定向分化（通用4篇）
定向分化 篇1
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)是干细胞的一种类型,具备干细胞的自我增殖能力和多向分化潜能,广泛存在于全身的结缔组织和器官间质中。由于取材容易,易分离,体外可大量扩增,诱导分化的组织细胞不存在免疫排斥反应,并可向心肌细胞[1,2]、神经元样细胞[3,4]、血管内皮细胞[5]、骨骼肌细胞[6,7]、软骨细胞[8]、脂肪细胞[6,9]、骨细胞[6,10]、肝细胞[11]等多种细胞分化,因此在细胞治疗、组织器官修复、基因治疗等方面显示出巨大的应用潜能。缺血性疾病包括冠心病、脑血管疾病和周围动脉闭塞性疾病, 是严重影响人类健康的一大类疾病,促进血管新生,改善微循环是治疗该类疾病的关键。本实验通过对其体外诱导分化为血管内皮细胞的能力和诱导条件的研究,旨在为临床骨髓间充质干细胞移植治疗缺血性疾病提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
Wistar大鼠(大连医科大学动物中心提供),胎牛血清(Hyclone公司),淋巴细胞分离液(Pharmacia 公司),兔抗八因子相关抗原(Ⅷ- R Ag)多克隆抗体(北京中衫金桥公司),CD34、CD29单克隆抗体(Phar Mingen公司),血管内皮细胞生长因子(VEGF, Cytolab/Peprotech公司),碱性成纤维细胞生长因子(bFGF, Cytolab/Peprotech公司),流式细胞仪 (FACS Calibur, BD公司)。
1.2 骨髓MSCs的分离培养
取健康0.2 kg左右Wistar大鼠1只,在无菌的条件下取出股骨和胫骨,骨剪剪断关节处,用5 ml注射器抽取无血清的L-DMEM将骨髓腔中的骨髓冲入含肝素的小瓶中,将骨髓细胞轻轻吹打制备细胞悬液,1 000 r/min离心10 min,弃上清液,用无血清的L-DMEM重悬细胞,将细胞悬液轻轻重层于等体积的淋巴细胞分离液(比重1.077 g/ml)上,2 000 r/min离心25 min。收集白膜层细胞于另一离心管中,用含10%胎牛血清的L-DMEM洗涤两次(1 000 r/min离心10 min),弃上清液,用含10%胎牛血清的L-DMEM重悬。以1×107cells/cm2密度接种于6孔板中,37℃,5%的CO2,饱和湿度下孵育,倒置相差显微镜下每天观察生长情况。2 d后半量换液,4 d时完全换液,弃去未贴壁细胞,贴壁细胞继续培养,以后每2～3天换液1次。待10 d左右细胞融合时,吸弃培养液,用PBS液冲洗一次,以去除残余的含血清培养液,以免影响胰蛋白酶活性。然后加入0.25%胰蛋白酶消化液1 ml消化,倒置相差显微镜下观察,待细胞变圆,部分脱落后,加入含血清的培养液,终止消化,按1 ∶ 2比例传代。传代后的细胞生长加快,一般2～3 d可传1代,定期观察细胞的生长情况。
1.3 骨髓MSCs的鉴定
细胞传至第4代后,用消化液消化细胞,PBS洗涤2次(1 000 r/min),流式细胞术检测CD34、CD29的表达情况。
1.4 骨髓MSCs向血管内皮细胞诱导分化及诱导条件的优化
选取状态较稳定的第4代细胞, 按1×106/ml的细胞密度接种于6孔板,分别用10%胎牛血清和2%胎牛血清的诱导液(终浓度为10 ng/mlVEGF、2 ng/mlbFGF的DMEM培养液)继续培养,每3～4天换液一次,倒置相差显微镜下观察细胞形态的变化。当细胞融合时,胰蛋白酶消化传代,于第14天免疫组化法观察FVIII的表达情况。
1.5 骨髓MSCs分化的血管内皮细胞的鉴定
选取2%胎牛血清诱导液诱导后的细胞分别于第7天、14天用流式细胞术和免疫组织化学法检测CD34和FVIII因子的表达情况。
2 结果
2.1 骨髓间充质干细胞的培养
从Wistar大鼠骨髓获得的MNC为比较一致的球型细胞。原代培养24 h,少部分细胞贴壁生长,其中大多数即为间充质干细胞。此细胞散在生长,形态长梭形,类似成纤维细胞。4 d内呈相对静止状态,之后细胞增殖加速,出现团、簇状细胞群。10 d时细胞贴满瓶底,此时呈鱼群样、漩涡状、辐射状或网状排列(图1)。传代后细胞增殖迅速,一般2～3 d可传一代。
2.2 骨髓间充质干细胞的鉴定
选取状态较稳定的第4代MSCs,流式细胞术分析结果显示,CD34阳性率为(1.01±0.56)%、CD29阳性率为(97.32±2.77)%。结果如图2、3。
2.3 骨髓MSCs向血管内皮细胞诱导分化及诱导条件的优化
在细胞培养至第4代,细胞生长倍增稳定,分别用10%胎牛血清和2%胎牛血清的诱导液继续培养发现,用10%胎牛血清诱导液诱导的MSCs增殖仍快,细胞每2～3 d可传一代,细胞形态变化不大;而用2%胎牛血清诱导液诱导的MSCs增殖放慢,细胞每4～5 d可传一代,细胞仍呈长梭形,但细胞变宽,且顺应性增加,呈铺路石样排列(图4)。14 d后免疫组织化学法检测FVIII的表达,10%胎牛血清诱导体系,细胞的阳性率为(12.21±2.32)%;而2%胎牛血清诱导体系,细胞的阳性率为(91.43±6.32)%。后者明显高于前者(P<0.01)。
