成骨分化

成骨分化（精选7篇）

成骨分化 篇1

动脉钙化常见于糖尿病和尿毒症患者, 与心肌梗死、血管弹性受损、支架术后再狭窄等并发症有关[1]。近年的研究表明动脉钙化并不是一种被动、退化的经过以及血管疾病的终末状态, 而是一种主动的、可调节的过程。我们和其他的研究者均发现与证实血管钙化与骨形成类似[2], 钙化斑块中存在骨矿化调节因子[3]。VSMCs向成骨细胞分化是动脉钙化的细胞学基础和关键环节[4]。但血管钙化的具体调节机制仍未完全阐明。

Apelin是一种新的生物活性肽, 孤儿G蛋白耦联受体APJ的内源性配体[5]。肥胖者血浆apelin水平明显增高, 与胰岛素抵抗以及高胰岛素水平相关。近年研究显示apelin-APJ系统已成为一种有力的心血管调节因子介导对生理性应激以及疾病的适应性。最近也有研究结果显示apelin-APJ系统主动调节主动脉瓣钙化的病理生物学过程, 这个过程类似血管钙化。但apelin对血管钙化的作用目前仍不清楚。

我们的研究旨在了解apelin-APJ信号系统是否参与VSMCs向成骨细胞分化的调控。为阐明apelin对VSMCs钙化的作用, 以及其中的调节机制。

1 方法与材料

人钙化型血管平滑肌细胞来源于肾脏移植术的多余血管供体, 脂肪组织来源于乳房整形术患者。以逆转录聚合酶链式扩增 (RT-PCR) 方法检测APJ基因在体外培养的CVSMCs中的表达。以免疫印迹方法检测APJ蛋白在体外培养的CVSMCs中的表达。在体外培养的CVSMCs中检测ALP活性以及骨钙素分泌。以茜素红染色方法检测基质矿化形成。RNA干扰方法沉默APJ。1 nM apelin干预CVSMCs5～60min后以免疫印迹方法检测促分裂素原活化蛋白激酶 (MAPK) 和PI3-K/Akt信号的活化。检测apein抑制CVSMCs向成骨细胞分化过程中的信号转导通路。以单因素方差分析方法进行统计学分析。P值<0.05被认为有显著统计学意义。实验重复至少3次以上。

2 结果

2.1 体外培养的CVSMCs表达APJ

应用RT-PCR技术, 我们证实CVSMCs表达APJ mRNA。皮下脂肪组织作为APJ mRNA表达的阳性对照。应用免疫印迹分析, 我们证实CVSMCs表达APJ蛋白。皮下脂肪组织作为APJ蛋白表达的阳性对照。应用siRNA-APJ干扰后未检测到CVSMCs表达APJ。我们的结果表明体外培养的CVSMCs表达APJ。

2.2 Apelin抑制CVSMCs向成骨细胞分化以及矿化

近来已有的研究表明动脉钙化与骨矿化过程类似, 表达骨相关分子。ALP以及骨钙素是具有代表性的成骨细胞表型标记物。Apelin预处理CVSMCs呈剂量依赖性显著抑制ALP的活性以及骨钙素生成。1 nM apelin使Runx2蛋白表达显著降低。10ng/mL TNF-a使培养的CVSMCsAL活性增加, 而这种作用被apelin抑制 (图1) 。基质矿化是成骨样分化和功能的标志, 以茜素红染色检测矿化结节的形成多少来评估。Apelin孵育12dCVSMCs矿化结节形成明显较对照组少, 钙含量也较对照组少。

(A、B) 分别以阴性对照 (无血清DMEM) 、10 pM、100 pM、1nM以及10 nM apelin干预细胞。检测ALP活性和骨钙素分泌 (以总蛋白校正) 。 (C) 不同剂量apelin对10 ng/mL TNF-α所引起CVSMCs ALP活性变化的影响。条柱代表平均值±SD (与control相比##表示P<0.01;与TNF-α干预而无apelin组比较**代表P<0.01, n=3) 。 (D) 分别以阴性对照 (无血清DMEM) 以及1 nM apelin干预细胞检测RUNX2蛋白。

2.3 Apelin作用的细胞内信号机制

MAPK以及PI3-K/Akt信号途径对调控细胞分化起关键作用。Apelin作用于CVSMCs 5min时开始激活Akt以及MAPK中的ERK信号磷酸化, 15分达活化峰值。但未检测到c—jun氨基末端激酶 (JNK) 以及丝裂原活化蛋白激酶 (p38) 信号活化。以50 mM H2O2为阳性对照。ERK抑制剂PD98059以及PI3-K抑制剂LY29400可分别阻滞apelin对ERK以及Akt信号的激活。这些结果显示apelin激活了CVSMCs中ERK以及PI3-K/Akt信号转导途径 (图2) 。

(A) 1 nM apelin干预细胞5～60min, 50µM H2O2干预15 min作为阳性对照。 (B) PD98059 (10µM) 或LY294002 (10µM) 预处理2h后1 nM apelin干预15 min。 (C) 乱序APJ siRNA或APJ siRNA转染细胞以1 nM apelin干预。

2.4 Apelin通过APJ/ERK和APJ/PI3-K/Akt信号途径抑制CVSMCs向成骨细胞分化

ERK抑制剂PD98059以及PI3-K抑制剂LY294002预处理细胞取消了1 nM apelin对ALP活性增高的抑制作用。RNA干扰能有效沉默CVSMCs APJ。应用siRNA-APJ沉默APJ也能取消了1 nM apelin对ALP活性增高的抑制作用, 乱序siRNA (scrambled siRNA) 作为对照。这些结果提示apelin通过APJ/ERK以及APJ/PI3-K/Akt信号途径抑制CVSMCs向成骨细胞分化 (图3) 。

以PD98059 (10µM) 或LY 294002 (10µM) 孵育细胞2h后以1 nM apelin干预细胞。乱序APJ siRNA或APJ siRNA转染细胞以1 nM apelin干预。与对照组比较**代表P<0.01。

3 讨论

本研究最重要的发现是apelin能直接抑制体外培养的CVSMCs钙化, 后者与骨钙化具有共同的调节因子。Apelin抑制CVSMCs矿化是通过降低ALP活性起的作用, 后者是促进基质矿化的关键酶。Apelin抑制CVSMCs向成骨细胞分化是通过APJ/ERK和APJ/PI3-K/Akt途径介导的。这些结果证实CVSMCs是apelin直接作用的靶细胞。

动脉钙化是一种主动调节过程, 与成骨过程类似。VSMCs向成骨细胞表型转分化过程在动脉钙化过程中起关键作用。钙化型血管平滑肌细胞” (CVMSCs) , 这是VSMCs的一种特异, 表达成骨样表型基因并形成钙化结节。钙化的血管细胞是VSMCs的一种亚型, 可自发成骨细胞化以及矿化。这种细胞模型特别适用于分析动脉钙化的机制, 已被广泛用于动脉钙化的研究。我们的实验以CVSMCs为研究对象, 揭示了apelin与动脉钙化的关系。

Apelin在1998年作为人孤儿G蛋白耦联受体APJ的内源性配体而被发现, 后者最早于1993年被认为是7次穿膜G蛋白耦联受体超家族中的一员。Apelin肽已被证实能影响哺乳动物的多种生物功能, 包括神经内分泌、心血管以及免疫系统。Apelin和APJ在广泛分布于机体各个系统。在心血管系统, 内皮以及血管平滑肌细胞表达apelin和APJ, 这提示在血管系统apelin存在旁分泌以及自分泌调节模式。已有研究结果提示apelin具有对心血管系统具有保护功能。

我们应用RT-PCR以及免疫印迹方法, 我们确定了CVSMCs表达APJ, 并是apelin的作用靶位。我们的结果显示apelin降低ALP活性以及骨钙素分泌, 这两者是成骨分化的早期指标, 在CVSMCs向成骨细胞分化过程中升高。同时, apelin直接抑制矿化结节的形成。TNF-a升高ALP活性, 但这种作用被apelin干预体外培养的CVSMCs所抑制。本研究还证实apelin降低CVSMCs表达Runx2, 后者是成骨细胞分化的转录因子, 进一步支持apelin抑制CVSMCs向成骨细胞分化的结论。

