的乙醇消毒30 s，再用0.1%的升汞溶液消毒10 min，无菌水冲洗3～5次，接种到MS基础培养基上，培养7 d后取胚轴，14 d后取真叶作为外植体材料。

1.2.2愈伤组织的诱导以无菌实生苗的胚轴、真叶为外植体，分别接种于添加不同浓度激素的MS愈伤组织诱导培养基中，采用四因素三水平的L9（34）正交设计（表1），将各处理放置于黑暗条件下培养7 d，然后置于恒温的黑暗12 h，光照12 h的培养箱中，于20 d后统计其愈伤组织诱导情况。

伤组织的诱导多以一定浓度的2，4-D和6-BA配合使用，朱学艺等[15]在培养基中添加6-BA后，愈伤组织出愈率低，形成的愈伤组织结构紧密，呈小颗粒状；NAA和6-BA结合使用诱导出的大豆愈伤组织也呈现质地坚硬的特点，愈伤组织量也相对较少[16]。TDZ是一种苯基脲衍生物，具有类细胞分裂素活性，已被广泛用于大豆组织培养，在孙明杰[24]等的研究中使用低浓度TDZ和6-BA配比，通过愈伤组织途径获得再生植株，提高了植株再生效率。本研究以3种不同基因型大豆的真叶及胚轴为外植体，不同的激素配比进行大豆愈伤组织诱导和继代研究，结果表明，在愈伤组织诱导阶段：以真叶为外植体时，最佳的组合为吉农28+1.5 mg/L TDZ+0.2 mg/L NAA+200 mg/L 活性炭；当以胚轴作为外植体时，诱导愈伤组织最佳组合为吉农17+1.0 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA+200 mg/L 活性炭。在愈伤组织继代培养阶段：以真叶作为外植体时，最佳的组合为吉农17+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+3.0 mg/L 2，4-D；以胚轴为外植体时，最佳的组合为吉农17+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+2.0 mg/L 2，4-D。

参考文献：

[1]Wang H J，Murphy P A. Isoflavone content in commercial soybean foods[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，1994，42：1666-1673.

[2]杨超. 大豆植株再生和遗传转化技术体系的研究[D]. 南京：南京农业大学，2009.

[3]Cheng T Y，Saka H，Voqui-Dinh T H. Plant regeneration from soybean cotyledonary node segments in culture[J]. Plant Science Letters，1980，19：91-99.

[4]肖文言，王连铮. 大豆幼荚子叶原生质体培养及植株再生[J]. 作物学报，1994，20（6）：665-669，769.

[5]王升吉，吴元华，王洪岩，等. 大豆不同外植体组织培养及再生研究[J]. 沈阳农业大学学报，1999，30（3）：255-259.

[6]Yoshida T. Adventitious shoot formation from hypocotyls sections of mature soybean seeds[J]. Breeding Science，2002，52：1-8.

[7]邱承祥，武天龙. 6-BA对大豆茎尖诱导再生植株的研究[J]. 大豆科学，2003，22（1）：32-35.

[8]Wang P，Wang G，Jing J I，et al. A novel systerm for proliferation，maintenance and plantlet germination from somatic embryo of soybean[J]. Acta Botanica Sinica，2004，46（2）：154-158.

[9]林樹柱，曹越平，卫志明，等. 6-BA诱导大豆子叶节和茎尖出芽的研究[J]. 上海交通大学学报：农业科学版，2005，23（2）：138-142.

[10]李海燕，武小霞，刘淼，等. 大豆子叶节、胚尖再生植株的研究[J]. 大豆科学，2007，26（5）：709-712.

[11]孙文丽，刘昱辉，吴元华，等. 大豆胚尖再生体系的建立及转基因初步研究[J]. 湖北农业科学，2008，47（6）：615-618.

[12]张东旭，张洁，商蕾，等. 大豆胚尖再生体系的研究[J]. 河北农业大学学报，2008，31（4）：7-13.

[13]武小霞，李静，姜成涛，等. 大豆子叶节再生中植物生长调节剂浓度及基因型筛选[J]. 中国油料作物学报，2011，33（2）：123-129.

[14]谢从华，柳俊. 植物细胞工程[M]. 北京：高等教育出版社，2004：236.

[15]朱学艺，梁晓芳，李红芳. 激素对大豆悬浮细胞系愈伤组织诱导的影响[J]. 厦门大学学报：自然科学版，2008，47（4）：562-566.

[16]李大玮，Schmid J，Keller E R. 植物生长调节剂的使用和大豆愈伤组织的诱导及保持[J]. 遗传，1989，11（2）：1-4，49.

枇杷花药培养愈伤组织诱导研究 篇4

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为宜宾职业技术学院农业科技园大五星、早钟6 号及龙泉1 号枇杷栽培品种的花药。从幼树及壮年枇杷植株上取不同直径为0.3~0.8 mm枇杷花蕾,在自来水中冲洗20 min,采用低温、热激、高渗透压与高速离心的方法,对花蕾进行预处理。

1.2 去绒灭菌

用手术刀片将经过预处理的枇杷花蕾表面绒毛刮去,用70%酒精浸泡30 s,后用0.5% Hg Cl2水溶液表面消毒8min,再用无菌水冲洗4~5 次,在无菌条件下拨开花蕾取出花药,同时彻底去除花丝。

1.3 预处理

低温4 ℃分别处理24、48、96、144 h,培养基中附加2.0mg/L 6-BA和0.5 mg/L 2,4-D,添加7%蔗糖和0.6%琼脂。

1.4 培养基

采用MS大量元素、微量元素和有机物。培养基附加2.0mg/L 6-BA和0.5 mg/L 2,4-D,并附加不同浓度的蔗糖(0、3%、5%、7%、9%)、 葡萄糖(0、3%、7%、9%),0.6%琼脂。 不同植物激素水平和浓度(2,4-D:0.01、0.02、0.05、0.10、0.30、0.50mg/L)进行完全组合,添加7%蔗糖和0.6%琼脂。

1.5 试验过程

每个三角瓶接种20 枚枇杷花药,用无菌封口膜密封,在25 ℃下黑暗条件下培养。培养1 周后,将未污染的花药转入新鲜遇上组织诱导培养基上,每个三角瓶转入20 枚枇杷花药。培养4 周以后统计培养效果。

2 结果与分析

2.1 灭菌方式对愈伤组织形成的影响

将花药剥出以后,对花药进行灭菌处理受到的伤害较为严重,在接种后会快速褐变。对整个花蕾进行灭菌,使花药受到的灭菌剂的伤害降低。采用流水下冲洗花蕾1~2 h处理花蕾,然后用75%酒精处理30 s,0.1%升汞灭菌25~30min , 无菌水冲洗5 ~6 次后, 剥出花药, 接种污染率高达90%。将枇杷花蕾表面绒毛刮去,然后再进行处理,会使污染率明显下降5%左右。

2.2 预处理对花药愈伤组织诱导的影响

没有经过预处理的枇杷花药在培养,对培养的反应差,诱导启动率诱导率低,基本产生不了愈伤组织。经过预处理后,诱导率明显提高。其中低温预处理对花药愈伤组织诱导效果最显著,对大五星枇杷诱导率达53%,龙泉1 号达56.33%,早钟6 号74%。低温预处理从24 h增加到48 h,能显著提高诱导率,但再延长,愈伤组织诱导率则会逐步下降。

2.3糖源种类和浓度对花药愈伤组织诱导的影响

蔗糖浓度从0 增加到5%时,愈伤组织的诱导率也随之增加,其中早钟6 号枇杷的花药愈伤组织诱导率最高。蔗糖浓度从7%到9%时,愈伤组织诱导率出现下降趋势。

2.4激素种类、浓度和组合对花药愈伤组织诱导的影响

在MS培养基上,或者在MS培养基中添加IBA、NAA、IAA、6-BA的不同浓度和组合,均不能诱导出愈伤组织。但添加了2,4-D后,能诱导枇杷花药分化形成愈伤组织。并且2,4-D浓度从0.01 mg/L增加到0.50 mg/L时,诱导率也从2.33%增加到69.33%。但在0.5~1.0 之间,处于不变状态。

3 结论与讨论

植物花药愈伤组织形成受多种因素的制约。该试验中,枇杷花蕾表面的绒毛给消毒造成了较大的困难,刮去绒毛后消毒灭菌能有效防止污染的发生。同时,预处理对花药愈伤组织诱导起决定作用,没有经过预处理的枇杷花药几乎不能诱导脱分化及再分化。花蕾经过预处理后,诱导率显著提高,在所有预处理方法中,低温预处理效果最为显著[3,4]。

糖类种类和浓度对花药愈伤组织的诱导率、愈伤组织发生时间、质地、组织学起源有显著影响。激素种类和糖类浓度均显著地影响到了愈伤组织的诱导率,2,4-D在枇杷花药培养中起着关键作用。但是,预处理对促进花药愈伤组织诱导的机制,以及愈伤组织再分化条件,需要进一步完善。

参考文献

[1]张恢志.中国果树志:枇杷[M].武汉:华中农业大学出版社,1990.