图2,3 MSCs CD34和CD29的表达情况
2.4 骨髓MSCs分化的血管内皮细胞的鉴定
选取含2%胎牛血清诱导液诱导的MSCs,分别于第7天 ,14天流式细胞术和免疫组织化学法分析CD34和FVIII因子的表达情况(图5,6,表1)。结果提示随着诱导时间的延长,CD34、FVIII表达逐渐增强,从而初步证明了用VEGF和bFGF可以诱导骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞。
图5,6 骨髓MSCs诱导14 d后FVIII、CD34的表达情况
3 讨论
3.1 MSCs的分离、纯化及鉴定
目前对骨髓中MSCs的分离、纯化、培养还没有统一的方法,密度梯度离心结合贴壁培养法是近年发展起来的一种有效的获得MSCs的常用方法。首先根据比重差异,用比重为1.077的淋巴细胞分离液分离骨髓MSCs,经梯度离心后,能有效地将绝大部分红细胞、粒细胞、脂肪细胞和血小板除去,获得纯度较高的单个核细胞,然后根据MSCs与血系细胞贴壁性能差异,随换液弃除悬浮生长的血细胞,贴壁细胞主要是MSCs,也可能混有单核细胞、淋巴细胞。再通过细胞传代方法使MSCs得到进一步纯化,经几次传代,细胞变为形态更均一,排列更有序的成纤维细胞样,有报道[12]通过密度梯度离心分离培养的MSCs在第一代时纯度达95%,第二代超过98%。由于MSCs没有特异性表面标志物,所以目前采用联合鉴定方法:①具有较强的贴壁生长特性;②人类MSCs(>98%)表达CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124、CD166等表面抗原;③不表达分化相关标志如II、III型胶原、骨桥蛋白等;④不表达造血系统标志,包括CD14, CD34及白细胞共同抗原CD45;⑤能被SH-2、SH-3、SH-4识别;⑥具有多向分化潜能等。本实验通过密度梯度离心结合贴壁培养法有效的分离纯化出形态均一的成纤维细胞样细胞,流式细胞术分析结果显示,CD34阳性率为1.01%、CD29阳性率为97.32%,初步证明此细胞即为MSCs。
3.2 骨髓MSCs向血管内皮细胞诱导分化及诱导条件的优化
CD34即CD34抗原,是一个分子量为105～120 kD的跨膜细胞表面糖蛋白,CD34基因选择地在人和鼠造血系统的干/祖细胞中表达,也可在胚胎及成体组织血管的内皮细胞中表达,是血管内皮细胞特异的细胞表面标志,在血管内皮细胞分化成熟、胚胎的血管形成可能有着重要作用。FVIII相关抗原存在于血管内皮细胞的胞浆内,因此可以用FVIII染色作为鉴定血管内皮细胞的特异性标志。在细胞体外培养阶段,我们于诱导前、诱导后7 d和14 d分别对细胞进行CD34和FVIII相关抗原的检测,结果提示随着诱导时间的延长,CD34、FVIII表达逐渐增强,初步证明了用VEGF和bFGF可以诱导MSCs分化为血管内皮细胞。骨髓间充质干细胞诱导分化为血管内皮细胞的研究,国内多采用10%胎牛血清诱导体系,本实验通过10%胎牛血清诱导体系与2%胎牛血清诱导体系的比较发现,10%胎牛血清更利于MSCs的增殖,而2%胎牛血清则更利于MSCs向血管内皮细胞分化。
3.3 临床意义
治疗性血管新生是近年来治疗严重缺血性血管疾病的一种新技术,它通过模拟体内血管生成机制以达到促进血管新生,改善侧支循环的目的。血管生成的自然过程是多种因子协调有序、相互作用的复杂过程,MSCs不仅可分泌多种促进血管生长因子[13,14],且本身可以发育为血管内皮细胞。因此MSCs可能成为治疗性血管新生及组织工程中理想的种子细胞,应用前景极为广阔。
摘要：目的建立分离和培养大鼠骨髓源间充质干细胞(MSCs)的方法及定向分化为血管内皮细胞诱导条件的优化。方法淋巴细胞分离液(比重1.077 g/ml)密度梯度离心法分离单个核细胞(MNC),在含10%胎牛血清L-DMEM培养基中培养,并传代扩增MSCs;选取状态较稳定的第4代细胞,分别用含10%胎牛血清和2%胎牛血清的诱导液(终浓度为10 ng/mlVEGF、2 ng/mlbFGF的DMEM培养液)继续培养,于第7、14天用流式细胞术分析CD34的表达情况,免疫组化法观察FVIII的表达情况。结果密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化MSCs,细胞呈均一的成纤维细胞样,流式细胞术分析MSCs结果显示,CD34阳性率为1.01%、CD29阳性率为97.32%;诱导14 d后免疫组织化学法检测FVIII的表达,10%和2%胎牛血清诱导体系细胞的阳性率分别为12.21%和91.43%。结论密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化MSCs;就诱导效果而言,2%胎牛血清诱导体系明显好于10%胎牛血清诱导体系,说明低浓度的胎牛血清更有利于MSCs向血管内皮细胞分化。
关键词：间充质干细胞,细胞培养,分化,血管内皮细胞
定向分化 篇2
1 材料与方法
1.1 大鼠肝卵圆细胞的分离