为进一步了解关于apelin抑制CVSMCs向成骨细胞分化的作用机制, 我们检测了细胞内转导信号途径。MAPK和PI3-K/Akt已被证实对调控细胞分化其重要作用。我们的研究证明了apelin诱导CVSMCs ERK和Akt信号活化。PI3-K抑制剂预处理能阻滞CVSMCs Akt活化, 提示Akt磷酸化依赖于PI3-K。siRNA沉默APJ阻滞了apelin对ERK和Akt的激活, 提示ERK和PI3-K/Akt的活化是经由APJ介导。而且, APJ沉默、PI3-K/Akt以及ERK活化的阻滞使apelin不表现降低ALP活性的作用。这提示apelin通过APJ/ERK以及APJ/PI3-K/Akt信号途径抑制CVSMCs向成骨细胞分化。

我们的发现显示apelin对抑制VSMCs向成骨细胞分化起重要作用, APJ/ERK和APJ/PI3-K/Akt两个信号转导系统参与其中。我们的研究结果提示apelin可能对动脉钙化有保护作用。

摘要：目的 研究apelin对VSMCs向成骨细胞分化的作用以及作用机制。方法 以体外培养的钙化型血管平滑肌细胞 (CVMSCs) 作为血管钙化的研究模型, 通过检测碱性磷酸酶 (ALP) 活性以及骨钙素的分泌观察apelin与VSMCs向成骨细胞分化之间的关系, 应用细胞外调节蛋白激酶 (ERK) 抑制剂、磷脂酰激醇3-激酶 (PI3-K) 抑制剂以及APJ的小干扰RNA (APJ siRNA) 观察涉及的信号通路。结果Apelin抑制ALP活性、骨钙素分泌以及矿化结节的形成。CVSMCs表达APJ蛋白。Apelin激活ERK和蛋白激酶B (AKT, PI3-K的下游子) 。应用siRNA沉默APJ取消了apelin对ERK和Akt活化的抑制作用。而且, 抑制APJ表达、ERK或PI3-K的活化逆转了apelin对ALP活性的影响。结论 Apelin通过APJ/ERK和APJ/PI3-K/AKT信号途径抑制CVSMCs向成骨细胞分化。Apelin可能对动脉钙化有保护作用。

关键词：动脉钙化,血管平滑肌细胞,apelin

参考文献

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成骨分化 篇2

关键词：成骨细胞,脂肪细胞,骨细胞,横向分化

成骨细胞在骨代谢中发挥了的重要作用, 其分化成熟、功能活动及归属对骨质疏松等代谢性疾病的发生发展意义深远。研究发现, 成骨细胞不仅可以在自身分泌的基质包埋下形成骨细胞, 还可以横向分化为脂肪细胞。本文就成骨细胞向脂肪细胞横向分化及其向骨细胞分化作一综述。

1 各细胞与基因的相关性

1.1 成骨细胞与Runx2

Runx2为Runxx (runt related gene, Runxx) 相关转录因子蛋白因子家族成员, 是成骨细胞特异转录因子, 在骨形成的多个阶段起调控作用。转录因子Runx2对成骨细胞表型的确定是必需的, 当Runx2缺失时, 鼠成骨细胞分化完全受抑制, 骨膜成骨及软骨内成骨都不能发生[1]。体外实验证实, BMP-2与Runx2联合作用可使成骨细胞更好地分化[2]。另外, 外源性Runx2还可对抗地塞米松诱导骨髓基质细胞向脂肪细胞分化的作用[3]。经典的Wnt/B—catenin信号通路和转化生长因子-β/骨形态发生蛋白 (TGF—β/BMP-2) 信号通路都可以促进成骨细胞的分化和其分泌的胞外基质矿化, 这两条通路对成骨分化极为重要, 研究发现它们最后的靶基因都是Runx2[4,5]。然而, Runx2不只是通过这两条途径发挥作用, 大多涉及到成骨分化途径的最终靶基因几乎均是Runx2[6]。由此可见Runx2作为各个转导通路的交汇点对成骨细胞的分化起着决定性作用。不少学者还认为不少细胞因子、激素、药物都可以调节Runx2的表达, 从而影响成骨分化。

1.2 骨细胞和SOST

SOST基因编码骨硬化蛋白, 其仅在骨细胞表达[7]。人的SOST表达缺失将导致高骨量疾病Van Buchem’s病和硬化性骨化病的发生。小鼠SOST基因缺失同样表现为高骨量和骨强度增加, 而转基因小鼠过表达人SOST则表现为低骨量[8,9]。这些研究证明SOST基因编码骨硬化蛋白对骨形成具有特殊的抑制效果[10]。SOST基因编码的骨硬化蛋白对骨形成蛋白 (BMP) 家族的成员蛋白具有很强的拮抗作用。此外, 骨硬化蛋白和Dkk1与LRP5和LPR6结合, 阻止Wnt信号通路的激活。此类研究表明骨细胞中少量表达的基因可能作为骨组织重建过程中的分子调解者。研究还发现, 甲状旁腺激素和雌性激素可抑制SOST基因的表达, 间断或连续给予PTH, 都将下调小鼠骨细胞中骨硬化蛋白的表达, 对人而言则降低骨硬化蛋白在体内循环水平[11]。

1.3 脂肪细胞和PPAR-γ

过氧化物酶增殖物激活受体γ (PPAR-γ) 在不同物种动物的脂肪组织中高度表达。研究发现, 在没有PPAR-γ的情况下, 没有发现一种因素可以诱导脂肪细胞的分化, 其被认为是与脂肪细胞分化最重要转录因子, 尤其在脂肪细胞分化早期起到不可或缺的作用[12]。尽管C/EBPα基因在脂肪形成过程中也有着至关重要的作用, 但在缺失PPAR-γ的永生纤维细胞系中, 仅有C/EBPα基因条件下不能促进脂肪形成, 而在C/EBPα基因缺失细胞中, PPAR-γ则可以促进脂肪形成[13]。不仅如此, Kim等[14]还发现, 将小鼠成骨细胞株MC3T3-E1经过成脂诱导后, 细胞的PPAR-γ的表达增强, 表明PPAR-γ参与调控成骨细胞向脂肪细胞横向分化过程。由此可见, 深入研究PPAR-γ信号通路将为脂类代谢疾病的治疗和预防提供重要的理论参考。

2 成骨细胞向脂肪细胞横向分化

随着细胞生物学研究的不断深入, 越来越多的研究表明, 起源于同一祖细胞的各种终末分化细胞在一定的条件下可以相互转化, 由一种细胞横向分化 (transdifferentiation) 为另一种细胞[15,16]。成熟的成骨细胞和脂肪细胞均是由骨髓间充质干细胞分化而来, 它们具有某些相同的细胞表型, 在一定条件下同样能发生横向分化。Nuttal等[17,18]的研究在这方面提供了有力证据, 他们认为在一定的条件下, 成熟成骨细胞能向脂肪细胞发生横向分化。此后国内学者将成骨细胞置于成脂培养基中进行诱导分化也证实了这个结论[19,20]。此外, 童天朗等[21]采用间充质干细胞向成骨细胞分化, 定向成骨分化的“前成骨细胞”也成功的分化为脂肪细胞。随着糖皮质激素在临床上的应用越来越广泛, Yao等[22]发现, 大剂量糖皮质激素作用下的小鼠骨髓组织中有大量脂肪细胞沉积。为探究其机制, 罗磊等[23]将糖皮质激素长期、大剂量地作用于大鼠颅骨成骨细胞, 发现糖皮质激素可使成骨细胞横向分化为成熟的脂肪细胞。进一步研究发现, 大剂量GCs作用下, PPAR-γ表达上调、Runx2表达下调, 调控BMSCs向脂肪细胞分化并促进成骨细胞横向分化为脂肪细胞[24]。这些发现证明了在超生理剂量GCs作用下, 一方面BMSCs向脂肪细胞分化, 并抑制其向成骨细胞分化;另一方面成骨细胞向脂肪细胞分化, 最终导致骨髓内脂肪细胞积聚、成骨细胞数量减少, 骨代谢失衡。

