细胞因子诱导的杀伤（通用12篇）
细胞因子诱导的杀伤 篇1
细胞因子诱导的杀伤细胞 (CIK细胞) 是将人外周血单个核细胞在体外经多种细胞因子共同诱导而获得的一群异质细胞, 又称自然杀伤样T淋巴细胞, 具有自然杀伤 (NK) 细胞的非主要组织相容性复合体 (MHC) 限制性杀瘤特点和T淋巴细胞强大的抗瘤活性, 杀伤活性强, 被认为是肿瘤过继免疫治疗的新希望, 越来越受到人们的重视。
1 CIK细胞的生物学特性
1.1 CIK细胞的来源
通过对CIK细胞的表面标志研究发现, CIK细胞为CD3CD56双阳性细胞群, 主要来源于C D3+C D5 6-的T淋巴细胞, 而非CD3-CD56+的NK细胞;另一重要来源是CD4-CD8+T淋巴细胞群。由于CD4-CD8-T细胞经过1个月的细胞因子诱导培养后, 有56%的T细胞可同时表达C D 3 CD 5 6, 说明C D 4-C D8-T细胞也是C I K细胞的重要来源。
1.2 C I K细胞的增殖
从人外周血分离制备的单个核细胞, 用IFN-γ100U/ml培养24h后加入重组白细胞介素2 (r IL-2) 3 0 0 U/ml、重组白细胞介素1α (r IL-1) 1 0 0 U/ml、抗CD3单克隆抗体50ng/ml, 细胞开始迅速增殖, 以后每3天更换新鲜培养液和r IL-2, 即可制备出C I K细胞, 在培养的第21~28天细胞数可增长1000倍以上, 达到高峰。刺激细胞增殖的主要原因是抗CD3单抗的作用, IFN-γ、r I L-2、r I L-1有增加C I K细胞毒力的作用, I F N-γ比r I L-2早2 4 h加入培养体系及联合应用r I L-1可提高细胞毒性。CIK细胞的高增殖活性解决了体外扩增效应细胞所获细胞数目少的难题[1]。
1.3 与其他过继免疫细胞比较
淋巴因子激活的杀伤细胞 (LAK细胞) 亦由外周血单个核细胞诱导而来, 主要起杀伤作用的是r IL-2活化的CD 3-CD56+NK细胞, 对靶细胞的杀伤无MH C限制性, 但LAK细胞的体外扩增能力较低、体内杀瘤活性不高, 需要大剂量的r IL-2来维持且毒副作用明显, 临床应用受限。肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL细胞) 是从肿瘤组织中分离出来的具有杀伤肿瘤细胞特性的淋巴细胞, 杀伤活性较LAK细胞强, 但对肿瘤的杀伤作用有MHC限制性, 杀瘤谱窄, 在分离过程中容易变异且体外扩增较困难, 难以广泛用于临床。CIK细胞杀伤活性明显较与肿瘤细胞直接接触才能增殖, 易于大量获得, 杀瘤谱广, 杀瘤活性不受CSA、FK50 6等免疫抑制药的影响, 对多重耐药肿瘤细胞同样敏感, 且对正常骨髓造血前体细胞毒性很小, 可以保存75%以上的粒系-巨系造血祖细胞集落 (CFU-GM) , 充分弥补了因放化疗引起肿瘤患者骨髓抑制的不足。因此, C IK细胞比LAK细胞、T IL细胞更适于肿瘤的生物治疗。
2 CIK细胞抗肿瘤作用机制
2.1 对肿瘤细胞直接杀伤作用
目前认为, C I K细胞可被淋巴细胞功能相关抗原有关识别结构激活, 导致胞浆毒性颗粒释放而杀伤肿瘤细胞, 也可因表面CD3受体被激活, 导致胞浆毒性颗粒释放而产生溶瘤作用。
2.2 间接杀瘤作用
K o r n a c k e r M等[2]在用C I K细胞治疗慢性淋巴细胞白血病 (CLL) 的研究中发现, CIK细胞分泌的IFN-γ能促使C LL细胞上的ICAM-1的表达, 还能分泌I L-2、I L-6、人粒细胞巨噬细胞集落刺激生长因子 (GM-C SF) 、TN F-α等细胞因子, 可增强细胞毒作用。Linn YC等[3]研究证实, 培养的CIK细胞可以分泌多种细胞因子, 如IL-1 0、IL-4、IFN-γ等, 不仅对肿瘤细胞有直接抑制作用, 还可通过调节抗体免疫系统反应间接杀伤肿瘤细胞。
2.3 诱导肿瘤细胞凋亡