选用昆明医科大学动物实验中心繁育的近交系SPF级雄性SD大鼠, 体质量 (250±20) g, 实验动物饲养于昆明医科大学天然药物重点实验室的SPF级动物实验室, 单笼饲养, 喂食普通饲料, 引用高压蒸汽灭菌水, 饲养环境温度波动于22~25℃, 湿度为40%~80%。应用二乙酰氨基芴/部分肝切除法 (2AAF/PH) 建立大鼠HOC增殖模型, 肝切除术后7d采用改良二步酶消化法[3]分离HOC, 并对HOC进行体外培养。
1.2 HOC体外培养及诱导向胆管上皮细胞分化体系的建立
细胞培养所用的新生牛血清 (new born calf serum) , DMEM-F12培养基购于hyclone公司, 表皮生长因子 (endothelial growth factor, EGF) 、干细胞生长因子 (stem cell growth factor, SCF) 、白血病抑制因子 (leukemia inhibitory factor, LIF) 购于sino生物公司。原代分离的HOC 3 d内培养于含20%新生牛血清的DMEM-F12培养基中, 第4天更换为含20%新生牛血清、SCF 20 ng/m L、EGF 10 ng/m L、LIF 10ng/m L的DMEM-F12培养基, 细胞培养于37℃, 5%二氧化碳细胞培养箱。
1.3 细胞形态观察及细胞生长曲线的绘制
每3 d于倒置相差显微镜下观察实验组及对照组细胞形态及生长情况, 必要时更换培养基并传代。在细胞培养过程中, 对第1、3、5和7代细胞进行传代时取部分细胞悬液, 调整细胞浓度为1×104/m L, 按5×102/孔将细胞接种于96孔板, 每代细胞接种7个复孔, 待细胞贴壁后分别于第0、1、2、3、4、5和6天取出培养板, 以MTT法比色法检测吸光度, 绘制细胞生长曲线。
1.4 流式细胞检测CK-19及OV-6阳性细胞的表达
分别取所培养的细胞原代及第4、6代细胞进行流式细胞检测, 流式细胞检测所用的小鼠抗大鼠OV-6抗体、兔抗大鼠CK-19抗体、FITC标记的山羊抗小鼠抗体以及PE标记的山羊抗兔抗体均购于Santa Cruz公司。将生长良好并铺满瓶底的上述代次细胞以胰酶消化使贴壁细胞漂浮后终止消化, 细胞离心后以PBS缓冲液悬浮, 调整细胞数量为1×105/m L, 将同一代细胞悬液分别置于3个流式管, 设立阴性对照组、OV-6组及CK-19组。1 200 r/min离心8 min, 弃上清, OV-6组及CK-19组分别加入相应的一抗, 振荡混匀后避光孵育30 min, 加入PBS缓冲液1 m L, 振荡后1 200 r/min离心8 min, 弃上清, 加入相应的二抗振荡混匀, 避光孵育30 min后上机检测。
1.5 免疫荧光显微镜观察胆管上皮细胞细胞分化
将实验组第1、3、5、7代细胞接种于24孔板, 待细胞细胞铺满后吸去培养基, 加入4%多聚甲醛固定15 min, 37℃下PBS振荡洗涤3次, 每次5 min, 以1%Triton-X100溶液破膜30 min, 37℃下PBS振荡洗涤3次, 每次5 min, 按1∶100稀释一抗后加入孔板, 37℃避光孵育20 min, 放入4℃冰箱中避光过夜。次日吸去一抗工作液, 37℃下PBS振荡洗涤3次, 每次5 min, 按1∶100稀释荧光标记的山羊抗兔抗体, 37℃避光孵育30 min, PBS振荡洗涤3次, 每次5 min, 每孔加入200μL DMEM培养基封闭, 上机检测。
1.6 统计学分析
实验数据以SPSS18.0进行统计学处理, 组间及组内差异采用单因素方差分析及LSD法进行比较, 检验水准α=0.05, P<0.05差异有显著性。
2 结果
2.1 原代HOC形态特点
以2AAF/PH方法3建立大鼠HOC增殖模型后以改良二步酶消化法分离的HOC在光镜下呈卵圆形, 细胞体积较小, 核质比大, 可见有较多体积较大的非卵圆细胞 (图1A) , 随着培养过程的进行, 非卵圆细胞逐渐减少, 培养第4天, 加入含有细胞因子的培养基后, 细胞生长速度增快, 至第8天可见典型的集落形成 (图1B) , 细胞传代后可见大量细胞为梭形或类圆形, 有少量细胞表现为不规则形, 细胞体积仍较小 (图1C) 。细胞培养传代至第3代时, 可见大量细胞为不规则形, 细胞体积较大, 细胞质变薄, 部分细胞可见明显的细胞核 (图1D) 。
2.2 细胞生长曲线
诱导后的HOC生长速度增快, 根据MTT法测吸光度后绘制的生长曲线可见, 第3代细胞生长速度最快, 而第5代及第7代生长速度虽然较第3代细胞慢, 但仍保持了较好的增殖活性, 生长较第1代细胞更为良好。
A:原代培养的大鼠干卵圆细胞, 可见细胞大小不一, 非目的细胞较多 (×100) ;B:诱导后的大鼠肝卵圆细胞形成典型的集落, 部分细胞形态发生变化 (×100) ;C:第3代HOC细胞形态发生改变, 大部分呈梭形, 仍可见少量类圆形细胞 (×100) ;D:第7代HOC细胞形态呈现不规则形, 细胞较薄, 呈典型的上皮样细胞形态 (×100)
2.3 流式细胞结果
%
注:1) 与原代细胞相比, P<0.05, 差异有显著性;2) 与第4代细胞相比, P<0.05, 差异有显著性