上述研究表明, 骨髓中脂肪细胞的增加伴随着成骨细胞的减少, 两者存在“此消彼长”的关系, 暗示脂肪细胞分化和成骨细胞分化可能有共同的作用调控靶点。细胞向特定方向分化受相关基因的调控。Runx2是成骨分化主要的决定基因, 而PPARγ主要促进脂肪形成。Kim等[14]实验发现可以通过成脂转录因子PPAR-γ将小鼠成骨细胞株MC3T3-E1诱导分化为成熟的脂肪细胞。表明内源性PPAR-γ活化在谱系分化过程中可使非成熟或成熟成骨细胞谱系更倾向于向脂肪谱系转变。另外, TAZ (具有PDZ结合域的转录共刺激因子) 是可以与14—3—3蛋白结合的一个转录调节因子, 其通过共激活Runx2依赖基因的转录和抑制PPARγ依赖基因的转录, 从而促进骨形成和抑制脂肪形成。这些发现表明Runx2或PPARγ2表达对细胞向成骨细胞还是脂肪细胞分化有着重要意义。

研究发现脂肪细胞分化特异转录因子和脂肪细胞特异基因的表达与激素使用剂量和使用时间呈正相关[25]。国内研究者在这方面做了深入的研究, 谢小伟等[26]认为长期、大剂量应用糖皮质激素可通过升高DKK-1的表达抑制促进成骨细胞分化的Wnt信号通路, 成骨细胞增殖受抑制, 促进其脂肪化, 提示经典Wnt信号通路对成骨细胞与脂肪细胞横向分化有一定的影响, 但具体的分子机制尚不明确。此外, 王兆杰等[27]指出缝隙连接蛋白Cx43可能在骨髓成骨细胞向脂肪细胞横向分化过程中起主导地位。其分子作用机制可能是某些抑制剂使细胞膜上有效的缝隙连接通道数量减少。骨骼中缝隙连接通讯的调节可能代表新一类药物的目标, 此类药物可以抑制成脂的发生而相应的引起成骨过程的升高。

3 成骨细胞向骨细胞分化

骨细胞和成骨细胞是骨组织中重要组成部分, 其中骨细胞总数占骨组织细胞90%以上, 它是由成骨细胞分泌基质并自身包埋分化而成, 并拥有大量突触结构, 因此, 骨细胞可以理解为终末的成骨细胞[28]。虽然骨细胞是终末分化的成骨细胞系, 但是两种细胞在形态、标志物、功能等方面均有显著差异。成骨细胞分化为新生骨细胞后, 细胞体积下降70%, 细胞也逐渐失去了细胞器和分泌细胞外基质的能力, 而突触的体积却增加[29]。这些含有细胞浆的突触将骨细胞与临近骨细胞、成骨细胞和破骨细胞串联起来, 成为与其他细胞形态学鉴别的突出特征。而Pazzaglia等[30]在这方面做了最新的研究, 他们使用扫描电镜 (SEM) 分析证实骨陷窝-微管系统 (lacuna-canalicuarsystem) 的形成对成骨细胞向骨细胞分化有重要意义。据报道, 成骨细胞中ALP的表达明显高于骨细胞, 且随着成骨细胞向骨细胞分化进展, ALP的表达呈逐步下降趋势[31]。骨钙素 (OC) 是成骨细胞特异性合成和分泌的一种非胶原蛋白, 是向成熟骨细胞分化的最具特征性的标志物。在成骨细胞分化后期表达大量的OC调节其向骨细胞分化, 而在成熟骨细胞阶段OC的表达处于高峰期。因此, 它在成骨细胞体外分化为成熟骨细胞及基质钙化的过程中具有重要意义。

然而, 近来的研究发现, 骨细胞在常规的二维培养环境中有发生去分化的趋势, 失去了骨细胞固有形态。甚至将其培养于含Ⅰ型胶原蛋白凝胶 (含0.1%FBS) 的三维培养基中, 随着时间的推移, 骨细胞同样去分化为成骨细胞, 但其去分化现象没有在二维培养基中显著[32]。为了全面分析骨细胞功能, 相关学者建立了一个更好的维持骨细胞特性和形状的培养条件 (含50%人工基膜 (Matrigel) 和0.2%FBS的Ⅰ型胶原培养基) , 但并不能完全抑制成熟骨细胞的去分化[33]。此外, Torreggiani等[34]发现内嵌在骨基质中的前骨细胞/骨细胞是活动的, 一旦给予额外的骨环境, 它们将从骨陷窝中迁移出去并去分化为成骨细胞, 这可能是成骨细胞另一来源。这些研究暗示, 我们有必要去建立一个更适合培养骨细胞的体外环境, 以避免骨细胞去分化为成骨细胞存在的干扰问题。

成骨分化 篇3

1 资料与方法

1.1 DFSCs成骨分化中基因表达芯片数据的获取

从GEO Datasets数据库获取DFSCs成骨分化过程中基因表达芯片数据,其方法是:输入网址“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds”,进入GEO Datasets数据库,在搜索栏输入“dental follicle”,搜索后获得DFSCs成骨分化的基因表达芯片数据集(GEO登记号:GSE18072),该数据集应用表达芯片检测DFSCs体外成骨分化前和成骨分化后差异表达的基因获得,其具体的实验条件在以往的文献中已有叙述[7,8]。本研究中,我们应用GEO Datasets自带分析软件GEO2R对原始数据进行分析,获得DFSCs成骨分化过程中差异表达的基因。

1.2 DFSCs成骨分化中基因表达芯片数据的分析

gene ontology(GO)和KEGG等数据库可对大量基因数据按照一定的共性进行富集和分类。DAVID数据库整合了GO、KEGG等数据库。本研究应用DA-VID数据库对DFSCs成骨分化过程中差异表达的289个基因进行生物信息学分析,其过程如下:输入网址“http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp”,进入DA-VID数据库,将DFSCs成骨分化过程中差异表达的289个基因复制到输入框,选择“official gene symbol”作为识别类型,选择“Homo sapiens”和“Mus musculus”作为注释种属,点击“Submit List”提交数据,最后点击“Start Analysis”按钮,应用DAVID的分析模块如Functional Annotation Clustering等对这些基因进行生物信息学分析。

1.3 被富集到“骨骼系统发育”子集基因的网络分析

DAVID数据库可将大量基因中具有共同属性的基因富集到不同的子集。然而,子集内基因的相互关系不能清楚的显示。Gene MANIA数据库可基于共表达(co-expression)、共定位(co-localization)、蛋白和基因的相互作用(protein and gene interactions)等对基因集进行分析和预测,显示这些基因的分子网络图。

DAVID数据库将DFSCs成骨分化中差异表达的12个基因按照Gene Ontology功能分类法富集到“skeletal system development(骨骼系统发育)”子集。应用Gene MANIA数据库分析这12个基因的相互关系,其方法如下:输入网址“http://www.genemania.org”,进入Gene MANIA数据库。选择种属“Homo sapiens”。接着将ALPL、CTSK、TUFT1、TGFBR2、FHL2、ROR2、STC1、POSTN、ZBTB16、FRZB、PRELP和IGFBP5等12个基因输入,点击“GO”进行分析并保存结果。