C IK细胞能活化肿瘤细胞凋亡基因, 使得FLIP、B cl-2、B cl-XL、DAD1、Sur vivin基因表达上调[4]。CIK细胞在培养过程中表达Fas L, 能抵抗Fas L+肿瘤细胞引发的效应细胞Fas-Fas L凋亡, 又可诱导Fas+肿瘤细胞凋亡, 发挥持久抗肿瘤作用[5]。Sun S等[6]在CIK细胞对MGC-803胃癌杀伤作用的研究中指出, C I K细胞早期诱导肿瘤细胞凋亡, 晚期则通过对P 5 3、C-m y c和B c l-2的下调及B a x的上调来诱导肿瘤细胞坏死。岑溪南等[7]通过实验证实, CIK细胞也可诱导Bcla b l阳性的K 5 6 2细胞凋亡。
2.4 促进T细胞增殖活化
任欢等[8]研究认为, C IK细胞体内抗肿瘤作用可能与促进宿主体内T细胞增殖活化有关, CIK细胞输入体内后在宿主机体状态或肿瘤抗原刺激下转变成具有杀瘤活性的细胞毒性T细胞而发挥抗
3 CIK细胞临床应用
3.1 血液系统恶性肿瘤
In tron a M等[9]研究发现, CIK细胞对白血病及T细胞、B细胞淋巴瘤有广泛的杀瘤作用。Alvar n as J C等[10]发现在GM-C SF动员下, 将自体移植患者外周血的造血祖细胞用CIK细胞培养方法进行扩增后, T细胞总数明显上升, CD3+CD56+细胞扩增, 具有明显杀伤B2细胞淋巴瘤和髓系白血病细胞的作用。国内研究观察C IK细胞与r IL-2联合治疗儿童急性淋巴细胞白血病微小残留病的疗效, 显示CIK细胞治疗具有明显清除微小残留白血病细胞、防止复发的作用且输注安全, 但临床疗效与患者体内的白血病负荷大小有关。
3.2 实体肿瘤
J i a n g J等[11]应用C I K细胞治疗晚期胃癌患者, 发现患者血清中的肿瘤标志物下降, 免疫功能、生活质量提高, 接受化疗及CIK细胞治疗者2年生存率比单独接受化疗者有较大的提高;Zhou QM等[12]在85名接受过微创治疗的肝细胞癌患者中观察CIK细胞的疗效, 发现经微创技术治疗后再用CIK细胞治疗能提高肝癌患者的免疫力, 减少复发。陈复兴等[13]报道了应用CIK细胞治疗63例肿瘤患者的近期疗效, 结果部分缓解加微效共28例, 有效率达44.4 6%, C D3、C D4、C D8 T细胞绝对值增加45%, 食欲体力改善者95%, 疼痛减轻者72%, 睡眠改善者51%, 体重回升者32%。鲍锋等[14]通过系统观察和分析CIK细胞过继免疫疗法对多种中晚期恶性肿瘤的临床疗效, 发现在256例接受CIK细胞治疗患者中总缓解率80.86%, 随诊1年生存率为96.09%, 2年为9 2.9 6%, 3年为8 8.2 8%, 说明C I K细胞对多种中晚期恶性肿瘤细胞具有广谱、高效杀瘤作用, 能明显提高患者免疫功能, 减轻症状, 提高生活质量, 延长生存期。
3.3 耐药肿瘤
多药耐药是造成化疗失败的一个重要原因。CIK细胞对表达P糖蛋白 (Pgp) 的肿瘤细胞具备有效的杀伤作用, 甚至在阿霉素耐药的K562细胞系比其亲代细胞对CIK细胞更敏感[15]。Schmidt-Wolf IG等[16]研究证实, 对柔红霉素耐药的K562细胞对CIK细胞较敏感, 证明CIK细胞对恶性克隆形成的抑制作用与多药耐药基因的表达无关。CIK细胞的这一特性使其在耐药肿瘤的治疗上具有明显的优势。
4 CIK细胞治疗的不良反应
多组临床应用CIK细胞的报道显示, 患者可有不同程度的发热, 体温在38℃左右, 多数可自行缓解, 必要时给予解热镇痛药退热[17]。目前认为, 生物治疗过程中患者出现的中度发热是机体免疫功能正常反应的结果, 对治疗有益。其他少见副作用有疲乏、胸闷、恶心, 尚未出现过敏、肝衰竭、肾衰竭等不良反应。
5 展望