附表和图3提示, 原代HOC中表达OV-6阳性的细胞比例较高, 约为 (94.30±1.40) %, 而原代细胞CK-19阳性细胞率仅为 (3.16±1.87) %, 而诱导后并传代的HOC, 第4代细胞CK-19阳性细胞比率为 (61.23±3.21) %, 而OV-6阳性细胞比率, 则下降至 (27.13±2.89) %, 与原代HOC相比, 差异有显著性 (P<0.05) 。而至第6代细胞, 此差异则更为明显。
A:原代HOC OV-6阴性对照流式细胞结果;B:原代HOC OV-6阳性细胞比率;C:诱导后的第4代HOC OV-6阳性细胞比率;D:原代HOC CK-19阴性对照流式细胞结果;E:原代HOC CK-19阳性细胞比率;F:诱导后的第4代HOC CK-19阳性细胞比率
2.4 免疫荧光显微镜结果
免疫荧光显微镜下, 第3代HOC中可见OV-6阳性细胞, 但表达强度不高, OV-6阳性细胞体积较小, 呈类圆形 (图4A) , 部分OV-6强阳性细胞可见突出的伪足样结构 (图4B) 。诱导后的第3代HOC CK-19广泛表达, 并可见部分细胞表达强阳性 (图4C) , 免疫荧光显微镜下可见CK-19阳性细胞体积较大, 细胞质较薄, 可见“伪足”样突起, 且可见诱导后的HOC并非平铺于孔板底部, 而是具有一定的立体空间结构 (图4D) 。
A:OV-6阳性细胞体积较小, 呈类圆形;B:部分OV-6强阳性细胞可见突出的伪足样结构;C:诱导后的第3代HOC CK-19广泛表达, 并可见部分细胞表达强阳性;D:免疫荧光显微镜下可见CK-19阳性细胞体积较大, 细胞质较薄, 可见“伪足”样突起
3 讨论
胆管上皮细胞在以往被认为是被覆于肝内外胆管的一类简单的上皮细胞, 其功能是维持胆道的结构完整以保持其输送胆汁进入肠道。而近几年来越来越多的研究证实, 胆管上皮细胞不仅仅是一类仅在结构上维持完整的细胞群, 而是在胆汁分泌、炎症发生及排斥反应等方面均起到重要作用的细胞群[4]。从组织起源来看, 肝内胆管由来源于肝芽突的肝前体细胞延门静脉分支形成, 而肝外胆管则由肝芽突及腹胰突之间的内胚层细胞形成[4]。目前, 对于胆管上皮细胞的组织来源及分化过程尚不完全明确, 但有研究认为, 胆道系统与肝脏及胰腺同样来源于胚胎发育过程中的内胚层前肠 (foregut) 。在肝外胆道中, 存在大量的胆管周围腺体 (peribiliary glands, PBGs) , 这些腺体中存在一类SOX17+/PDX1-的细胞亚群, 能够分化为肝外胆管上皮细胞[5]。而在肝内组织中, hering管中的肝卵圆细胞则被认为是肝内干细胞, 能够分化为成体肝细胞或胆管上皮细胞, 从而维持肝内的结构和功能完整。
目前对于肝卵圆细胞的表面及胞内分子标志, 尚无统一的认识, 目前的研究发现, HOC可表达c-kit、CD90和OV-6等表面标志[6]。因此, 有学者认为OV-6可标记大部分的卵圆细胞。而胆管上皮细胞则可表达SOX17、γ-GT和CK19等表面和胞内分子标志, 其中CK-19被认为是胆管上皮细胞的特异性标志。根据以上研究结果, 本研究选择了OV-6作为大鼠肝卵圆细胞的标志, CK-19作为诱导后胆管上皮细胞的标志, 自原代培养的细胞开始以流式细胞检测OV-6阳性肝卵圆细胞及CK-19阳性胆管上皮细胞的比例变化。
目前, 对于体外培养胆管上皮细胞的研究较少, 这不仅仅因为成体的胆管上皮细胞难以分离、纯化, 作为一种分化成熟的细胞, 成体胆管上皮细胞体外培养容易老化, 在培养过程中增殖能力有所减弱[7]。而对于通过肝卵圆细胞诱导获得胆管上皮细胞, 尚无统一有效地方法, 有研究采用丁酸钠作为诱导分化剂, 可诱导大鼠肝卵圆细胞分化为胆管上皮细胞, 但过高浓度的丁酸钠反而有可能抑制细胞生长[8]。
表皮生长因子 (epithelial growth factor, EGF) 是促有丝分裂因子, EGF通过与其膜受体EGFR结合, 起到促进细胞增殖的作用, 有研究使用EGF对实施2AAF/PH后的大鼠进行体内灌注EGF, 证实EGF能够促进胆小管细胞及其周围细胞的增殖, 并且能够促使HOC从汇管区向肝实质迁移[9]。此外, 干细胞生长因子 (stem cell growth factor, SCF) 是一种重要的造血刺激因子, 通过与细胞表面的c-kit结合, 是细胞活化并产生增殖。HOC表面可表达c-kit, 并且SCF可能在卵圆细胞的增殖活化过程中起到关键作用[10]。
对于大鼠肝卵圆细胞体外分化为胆管上皮细胞的研究, 目前还较少, 本实验通过EGF及SCF的协同作用, 成功诱导大鼠肝卵圆细胞分化为表达CK-19的胆管上皮细胞, 并且细胞形态发生了明显的改变, 符合上皮细胞形态特点, 并且免疫荧光证实CK-19在培养细胞中的表达。但对于诱导过程中的具体机制, 还需要进一步研究来阐明其作用途径及机制。