2 结果

2.1 DFSCs成骨分化中差异表达的基因

应用GEO2R对从GEO Datasets数据库获得的原始数据集(GSE18072)进行分析,获得大量DFSCs成骨分化过程中差异表达的基因,选择表达差异明显(P<0.05)的289个基因用于进一步分析:ADH1B,AP-OD,PIP,GPRC5B,CCND2,SERPING1,TMEM176A,ZBTB16,STC1,ENTPD1,METTL7A,IL7R,GPM6B,MFAP4,SPON1,CYP39A1,SH2D4A,RAB27B,ASPN,TGFBI,SLC39A8,ADH1A,MAOA,FKBP5,SPRY1,ID3,PRELP,MTHFD2,DIO2,ROR2,PTGS1,PLAT,CCDC69,CDC23,EFEMP1,SAA2,FGD4,SULF1,MMP1,VIT,CFH,OLFML1,SGCG,TIMP4,CORIN,ABCA6,PTGFR,SLC7A5,GLUL,SESN3,ADAM12,ISM1,PNMA2,ROBO2,ST8SIA1,LYPD6B,FMOD,SEPP1,RFTN2,FRZB,ARRDC2,FMO3,INMT,GLUL,CD14,BIRC3,ADH1C,FNDC1,SHC3,DLL1,SLC40A1,PRUNE2,COL14A1,TNFSF15,SAMHD1,AKAP12,FAM43A,PSG1,PROS1,NRG1,DIO3,SLC9A9,TM4SF20,CFHR1,IGFBP2,SHCBP1,NAP1L2,NR4A3,PRC1,PROS1,KIF14,ADAM19,PRUNE2,SH3PXD2B,KCNH1,TSC22D3,LIF,ITGB8,GPT2,FAM20A,SYTL2,TMTC1,TOP2A,CHAC1,SLC8A1,HMGN2,LR-RN3,CA5B,NRG1,HSPA2,CTSK,EDNRB,ABHD2,KIT,PBK,C1QTNF1,SAT1,ASPM,RARRES2,HMGN2,FMO4,CYP7B1,CEP55,IGFBP5,LAMP5,FAXDC2,CA12,DEPDC1,ALPL,SERAC1,PLA2R1,EZR,TXNIP,MUC15,TACC3,UGCG,TJP2,GPR39,BDNF,PCDH18,LRRN4CL,KIF23,SH3BGRL2,NUDT6,SULT1B1,NRP2,KIAA0101,PGM2L1,USP53,LAMA2,RNF157,GPX3,PHKA1,AJUBA,ID1,KRE-MEN1,IRAK3,ABCA8,MARS,BUB1,LRCH2,SI-PA1L2,IL12RB2,EPHA4,JUP,MTHFD1L,ARHGAP24,NEK10,ADRA1D,MKI67,PDGFD,ZNF594,DLGAP5,HIST1H1B,TMEM176B,POSTN,LOXL2,BDKRB1,NME2,NME1,MEGF9,LOC100506242,HIST1H2BM,HMCN1,ANTXR1,COLEC12,EFHD1,ZNF608,PTCHD4,FLVCR2,GFRA1,KRT7,SPON2,FBLN1,HJURP,ASNS,SLC38A5,FHL2,SEL1L3,ADAMTS6,CENPF,NPTX1,NUF2,SLC35E3,CASC5,THRB,RASL11A,KCND3,CHRNA1,SPC25,SLC17A7,MTH-FD2,CNTN3,TUFT1,TNFRSF12A,SNORD75,ARRB1,ACTG2,UBE2T,IQGAP3,SNED1,ETV1,TTK,NCAPH,CRABP2,CD302,SLC44A1,SERPINF1,MME,EBF1,CTPS1,LAMA3,MRVI1,FBXO32,EIF1AY,FAM105A,MAGED4,MAGED4B,APBB1IP,STON1-GTF2A1L,PRR5L,LRRK2,RDH10,SHMT2,STAC,LINC00341,ITGA10,RRM2,PCK2,DSE,SLC6A6,TPM1,CDK1,TGFBR2,IL1R1,KRTAP1-1,KRTAP1-3,TYMS,KI-AA1524,SLC25A27,OBFC1,KCNJ6,P4HA3,STXBP4,C7orf69,BCL6,DIAPH3,PTK2B,TBX18,OLAH,HIST1H3B,RNF152,LOC100131826,SLC31A2,PTTG3P,PTTG1,CTSB,ACKR4,PAMR1,C5AR2,TBC1D8,MFSD6,KIAA0355,BIRC5,DPT,LGMN,CMTM4,PDE1A,ELN,SGOL1。

2.2 DFSCs成骨分化中差异表达的基因被富集在不同的信号通路与生物学过程

应用DAVID数据库对此289个基因进行生物信息学分析,结果显示这些基因可以富集到不同的信号通路、生物学过程等子集。

基于KEGG信号通路,EDNRB、SLC8A1、PTK2B、PDE1A、PHKA1、BDKRB1、PTGFR和ADRA1D等8个基因被富集到与成骨分化密切相关的“Calcium signaling pathway(钙信号通路)”,这些基因在该信号通路所处的位置及与其它信号通路的关系见图1。

基于GO数据库的“Biological process(生物学过程)”分析,将此289个基因富集到多个子集,其中与间充质干细胞增殖、成骨分化密切相关的一些子集见表1。ALPL、CTSK、TUFT1、TGFBR2、FHL2、ROR2、STC1、POSTN,ZBTB16、FRZB、PRELP、IGFBP5等12个基因富集到了“骨骼系统发育”生物学过程子集。

2.3“骨骼系统发育”子集中基因的相互作用关系

应用Gene MANIA数据库对富集到“骨骼系统发育”子集的12个基因进行分析,结果显示这12个基因及一些相关基因通过共表达、共定位、物理相互作用、蛋白相互作用等发生关联,建立了这些基因的调控网络(图2)。

网络图显示成骨分化标记基因COL1A1与CTSK存在共同表达的时空关系,后者与牙齿的发育和矿化密切相关[9]。COL1A1同时与PRELP存在物理相互作用,后者对骨改建也有重要的作用[10]。网络图也显示成骨分化标记基因ALPL与FZD5及ROR2存在共同表达的时空关系,后两者是WNT信号通路的成员,在骨发育和改建中发挥着重要作用[11]。此外,与间充质干细胞成骨分化密切相关的基因TGFBR2、IGFBP5等也彼此存在广泛联系。这些结果提示“骨骼系统发育”这一子集的基因在DFSCs成骨分化过程中发挥了重要作用且相互关联。

图1“钙信号通路”网络图(★:在DFSCs的成骨分化中差异表达的基因)Fig 1 Network view of calcium signaling pathway(★:differentially expressed genes during the osteogenic differentiation process of DFSCs)

3 讨论

牙囊由颅神经嵴细胞迁移、增殖和分化形成,可形成牙骨质和牙周膜。以往研究表明,牙囊组织中包含一类具有多向分化潜能的牙囊干细胞,在一定条件下可分化形成脂肪细胞、软骨细胞、成肌细胞、神经细胞和成骨细胞[6],是一种具有潜在应用价值的成骨、成牙种子细胞。

以往研究表明,BMP2、BMP7、BMP9可促进DFSCs的成骨分化,而Wnt5a、p38 MAPK、ALP、DLX3、DLX5、MSX2、ZBTB16等参与了DFSCs成骨分化[3,4,5,6,12]。本研究通过对DFSCs成骨分化中差异表达的基因进行分析,发现ALPL等12个基因表达发生改变并且富集到“骨骼系统发育”基因子集,进一步支持这些基因对DFSCs成骨分化具有重要的调控作用[13]。Gene MA-NIA分析结果还显示,这些基因之间及与其他一些WNT信号通路分子如ROR2等存在共表达、共定位等联系。而富集在KEGG“钙信号通路”的一些在DFSCs成骨分化中表达发生改变的基因也与MAPK及TGF-beta等信号途径存在关联。提示WNT、MAPK、TGFbeta等信号通路在DFSCs成骨分化过程中可能存在对话,进而调控成骨分化标记基因如ALPL、COL1A1的表达。此外,生物信息学分析结果还显示,许多差异表达的基因对细胞增殖、分化具有重要的调控作用,这些基因也被富集到“细胞周期”和“细胞增殖”等不同子集,提示在DFSCs成骨分化过程中,细胞周期和增殖信号也发生了改变,以适应成骨分化这一生物学过程。

通过分子、细胞和动物等方法可确切的研究基因功能[14]。然而,基因靶标的研究往往范围较大,直接进行功能实验要耗费大量的时间和精力,而多个基因间内在关系的研究则更为复杂。生物信息学的发展帮助我们实现了靶标基因的预测及研究多个基因间的复杂关系。本研究从GEO Datasets数据库获取了DFSCs成骨分化中差异表达的基因数据,节约了研究成本。然后通过DAVID及Gene MANIA等数据库对这些基因分析后把功能属性相似的基因进行了富集,建立了部分基因的调控网络,为从整体上认识DFSCs成骨分化提供了思路。