[2]张日清,闻丽,刘友垒,等.低温预处理对油茶花药愈伤组织诱导的影响[J].中南林学院学报,2005,25(6):24-28.

[3]陈红,王永清.枇杷花药培养诱导愈伤组织的研究[J].安徽农业科学.2007,35(27):8453-8454.

愈伤组织培养 篇5

用于蛋白亚细胞定位研究的烟草愈伤组织培养条件优化

使用绿色荧光蛋白作为报告基因来研究目的蛋白的亚细胞定位得到广泛应用.使用稳定表达系统研究蛋白的亚细胞定位比较耗时,但可以先选择愈伤组织进行观察以确保构建的载体能够表达.优化了愈伤组织的培养条件,得到了质地疏松柔软的`白色愈伤,不受叶绿体的荧光干扰,便于进行荧光观察.

作 者：夏玉凤 XIA Yu-feng 作者单位：河北师范大学,生命科学学院,河北,石家庄,050016刊 名：河北师范大学学报(自然科学版) ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF HEBEI NORMAL UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE EDITION)年，卷(期)：30(3)分类号：Q786关键词：稳定表达 亚细胞定位 融合蛋白 愈伤组织

金银花愈伤组织的诱导 篇6

关键词：愈伤组织；金银花；组织培养；诱导培养基；配方；IAA；NAA；6-BA；最佳浓度

中图分类号： S567.7+90.43 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）03-0038-03

金银花（Lonicera japonica Thunb）别称银花、双花、忍冬、二宝花，是忍冬科忍冬属多年生半常绿木质藤本植物[1-2]。金银花单叶对生，叶片卵形或长卵形，两面被柔毛；每叶腋内由二花组成一小聚伞花序，花两侧对称，花冠唇形，初开时为白色，2～3 d后变成金黄色，故名金银花[3]，花期为4—6月。金银花喜温暖湿润气候，适应性比较强，对土壤要求不严，耐寒、耐旱、耐涝，除东北、西北等高寒、干旱地区和海南外，全国各地均有分布。金银花全草均可入药，其主要药用成分是绿原酸和异绿原酸，具有清热解毒、除火、消炎等多种功效，主治温病、风热感冒、咽喉肿痛、痛肿溃疡、痢疾、丹毒、肺炎等症[4]。金银花的花蕾含有挥发性芳香油、皂苷、绿原酸、肌醇和黄酮类化合物等，还含有肉桂酸、茉莉醛、橙花醇等；其茎中含有生物碱；其叶中含有忍冬苷、忍冬素和木樨素等。根据药理研究，金银花对大肠杆菌、痢疾杆菌、葡萄球菌和肺炎双球菌等有抑制作用[5-6]，是我国著名的豫产道地中药材之一。尤其是在2003年的“非典”时期，以金银花为重要成分的中草药对“非典”的预防作用十分显著。金银花除了作为用途广泛的中药材外，还具有良好的保健作用。此外，金银花茶香气宜人，对防治盛夏中暑、风热感冒、上呼吸道感染和肠胃疾病有良好的效果，可以制作饮料。尤其是对清除人体自由基、提高人体免疫机能和延缓衰老等具有良好的作用，因而也是高血压和心血管系统患者降低胆固醇的保健佳品。金银花花开清香宜人，黄白相间，繁华密布，也是优良园林绿化植物。目前，金银花仍采用传统的扦插和压条2种繁育方式[7]，但这些传统的繁殖方式繁殖速度慢、繁殖系数低，繁殖的苗木规格不一，商品化程度不高，不能满足金银花优良品种迅速推广种植的需要，因此，如何提高其繁殖速度，增加繁殖系数，并使其迅速推广种植已成为金银花生产中亟待解决的一个重要问题。而国内外对金银花的研究多集中在栽培、管理、加工、药理、制剂等方面，关于其组织培养、离体快繁的研究[8-9]却报道得极少，仅见有凤爪金银花[10]和蒙花1、2号金银花[11]的组培报道，但封丘金银花组培还未见有报道。本试验以新乡学院校园内的封丘金银花品种的叶片为外植体，在不同浓度的MS培养基上进行愈伤组织诱导，通过对照不同的激素组合，以探索金银花的愈伤组织诱导的最佳条件，为金银花的快速繁殖和充分利用打下良好基础。

1 材料与方法

1.1 材料选择

从新乡学院校园内采集健壮的封丘金银花幼茎，剪取叶片为外植体进行培养。取材时间为3月中旬至4月下旬。

1.2 试验方法

1.2.1 配制培养基

试验以MS培养基为基本培养基，以不同的生长调节物质浓度组合共设计采用了50组愈伤组织诱导培养基M1～M50：MS+（0.1～1.5） mg/L IAA/NAA+（0.1～2.0） mg/L 6-BA（表1），每组做3个对照。所有培养基均添加3%蔗糖、0.65%琼脂，调至pH值至5.8，分装于培养瓶内，每瓶25 mL，封口后在121 ℃条件下灭菌20 min，并且将重蒸水、镊子、打孔器、滤纸用聚丙烯薄膜包装后一并灭菌[12]。待培养基冷凝后，放入超净工作台，紫外线表面灭菌 1 h，准备接种。

1.2.2 获得无菌材料

取新鲜的叶片，先用流水冲洗 30 min，然后放到超净工作台上，用75%乙醇灭菌30 s，无菌水冲洗4次，再用0.1% HgCl2灭菌8 min，无菌水冲洗4次[13-14]，用无菌滤纸吸干材料表面的水分。

1.2.3 愈伤组织的诱导

用打孔器将材料切成大小均匀的若干小圆片，将材料接种在M1～M50培养基上，先经暗培养24 h，然后置于25 ℃培养箱中培养。

2 结果与分析

2.1 培养接种30 d后的观察结果

以叶片为外植体，叶片切口处有膨大现象最早是第6天，10 d后大多数成活叶片切口处均有膨大的现象，14 d后有白色颗粒状的愈伤组织出现。这与赵慧贤等的组培报道中以叶片为外植体的形成时间[15]略有差异，这可能与金银花的品种不一样有关。

从愈伤组织组数观察结果（表2）中可以计算出，在愈伤组织在形成过程中，150瓶培养瓶中污染率为6.00%，死亡率为18.67%，诱导率为76.99%（诱导率为诱导数除以除去污染数和死亡数的接种总数）。

2.2 不同浓度的生长素对愈伤组织诱导的效果

试验结果（表3、表4）表明，IAA和NAA都是在0.5～1.0 mg/L 的浓度范围内诱导效果较好。其中又以NAA 浓度为1.0 mg/L 时效果最好，诱导率最高，达91.67%。随着 1.0 mg/L 浓度升高诱导率下降；当浓度低于0.5 mg/L 时，诱导效果也欠佳。IAA浓度为1.0 mg/L时诱导率也较高，达到88.89%。这与刘连芬等的组培报道中金银花愈伤组织形成的最佳生长素浓度结果[16]基本一致。

2.3 不同濃度的细胞分裂素对愈伤组织诱导的效果

试验结果（表5、表6）表明，生长素为IAA或者NAA的情况下，6-BA都是在1.5 mg/L的浓度诱导效果较好，诱导率高达100%。

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2.4 不同生长素/细胞分裂素组合对愈伤组织诱导的效果

接种14 d后，叶片外植体開始变绿且变厚，接触到培养基的外植体表面长出米粒状的白色愈伤组织。30 d后，叶片愈伤组织以深褐色和淡黄色为主，深褐色的愈伤组织结构紧密，质地较硬，呈不透明状；淡黄色的愈伤组织结构松散，质地松软，呈透明状。对比发现M3、M8、M15、M16、M17、M19、M22、M24、M29、M31、M34、M39、M42、M44、M47、M49效果较好（表7），生长速度快且愈伤组织多，其中又以M44（MS+15 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA）效果最好。因此较理想的金银花愈伤组织诱导培养基配方是MS+1.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA。

3 讨论

本试验中叶片的污染率（6.00%）较高，可能是因为叶片与空气接触的时间较长，被空气中的微生物侵染的几率较大，也可能是因为在灭菌过程中，灭菌剂浓度较低或者灭菌时间较短；死亡率（18.67%）较高，这可能是因为叶片脱毒时操作时间过长对叶片组织破坏，也可能是因为接种时镊子在酒精灯上烤烧的时间过长，冷却较慢，容易烫伤叶片。试验观察到的2种不同状态的愈伤组织，哪一种更适合做传代培养[17]，这还需要进一步研究。此外，因试验条件和试验时间的限制，本试验接种组数较少，故其数据不具有普遍推广意义。

参考文献：

[1]王光全，孟庆杰，张志忠. 金银花生物学特性及其栽培利用[J]. 江苏林业科技，2000，27（6）：36-37.