摘要：目的 通过对大鼠肝卵圆细胞进行体外培养, 建立诱导大鼠肝卵圆细胞分化为胆管上皮细胞的诱导体系。方法 通过2AAF/PH建立大鼠肝卵圆细胞活化模型, 使用二步酶消化法获得原代肝卵圆细胞, 应用20ng/mL干细胞生长因子及10 ng/mL表皮生长因子诱导肝卵圆细胞向胆管上皮细胞分化, 并应用流式细胞及免疫荧光观察细胞分化过程中OV-6及CK-19标志的表达变化。结果 原代肝卵圆细胞OV-6阳性细胞为 (94.30±1.40) %, CK-19阳性细胞为 (3.16±1.87) %, 诱导后第7代细胞OV-6阳性细胞为 (4.97±0.21) %, CK-19阳性细胞为 (96.17±1.21) %, 差异有显著性 (P<0.05) 。免疫荧光结果证实CK-19广泛表达。结论 成功诱导大鼠肝卵圆细胞分化为表达CK-19的胆管上皮细胞, 细胞形态符合上皮细胞形态特点, 表皮生长因子及干细胞生长因子可诱导肝卵圆细胞分化为胆管上皮细胞。
关键词：大鼠,肝卵圆细胞,胆管上皮细胞,细胞分化
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定向分化 篇3
关键词：骨髓间充质干细胞,细胞移植,肝细胞,分化,慢病毒
骨髓间充质干细胞是一种源于中胚层并具有自我复制、高度增殖能力和多向分化潜能的细胞[1~3]。研究证实,在体外培养条件下BMSCs可由肝细胞生长因子等细胞因子诱导向肝细胞分化,并可释放多种肝细胞因子[4,5]。但骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal stem cells,BMSCs)体内移植后对受损肝脏是否有修复作用则鲜见报道。为此,我们通过将大鼠骨髓中分离获得的BMSCs,体外纯化、扩增后通过门静脉移植入肝脏损伤大鼠体内,观察BM-SCs移植后在肝实质内的分布、增殖及受损肝脏修复状况,为临床应用提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 动物
纯系3周龄雄性SD大鼠5只(供体大鼠),成年纯系雄性SD大鼠30只,体重180~220 g(受体大鼠),南方医科大学动物实验中心提供。
1.1.2 主要试剂和仪器
DMEM/F12(1∶1)培养基(Hyclone),Percoll(比重1.077 g/L,Pharmacia),南美洲胎牛血清(Hyclone),0.25%胰蛋白酶(Gibco),2-AAF(二乙酰氨基笏,SIGMA),NC-GFP-Lentivirus,10 mg/m L polybrene,Enhanced Infection Solution(GENECHEM)。二氧化碳培养箱(德国HERABUS公司),倒置荧光相差显微镜与激光扫描共聚焦显微镜(德国Leica公司),全自动生化分析仪(美国Beckman公司)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
用密度梯度离心法结合贴壁细胞培养法对BMSCs进行提取,纯化、扩增至第3代备用[6]。
1.2.2 慢病毒感染大鼠BMSCs
取第3代生长融合30%~50%BMSCs弃去原培养液,加入表达绿色荧光蛋白的慢病毒,调整polybrene至终浓度为5μg/m L、MOI(Multiply of Infection)=5感染BM-SCs,24 h后更换为含10%胎牛血清的DMEM/F12完全培养液继续培养,48 h后开始观察绿色荧光表达情况。
1.2.3 肝损伤模型构建和动物分组
30只雄性SD大鼠随机分为3组:A组(2-AAF+肝2/3切除)从门静脉移植BMSCs;B组(2-AAF+肝2/3切除)从门静脉注射DM-EM/F12;C组正常大鼠组各10只。A、B组用2-AAF灌胃,剂量为20 mg/(kg·d),连续灌6 d,第7天行2/3肝切术,切除中叶和左外叶。
1.2.4 BMSCs移植
造模术毕关腹前,A组用1mL注射器从门静脉缓慢注射1 ml含表达绿色荧光蛋白第3代BMSCs(5×106/m L)的DMEM/F12,B组从门静脉缓慢注射1 m L DMEM/F12。
1.2.5 肝功能检测
3组大鼠分别在移植术后7、14和28 d于同一时间点空腹从尾静脉采血,离心,全自动生化仪检测白蛋白(ALB)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)。
1.2.6 标本处理
于移植术后的第28天取出肝脏,行冷冻切片在倒置荧光显微镜下观察表达绿色荧光的BMSCs在大鼠肝脏内定居分布情况。
1.3 统计学处理
应用统计软件SPSS 14.0分析数据。计数资料以均数±标准差表示并进行双因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义,P<0.01为差异有极显著性。
2 结果
2.1 BMSCs的形态学特征
原代培养中细胞较为分散、克隆集落方式增殖;当相邻集落融合成片达80%以上,细胞排列呈漩涡状,细胞间的界限不清,细胞呈长梭状;此外,还存在少数的小圆细胞。传代后,细胞不再以集落形式生长,而是均匀分布长梭形细胞生长,随着传代次数的增加杂质细胞越来越少,BMSCs纯度越来越高,传至第3代BMSCs的纯度基本满足移植要求,见图1。