成骨分化 篇4

1 材料和方法

1.1 实验材料和设备

α-MEN培养液 (Gibco, 美国) , CCK-8 (同仁, 日本) , 5%CO2恒温孵箱 (Heraeus, 德国) , 酶标仪 (Biocell, 美国) , 倒置显微镜 (Olympus, 日本) , 碱性磷酸酶试剂盒 (南京建成) 。

1.2 m PRP的制备

收集经检验合格的人AB型机采血小板0.1单位, 加入肝素 (终浓度2 U/ml) , 3 000 r/min离心20min, 吸弃部分上清, 将血小板密度调至1×1012个/L, 吸管反复吹打使血小板重新悬浮成为富血小板血浆;将PRP分装入冻存管内, 浸入液氮罐5 min, 迅速取出浸入37℃水浴箱5 min, 反复3次, 使血小板充分冻融裂解;3 000 r/min离心20 min, 去除血小板沉渣, 0.2μm过滤, 保存于-80℃备用。

1.3 SHED的分离培养

选取6~10岁健康儿童无牙体牙髓疾病的滞留乳牙多颗, 参照文献[1]的方法提取牙髓组织, 进行原代培养, 获得乳牙牙髓干细胞。

1.4 SHED的鉴定

1.4.1 增殖能力

取第3代生长良好的SHED以1×104/ml、200μl/孔接种于96孔板, 共接种4×8个孔, 37℃、5%CO2下分别培养1~7 d, CCK-8法测定孵育2 h后于450 nm波长处A值, 绘制细胞生长曲线。

1.4.2 SHED的定向分化潜能

取第3代细胞以1×105/孔的密度接种于6孔板, 在培养基中分别加入矿化诱导液和成脂诱导液, 一段时间后观察培养体系中矿化结节和脂滴的形成情况。

1.5 不同培养条件下SHED的成骨分化能力比较

1.5.1 实验分组

按不同培养条件分为4个实验组和一个对照组, 实验组在α-MEM培养基中分别加入1%、2%、5%和10%m PRP;对照组在α-MEM培养基中加入10%FBS。各组均加入矿化诱导液进行诱导矿化 (培养基中加入终浓度为1μmol/L地塞米松、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50μg/ml维生素C) 。

1.5.2 碱性磷酸酶活性

将生长状态良好的第4代SHED以5×103/孔密度接种于96孔板内, 培养24 h待细胞贴壁后分别加入不同的细胞培养液, 培养2、4、6 d后, 按照ALP试剂盒说明操作, 520 nm处酶标仪测各孔吸光度 (A) 值, 检测细胞ALP活性。

1.5.3 qRT-PCR

用5种不同的培养液分别培养SHED 7 d后, 按照Trizol试剂盒说明书提取细胞总RNA, SuperscripⅢ逆转录酶合成c DNA模板。引物由上海生工合成。PCR引物序列见表1。RT-PCR反应体系:共25μl, 上游引物1μl, 下游引物1μl, SYBR12.5μl, c DNA 2μl, 水8.5μl。反应参数:95℃30 s, 95℃10 s, 64℃30 s, 35个循环, 最后1个循环结束后做熔解曲线, 确定PCR反应质量, GAPDH为内参, 并设置无模板阴性对照。qRT-PCR反应结束后, 利用PCR扩增仪自带软件进行荧光定量分析, 得出Ct值, 绘制标准曲线。确定RUNX2、骨钙素的mRNA含量。比较各组间SHED的RUNX2、骨钙素mRNA含量的差异。

1.6 统计学分析

相同实验条件重复3次, 实验数据以±s表示, 采用SPSS 18.0软件进行统计学分析, 时间和分组的交互作用采用析因设计的方差分析, 同一时间点组间均数的比较以及同一组内部各时间点的比较采用单因素方差分析, 多重比较采用LSD方法, 显著性差异检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 SHED的分离和鉴定

获取了形态良好的SHED, 单细胞形式生长, 长梭形, 成纤维细胞样形态, 6~7 d即汇合可传代 (图1) 。

对第3代SHED进行体外诱导矿化, 细胞增长迅速, 第6天后细胞逐渐重叠生长, 第30天时形成明显结节, 茜素红染色后呈阳性;对第3代SHED进行体外诱导成脂实验, 第21天可见透明高亮度点, 并有部分融合, 油红-O染色呈阳性。

2.2 m PRP对SHED ALP活性的影响

不同浓度m PRP均可增强SHED碱性磷酸酶活性, 尤其是在第6天, 与对照组相比各实验组SHED ALP活性差异均具有显著性 (P<0.01, 图2) , 其中浓度为2%m PRP对SHED ALP活性的促进作用最大。

2.3 m PRP对SHED中RUNX2 mRNA含量的影响

qRT-PCR结果显示, 矿化诱导第7天时, 1%、2%和5%m PRP培养的SHED中RUNX2 mRNA表达量显著高于对照组, 而10%m PRP培养的SHED中RUNX2mRNA表达量显著低于对照组 (图3) 。

2.4 m PRP对SHED中骨钙素mRNA含量的影响

qRT-PCR结果显示, 矿化诱导第7天时, 2%和5%m PRP培养的SHED中骨钙素mRNA表达量显著高于对照组, 而1%和10%m PRP培养的SHED中骨钙素mRNA表达量与对照组差异无显著性 (图4) 。

3 讨论

干细胞具有自我更新以及多向分化潜能, 在组织器官的发育以及损伤的修复过程中发挥着重要作用。SHED的增殖率高于骨髓基质干细胞和牙髓干细胞 (dental pulp stem cells, DPSCs) , 在体外环境作用下可以向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等方向进行分化[2]。

有学者研究发现, MSCs表达高水平的PDGF-A、PDGF-B、b FGF、TGF-βⅡ和IGF-1受体, PDGF、FGF和TGF-β信号通路在MSCs的增殖和分化过程中起着重要作用, 选择性地抑制PDGF受体激酶, 则骨细胞的形成明显减少, 并且不能形成矿化结节, 血小板中的生长因子可能通过这些受体作用于这一类细胞[4];PRP处理过的DPSCs高表达成牙本质基因和成骨基因[5], 通过上调骨桥蛋白 (osteoprotein, OPG) 和ALP可以促进成骨分化[6]。我们的前期研究发现, 10%~30%的PRP可明显提高牙髓细胞ALP活性, 其中以20%浓度尤为明显;10%~30%的PRP明显促进了矿化诱导后10d的牙髓细胞形成矿化结节, 其中10%浓度在矿化诱导20d促进牙髓细胞形成的矿化结节最大[7]。如果m PRP也能促进SHED成骨分化, 两者联合应用于组织工程, 可以避免因使用异种血清可能带来的感染和免疫排斥等风险。

本实验成功获取了m PRP和SHED。经鉴定SHED具有成骨、成脂等多向分化能力。PRP含有大量的生长因子, 如血小板源性生长因子 (platelet-derived growth factor, PDGF) , 转化生长因子-β (transforming growth factor-β, TGF-β) , 胰岛素样生长因子 (insulin-like growth factor, IGF) , 表皮生长因子, 血管内皮生长因子等。以往的研究往往通过使用牛凝血酶等使PRP中的血小板裂解以释放生长因子。我们的前期研究发现, 用液氮反复冻融PRP可激活血小板, 不但可以避免异种蛋白的污染, 而且其促进DPSCs增殖的作用更强[8]。此外, 本实验采用机采血小板, 可进一步纯化血小板, 避免其它血细胞的混杂, 更有利于分析研究血小板及其裂解物对细胞增殖矿化的作用。

ALP活性是成骨样细胞分化成熟的重要指标, 其活性高低可以反映不同组织、细胞的矿化能力以及向成骨方向转化的趋势[9]。本实验结果显示, 不同浓度的m PRP均可增强SHED的ALP活性, 尤其以2%作用最强。