[2]王恒波，袁月芳. 金银花繁育栽培技术[J]. 河北林业科技，2003（3）：38-39.

[3]马清温，丁作超，孙震晓，等. 山东药用植物[M]. 济南：山东科学技术出版社，1998.

[4]陈志远，祁承经，汤庚国，等. 树木学：南方本[M]. 北京：中国林业出版社，2005.

[5]赵国玲，刘佳佳. 金银花化学成分及药理研究进展[J]. 中药材，2002，25（10）：762-763.

[6]王林青，崔保安，张红英. 金银花药理作用研究进展[J]. 中国畜牧兽医，2007，34（11）：91-95.

[7]杨小红. 金银花的培养[J]. 植物杂志，1989（5）：8.

[8]王天志，李永梅. 金银花的研究进展[J]. 华西药学杂志，2000（4）：292-294，298.

[9]于生兰，张 龙，孙 玲.金银花的研究进展[J]. 时珍国医国药，2002，13（8）：498-500.

[10]王光全，孟庆杰，孟庆军. 凤爪金银花的组织培养技术[J]. 河北林业科技，2002（5）：25.

[11]仇 键，谭晓风.蒙花1、2号金银花的组织培养与快速繁殖[J]. 中南林学院学报，2005，25（4）：53-56.

[12]杨 峰，刘巧莲，代真真，等. 不同基本培养基和外植体对剑麻愈伤组织诱导及分化的影响[J]. 热带作物学报，2012，33（3）：475-478.

[13]李景刚，孙满芝. 良种金银花的组培快繁技术研究[J]. 山东林业科技，2004（6）：36-37.

[14]戴小英，洪林育，龚 斌，等. 金银花优良无性系离体快繁研究[J]. 江西林业科技，2010（6）：10-11，15.

[15]赵贤慧，刘庆华，王奎玲，等. 诱导红金银花愈伤组织的影响因素研究[J]. 山东林业科技，2007（1）：9-11.

[16]刘连芬，钱关泽. 金银花（Lonicera japonica Thunb.）愈伤组织的诱导和分化[J]. 聊城大学学报：自然科学版，2007，20（4）：48-50，107.

[17]曹方莉，王晓明，赵思东，等. 花蕾型金银花同源四倍体的诱导和鉴定[J]. 安徽农业科学，2008，36（9）：3619-3621.

愈伤组织培养 篇7

影响植物愈伤组织诱导、继代生长和次生代谢产物含量的因素很多, 主要可以分为植物自身因素、培养基因素和环境因素。植物因素包括植物的基因型、外植体的来源、种类及生理状态等;培养基因素包括培养基的种类、成分和配制方法等;环境因素包括培养材料所需的光照、温度、湿度和气体成分等因子。

本研究则系统地研究了多种因素对荞麦愈伤组织诱导、继代生长和黄酮含量的影响, 并获得了高黄酮含量、生长旺盛的荞麦幼叶愈伤组织, 为进一步的荞麦细胞悬浮培养生产荞麦黄酮奠定了坚实的基础。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

荞麦, 吉乌1号, 由本试验室提供;培养基, MS培养基;6-BA, IAA均购于美国Sigma公司。

1.2 试验方法

1.2.1 荞麦愈伤组织的培养

(1) 荞麦种子的采集。直接采集10月中旬到11月份的健壮、饱满的种子晒干后贮存于干燥箱中。种子萌发前于4℃冰箱中预先处理14d。

(2) 荞麦无菌苗的获得。用自来水冲洗荞麦种子并用清水浸泡过夜。剥去种壳, 在75%酒精消毒30s, 无菌洗2次, 再用0.1%升汞消毒5min, 无菌水冲洗5次, 最后用无菌滤纸吸干种子表面水分, 消毒处理的种子接种于无激素的1/2MS培养基上, 暗培养。待种子萌发后移入光照培养箱于25℃培养。

(3) 荞麦茎和叶片愈伤组织的诱导。取无菌苗的茎和叶片作为外植体, 将茎段切成0.5cm2左右长的小段, 将叶切成0.5cm2块, 分别接种于含不同浓度组合的6-BA (mg/L) 和NAA (mg/L) 的Ms固体培养基上愈伤组织, 记录其发生时间并统计诱导率, 确定最佳激素组合。在含最佳激素组合的MS培养基上进行固体继代培养, 每隔20d继代1次。

(4) 高黄酮含量愈伤组织的目视法筛选。采用目视法可初步确定愈伤组织的生长快慢、褐化状况及颜色特征等情况。从MS添加6-BA和NAA的最佳激素组合的固体培养基上连续继代3次的愈伤组织中挑选出生长较快或不易褐化、或颜色为红色 (这类愈伤组织的类黄酮含量可能较高) 的愈伤组织。

(5) 高黄酮含量愈伤组织的分光光度法筛选。将目视法筛选出的愈伤组织用722可见光分光光度计 (上海校光) 对其类黄酮含量测定, 筛选出类黄酮含量高的愈伤系。

1.2.2 标准曲线的获得

愈伤组织类黄酮含量的测定采用紫外分光光度法, 具体如下:精密称取经冷冻真空干燥后的芦丁标准品97.6mg, 用70%的酒精定容于100mL容量瓶中, 得到芦丁标准品溶液。分别吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0mL芦丁标准品溶液于25mL容量瓶中, 加5%NaNO2溶液1.0mL, 混匀, 放置6min;加10%Al (NO3) 3溶液1.0mL, 混匀, 放置6min;加1mol/L NaOH溶液10mL, 再加去离子水至刻度, 摇匀, 放置15min, 于500nm处测吸光度 (A) 。记录各吸收波长并绘制曲线。

1.2.3 总黄酮含量测定

将荞麦完全展开的叶片及其30d龄的愈伤组织, 流水清洗后沥干, 真空冷冻干燥 (-50℃, 24h) , 研磨后过40目筛。取100mg干粉于100mL容量瓶中, 加入100mL 70%的酒精, 60℃水浴并振荡5h, 过滤, 用70%的酒精定容, 取样品1mL于25mL容量瓶中, 加5%NaNO2溶液1.0mL, 混匀, 放置6min;加10%Al (NO3) 3溶液1.0mL, 混匀, 放置6min;加1mol/L NaOH溶液10mL, 再加去离子水至刻度, 摇匀, 放置15min, 于500nm处测吸光度 (A) 。试剂空白作参比。根据回归方程及测得的吸光度 (Ai) 计算出样品中总黄酮的浓度 (Wi) 。将叶片及其愈伤组织干粉中总黄酮含量定为字母X, 用计算公式表示为:

每种植物随机选取3株, 每株植物测3次, 求得平均值作为衡量该种植物的指标。

2 结果与分析

2.1 荞麦无菌苗的获得

消毒的荞麦种子暗培养2~4d后, 约97%的种子萌发, 25℃条件下, 光照培养10~15d后长成5~6cm高的无菌苗。

2.2 愈伤组织的诱导

愈伤组织的形成, 是已经停止分裂活动的组织细胞产生一种返老还童现象, 并再次呈现其分裂机能的过程。生长素能促进己分化的组织细胞解除分化, 并促进细胞生长。但不同种类, 不同浓度的生长素对于启动细胞恢复分裂的能力是不同的。细胞分裂素最明显的生理作用是促进细胞分裂。细胞分裂素同时具有促进分化, 延迟衰老, 增强蛋白质合成的特点。它常和生长素配合使用, 共同影响愈伤组织形成过程。为此, 在相关文献基础上, 我们选用了生长素NAA和细胞分裂素6-BA进行不同浓度组合诱导愈伤组织。以无菌苗的茎段和叶片作为外植体进行愈伤组织的诱导, 结果见表1。

由表1可知:茎和叶的愈伤组织都容易诱导。在添加2.0mg/L 6-BA和0.5mg/L NAA的MS培养基上, 通过14d的诱导, 茎可获得100%的诱导率。叶片愈伤组织在添加l.5mg/L 6-BA和1.0mg/L NAA的MS培养基上诱导16d, 可获得100%的诱导率。

2.3 高黄酮含量荞麦愈伤组织的筛选

2.3.1 目视筛选法

荞麦茎段轴与叶片分别在MS培养基添加2.0mg/L6-BA和0.5mg/LNAA的培养基和MS培养基添加1.5mg L 6-BA和1.0mg/L NAA的固体培养基上经系统诱导并连续继代3次, 获得了大量的稳定愈伤组织。采用目视法初步筛选出生长较快和质地疏松、继代稳定的愈伤系, 结果如图1所示。其中红色和绿色, 质地疏松, 继代稳定的愈伤系主要来源于叶片的诱导;而褐色和白色的愈伤系主要来源于茎段的诱导, 且继代后褐变严重。