2.2 慢病毒感染BMSCs结果
经NC-GFP-Lentivirus转染的BMSCs在72 h后可以观察到少量表达绿色荧光的细胞,随着时间的延长表达绿色荧光的细胞数越来越多,1周后可见大量表达绿色荧光的细胞,转染率达80%以上。慢病毒转染BMSCs后继续传代培养可见绿色荧光高效稳定表达,见图2。
2.3 SD大鼠连续2-AAF灌喂后一般情况及肝脏病理变化
A、B组连续2-AAF灌喂6 d后与正照组相比,大鼠出现精神萎靡、厌食、少活动、尿深黄。两组大鼠未出现死亡。术中可见肝脏均表现为明显充血,肝脏边缘圆钝,肝脏表面可见针尖样细小颗粒,呈局灶性,偶见肝脏有小出血点。术中切下肝脏通过苏木精-伊红染色可见部分肝细胞肿胀、胞质疏松,个别肝细胞呈小灶状坏死,见图3、4。
2.4 移植术后肝脏冷冻切片荧光检测结果
A组均可见表达绿色荧光的BMSCs主要在中央静脉和汇管区周围,肝实质里也可见散在分布的BMSCs。B,C组均未发现,见图5、6。
2.5 术后肝功能检测结果
A、B组各项肝功能指标均随着时间的延长逐渐改善,但A组肝功能修复明显好于B组。详见表1、表2。
注:1)与B组比较,P<0.05;2)与C组比较,P<0.05;3)与B组比较,P<0.01;4)与C组比较,P<0.01
注:1)与B组比较,P<0.05;2)与C组比较,P<0.05;3)与B组比较,P<0.01;4)与C组比较,P<0.01
3 讨论
1999年PETERSEN[7]首先发现:骨髓中存在肝细胞的前体细胞,ALISON等[8]的研究指出,骨髓干细胞能够在鼠肝内转化成为肝卵圆细胞甚至成熟的肝细胞和胆管细胞,WANG等[9]实验提示在肝损伤情况下干细胞可向肝细胞横向分化,且在不同的微环境下分化程度和方向有差异。为此,本实验通过2-AAF+部分肝切除构建起肝损伤模型,一方面抑制正常肝细胞增殖,另一方面刺激机体分泌出各种促进肝细胞再生的生长因子,为移植细胞提供定居、分化所需的微环境。Lentivirus载体是最近兴起的一种病毒载体,研究表明Lentivirus载体具有表达时间长、宿主细胞免疫反应小、细胞毒性小、能感染非分裂细胞等优势[10]。本实验选用MOI=5、标记24 h作为最佳标记进行后续实验。在倒置相差显微镜下观察细胞的形态、生长、增殖与未经标记的细胞相比未见明显差异,表明用慢病毒标记BMSCs是可行的。为此,笔者利用携带绿色荧光蛋白的慢病毒进行示踪BMSCs在肝脏中的分别情况。实验中可观察到绿色荧光蛋白标记的BMSCs细胞经门静脉注射入肝脏损伤的大鼠体内后,主要在中央静脉和汇管区,并能向肝实质内扩散与成熟肝细胞紧密结合,这与参考文献[11]报道的一致。这证明了BMSCs能在特定肝脏微环境下定居、分化。实验动物A组在输注骨髓间充质干细胞后,ALB、ALT及AST水平在各相同的时间点均明显好于B组。尤其是ALB水平在术后第7、28天A组明显要高于B组,差异有显著性(P<0.05),这可能是BMSCs在移植早期可以促进肝细胞分泌各种生长因子促进肝脏蛋白的合成,到了后期可能是部分BMSCs分化为成熟肝样细胞直接行使合成蛋白的功能;AST在术后第7天A组明显低于B组,差异有极显著性(P<0.01),第14天也要明显低于B组,差异有显著性(P<0.05),可能原因是BMSCs自身分泌和促进未受损肝细胞分泌各种细胞因子,以促进受损肝脏修复。术后14天A组ALB、ALT和ALP均趋于正常,与C组无明显差异(P<0.05)。28 d后A组的肝功能恢复至正常水平;而B组肝功能水平未能恢复正常,特别是ALB、ALT与C组比较差异有显著性(P<0.01)。这些均能证明:BMSCs移植能在一定程度上促进受损肝脏的修复。实验中发现,A组与B组比较在同一时间点ALP水平差异均无显著性,但A组高于B组呈降低趋势,可能与BMSCs在体内转化为肝前体细胞有关。
本实验的研究结果初步证实:经门静脉移植的BMSCs能在特定肝脏微环境下定居、增殖、分化,BMSCs移植可以在一定程度上促进并加快受损肝脏的修复。但目前的研究只是根据细胞形态和肝功能水平来判断BMSCs是否分化成“肝样细胞”对受损肝脏进行修复,而未能阐述BMSCs分化与修复受损肝功能的具体机制,因此BMSCs如何修复受损肝脏的机制是下一步研究的方向。
参考文献
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[8]ALISON MR,POULSOM R,JEFFERY R,et al.Hepatocytes from nonhepatic adult stem cells[J].Nature,2000,406:257.
[9]WANG X.Albuminexpressing hepatocyte like cells develop in the livers of immunedeficient mice that received transplants of highly purified human hematopoietic stem cells[J].Blood,2003,101(10):42014208.