RUNX2和骨钙素是与矿化相关的重要因子, 是检测细胞矿化的重要指标。申元源等[10]发现SHED在体外培养过程中可以表达成骨细胞的标志, 如RUNX2、OC、BSP。本实验用qRT-PCR方法检测不同浓度m PRP对SHED内RUNX2及骨钙素mRNA表达的变化, 直接反映m PRP对SHED的成骨促进能力。结果显示, m PRP对SHED内RUNX2和骨钙素mRNA表达促进作用具有浓度特异性, 矿化诱导第7天时, 2%和5%m PRP培养的SHED中RUNX2和骨钙素mRNA表达量均显著高于10%FBS, 尤其以2%促进矿化作用最强。

综上所述, 一定浓度的m PRP对SHED的骨向分化具有一定的促进作用, 而较强的增殖与骨向分化能力正是SHED作为骨组织工程种子细胞所需具备的特性。本实验结果为SHED更好的应用于骨组织工程提供了一定的实验依据。选择具有更强体外扩增和成骨能力的SHED, 并采用m PRP进行体外培养, 有可能解决目前制约体外组织工程骨构建中所存在的难题, 从而提高组织工程骨体外构建的效率, 降低成本, 并增加临床治疗的安全性。

参考文献

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成骨分化 篇5

1 资料与方法

1.1 一般资料

选用荧光定量PCR试剂盒、胎牛血清、乌龙茶、胰蛋白酶RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒以及青-链霉素溶液作为主要试剂, 并选用倒置荧光显微镜、CO2培养箱、PCR仪以及荧光定量PCR仪作为试验的主要仪器。

1.2 方法

1.2.1 对乌龙茶中茶多酚进行提取

应用定量秤称取5kg茶叶, 将茶叶磨碎后与浓度为60%的100mL乙醇溶液相混合, 然后在70℃水浴中浸泡30min, 重复此操作步骤3次, 将滤液合并, 将其真空抽空后再过滤。对乙酸乙酯进行萃取, 然后滤液, 3次后将萃取液合并, 旋转蒸发仪后使其浓缩, 然后在真空冷冻条件下将浓缩所得制剂干燥化, 将茶多酚提取物取出, 最后应用DMSO溶液对茶多酚进行稀释, 所得溶液于零下20℃的环境中保存。

1.2.2 对hbMSCs进行分离与培养

试验必须在无菌条件下进行, 将抽取的5mL患者骨髓放入装有ACD抗凝液的离心管中调匀, 再将5mL生理盐水加入其中, 打散其中的细胞, 将细胞悬液以渐进性速度加入淋巴细胞分离液中 (容量为10mL) , 采取离心、分层, 从骨髓干细胞层中抽取淡黄色液层, 将淡黄色液按1∶1比例置入生理盐水中, 摇匀后在培养瓶中进行接种, 然后放入37℃的环境中, 在浓度为5%的CO2培养箱中进行培养, 两天后初次换液, 之后每3天更换1次, 当细胞融合至90%时, 应用浓度为0.25%的胰酶进行传代[1]。

1.2.3 茶多酚EGCG在hbMSCs试验中的作用

取出传代至第3代的hbMSCs, 将其按密度为105M接种于含有六孔的培养板中, 将应用浓度为10-5M以及10-6M的茶多酚EGCG作用于人骨髓基质干细胞3周后相关基因的表达变化与DMSO阴性空白对照后进行对比, 细胞融合至90%时, 将茶多酚培养液置入其中, 设置组别为空白对照组 (DMSO阴性组) 、10-5M茶多酚组、10-6M茶多酚组[2]。

1.2.4 对RNA进行提取与逆转录

细胞培养21天后, 应用PBS对细胞进行冲洗, 二次后得到提取物hbMSCs, 然后对RNA进行提取, 应用Trizol提取方法, 最后实施逆转录反应。提取菌株, 并应用PCR荧光定量分析法制备标准品, 观察菌株特异性引物的PCR检测过程中的反应, 对产物进行切胶与回收, 提取其DNA片段, 并将其作为定量的标准品。

1.3 统计学分析

选用SPSS17.0软件进行数据分析, 采用卡方检验进行计数资料的对比, 应用Student t检测方法进行计量资料的对比, 最后检测P值, P<0.05表明数据存在差异性, 具有统计学意义。

2 结果

应用荧光定量PCR法测定三组人骨髓基质干细胞基因表达的结果, 见表1。

(±s)

对BMP-2基因的表达水平进行总结, 其中DMSO对照组浓度低于10-6M的茶多酚EGCG<浓度为10-5M的茶多酚EGCG。而ALK以及RUNX2基因在三组间的表达无显著变化, 因而不具有统计学意义 (P>0.05) 。

3 讨论

本研究结果显示, 采用荧光定量PCR测定法对ALK、RUNX2、COLIAI以及BMP-2等基质干细胞向成骨分化过程中产生重要作用的基因, 能分化激活骨髓基质干细胞, 并提高骨细胞成熟率, 而在逆转录以及成骨分化过程中, 具有重要意义[3,4]。骨细胞中含量最为丰富的两种成分为ALK、COLIAI, 其中ALK具有水解作用, 能水解为有机磷酸酶, 使局部磷酸根浓度得以提高, 在钙的作用下实现钙化;CO-LIAI中含有的胶原蛋白具有特异性, 茶多酚对骨分化基因中的COLIAI、ALK以及RUNX2具有较小影响[5,6]。

综上所述, EGCG在骨分化bmp-2的基因表达水平中具有重要的促进作用, 而骨形态蛋白作为骨髓基质干细胞成骨分化基因的重要部分起到了诱导性作用, BMP-2不仅对未分化的细胞有促进分裂作用, 对BMSC也有骨细胞分化的转化作用, 同时有利于其实现钙化, 因此BMP-2基因表达一旦达到相应阈值就能起到很好的诱导性作用。茶多酚EGCG对人骨髓基质干细胞成骨分化基因的BMP-2的表达水平具有促进作用, 有利于研究的进一步开展。

摘要：目的:观察并探讨茶多酚EGCG对人骨髓基质干细胞成骨分化基因中有关成分表达的影响。方法:应用浓度为10-5 M以及10-6 M的茶多酚EGCG作用于人骨髓基质干细胞, 3周后对比分析相关基因的表达变化, 并与DMSO阴性对照, 总结茶多酚EGCG对人骨髓基质干细胞成骨分化基因的相关影响。结果:DMSO对照组浓度低于10-6 M的茶多酚EGCG<浓度为10-5 M的茶多酚EGCG。结论:茶多酚EGCG对人骨髓基质干细胞成骨分化基因BMP-2的表达水平有促进作用。

关键词：骨质疏松症,茶多酚EGCG,人骨髓基质肝细胞,成骨分化基因

参考文献

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成骨分化 篇6

1 材料与方法

1. 1 主要试剂和仪器

骨桥蛋白( R&D Systems公司,美国) ; DMEM高糖型培养基( Gibco公司,美国) ; 胎牛血清( Hyclone公司,美国) ; 胰蛋白酶、Ⅰ型胶原 酶、茜素红 ( Sigmaaldrich公司,美国) ; 抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、L-谷氨酰胺( Sigma公司,美国) ; 逆转录试剂盒( Roche公司,瑞士) ; PCR Master Mix ( Tiangen公司) ; CO2孵箱( Heraeus公司,德国) ; YJ-875型超净2工作台( 苏州净化设备厂) ; 倒置相差显微镜( Olympus公司,日本) ;台式低温高速离心机 ( Hettich公司,德国) ; PCR仪( 杭州博日科技有限公司) ; 精密酸度计( 上海虹益仪器仪表有限公司) 。