2.3.2 分光光度法筛选

标准曲线的绘制:标准曲线的获得愈伤组织类黄酮含量的测定采用紫外分光光度法, 具体如下:精密称取经冷冻真空干燥后的芦丁标准品97.6mg, 用70%的酒精定容100mL容量瓶中, 得到芦丁标准品溶液。分别吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0mL芦丁标准品溶液于25ml容量瓶中, 加5%NaNO2溶液1.0mL, 混匀, 放置6min;加10%Al (NO3) 3溶液1.0mL, 混匀, 放置6min;加1mol/L NaOH溶液10mL, 再加去离子水至刻度, 摇匀, 放置15min, 于500nm处测吸光度 (A) 。记录各吸收波长并绘制曲线。

3 讨论

植物愈伤组织的诱导是建立植物组织培养和利用植物细胞生产次生代谢产物的第一步。愈伤组织的质量将影响其后期工作的成败。生长速度快、目标次生代谢物质产量高的愈伤组织能大大缩短培养周期、降低工业生产成本, 使利用植物细胞生产次生代谢产物实现商业化成为可能。愈伤组织的形成过程是一个外植体、基本培养基、生长调节物质和外界环境条件等诸因素之间相互作用的复杂过程, 诸因素的作用机制还不十分清楚。一般认为愈伤组织形成过程大致分为3个阶段, 即诱导、细胞分裂和细胞分化。在诱导阶段, 外植体组织受外界条件的刺激改变了原有的代谢方式, 并开始为细胞分裂做准备。随后, 细胞经历了一个“脱分化”的过程转变成类似于分生组织的细胞, 即进入细胞分裂阶段。这时愈伤组织细胞团是拟薄壁组织, 分化程度较低, 进一步培养使愈伤组织进入一个细胞分化时期, 此时有导管成分的出现和某些次生代谢途径的形成。在本试验中, 分别用叶和茎为材料, 选用了不同浓度比例的6-BA和NAA进行荞麦愈伤组织的诱导, 都能较容易快速的获得愈伤, 并且不同质地的愈伤组织连续继代培养后, 最终形成了具有不同颜色和质地硬度不同的生长状态稳定的愈伤组织。

组织来源是影响植物细胞培养物次生代谢产物积累的重要因素之一。一般认为若用次生代谢产物含量高的植物或器官外植体诱导出来的愈伤组织进行培养, 其培养物中次生物质的含量也高。用烟草试验证明, 来自高尼古丁含量的烟草的愈伤组织中其尼古丁含量也高 (KimeSley, 1981) 。在研究长春花组织培养中生物碱的形成时, 也发现高产株产生的愈伤组织, 其生物产量也高 (Zenk, 1977) 。

本试验研究发现愈伤组织培养物中次生代谢产物含量的区别表现在器官类型上, 荞麦花中的黄酮含量是最高的, 叶、茎和根依次次之, 而由幼叶、幼茎和幼根诱导而来的愈伤组织中黄酮含量也依次降低。

以上的研究表明:荞麦组织培养物中黄酮含量与荞麦自身有很大关系, 因此在进行荞麦愈伤组织诱导时, 由叶诱导而来的愈伤组织中黄酮含量高于由茎诱导而来的愈伤组织中的黄酮含量, 所以用优良的幼叶愈伤组织进行了细胞悬浮培养的研究。

参考文献

[1]张长河, 刘幸福, 余龙江, 等.低密度和条件培养对红豆杉细胞生长的影响[J].生命科学研究, 2000, 4 (3) :222-227.

[2]胡赞民, 邓向东.马铃薯脱毒微型薯人工种子工厂化生产技术研究[J].中国科学院院刊, 2001, 16 (5) :361-364.

[3]刘春朝, 王玉春, 欧阳藩, 等.生物反应器技术用于植物组织培养的研究进展[J].化工冶金, 1999, 20 (3) :329-336.

[4]Zhong J.J., Wang S.J..Eeffets of nitorgen soure on the produe-tion of ginseng saponin and polysaccharide by cell cultures of Panxa quinqueflium[J].Poreess Bioehemistty, 1998, 33 (6) :671-675.

[5]Liu S., Zhong J.J..Eeffet of potassiumiononeell growth and pro-dution of ginseng saponin and polysaecharide in suspension cultuers of panax ginseng[J].Jounral of Biote hcnology, 1996 (52) :121-126.

愈伤组织培养 篇8

1 材料和方法

1.1 材料

江西吉安青原区白云山林场陈山红心杉嫁接种子园未成熟球果,2006年8月采摘。种胚经无菌处理后诱导获得胚性愈伤组织,本次试验采用的愈伤组织材料的获得方法详见参考文献[3][3]。

1.2 方法

将愈伤组织切成约10 mm×10 mm块状,接种于附加不同浓度的NAA或2,4-D,编号1~16培养基上,每组接种25瓶,每瓶接种1块愈伤,每个试验重复3次。

培养基:

培养基灭菌后称重,接种后立即称重,两者相减得接种愈伤质量,48天后称重培养瓶,用镊子仔细取出愈伤组织(若带出了培养基,用镊子放回瓶中),再称量瓶子,两者相减得到愈伤组织的质量,计算愈伤组织的增长率。

愈伤组织增长率(%)=(培养后愈伤组织的质量-接种时愈伤组织的质量)/接种时愈伤组织的质量×%

培养条件:温度25(±2)℃,光照时间14 h/d,光照强度1 500~2 000 lx,培养基p H 5.8,蔗糖30 g/L,卡拉胶6.4 g/L,灭菌温度121℃,灭菌时间18 min。

2 结果与分析

2.1 2,4-D对愈伤生长的影响

将材料接种于编号为1~8,附加了2,4-D的MS培养基上,愈伤组织的生长情况如表1。

从实验结果可看出,2,4-D浓度在0.1~1.0 mg/L范围内,愈伤的生长状况差异不大,当浓度超过1.0 mg/L时,愈伤的生长和质地出现下降趋势,适宜的浓度为0.5~1.0 mg/L。2,4-D与6-BA组合试验结果表明,6-BA表现出对愈伤组织生长有抑制作用。

2.2 NAA对愈伤组织生长的影响

材料接种于附加了NAA,编号9~16培养基上,愈伤组织的生长情况如表2。

实验结果表明,适宜的NAA浓度为0.5~1.0 mg/L,愈伤组织的生长效果和使用2,4-D相当,6-BA与NAA组合同样表现出抑制效果。

3 讨论

在建立了陈山红心杉胚性愈伤组织再生方法的基础上[3],通过对陈山红心杉愈伤组织的增殖培养研究,发现细胞分裂素6-BA无论是与2,4-D组合,还是与NAA组合,对愈伤组织的生长都呈现出抑制作用,NAA与2,4-D对陈山红心杉胚性愈伤组织细胞的分化及生长效果相当,适宜的2,4-D浓度范围为0.5~1.0 mg/L,NAA浓度范围为0.5~1.0 mg/L,但是,在诱导培养阶段,2,4-D的效果明显好于NAA,不同阶段培养对象表现出的这种差异性在杉木其它品种中也是存在的[4]。

摘要：研究不同激素对胚性愈伤组织生长的影响,实验结果表明,陈山红心杉胚性愈伤组织在诱导阶段和增殖培养阶段,NAA对愈伤的增殖效果存在较大差异。在诱导阶段,2,4-D的效果比NAA强得多,但是,在继代培养阶段,NAA也表现出较好的效果,6-BA对胚性愈伤组织的生长显现抑制作用。

关键词：陈山红心杉,胚性愈伤组织,组织培养

参考文献

[1]曾志光,杨先锋,肖复明,等.陈山红心杉材性变异及其基因资源利用的研究[J].江西林业科技,2001(3):1-6.

[2]杨先锋,曾志光.优质陈山红心杉产业化开发的探讨[J].林业科技开发,2003(2):57-58.

[3]黄宝祥,符树根.陈山红心杉胚性愈伤组织的培养[J].江西林业科技,2008(6):21-22.