[10]MA XS,LV FZ,LI XK,et al.Rat mesenchymal stem cell can be differentiated into osteoblasts by recombinant hum an BM P2lentivirus[J].Fudan Univ J Med Sci,2006,33(5):592596.Chinese
定向分化 篇4
1 材料与方法
1.1 实验动物及材料
清洁级雄性SD大鼠, 4周龄, 体重100 g～120 g, 由山西医科大学动物实验中心提供。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。胎牛血清 (美国HyClone公司) ;5-氮胞苷 (5-Azα, 美国Sigma公司) ;噻唑兰 (MTT, 美国Sigma公司) ;一抗:兔抗鼠cTnT 抗体 (上海蓝基生物科技有限公司) , 兔抗鼠α-action 抗体 (上海蓝基生物科技有限公司) ;过氧化物酶标记的链霉素卵白素染色试剂盒 (上海蓝基生物科技有限公司) 。
1.2 大鼠骨髓间充质干细胞的分离和培养
CO2窒息处死动物, 无菌条件下取大鼠股骨和胫骨, 以完全培养液冲洗骨髓腔。按照1∶1的比例将上述细胞悬液缓慢滴加到密度为1.077 g/mL的Percoll分离液上层, 1 500 r/min离心30 min。吸取上、中层液面间的乳白色云雾状的单个核细胞层, 加入完全培养液重悬, 离心洗涤2次。加入培养液以2×105/cm2～3×105/cm2细胞密度接种于细胞培养瓶, 置于37 ℃, 5%CO2, 饱和湿度的孵箱内培养72 h换液, 达60%～70%融合状态, 传代培养。
1.3 各代大鼠骨髓间充质干细胞增殖率测定及体外诱导
取第2代MSCs, 消化后调整细胞悬液浓度至3×104 /mL, 接种于7个96孔板, 每孔加入200 L, 设调零孔5个。5%CO2, 37 ℃孵育4 h待细胞贴壁。于贴壁后每天各取一板, 每孔加入20 μL MTT溶液 (5 mg/mL, 即0.5%MTT) , 37 ℃继续孵育4 h后吸取孔内上清液弃去。每孔加入150 μL二甲基亚砜, 置摇床上低速振荡10 min, 使紫色结晶充分溶解。在酶联免疫检测仪上490 nm波长下测量各孔的吸光值 (OD值) , 记录结果。选取第2代、第6代、第10代MSCs以3×104 /mL细胞密度分别接种于96孔板, 每代种植3板, 贴壁12 h。每板分为4组, 每组23孔, 余4孔为调零孔。每板取3组为诱导组, 分别以含5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L 5-氮胞苷的完全培液孵育24 h, 对照组每板23孔以完全培液孵育24 h, 后改用完全培养液培养5 d。采用MTT法, 测取诱导后各代细胞第1天、第3天、第5天的OD值。同时取第2代、第6代、第10代细胞, 以含5 μmol/L、10 μmol/L、 15 μmol/L 5-氮胞苷的完全培养液诱导24 h后, 培养4周, 并设未诱导组为阴性对照。
1.4 细胞形态学观察
倒置显微镜观察各组细胞的形态学变化和生长情况。
1.5 心肌特异性蛋白cTnT、α-Actin的检测
将诱导培养4周的第2代、第6代、第10代细胞玻片, PBS清洗后4%多聚甲醛室温固定 30 min。蒸馏水冲洗3次, 每次3 min。3%H2O2去离子水孵育5 min～10 min。滴加山羊血清室温孵育10 min, 倾去勿洗。滴加适当比例稀释的一抗, 4 ℃过夜。PBS清洗, 3 min×3次;滴加生物素化二抗工作液 (IgG/Bio) , 37 ℃孵育10 min。PBS清洗, 3 min×3次;滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液, 37 ℃孵育10 min。PBS清洗, 3 min×3次;DAB显色。冲洗、复染、脱水、透明、封片。
1.6 统计学处理
采用SPSS 13.0软件对样本资料进行分析, 数据以均数±标准差 () 表示, 采用方差分析, 组间两两比较进行SNK法检验, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 骨髓间充质干细胞的分离培养和形态学观察
通过密度梯度离心法获得的MSCs, 接种于完全培养基中, 48 h呈现为短纺锤、三角形短小细胞, 细胞折光性好, 可见黏附于细胞表面的Percoll颗粒。72 h成为细长纺锤、细长梭形细胞。第4天, 细胞开始增殖, 伴有较多的折光双联体, 并形成小岛状克隆, 细胞密度较低时, 细胞排列不规则, 可见三角形细胞。7 d～10 d可达70%～80%融合状, 细胞排列开始规整, 呈束状、旋涡状或鱼群状。细胞传至第2代, 细胞形态趋于一致, 细胞呈成纤维细胞样。传至第6代, 可见少量圆形扁平细胞, 约占细胞总数的5%, 并随细胞传代次数的增加, 有所增加但不明显。此类细胞的增殖和克隆能力明显低于纺锤样成纤维样细胞。
2.2 MSCs的体外诱导分化
各代细胞经5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L 5-Azα诱导液分别诱导24 h, 细胞均有死亡, 且随药物浓度的升高细胞死亡率升高, 但细胞代数对细胞的死亡率影响不明显。细胞诱导24 h, 贴壁的部分细胞变扁平或呈短棒状。3 d后存活细胞开始增殖, 细胞呈细长梭形, 少数细胞呈三角形或多边形。培养4周后, 80%～90%细胞呈肌纤维状, 少数细胞为三角、多边形或铺路石状, 细胞出现聚集状生长。不同代数细胞经不同浓度5-氮胞苷诱导四周后均未见自发性搏动。