1. 2 方法

1. 2. 1牙髓干细胞的分离和培养[8]收集临床14 ~29岁因阻生或正畸拔除的正常健康的第三磨牙或前磨牙,劈开牙体,用镊子与探针挑出牙髓,含双抗PBS充分冲洗,在体积分数为0. 3% 的Ⅰ型胶原酶中用37℃水浴振荡器消化1 h,200目尼龙筛过滤悬液至10ml离心管中,1 000 r / min离心5 min,弃上清,加入含20% FBS培养基,吹打混匀,血细胞计数板计数以1×105个/ml细胞接种至50 ml的培养瓶,37℃、5% CO2恒温培养箱中培养。每周换液2 ~ 3次,细胞融合达80% 后,0. 25% 胰蛋白酶消化,1∶2比例传代。

1. 2. 2牙髓干细胞的纯化和鉴定[9,10]克隆团分选技术将牙髓细胞悬液进行纯化分离,流式细胞技术鉴定DPSCs,倒置相差显微镜观察细胞形态,细胞常规传代至2 ~ 3代用于后续实验。

1. 2. 3茜素红矿化结节染色( Alizarin red S staining)将第3代人DPSCs以1×105个/ 孔接种于6孔板中。12 h后,随机分为2组: 矿化液组( DMEM F/12培养基、胎牛血清、青链霉素、100μmol/L抗坏血酸,10mmol / Lβ-甘油磷酸 钠, 2 mmol / L L-谷氨酰胺[11,12]) ; OPN组( DMEM F/12培养基、胎牛血清、青链霉素、0. 01μg /ml OPN[13]) 。每组设3个复孔。继续培养28 d后进行茜素红染色,培养板PBS缓冲液冲洗3遍,95% 无水乙醇固定15 min,蒸馏水冲洗3次,0. 1% 茜素红-Tris-HCl ( p H = 8. 3 ) 37℃孵育30 min,蒸馏水轻轻冲洗2次,干燥。

1. 2. 4逆转录聚合酶链反应( reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR ) 检测将第3代人DPSCs以1×105个/孔接种于6孔板中。12 h后,随机分为2组: 矿化液组( DMEM F/12培养基、胎牛血清、青链霉素、100μmol/L抗坏血酸,10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠,2 mmol/L L-谷氨酰胺) ; OPN组( DMEM F/12培养基、胎牛血清、青链霉素、0. 01μg /ml OPN) 。每组设3个复孔 ( 实验重复3次) 。继续培养7 d后进行RT-PCR实验检测各组骨涎蛋白 ( bone sialoprotein,BSP) 、Runx-2转录因子、骨钙蛋白 ( osteocalcin,OCN) 、Ⅰ型胶原蛋白( collagen-1,Col-1) 表达情况。依据操作手册使用Trizol试剂裂解细胞,提取总mRNA。参照RT-PCR逆转录试剂盒操作说明书将总mRNA依次按25℃10 min、50℃1 h、85℃5 min逆转录为c DNA。PCR反应条件为: 94℃3 min预变性后,94℃30 s、48. 2 ~ 60. 1℃30 s、72℃1 min,30个循环,72℃5 min延伸,4℃保存。RT-PCR引物序列见表1。

1. 3 统计学处理

计量资料采用x珋±s形式进行描述,统计分析采用方差分析( ANOVA) 比较矿化液组和OPN组之间的差异( P < 0. 05) 认为2组之间存在统计学意义,所有统计数据均采用SPSS 15. 0 ( SPSS Inc,Chicago,IL) 统计分析软件进行分析。

2 结 果

2. 1 DPSCs 在光学显微镜下细胞形态学变化

DPSCs原代培养24 h内细胞贴壁缓慢,可见细胞呈梭形,形态较小,未完全伸展,且有少量悬浮未贴壁细胞。48 h,细胞为梭形,贴壁较多,少量细胞呈克隆团状生长。7 d后可见DPSCs大量扩增,呈伸展长梭形,克隆团状聚集生长,细胞融合率可达80% ( 图1) 。

2. 2 茜素红矿化结节染色

取克隆化培养第3代的DPSCs分组培养28 d,OPN组和矿化液组经茜素红染色后光学显微镜下可见红色团状矿化结节( 图2) 。用Image Pro Plus 6. 0软件完成图像分析,OPN组与矿化液组矿化面积百分比分别为( 13. 42±1. 96) % 和( 12. 81±1. 24) % ,结节数量分别为128±15、132±11,结节平均面积( μm2)分别为( 1 287. 94±96. 25) 、( 1 192. 26±78. 26) ,各组均无明显差别( P >0. 05) 。

2. 3 RT-PCR 检测

OPN和矿化液诱导培养后DPSCs骨源性基因表达均呈阳性。OPN组BSP基因表达水平高于矿化液组( 分别为0. 864±0. 112和0. 514±0. 068,P <节数量分别为128±15、132±11,结节平均面积( μm2)分别为( 1 287. 94±96. 25) 、( 1 192. 26±78. 26) ,各组均无明显差别( P >0. 05) 。0. 05) ,Runx-2基因表达水平低于矿化液组 ( 分别为0. 186±0. 017和0. 324±0. 058,P < 0. 05) ; Col-1及OCN基因表达水平相近 ( 1. 346±0. 175和1. 276±0. 146; 0. 115±0. 015和0. 118±0. 015) ( 表2) 。

注: 1与矿化液组比较,P < 0. 05

3 讨 论

如今,干细胞的应用为人类多种疾病的治疗带来了新的希望,应用组织工程修复口腔牙槽骨组织缺损是近年来研究的热点。牙髓干细胞来源广泛,取材方便,具有自我更新和多向分化的能力,体内体外实验均已证实其具有很强的成骨能力。科学家们也因此认为这类成体干细胞将可替代骨髓来 源的间充质干细胞,成为骨组织工程研究理想的种子细胞[12]。

为提高DPSCs修复骨组织缺损的能力,研究者们长期致力于探索各种有效的诱导方法使DPSCs转化为成骨细胞。现已证实牙髓干细胞在成骨细胞的旁分泌蛋白作用下可实现向成骨细胞分化[14]。骨桥蛋白( OPN) 属成骨细胞旁分泌因子的一种,是小整合素结合配体N端联结糖蛋白家族( SIBLING家族) 成员,含有在骨基质的形成、矿化以及在介导细胞 - 细胞、细胞- 基质的相互作用中发挥关键作用的RGD蛋白,是矿化过程中发挥重要作用的涎蛋白之一,可迁移趋化干细胞到受损组织中,发挥干细胞修复作用[5,6,15]。本实验用OPN诱导培养DPSCs,比较其与目前应用较广的矿化液的诱导效果。

通过倒置相差显微镜观察,OPN诱导后的DPSCs形态近似成骨细胞的多角形或椎 体形态,能多层重叠生长而不出现接触抑制现象,具有与成骨细胞相似的形态和生长特点[16],说明DPSCs开始进入到分化过程中,同时推测这种不完全的成骨细胞形态是由于DPSCs首先分化为骨祖细胞和 前成骨细胞而 形成的。

成骨分化 篇7

本研究利用体外定向诱导人骨髓间质干细胞 (human bone marrow mesenchymal stem cells,h MSCs)分化为成骨细胞的模型和蛋白组学技术,研究h MSCs分化为成骨细胞过程中成骨相关蛋白的表达,对于阐明MSCs分化为成骨细胞的分子机制具有重要意义,也将为临床上治疗骨质疏松、难治性骨损伤等奠定初步的实验基础。

1材料与方法

1.1细胞与试剂

h MSCs来自中山大学中山医学院干细胞与组织工程中心,L-DMEM培养基、H-DMEM培养基均购自美国Gibco BRL公司,Vitamin C、地塞米松购自美国Sigma公司,β- 甘油磷酸钠购自美国Calbiochem公司,溴酚蓝、十二烷基磺酸钠、固相p H梯度胶条(p H 3~10,线性)、蛋白质纯化试剂盒及蛋白质定量试剂盒等均购自瑞典Amersham Biosciences公司。