愈伤组织培养 篇9

1 试验仪器与材料

无菌工作台, 微波炉, 分析天平, 全自动不锈钢双层立式电热蒸汽压力消毒器 (YX.350Z) , 烧杯, 三角瓶 (50ml) , 广口瓶 (100ml) , 量筒 (1000ml) , 容量瓶, 移液枪。本试验所用的试验材料是1个月健康约4cm魔芋试管苗的叶柄。

2 试验方法

2.1 不同取材部位、放置方向及光照条件对魔芋试管苗叶柄培养的影响

以MS+6-BA 0.6mg/L+NAA 0.1mg/L为诱导培养基, 用继代1个月左右的魔芋试管苗, 取叶柄, 切成长2cm左右柄段, 通过对取材部位、放置方向和光照条件3因素, 设计正交试验 (27个处理组合) 来筛选最佳取材部位及培养条件, 每处理接种3瓶, 每瓶放置7个外植体。培养温度在25～28℃条件下进行。

在实验过程中愈伤的环境条件为:光照:光照强度为30μmol·m-2·s-1, 光照时间10h·d–1;散光:光照强度为10μmol·m-2·s-1, 光照时间10h·d–1;暗:光照强度为0μmol·m-2·s-1。上表示魔芋叶柄上端;中表示魔芋叶柄中段;下表示魔芋叶柄下端;正表示自然生长方向;平表示平放于培养基;反表示倒插于培养基。

2.2 不同生长调节剂配比对魔芋试管苗叶柄培养的影响

用继代1个月左右的魔芋试管苗, 切取叶柄, 不分部位, 竖直, 按生长方向插入培养基, 以6-BA、NAA为研究因素, 各设置3个水平 (表2) , 共9个处理组合, 来筛选最佳植物生长调节剂配比, 每处理接种3瓶, 每瓶置7个外植体。在培养温度25～28℃, 光照强度为30μmol·m-2·s-1, 光照时间10h·d–1的条件下 (见表1) 进行正交试验完全试验设计。

2.3 数据统计分析方法

叶柄出愈率%= (叶柄出愈数/接种叶柄数) ×100%, 采用DPS统计分析软件中Duncan新复极差法。

3 结果与分析

3.1 不同取材部位、放置方向及光照条件对魔芋试管苗叶柄诱导率的影响

魔芋叶柄培养过程中逐渐生长, 但部分叶柄因污染而死亡, 存活叶柄在诱导培养基中培养1个月后开始出现膨大现象, 体积增大到原体积的2～3倍, 但此时并未出愈。从表2可以看出, 其叶柄诱导率最高可达75%, 最佳处理组合是第19组合。

将取材部位、放置方向、光照条件的各个单因素分别进行方差分析, 结果见表3。

通过表3可以看出, 取材部位和放置方向对魔芋叶柄愈伤的影响是显著的, 而光照对魔芋叶柄培养的影响不显著。

3.2 不同植物生长调节剂配比对魔芋试管苗叶柄出愈率的影响

从表4中可以看出, 在各个处理中, 以第4个处理出愈最好, 而且和其它组合的出愈率相比达到极显著水平, 在浓度比较低时 (0.1 mg/L) 的愈伤的诱导率和中等浓度 (0.3 mg/L) 的愈伤的诱导率具有显著差异, 高浓度的NAA (1.0 mg/L) 时的愈伤的诱导率和中等浓度 (0.3 mg/L) 的愈伤的诱导率没有显著差异。但高浓度的 (1.0 mg/L) 时的愈伤的诱导率和低等浓度 (0.1mg/L) 的愈伤的诱导率则达到显著差异。因此在魔芋愈伤的诱导过程中, 应该选用低等浓度的NAA才能达到比较好的效果。

所以在本实验中, 以MS+0.6 mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA是魔芋叶柄愈伤诱导的最佳培养基。

4 小结与讨论

4.1 不同取材部位, 放置方向及光照条件对魔芋叶柄组培的影响

本试验结果表明, 魔芋叶柄组织培养的最佳取材部位是魔芋叶柄的植物学下端, 并且以魔芋的上下两端的叶柄段为显著。在取魔芋苗的下端, 通过培养后, 其愈伤诱导率可达到75%。但有的魔芋叶柄在组织培养初期有一点点膨大, 过了1个月后, 并未出愈。这种情况是因为在接种的时候有污染。在以前做过的组织培养的试验, 大多是以魔芋球茎, 茎尖作为组织培养的材料[4], 但本试验以魔芋试管苗的叶柄做为试验材料。经研究魔芋幼嫩鳞叶和叶柄是理想的外植体, 而且不会因为多次的切割和继代培养而影响分化能力。

4.2 不同生长调节剂的配比对魔芋试管苗叶柄培养的影响

以前的试验多以结构致密、颜色粉的愈伤做分化培养, 但存在褐化严重的现象, 我们得到组织白嫩, 稍带绿的愈伤, 褐化少, 下一步需继续开展其分化条件研究, 看是否能解决魔芋组培褐化问题。褐变的防控措施:选择魔芋的外植体年龄越小、切取外植体的体积适当的较大、避免在高温季节采收外植体并对其进行预培养;培养基中生长激素2, 4-D浓度适当的降低和细胞分裂素浓度相对提高;把培养基放在低温和黑暗条件下进行培养;接种时将培养体切面浸入培养基中, 将初代接种后的外植体尽快转移到新鲜培养基中;在培养基中分别添加活性炭 (500mg/L) 、半胱氨酸、二氧化硫、 (100mg/L) PVP (聚乙烯毗咯烷酮) 或抗坏血酸 (Vc) 等都能有效降低魔芋组织培养中的褐变率[5]。不过由于时间问题, 本试验就只能做到愈伤膨大。

摘要：以1个月健康试管魔芋苗的叶柄作为组培对象, 研究魔芋叶柄愈伤诱导的最适培养条件和最适生长调节剂的浓度。分别确定了叶柄愈伤诱导的最佳培养条件为:取材部位、放置方向、光照条件的不同为实验因素, 测出其诱导率最高为75%;魔芋叶柄愈伤诱导的最佳生长调节剂配比为6-BA0.6mg/L:NAA0.1mg/L, 愈伤诱导率最高达50%。通过取材部位、放置方向及光照条件的试验发现, 魔芋在组织培养时, 以切取魔芋苗的下段和上段, 并以正方向插入培养基中的这种培养方法为最好。而在生长调节剂对魔芋叶柄培养影响的试验中, 选用中等浓度的6-BA (如0.6mg/L) 和低等浓度的NAA (如0.1mg/L) 才能达到比较好的效果。

关键词：魔芋,叶柄,愈伤

参考文献

[1]刘佩瑛, 孙远明, 张盛林.魔芋农家品种的选育研究[M].上海:上海科技出版社, 1990, 45～50.

[2]胡建斌.魔芋种芋生产中的问题及解决途径[J].贵州农业科学, 2007, (01) :30～32.

[3]胡建斌, 柳俊, 魔芋属植物组织培养与遗传转化研究进展[J].植物学通报, 2008, 25, (1) 14～19.

[4]苏承刚, 张兴国.南蛇棒魔芋的组织培养与植株再生研究[J].西南农业大学学报, 2003, 25 (5) :393～395.

南丰蜜桔胚性愈伤组织的诱导 篇10

关键词：南丰蜜桔,胚性愈伤组织,花药离体培养,再生

南丰蜜桔是我国的地方良种, 素享“桔中贡品”之美誉 (胡正月等, 2005) 。它以肉质脆嫩化渣、风味浓甜、少核或无核而深受消费者喜爱。进入20世纪90年代后, 由于感染柑桔碎叶病毒等原因, 单产下降, 果实品质变劣, 发生了种性退化, 市场竞争力下降 (吴德喜等, 1990) 。因此, 应用生物技术手段培育无病毒苗木或改良品种就成为目前南丰蜜桔生产中亟待解决的问题。因此开展以离体培养为基础的生物技术育种研究显得尤为重要, 花培技术就是其重要途径。再者, 愈伤组织保存是柑桔种质资源保存的一条值得探索的途径, 具有节省人力、物力、财力以及避免自然灾害和病虫害等优点 (张俊娥和邓秀新, 2007) 。目前, 国外仅有意大利报道柑桔类花药组织培养再生出不定芽, 但其再生率很低 (Germana et al., 1998) ;国内尚未出现研究成功的报道, 笔者以花药为外植体, 建立南丰蜜桔的胚性细胞系, 为今后进行与其有关的原生质体融合, 转基因研究, 纯系二倍体和无核品种以及种质资源离体保存奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

以南丰蜜桔“杨小—26”为应试品种, 材料取自花蕾发育的各个时期, 并保持花粉无污染。

1.2 方法

1.2.1 材料预处理:

先低温预处理, 将花蕾放于

4℃冰箱72h后, 再振荡培养 (60转/min) , 消毒, 将花蕾接种于液体培养基, 振荡暗培养9d。

1.2.2 消毒:

整个花蕾于25%NaCl溶液中消毒20min, 无菌水冲洗3遍。

1.2.3

将预处理的试验材料剥离花药, 接种固体培养基中, 暗培养28d后, 进行光培养, 每20d继代1次。

1.2.4 培养基:

(1) MT+TDZ 30mg/L+A1.0 3.0mg/L+NAA 1.0mg/L+10mg/L AgNO3; (2) MT+TDZ3.0mg/L+A1.0 3.0mg/L+NAA 1.0mg/L; (3) SH+TDZ 30mg/L+A1.0 3.0mg/L+NAA 1.0mg/L+10mg/L AgNO3; (4) SH+TDZ 3.0mg/L+A1.0 3.0mg/L+NAA 1.0mg/L; (5) LP+TDZ 30mg/L+A1.0 3.0mg/L+NAA 1.0mg/L+10mg/L AgNO3; (6) LP+TDZ 3.0mg/L+A1.0 3.0mg/L+NAA 1.0mg/L。

愈伤组织培养基加蔗糖30g/L, 琼脂6g/L, 继代培养基加蔗糖50g/L。KT、AgNO3和A过滤灭菌。

1.3 培养条件

本文无特殊说明, 培养温度均为26℃, 光照3000Lx, 光周期为16h/d。

2 试验结果与分析

2.1 花药培养

2.1.1 愈伤组织形成。

预处理后的花药离体培养1周左右, 颜色开始由黄色变淡黄至黄褐色, 同时在花药中心线一侧出现淡褐色小点。2周左右某些花药颜色发亮, 经过l～2天, 发亮的花药从缢痕处生出小白点, 逐渐扩大体积, 颜色由白变淡黄或黄绿色 (图1) , 这就是愈伤组织绝大多数在20天左右形成愈伤组织, 从其外形看有紧实和疏松2种, 前者为黄绿色, 后者为黄白色。紧实型中又分表面光滑和不光滑两种。前者颜色较深, 在培养过程中慢慢老化死亡或不分化。后者生长旺盛分裂能力强, 分化能力强。而未经过预处理的花药无愈伤组织形成。

2.1.2

胚性愈伤组织形成, 愈伤组织鲜重达到30g时 (图2) , 继代培养60d, 有胚状体产生 (图3) , 再继代60d生出胚性愈伤组织 (图4) .

2.1.3 花粉发育时期与胚性愈伤组织形成。

只有单核靠边期的花药适于生长出愈伤组织和胚性愈伤组织。

2.1.4 培养基对胚性愈伤组织的影响。

由表1可以看出, 花药在6种培养基均可生出愈伤组织, 平均愈伤组织发生率均在80%以上, 培养基对愈伤组织再生无显著差异。培养基配方对胚性愈伤组织的生长有重要的作用, 1和2培养基上无胚性愈伤组织生长, 3、4、5和6培养基上有利于胚性愈伤组织生长, 5和6培养基较适于生长, 并且5和6培养基的胚性愈伤组织发生率显著高于3和4。培养基配方有否AgNO3对胚性愈伤组织生长无显著差异。

3 讨论

本研究发现, 取花药时的小孢子发育时期很关键, 这关系到是否能产生胚性愈伤组织。南丰蜜桔花药培养的最佳时期是单核靠边期, 而在大多数瓜类花药培养中, 选用的都是花粉单核靠边期 (董艳荣, 2002) (陈振光, 1995) 。

预处理包括离心、低温、高温和热激, 目的是从形态上改变极性分布, 从生理生化上改变细胞生理状态, 而改变其分裂方式和发育途径。本试验采用预处理是低温和震荡培养, “杨小26”的胚性愈伤组织发生率最高达20.3%, 验证了陈英等 (1997) 的研究结果。

本试验结果表明, MT培养基不适合花药组织培养, 这与柑桔类胚性愈伤组织研究结果不符 (张俊娥等, 2003) , 尚需试验进一步验证。LP和SH培养基适合做花药组织培养, 这为高硝态氮培养基较适合于木本果树离体再生研究提供一个佐证 (Khachatourian et al, .2002) 。笔者发现培养基配方中AgNO3对胚性愈伤组织生长无显著影响, 而谭祖国 (1998) 、李韬等 (1997) 分别将Ag NO3应用于红江橙、朋娜、纽贺尔、芦柑、雪柑的胚珠培养中, 克服了难获得胚性愈伤组织的难题, 获得了相应的胚性细胞系, 这或许因为离体器官不同所致。

参考文献

陈英丁海付贵荣黄永芬汪清胤转基因番茄的花粉组织培养哈尔滨师范大学自然科学学报199713 (2) .

陈振光.园艺植物离体培养学.中国农业出版社, 1995.23-25

董艳荣.甜瓜花药再生体系的基础研究.南京农业大学 (硕士论文) , 2002

胡正月罗省根胡冬英实施"金牌"战略提高南丰蜜橘含金量现代园艺2007.1

李韬, 芦柑、雪柑胚性愈伤组织的诱导[J].福建果树, 1997, (101) :11-12.

舒广平吴德喜.柑橘碎叶病毒生物鉴定研究.中国柑橘, 199019 (I) :47-49

谭祖国.红江橙原生质体分离培养以及植株再生的研究[D].江西农业科技, 1998, (4) :28-31.

谭祖国, 万蜀渊.朋娜和纽贺尔脐橙胚珠离体培养获得无病毒珠心苗方法研究[D].湖北农业科学, 1998, (4) :43-45.

愈伤组织培养 篇11

关键词：三叶木通；愈伤组织；分化

中图分类号：S567.904.3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）07-0050-03

三叶木通[Akebia trifoliata （Thunb.） Koidz]是木通科（Lardizabalaceae）木通属（Akebia）的一种果实营养价值较高的半落叶藤本野生果树[1]，别称八月瓜、八月扎、炸瓜。主要分布于中国甘肃南部、陕西南部，湖南、湖北、山西、河南等地也有少量分布[2]。研究发现，三叶木通种子脂肪酸含量较高，且主要以不饱和脂肪酸为主[3]；果实味美、营养丰富，蛋白质、氨基酸、可溶性糖、有机酸和矿物质含量也很高，被誉为果中之王[4]，具有较高的经济价值和开发价值。三叶木通是中国传统中药，有清心火、利小便、通经下乳作用[5]。近年来，国内学者对三叶木通的研究主要集中在药用成分分析以及扦插栽培等方面[6-7]，组织培养方面研究较少，目前，只有愈伤组织诱导的研究，且诱导率较低，尚无关于三叶木通愈伤组织分化成苗的相关报道。本试验对三叶木通下胚轴愈伤组织诱导及分化进行了研究，研究不同生长调节剂种类、浓度组合对三叶木通下胚轴再生的影响，以期建立三叶木通下胚轴高效离体再生体系，为其遗传转化体系的建立奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

三叶木通种子由湖南怀化种植基地提供。

1.2 方法

1.2.1 无菌外植体的获取 挑选富有光泽、饱满的种子，置于超净工作台内，无菌水浸泡24 h，使其充分膨胀。75%的乙醇浸泡30 s，无菌水冲洗3次，0.1%的氯化汞浸泡10 min，无菌水冲洗3次，置于无菌滤纸上吸干多余水分，用解剖针划开种皮，将胚取出，分别接种于MS培养基、1/2 MS培养基、MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L和1/2 MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L培养基中诱导种子萌发，24 h光照培养7 d，统计试验结果。

1.2.2 愈伤组织诱导培养基的筛选 切取长度约为5 mm的三叶木通下胚轴，以MS为基本培养基，选用3因素3水平正交试验设计L9（33）方案，观察2，4-D、NAA、KT 3种植物激素的浓度及配比对愈伤组织诱导的影响（黑暗培养），每瓶接5个材料，每组处理10瓶，40 d后统计愈伤组织诱导结果。

1.2.3 光照对愈伤组织诱导影响及抗褐化剂的筛选 切取长度约为5 mm的下胚轴，接种于MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L中，分别进行黑暗、光照、黑暗20 d再光照 20 d 3种处理方案培养，定期观察并记录生长情况，40 d后统计试验结果。将约5 mm大小的外植体接种于愈伤诱导培养基MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L中，分别添加维生素C 10、20、50 mg/L，AC（活性炭）0.5、0.8、1.0 g/L，PVP（聚乙烯吡咯烷酮）0.6、0.8、1.0 g/L的抗氧化剂和吸附剂，以不添加任何抗褐化剂和吸附剂作为空白对照，黑暗处理，40 d后统计愈伤组织的褐化程度及生长状态。

1.2.4 愈伤组织分化培养基的筛选 将长势较好的愈伤组织转移于培养基：（1） MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVP 0.6 g/L；（2） MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA0.2 mg/L+PVP 0.6 g/L；（3） MS+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVP 0.6 g/L；（4） MS+TDZ 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVP 0.6 g/L，每瓶接5个材料，每个处理重复10瓶。黑暗处理 10 d 后，光照培养，50 d后分别观察并记录愈伤组织分化结果。