国内外多年来临床研究表明, CIK细胞可以有效地杀伤直肠癌、乳腺癌、肺癌、肾癌、淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、恶性黑色素瘤、卵巢癌等多种肿瘤细胞, 提高肿瘤患者自身的细胞免疫功能, 对于清除手术、化疗、放疗后体内残留的肿瘤细胞及微小转移灶有明显疗效, 是目前国内外已确认并进入临床阶段的有效肿瘤生物治疗方法之一。进一步研究CIK细胞抗肿瘤作用的机制、获得足够数量的CIK细胞以满足临床需要, 以及寻找与手术、放疗、化疗联合应用的最佳组合等是我们今后需要解决的问题。
(参考文献略, 如有需要请与编辑部联系)
(收稿:2010-04-30) (发稿编辑:杨海陆)
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细胞因子诱导的杀伤 篇2
诱导多能干细胞最新进展
摘要：通过导入特定基因诱导完全分化的体细胞重编程为诱导多能干细胞(iPS),这为干细胞的研究及应用带来了革命性的`变化.短短3年时间,细胞重编程的机理研究、探索疾病的发生机制以及临床医学的应用等领域取得了很多突破性的进展,主要从iPS诱导机理、效率以及诱导新技术上作一综述,以期对iPS的研究提供参考.作 者：胡敏华 郭欣政 张守全 作者单位：华南农业大学,广州,510642期 刊：生物技术通报 PKU Journal：BIOTECHNOLOGY BULLETIN年，卷(期)：,“”(10)分类号：关键词：体细胞 重编程 多能干细胞 机理
烟叶唇柱苣苔不定芽的诱导因子 篇3
关键词：烟叶唇柱苣苔；叶片；不定芽；组织培养
中图分类号：Q943.1文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）11-0075-03
苦苣苔科植物具有极重要的生物学价值和分类意义[1]，其种类繁多，全世界约有150属3000余种，我国有58属约463种[2]，其中海南省约有13属21种1变种，而特有种10种[3]。苦苣苔科植物中许多种类是重要的观赏植物、药用植物和特种蔬菜资源。烟叶唇柱苣苔（Chiritaheterotricha）是苦苣苔科唇柱苣苔属多年生草本植物，生于海拔约430m的山谷林中或溪边石上，是海南特有的野生花卉，其花冠淡紫色或白色，极为优雅，而且花期长，四季长绿，适合观赏和园艺。此外，唇柱苣苔属植物具有广泛的适应性[4]，因而烟叶唇柱苣苔具有极大的开发潜力。目前，烟叶唇柱苣苔仍处于野生状态，未进行商品化开发。由于人类活动的干扰、生态环境恶化以及自身的原因，烟叶唇柱苣苔资源逐渐减少，因此极有必要进行组织培养研究，以满足烟叶唇柱苣苔的保护和开发利用的需要。本试验以烟叶唇柱苣苔无菌叶片作为材料，较系统地研究叶片分化不定芽过程中的若干影响因素，以期筛选出最佳的不定芽诱导培养条件，快速建立烟叶唇柱苣苔组培技术体系。
1材料与方法
1.1试验材料
植株采自海南省保亭县。取幼叶进行表面消毒后培养获得的无菌叶片作为试验材料。
1.2试验方法
在基本培养基中添加不同种类和浓度的植物生长调节剂，除试验项目以外，所有处理中的基本培养基中含食用蔗糖30g/L、卡拉胶9g/L，灭菌前pH值为6.0，光照强度1500lx，光照时间9h/d，培养温度（26±2）℃。取无菌植株小叶片（约0.5cm×0.5cm），以叶面朝上接种于各种培养基上（图1），每个处理接种8袋，每袋3张叶，3次重复，定期观察并记录，培养40d后统计叶片不定芽诱导率和平均不定芽数。不定芽诱导率=诱导出芽叶片数/接种叶片数×100%，平均不定芽数=不定芽总数/诱导出芽叶片数。
1.2.1不同接种方式对不定芽诱导的影响以MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L为基本培养基，接种叶片分别以叶背和叶面平放于培养基上，共2种处理。
1.2.2pH值对不定芽诱导的影响以MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L为基本培养基，灭菌前pH值分别调至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，共5个处理。