1.2仪器

倒置显微镜(IX71-22FL/PH,日本OLYMPUS公司),超净工作台(NU-301-630E,美国NUARIE公司),等电聚焦电泳系统 (Ettan IPGphorⅡ,瑞典Amersham Biosciences公司)、垂直电泳系统 (Ettan DALTsix,瑞典Amersham Biosciences公司)、扫描仪 (Typhoon9400,瑞典Amersham Biosciences公司)、 图像分析软件(Image Master TM 2-D Platinum software 5.0,瑞典Amersham Biosciences公司)、全自动斑点处理工作站(Ettan Spot Handing Workstation, 瑞典Amersham Biosciences公司)、基质辅助激光解析离子飞行时间质谱分析仪 (Ettan MALDI-TOF Pro Mass Spectrometry,瑞典Amersham Biosciences公司)等。

1.3方法

1.3.1 h MSCs体外定向诱导分化为成骨细胞及鉴定将传代扩增后至第5代的h MSCs接种于六孔板,实验组每孔加入成骨细胞诱导液(含10-7mol/L地塞米松,10 mmol/L β- 甘油磷酸钠,50μg/ml Vitamin C) 2 ml;对照组每孔加入L-DMEM完全培养液,置培养箱中。碱性磷酸酶染色:取成骨细胞诱导分化第10天的细胞,4%多聚甲醛固定15 min,加入适量碱性磷酸酶染色液在室温下孵育10~20 min,显微镜下观察染色的结果。钙结节染色:取上述诱导分化第18天的细胞,加入适量的茜素红 -S染色10~15 min,显微镜下观察结果。

1.3.2蛋白样品的制备、双向凝胶电泳及图像分析加入裂解液裂解h MSCs及诱导成骨分化7 d的细胞,超声波处理,20000 g,4℃离心30 min,取上清液。按蛋白质纯化试剂盒说明书方法纯化蛋白后,使用蛋白质定量试剂盒,按照说明书方法,对蛋白浓度进行定量。将蛋白样品进行第一向等电聚焦电泳后, 将胶条转移至12.5%浓度的SDS-PAGE胶面上进行第二向电泳,直至胶内电泳指示剂溴酚蓝跑出凝胶下缘10 min后,对凝胶进行荧光染色。用扫描仪对荧光染色的凝胶进行扫描后,利用图像分析软件进行双向凝胶电泳(Two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)图像分析,通过背景消减、斑点检测等,建立h MSCs和诱导成骨分化7 d的凝胶图像,选取ratio≥2.0的差异表达候选蛋白,进行质谱鉴定和生物信息学分析。

1.3.3质谱鉴定和生物信息学分析使用全自动斑点处理工作站对差异蛋白斑点自动进行切割、脱色、 干燥、酶解、加入基质和质谱靶点样等一系列操作。 将点好的质谱靶放入质谱仪,激光源为337 nm波长的氮气激光器,获得样品的肽质量指纹图谱。质谱数据的分析使用Profound软件检索,以MASCOT为搜索引擎在人的NCBInr和Swiss-prot数据库中进行搜索。对所鉴定出的蛋白,依据Gene Ontology的生物过程和分子功能分别对它们分类分析,并绘制成图。

2结果

2.1hMSC成骨诱导分化过程中的形态变化及成骨诱导分化的鉴定

h MSCs加入成骨诱导液后,可见部分细胞由长梭形逐渐变为多角形,体积增大。随着培养时间的延长,这种多角形细胞逐渐增多。随着成骨诱导的进行,细胞持续增殖,开始呈多层重叠生长,细胞之间界限模糊,细胞逐渐聚集形成多个散在的岛状细胞结构,此岛状细胞结构逐渐被分泌的基质所包埋, 13~14 d左右出现钙结节,有明显的钙沉积。对照组加入L-DMEM完全培养液,细胞增殖良好,形态不变,不见致密的岛状细胞结构和钙化结节。见图1。

在诱导培养的第10天,进行碱性磷酸酶染色, 实验组可观察碱性磷酸酶染色反应为强阳性,细胞密集区出现紫黑色颗粒,胞浆内有紫黑色的颗粒沉淀;对照组碱性磷酸酶染色阴性或弱阳性反应,见图2。在成骨细胞诱导培养2周后用茜素红 -S检测钙沉积的情况,实验组镜下可见散在大量橘红色的钙结节,为茜素红与钙盐形成的橘红色的复合物,对照组结果为阴性,见图3。

2.2hMSCs及诱导成骨分化7d的总蛋白的双向凝胶电泳及其质谱鉴定

软件分析结果显示,3张h MSCs和3张诱导成骨分化7 d的双向凝胶电泳图谱蛋白质斑点匹配率均达到75%以上,胶的重复性好,蛋白点的分子量主要集中在20~80 k D之间,等电点主要分布在p H 4.0~8.0之间,蛋白点分离良好。

筛选ratio≥2.0的差异表达候选蛋白,经过胶内酶切和多肽提取后,进行质谱鉴定,70多个蛋白质点成功的获得了肽质量指纹图谱。

2.3生物信息学分析

通过数据库搜索,共鉴定出52种差异蛋白质, 其中13种蛋白质在成骨诱导7 d后表达明显上调, 39种蛋白质在成骨诱导7 d后表达明显下调。附表列出了这些蛋白质的相关信息,其中后35种蛋白在相关文献中已有报道[3],从左到右依次是数据库登入号、蛋白质名称及表达情况:上调 / 下调(U/D)。

按照Gene Ontology的分类方式对所有鉴定的蛋白质分类绘图,生物学过程分类中发现参与体内代谢和发育过程的蛋白质分别占37%和31%,分子

3讨论

蛋白质组学方法己被广泛应用于各种组织细胞的生理病理的分子特征的分析[4,5],本研究通过高分辨率的双向电泳技术、质谱分析以及生物信息学技术,成功的鉴定出52种差异蛋白,一些可能是在成人骨髓间质干细胞诱导成骨分化过程中起关键作用的新蛋白。

本研究鉴定出的多种蛋白中,一些是已知的与骨发育有关的蛋白,如Annexin A2和Annexin V, 研究表明,Annexin A2和Annexin V对于启动成骨的矿化过程有着至关重要的作用[6]。Annexin A2与成骨必需的碱性磷酸酶位于细胞膜上的同一脂筏中,Annexin A2能增强碱性磷酸酶的活性,从而有利于成骨的矿化,如果抑制Annexin A2的表达则减弱了成骨的矿化过程[7]。GENETOS等研究发现, Annexin A2和Annexin V可通过调节成骨前体细胞的增殖、分化以及对细胞因子的反应而影响成骨过程[8]。成骨细胞表达Annexin A2,对于移植造血干功能分类中发现具有催化活性和结合功能的蛋白质分别占37%和27%,见图4。细胞在骨髓微环境的黏附、归巢及迁移起到重要的调节作用[9]。研究发现,ERK信号传导通路在成骨分化过程中有重要作用[10,11],而ERK信号通路可激活Annexin A2的表达[12],可能在成骨过程中,成骨诱导剂通过ERK信号通路而作用与Annexin A2,从而使成骨过程顺利进行。

本研究鉴定的蛋白中,一些是与分化发育有关的蛋白,如胞内氯离子通道蛋白4(chloride intracellular channel protein 4,CLIC4),研究表明,CLIC4参与内皮增殖及内皮与上皮的形态建成[13,14],抑制CLIC4的表达将导致细胞的凋亡[15,16],在肌纤维母细胞的分化中,CLIC4通过p38信号通路调节此分化过程[17],而p38信号转导通路在成骨分化中发挥重要的作用[18,19],h MSCs成骨诱导分化过程中,细胞的数量也在不断增加,CLIC4可能有助于细胞增殖以及通过p38信号转导通路而调节h MSCs成骨分化的过程。另外,新生多肽相关复合体 α 多肽的下调表达在h MSCs成骨分化中可能起重要作用,研究表明,caspases能促进成骨分化[20],caspases的激活需要Fas相关死亡域蛋白(fas-associated with death domain protein,FADD)的参与,而新生多肽相关复合体 α 多肽与FADD的结合抑制了FADD的二聚体形成,从而抑制caspases的表达[21],在本试验中,新生多肽相关复合体 α 多肽的表达下调,可能通过调节FADD的二聚体形成、增强caspases的表达进而促进成骨分化过程。对于所鉴定出的蛋白的具体作用机制还有待于进一步的实验研究。