1.2.5 培养条件 培养基pH值为5.8～5.9，琼脂8 g/L，蔗糖30 g/L，培养温度（24±1） ℃，培养室湿度为60%～70%，光照时间为24 h/d（黑暗处理及光照试验除外），光照度为1 200～1 500 lx。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对无菌外植体获得的影响

观察发现，3 d后接種在MS和1/2MS培养基中的种胚变绿且子叶张开，下胚轴开始伸长；另外2组培养基几乎没有变化。7 d后不同培养基中的下胚轴长度存在差异，子叶形态也不同（表1）。接种于MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L和1/2 MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L培养基中的种胚不能形成健壮幼苗，发育畸形。因此，将MS培养基作为获得外植体的最佳培养基。

2.2 愈伤组织诱导培养基的选择

观察发现，接种7 d左右下胚轴两端切口处开始膨大，40 d 后愈伤组织形成，愈伤组织诱导结果见表2。当激素配比为2，4-D 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L时，愈伤诱导率最高，为96.5%。为进一步观察各控制变量是否对观测变量产生影响，利用SPSS软件进行多因素多水平的方差分析，结果见表3。

由表3可知，2，4-D、NAA 2个因素对愈伤组织诱导率的影响都极为显著，KT则不显著。即2，4-D、NAA 2种激素的3种浓度处理间差异均为显著；KT的3种浓度处理间差异不显著。为了筛选2，4-D、NAA的最佳浓度，对2因素进行Duncan检验，结果见表4、表5。

nlc202309041633

2.2.1 2，4-D 3个浓度水平的Duncan检验 多重分析比较结果见表4，2，4-D 3个浓度间差异显著；2.4-D 3.0 mg/L与 4.0 mg/L 差异极显著，就平均值来看2，4-D 2.0 mg/L的诱导平均值最高，因此，确定三叶木通下胚轴愈伤组织诱导适宜的2，4-D浓度为2.0 mg/L。

2.2.2 NAA 3个浓度水平的Duncan检验 多重分析比较结果见表5，NAA的3个浓度间差异显著；而NAA 0.2 mg/L与 06 mg/L 间差异极显著。 就平均值来看， NAA 0.2 mg/L 平

均值最高，因此，确定三叶木通下胚轴愈伤组织诱导适宜的NAA浓度为0.2 mg/L。

试验结果表明，2，4-D、NAA 2种植物激素及其配比对愈伤组织的诱导率有极显著影响，当2，4-D浓度为2.0 mg/L，NAA浓度为0.2 mg/L时愈伤组织诱导率最高。

2.3 光照时间及不同抗褐化剂对愈伤组织的影响

试验结果表明，黑暗处理条件下愈伤组织诱导率最高，且生长状态好，呈浅黄色；光照条件下的愈伤组织褐化率高达100%，愈伤组织呈深褐色；黑暗20 d再光照20 d培养的愈伤组织开始时呈浅黄色，当进行光照培养5 d后观察到约40%愈伤组织开始慢慢变成褐色，20 d后愈伤组织的褐化率高达60%。表明黑暗条件下培养可很大程度上降低三叶木通的褐化。不同抗褐化剂对愈伤组织的影响见表6。

常用抗氧化剂维生素C 及吸附剂AC 并没有起到很好的抗褐化作用，而PVP 0.6 g/L对防止褐化有相对较好作用，本结果与刘香在超声对三叶木通叶片愈伤组织生长及代谢影响得出的结论[8]一致。

2.4 愈伤组织分化培养基的筛选

将愈伤组织接种于培养基后，定期观察分化情况。培养30 d后观察到2号和4号培养基仍未分化且愈伤组织呈黑褐色，35 d后愈伤组织表面有芽点冒出。接种到1号和3号培养基的愈伤组织也有少量呈黑褐色，但已明显分化，呈团簇状。50 d后愈伤分化情况见表7。由表7可以看出，3号培养基MS+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVP 0.6 g/L的长势最好，芽分化程度最高，为适宜分化培养基，分化情况见图1。

3 结论与讨论

本试验中种胚接种于不同的培养基时下胚轴长度存在很大差异，在添加植物激素的培养基中下胚轴的长度较短，可能是由于外源激素与种胚本身内源激素相互作用抑制了生长。种胚接种于1/2 MS培养基中下胚轴长度也较短，可能是大量元素减半而导致种胚在萌发过程中大量元素不足的原因。

三叶木通中含有丰富的酚类物质，因此在愈伤组织培养过程中易发生褐化现象，从而影响培养的效果[9-11]，丰富的酚类物质还会在三叶木通果汁饮料的加工过程导致果汁色泽褐变[12]。光照对愈伤组织诱导过程中的褐化现象有着很强的诱导作用[13]。试验结果，PVP 0.6 g/L对防止褐化有着较好的作用，褐化程度明显降低，可能是与PVP吸附了酚类氧化物质有关。李然红等在甘蓝组织培养中也发现PVP对褐化抑制作用明显[14]。

在组织培养中，外植体的类型以及适当浓度配比的细胞分裂素和生长素都对愈伤组织形成有着很重要的影响[15-16]，本试验以下胚轴为外植体，通过正交设计筛选出适宜诱导愈伤组织的培养基为：MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L。沈国林等以三叶木通叶片为外植体，筛选出最适宜诱导愈伤组织的培养基为MS+2，4-D 4.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+KT 1.0 mg/L[5]，但愈伤诱导率只有87.5%，低于本研究的96.5%，且没有进行分化研究。

本试验在解决了三叶木通愈伤诱导及褐化问题后，利用得到的愈伤组织进行了分化的初步研究，筛选出适宜的分化培养基为MS+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVP 0.6 g/L，为后续快繁体系的建立奠定了基础。

參考文献：

[1]马玉华，王 荔. 三叶木通特性研究进展[J]. 江西农业学报，2011，23（5）：71-73.

[2]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志：第29卷[M]. 北京：科学出版社，2001.

[3]彭涤非，王中炎. 三叶木通种子脂肪酸成分的GC-MS分析[J]. 植物资源与环境学报，2006，15（4）：71-72.

[4]马玉华，王 荔. 三叶木通特性研究进展[J]. 江西农业学报，2011，23（5）：71-73.

[5]沈国林，邵爱娟，黄璐琦，等. 三叶木通愈伤组织培养研究[J]. 中国中药杂志，2007，32（10）：899-901.

[6]张 铮，王喆之. 三叶木通不同部位有效成分含量比较研究[J]. 中药材，2005，28（11）：983-984.

[7]田定科，余志民. 影响三叶木通扦插成活的栽培因素[J]. 湖南农业科学，2009（7）：129-131.

[8]刘 香. 超声对三叶木通叶片愈伤组织生长及代谢影响的研究[D]. 西安：陕西师范大学，2009.

[9]郑颖，秦红玫，黎云祥.台湾桤木组织培养中污染和褐化的防止[J]. 江苏农业科学，2013，41（2）：64-65，117.

[10]黎世龄，汤晓红，陈云风，等. 八月瓜胚乳愈伤组织诱导研究初报[J]. 中国南方果树，2008，37（2）：46-48.

[11]陈永胜，邵志敏，李国瑞，等. 蓖麻花药愈伤组织诱导及防褐化研究[J]，江苏农业科学，2014，42（3）：39-40.

[12]曹 庸，熊大胜，朱金桃. 八月瓜果汁饮料加工中褐变及沉淀的研究[J]. 中南林学院学报，1999，19（3）：48-50，54.

[13]邵志敏，陈永胜，黄凤兰，等. 低温预处理与光照条件对蓖麻花药愈伤组织诱导的影响[J]. 内蒙古民族大学学报：自然科学版，2012，27（2）：189-193.

[14]李然红，于丽杰，李晓东. 甘蓝组织培养中防止外植体褐化的研究[J]. 北方园艺，2009（11）：96-99.

[15]余桂红，张旭，孙晓波，等. 大麦苏啤4号幼胚愈伤组织的诱导及植株的高频再生[J]. 江苏农业学报，2013，29（5）：953-956.

[16]王忠敏，付淑琴，张莉华，等. 迎春花无菌体系的建立以及茎段和叶片愈伤组织的诱导[J]. 上饶师范学院学报，2008，28（3）：61-66.