1.2.3无机盐浓度对不定芽诱导的影响以1/4MS、2/4MS、3/4MS、MS作为基本培养基，各添加6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L，共4个处理。
1.2.4不同种类细胞分裂素对不定芽诱导的影响以MS+NAA0.1mg/L为基本培养基，分别添加6-BA0.1mg/L、KT0.1mg/L和TDZ0.1mg/L，共3个处理。
1.2.5蔗糖浓度对不定芽诱导的影响以MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L为基本培养基，设置蔗糖浓度10、20、30、40、50g/L共5個处理。
1.2.6不同植物生长调节剂组合对不定芽诱导的影响以MS为基本培养基，设计6-BA0.1、0.5、1.0mg/L与NAA0.1、0.5mg/L不同配比，共6个处理。
1.3数据分析
采用方差分析法，F测验显著后用新复极差法进行多重比较。
2结果与分析
2.1不同接种方式对不定芽诱导的影响
烟叶唇柱苣苔叶片几乎无明显的愈伤组织分化，可以直接分化出不定芽。接种15d后，叶面开始膨大隆起，25d开始有小芽点萌动，40d在叶片边缘、主叶脉基部和叶面处均分化出不定芽。从表1可见，以叶背和叶面2种方式接种培养的结果差异极大，以叶背接触培养基的叶片不定芽诱导率高达100%，平均不定芽数为7.22个/张；而叶面接触培养基的不定芽诱导率只有73.91%，平均不定芽数为4.76个/张。方差分析结果表明，2种接种方式不定芽诱导率和平均不定芽数的差异均达到极显著水平，因此烟叶唇柱苣苔叶片不定芽的诱导以叶背平置于培养基上为宜。
2.2pH值对不定芽诱导的影响
由表2可知，pH值为6.0的培养基上不定芽的诱导率和平均不定芽数最高，分别为100%和7.34个/张；其次为pH值为6.5的培养基，其不定芽诱导率和平均不定芽数分别为96.30%和6.07个/张；最低的为pH值为5.0的培养基，其不定芽诱导率和平均不定芽数分别为79.17%和4.01个/张。经方差分析可知，pH值为6.0的培养基与其他培养基处理的不定芽诱导率和平均不定芽数的差异极显著，因此烟叶唇柱苣苔不定芽诱导培养基的pH值在灭菌前宜调至6.0。
2.3无机盐浓度对不定芽诱导的影响
从表3可见，除1/4MS外，其余3种无机盐浓度对叶片不定芽的诱导率均能达到100%，而平均不定芽数则随着无机盐浓度的增加而增加，呈正相关关系。MS对叶片不定芽的诱导效果最好，平均不定芽数最多，达7.23个/张，与其他处理差异极显著，且芽苗生长健壮，叶色浓绿；3/4MS的诱导效果次之，分化芽数为6.18个/张，芽生长势也好，叶绿色；1/2MS和1/4MS诱导的平均不定芽数差异不显著，但1/4MS诱导的不定芽生长势差，部分叶片出现黄化现象。说明全量MS培养基适合烟叶唇柱苣苔不定芽诱导培养。
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2.4不同种类细胞分裂素对不定芽诱导的影响
由表4知，6-BA和TDZ对叶片不定芽的诱导率均达到100%，但二者诱导的平均不定芽数差异极显著，6-BA平均不定芽数达7.17个/张，而TDZ仅为4.25个/张；诱导效果最差的为KT，不定芽诱导率仅为47.62%，平均不定芽数为3.10个/张。从生长势看，6-BA诱导的不定芽长势好，KT诱导的不定芽也正常，但较细小，而TDZ诱导的芽在40d以后出现较多的玻璃化现象。因此，烟叶唇柱苣苔不定芽的诱导培养，细胞分裂素宜选用6-BA。
2.5蔗糖浓度对不定芽诱导的影响