2.3 细胞生长状况及增殖率测定
MSCs传代培养潜伏期约1 d～2 d, 第3天进入对数增殖期, 第6天～第7天进入平台期。不同浓度5-氮胞苷诱导的各代MSCs, 通过MTT检测, 显示诱导后的第2代MSCs增殖能力优于第6代和第10代细胞, 第6代与第10代MSCs增殖能力无统计学意义。未经5-氮胞苷诱导的对照组显示, 第2代与第6代细胞增殖能力无统计学意义, 均优于第10代细胞。药物对细胞增殖能力有一定影响, 但随细胞代数的增加其影响有减弱的趋势;药物浓度对细胞增殖能力的影响无统计学意义。详见表1。
2.4 心肌特异性肌钙蛋白cTnT的检测
以三种不同浓度5-Aza体外诱导四周的第2代、第6代、第10代BM-MSCs进行细胞免疫化学检测cTnT、α-Actin表达, 各诱导组均表达阳性。说明经三种浓度5-Aza诱导后的第2代、第6代、第10代BM-MSCs已向心肌定向诱导转化, 并表达心肌特异性蛋白。
3 讨 论
骨髓间充质干细胞是一种比较原始的骨髓基质细胞, 因其具有自我更新、扩增和多向分化潜能, 在适宜条件下可被诱导分化为多种组织细胞[6], 能够分泌多种细胞因子, 支持组织再生和修复, 获取途径便利, 易体外培养扩增, 回植无免疫排斥反应, 对组织损伤小等优点[1,4], 使得科学家们开始广泛关注MSCs在组织修复和基因治疗中的临床应用。因其具有心肌和血管修复潜能的优点[2], 已成为心肌组织工程研究中种子细胞来源的热点之一。但 MSCs在骨髓中的含量很低, 细胞培养接近高密度时, 细胞进入平台期, 由纺锤体样形态转变为较大较平的表型[7], 细胞的增殖与分化能力可能受到影响。在治疗心肌损伤的疾病时, 无论是采用经外周静脉、冠脉、心内膜及心外膜注射等途径, 还是进行心肌组织工程构建, 首先需要有足够的细胞数量和良好的细胞分化能力, 因此如何获得充足细胞数量, 同时保持细胞良好的增殖分化能力, 成为合理应用MSCs的前提。
能否实现MSCs在体外既保持良好的增殖分化能力又保持多潜能分化能力?李克等[8]将携带人端粒酶逆转录酶 (hTERT) 目的基因的质粒通过脂质体转染法转入人骨髓 MSCs中, 显示外源性 hTERT基因可以在人骨髓 MSCs中获得异位表达, 并能诱导人骨髓 MSCs的端粒酶活性, 使人骨髓间质干细胞的寿命明显延长而且不影响其维持干细胞的多向分化潜能特性。徐燕等[9]通过携带人端粒酶逆转录酶目的基因的反转录病毒质粒转染人骨髓 MSCs, 达到了相似的效果。张海红等[10]通过促红细胞生成素与MSCs共培养, 发现MSCs的增殖指数明显增加, 促红细胞生成素呈时间、剂量依赖性促进MSCs增殖。亦有通过碱性成纤维细胞生长因子, 中药提取物等促进MSCs增殖的报道。 实验发现细胞传代次数对细胞数量、增殖能力、分化能力和纯度均有影响。相同药物浓度诱导后的第2代细胞增殖能力优第6代、第10代细胞, 第6代、第10代细胞增殖率无统计学意义。不同药物浓度诱导的同代细胞间增殖能力无统计学意义。随着细胞代数的增加, 药物浓度对细胞的增殖能力影响越来越小。经5-氮胞苷诱导的BMSCs表达心肌特异蛋白cTnT、α-Actin, 未经诱导的BMSCs不表达心肌特异蛋白。钱海燕等[11]研究表明, 第10代MSCs经5-氮胞苷诱导后心肌特异性蛋白的表达率明显高于第1代、第4代、第8代细胞。由此推之, 在增殖能力相同的情况下, 细胞代数越高, 越有利于细胞数量和诱导分化能力的提高, 越有利于细胞移植、组织构建、临床应用中对细胞数量和时间的要求。但细胞增殖能力的强弱与诱导率的高低是否存在一定关系, 增殖能力与诱导率何者更有利于修复坏死的心肌还有待进一步研究。
摘要：目的 探讨不同细胞代数与不同5-氮胞苷 (5-Aza) 浓度对体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞 (MSCs) 向心肌细胞定向分化增殖能力的影响。方法 采用Percoll密度梯度离心法分离大鼠骨髓单个核细胞。选择第2代、第6代、第10代细胞, 每代分为四组 (三组为诱导组, 一组为对照组) , 三个诱导组分别以5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L5-氮胞苷孵育24h后, 与对照组以完全培养液连续培养5d。通过MTT法测取各代细胞诱导组与对照组第1天、第3天、第5天的OD值, 计算三代细胞经不同浓度5-氮胞苷诱导后及对照组的增殖率。采用免疫细胞化学法检测各代MSCs经不同浓度5-氮胞苷诱导培养4周后心肌特异蛋白cTnT、α-Actin的表达。结果 正常对照组第2代与第6代细胞增殖率无统计学意义 (P>0.05) , 与第10代细胞均有统计学意义 (P<0.05) 。相同浓度药物诱导的三代细胞, 第2代细胞与第6代、第10代细胞增殖率有统计学意义 (P<0.05) , 第6代、第10代细胞增殖率无统计学意义 (P>0.05) 。不同5-氮胞苷浓度诱导的同代细胞间增殖率无统计学意义 (P>0.05) 。经三种浓度5-氮胞苷诱导的2代、6代、10代MSCs均表达心肌特异蛋白cTnT、α-Actin, 对照组表达为阴性。结论 随着细胞代数的增加, 药物浓度对细胞的增殖能力影响越来越小。经5-氮胞苷诱导的MSCs表达心肌特异蛋白cTnT、α-Actin, 未经诱导的MSCs不表达心肌特异蛋白。