辐射徐长卿愈伤组织的研究 篇12

关键词：徐长卿,愈伤组织,60 Co-γ射线,变异

徐长卿(Cynanchum paniculatum)为萝藦科多年生草本植物[1],在我国多地有分布[2-3]。因为徐长卿全草含牡丹酚等多种药用成分,使其全草均可入药,具有镇疼止咳、祛风解毒等功效;能治跌打损伤、毒蛇咬伤、风湿疼和湿疹等多种疾病[4-5]。鉴于徐长卿是一味极为常见的中药,需求量甚大,长期大量的采收出售和药用使徐长卿在大连地区几近濒危。为了保护野生资源,张松岩等对徐长卿进行了组织培养及再生体系建立的研究[6],并获得了能保持徐长卿所有植物学性状,收获的药用全草单株均重比野生植株增加16%的定植试管苗。为探讨60Co-γ射线辐射处理对徐长卿愈伤组织的影响,以获得有利变异植株,在张松岩等研究[6]的基础上,对徐长卿的愈伤组织进行了60Co-γ射线辐射研究。

1材料与方法

1.1材料

试验以徐长卿愈伤组织为材料。

1.2方法

1.2.1培养条件经过60Co-γ射线辐射处理后的愈伤组织,除了培养恒温24℃、光照度2 800lx、固体培养基胨力强250g·cm-2的条件外[7],其它培养条件均参见徐长卿研究[6]。

1.2.2愈伤组织辐射处理将在MS+6-BA0.3mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1+ 2,4-D 0.4mg·L-1培养基上由子叶培养的绿色颗粒状愈伤组织从培养瓶取出后,将其分散成较均匀的块状,之后接种到下部相同成分培养基的培养皿中, 进行愈伤组织的继续生长培养,培养至18d愈伤组织开始旺盛生长时,再分别用0(CK)、4、8、12、 16、20、24、28和32Gy(剂量率为1Gy·min-1)8种剂量的60Co-γ射线进行辐射处理,之后转移到光照培养箱继续进行正常培养。培养到25d时,对其致死率和成活愈伤组织的长势进行详细观察统计,每种辐射剂量处理愈伤组织为100块,试验重复3次。

1.2.3不同剂量γ射线辐射处理对愈伤组织分化不定芽的影响将在MS+6-BA 0.3mg·L-1+ NAA 0.2mg·L-1+2,4-D 0.4mg·L-1培养基上由子叶培养的绿色颗粒状愈伤组织从培养瓶取出后,用镊子分散成均匀块状,然后接种到下部为MS+6-BA 0.8mg·L-1+NAA 0.1mg·L-1的愈伤组织分化培养基中,培养8d后愈伤组织块外观上处于旺盛状态时,再分别用0、4、8、12、16、和20Gy 6种剂量的60Co-γ射线进行处理,进行不同剂量的60Co-γ射线处理对愈伤组织分化及变异的影响试验。在试验培养过程中对愈伤组织的变化进行观察。辐射处理后培养到第58天时对愈伤组织块的分化率、变异率和分化不定芽的长势进行详细观察统计。每种剂量每次处理150个愈伤组织块,试验重复3次。变异率为已分化的不定芽占愈伤组织块总数的百分率。

1.2.4变异不定芽的生根培养以用0Gy辐射处理的不定芽作为对照组,每次试验每种辐射剂量分别生根培养60个不定芽。3次试验,每种处理共用180个不定芽进行生根试验。把用8、12、 16Gy 3种辐射剂量处理分化的所有变异的不定芽均从基部切下,进行不同剂量60Co-γ射线辐射处理对分化的变异不定芽生根培养的影响试验。 以1/2MS+NAA 2.0mg·L-1+蔗糖15g·L-1为生根培养基。3次试验共用于试验的变异不定芽数量分别是:8Gy 12个、12Gy 45个、16Gy 56个。培养到30d时对试验结果进行全面统计观察。

1.2.5变异试管苗的移栽和定植把培养的50株对照试管苗经过剂量分别为8、12、16Gy60Co- γ射线辐射处理后,分化培养的变异不定芽生根培养的所有变异试管苗生根培养到25d时,放到温室的光照下炼苗2d后,将试管苗移栽到上半层是干净河沙、下半层为肥沃园土的温室营养钵中,进行不同剂量60Co-γ射线辐射处理对变异试管苗移栽的影响试验。移栽后前13d保持没有直射光、温度19℃以上、湿度80%~90%的环境条件。移栽试验进行3次。

2结果与分析

2.1不同剂量６０Co-γ射线辐射处理对愈伤组织致死率的影响

培养到25d时观察统计,由表1可知,用不同剂量60Co-γ射线对愈伤组织进行辐射处理,产生明显不同的结果。在所试验的8种剂量内,24、 28、32Gy 3种辐射剂量的愈伤组织死亡率为100%;而在8、12、16、和20Gy 4种辐射处理的范围内,愈伤组织死亡率随着辐射剂量的增加而升高。观察统计还表明,经过剂量为4Gy处理的愈伤组织不仅死亡率比对照组低,而且处理后培养到25d时其长势非常旺盛。培养的前期观察表明,辐射处理后培养的前6d,所有处理的愈伤组织外观上基本没有明显变化,而后迅速变褐,培养到15d时,已经变褐的愈伤组织几乎都变成黑色死亡愈伤组织,重复试验观察统计的结果几乎一致。以上结果说明,对徐长卿子叶愈伤组织进行60Co-γ射线进行处理,致死临界剂量为24Gy; 用4Gy的剂量进行处理,能提高成活率,并促进愈伤组织的生长。

注:+++为非常旺盛;++为长势旺盛;+为长势一般;-为死亡。下同。 Note:+++ means very strong;++ means growing strong;+ means growing generally;- means death.The same below.

2.2不同剂量６０Co-γ射线辐射处理对愈伤组织分化不定芽的影响

对辐射处理后的培养结果进行观察统计,3次试验的平均结果见表2,在经过剂量为4、8、12、 16Gy 4种剂量射线处理的愈伤组织的分化率随着处理剂量的增加而降低;而其变异率随着处理剂量的增加而升高。分化出变异类型包括叶片增多、叶片减少并变小、白化、叶色深绿或具紫斑等。 观察还发现,经过剂量为4Gy辐射处理的愈伤组织不仅分化率较高、分化的不定芽长势也非常旺盛,并且未见出现变异性状的不定芽。以上结果说明,用4Gy60Co-γ射线对愈伤组织进行处理, 能提高愈伤组织的分化率,而经过8、12、16Gy 3种剂量辐射处理的愈伤组织,不仅能使分化的不定芽发生变异,而且变异率随着辐射剂量增加而提高。

2.3不同剂量６０Co-γ射线辐射处理对分化的变异不定芽生根培养的影响

由表3可知,在经过8、12、16Gy 3种不同剂量处理并分化的变异不定芽培养的试管苗,其生根率与平均生根数随着辐射剂量增加而降低,并且试管苗的长势都较弱,观察统计还表明,3次重复试验的结果基本一致。结果表明,用8、12、 16Gy 3种剂量的60Co-γ射线对徐长卿的愈伤组织进行辐射处理后,对变异的不定芽生根培养会产生一定的抑制作用。

2.4变异试管苗的移栽和定植

移栽后29d统计观察,经过8、12、16Gy 3种不同剂量γ射线处理的愈伤组织并分化培养的变异试管苗,移栽的成活率随着辐射剂量的增加而降低,其变异试管苗长势也随着辐射剂量的增加而变弱。

移栽后40d进行观察统计(见表4),试验平均结果表明,移栽的150株对照试管苗成活率为96.7%;经过8Gy处理定植7株变异试管苗,成活了5株,成活率为71.4%;经过12Gy处理移栽13株变异试管苗,成活了6株,成活率为45.2%;经过16Gy处理移栽9株变异试管苗,成活了2株,成活率20.2%;经过8、12Gy两种剂量辐射处理移栽成活的试管苗中有5株变异试管苗,为5种变异类型,其中经过8Gy剂量辐射处理的变异试管苗出现了1株生长非常旺盛的变异类型,为有利变异植株。

当这株有利变异试管苗生长到第2年时,以嫩茎为材料,按照张嵩岩的培养方法[6]培养试管苗,并移栽、定植,成活125株试管苗。对其进行观察,结果表明,这种具有有利变异的试管苗不仅保持了野生徐长卿的植物学特征,而且还保持了生长非常旺盛的有利变异性状。10月中旬随机采收了10株这种试管苗的全株和10株野生徐长卿的全株,晒干后10株具有有利变异试管苗的干重比野生植株增重43%,观察的结果也与重量分析结果相同。结果表明,经过8Gy辐射剂量处理获得的有利变异试管苗,其有利变异性状能保持不变,具有遗传性,说明剂量为8Gy的60Co-γ射线辐射处理的徐长卿愈伤组织能选育出有利变异性状的新类型。

3结论与讨论

该研究表明,对徐长卿的愈伤组织进行剂量为8、12、16Gy的60Co-γ射线辐射处理能引起变异,并分化培养出具有变异性状的不定芽和具有有利变异性状的试管苗。这也说明采用一定剂量的60Co-γ射线对徐长卿的愈伤组织进行辐射处理的方法不仅是愈伤组织进行诱变的一条有效途径,也是选育徐长卿新类型的新途径。