由表5可以看出，30g/L蔗糖对烟叶唇柱苣苔不定芽的诱导效果最好，不定芽诱导率达到100%，平均不定芽数为7.50个/张；其次是20g/L蔗糖，不定芽诱导率和平均不定芽数分别为100%和6.67个/张；最差的为50g/L蔗糖，不定芽诱导率和平均不定芽数分别为92.31%和3.14个/张。可见5种蔗糖浓度培养基的不定芽生长均正常。经方差分析结果可知，20、30g/L蔗糖诱导的不定芽诱导率和平均不定芽数差异均不显著，而二者与10、40、50g/L蔗糖处理差异极显著，说明蔗糖浓度对烟叶唇柱苣苔不定芽的诱导影响较大，过高或过低的蔗糖均不利于不定芽的生长，因此烟叶唇柱苣苔不定芽的诱导培养可以选用20～30g/L蔗糖。
2.6不同植物生长调节剂组合对不定芽诱导的影响
叶片接种于6个含植物生长调节剂的培养基中，25d后均有不定芽分化，40d平均不定芽数均超过4个/张。从表6可见，不同的6-BA和NAA配比对烟叶唇柱苣苔不定芽诱导和生长影响很大，其中以6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L组合对不定芽的诱导效果最好，不定芽诱导率高达100%，不定芽分化数量最多，平均有9.58个/张，其芽苗生长势好，叶色绿而健壮（图2）。其次为6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L组合，其不定芽诱导率也高达100%，但不定芽分化数量较少，为7.21个/张。方差分析结果表明，6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L组合与6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L组合不定芽诱导率差异不显著，与其他配比组合差异极显著；而平均不定芽数与其他配比差异极显著，因此适合烟叶唇柱苣苔不定芽诱导的植物生长调节剂组合为6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L。
3结论与讨论
本试验结果表明，影响烟叶唇柱苣苔不定芽诱导的因素较多，接种叶片放置方式、培养基pH值、无机盐浓度、蔗糖浓度、植物生长调节剂种类及配比对不定芽诱导均有影响，本试验中所有处理均可诱导不定芽分化，但各处理间差异较大。
烟叶唇柱苣苔以叶背朝下的方式接入培养基为佳，表现为诱导率高，分化芽数多，与叶面朝下方式间差异极显著。桂林唇柱苣苔、三苞唇柱苣苔等苦苣苔科植物组织培养的叶片外植体均为叶背朝下接入培养基中[5-6]，不同植物外植体的生长与分化所需最适合的pH值不同，烟叶唇柱苣苔的叶片分化以pH值为6.0最适宜，与其他处理间的不定芽诱导率和不定芽分化数差异极显著。本试验中无机盐浓度对不定芽的诱导数量和生长势影响极大，在全量的MS培养基上平均不定芽数最多，生长势好；而在1/4MS培养基的诱导效果最差，不定芽诱导数量少，叶片黄化。培养基中的无机营养成分是组成植物生命体的主要元素，会影响植物的生长与分化，而镁是叶绿素分子结构中的一部分，缺镁时叶绿素不能形成，致使叶片失绿[7]，这可能是培养物出现黄化现象的原因。植物生长调节剂的种类及配比对不定芽的诱导影响极大，6-BA的效果极显著优于KT和TDZ。TDZ兼有细胞分裂素和生长素的功效，在组培中应用广泛[8]，但在苦苣苔科植物中尚未有应用的报道。本试验中TDZ的效果并不理想，诱导率低分化芽数少，后期还会出现玻璃化现象，这也许是由于浓度偏高的原因。6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L组合对不定芽的诱导效果最好，诱导率达到100%，平均诱导不定芽数高达9.58个/张，较其他配比差异极显著。该结果与汤正辉的研究结果[9]有差异，汤正辉认为6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L组合的效果最佳[9]。蔗糖在组织培养中主要作为碳源和能源物质，同时可以调节培养基的渗透压[7]，其浓度与细胞增殖和分化有关[10-11]。本试验中蔗糖对烟叶唇柱苣苔不定芽诱导生长的作用十分明显，过高或过低的蔗糖浓度均不利于芽的诱导，以30g/L浓度最佳。
综合试验结果可知，在温度（26±2）℃、光照度1500lx的培养条件下，烟叶唇柱苣苔不定芽诱导的最佳培养基为MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L，灭菌前pH值为6.0，接种叶片以叶背平置于培养基上，不定芽诱导效果最好，其诱导率高，不定芽分化多，芽苗生长势好。
苦苣苔科植物由于叶片表面密布绒毛，消毒极为困难，初代培养污染率极高。目前，有关烟叶唇柱苣苔的组织培养研究极少，本试验通过系统研究建立起叶片诱导体系，减少了初代培养接种污染概率，且增殖效率高，可以快速建立高效再生体系，为烟叶唇柱苣苔的商品化开发奠定基础，也可以为其他苦苣苔植物的开发利用及技术研究提供技术参考。
参考文献：
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细胞因子诱导的杀伤 篇4
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取来该院治疗的鼻咽癌患者120例为研究对象, 所有患者均经过MR或CT检查, 都为非转移鼻咽癌, 其中Ⅰ期8例 (6.7%) , Ⅱ期31例 (25.8%) , Ⅲ期56例 (46.7%) , Ⅳ期25例 (20.8%) 。现将所有患者随机分成两组, 其中治疗组60例, 男34例, 女26例;年龄21~78周岁, 平均 (46.1±1.2) 周岁;病程2~8年, 平均 (5.6±2.1) 年。对照组患者60例, 男27例, 女33例;年龄22~78周岁, 平均 (46.2±1.3) 周岁;病程2~8年, 平均 (5.5±2.2) 年。
1.2 治疗方法
两组患者均用直线加速器9MV的光子线和8Me V的β射线, 深部X射线治疗机进行放射治疗, 治疗组再用高效细胞因子诱导的杀伤细胞进行治疗[2]。治疗1个月后根据病理组织学和鼻咽纤维镜检查患者的治疗效果。所有患者进行为期1年的随访, 统计复发率。
1.3 统计方法
用SPSS 18.0软件来进行数据的统计及处理, 以χ2检验应用于计数资料。
2 结果
经过28 d的治疗后, 结果为, 治疗组的治愈情况:Ⅰ期5例 (100%) , Ⅱ期12例 (85.7%) , Ⅲ期26例 (89.6%) , Ⅳ期10例 (83.3%) ;对照组治愈情况, Ⅰ期1例 (33.3%) , Ⅱ期10例 (58.8%) , Ⅲ期17例 (63.0%) , Ⅳ期6例 (46.1%) 。两组结果差异有统计学意义 (P<0.05) 。见表1。
注:χ2=8.21, P<0.05。
经过一年的随访, 复发的结果为, 治疗组, Ⅰ期0例 (0%) , Ⅱ期1例 (7.1%) , Ⅲ期3例 (10.3%) , Ⅳ期1例 (8.3%) ;对照组, Ⅰ期1例 (33.3%) , Ⅱ期4例 (25.5%) , Ⅲ期6例 (22.2%) , Ⅳ期3例 (23.1%) 。两组结果差异有统计学意义 (P<0.05) 。见表2。
注:χ2=11.45, P<0.05。
3 讨论
细胞因子诱导的杀伤细胞 (CIK) 最初由斯坦福大学的Schmidt-Wolf等报道[3]。CIK的制备方法主要是在体外将人体的外周血单个核细胞与多种细胞因子 (白细胞介素2, 白细胞介素1α等) 共同培养后得到一种异质细胞[4], 这种异质细胞可以表达CD56和CD3, 它既有自然杀伤细胞的非组织相容复合物限制性, 也具有T淋巴细胞的抗肿瘤活性。CIK治疗已被认为是一种抗肿瘤的方法[5]。
CIK细胞开始指的是在人体中存在的含CD3和CD56的T淋巴细胞, 这些细胞在细胞因子的作用下会大量的增殖, 而且还有非MHC限制的溶瘤活性。溶瘤作用有两种方法: (1) CIK细胞直接对肿瘤细胞进行杀伤, 人体内的淋巴因子会使CIK细胞的胞浆颗粒释放到细胞外[6], 从而能破坏和杀死肿瘤细胞。 (2) CIK细胞进入人体后会分泌许多细胞因子, 比如肿瘤坏死因子 (TNF-α) , 白介素和干扰素等, 这些细胞因子可以和免疫系统一起破坏和杀死肿瘤细胞。 (3) CIK进入人体后会产生Fasl, 这种Fasl可以导致肿瘤细胞凋亡, 从而杀死肿瘤细胞。
放射治疗会抑制患者全身或局部的骨髓, 患者会因为骨髓受到抑制而无法继续治疗, 使病情难以得到有效的控制, 此时再应用CIK细胞进行辅助治疗有助于患者病情的好转。
在该研究中发现, 用传统的放射治疗的方法治疗鼻咽癌效果不理想, 治愈率为56.7%, 复发率为23.3%, 与相关文献的报道相近[6]。但是用高效细胞因子诱导的杀伤细胞治疗再联合放射治疗治疗鼻咽癌, 效果显著, 治愈率为88.3%, 复发率仅为8.3%。所以可以认为用这种联合的方法治疗鼻咽癌比传统的放射治疗效果更加显著, 治愈率更高, 复发率更低, 从而为临床治疗提供一定的依据。
摘要：目的 探讨高效细胞因子诱导的杀伤细胞联合放射治疗鼻咽癌的效果。方法 回顾性分析了2009年3月—2011年5月来该院治疗的鼻咽癌患者120例, 将他们随机分成治疗组和观察组, 两组患者均用直线加速器9MV的光子线和8MeV的β射线, 深部X射线治疗机进行放射治疗, 治疗组再用高效细胞因子诱导的杀伤细胞进行治疗, 治疗一个月后根据病理组织学和鼻咽纤维镜检查患者的治疗效果。所有患者进行为期1年的随访。结果 治疗组的治愈情况:Ⅰ期5例 (100%) , Ⅱ期12例 (85.7%) , Ⅲ期26例 (89.6%) , Ⅳ期10例 (83.3%) ;对照组治愈情况, Ⅰ期1例 (33.3%) , Ⅱ期10例 (58.8%) , Ⅲ期17例 (63.0%) , Ⅳ期6例 (46.1%) 。治疗组复发情况, Ⅰ期0例 (0%) , Ⅱ期1例 (7.1%) , Ⅲ期3例 (10.3%) , Ⅳ期1例 (8.3%) ;对照组复发情况, Ⅰ期1例 (33.3%) , Ⅱ期4例 (25.5%) , Ⅲ期6例 (22.2%) , Ⅳ期3例 (23.1%) 。两组结果差异有统计学意义 (P<0.05) 。结论 用高效细胞因子诱导的杀伤细胞联合放射治疗鼻咽癌能提高治愈率和降低复发率。
关键词：高效细胞因子诱导,杀伤细胞,合放射治疗,鼻咽癌
参考文献
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细胞因子诱导的杀伤 篇5
小胶质细胞释放的炎症介质对神经退行性疾病的发展有很重要的作用,白藜芦醇可抑制外周吞噬细胞生成和释放炎症介质.采用RT-PCR的方法在N9细胞株和原代小胶质细胞中检测了白藜芦醇对内毒素(LPS)诱导小胶质细胞肿瘤坏死因子α(TNF-α)和诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)基因表达的影响.结果表明白藜芦醇在5～50 μmol/L的浓度范围能显著的`抑制TNF-α和iNOS的表达,白藜芦醇的上述抑制作用呈浓度依赖性.同时,白藜芦醇在N9细胞株中的抑制作用要稍强于原代小胶质细胞.
作 者：鲁晓锋 陈宏 乐颖影 LU Xiao-feng CHEN Hong LE Ying-ying 作者单位：鲁晓锋,LU Xiao-feng(西北农林科技大学动物科技学院,陕西省农业分子生物学重点实验室,陕西杨凌,712100;中国科学院上海生命科学研究院营养科学研究所,上海,31)
陈宏,CHEN Hong(西北农林科技大学动物科技学院,陕西省农业分子生物学重点实验室,陕西杨凌,712100;徐州师范大学细胞与分子生物学研究所,江苏徐州,221116)
乐颖影,LE Ying-ying(中国科学院上海生命科学研究院营养科学研究所,上海,200031)
细胞因子诱导的杀伤 篇6
关键词 油棕 ；体胚发生 ；胚状体 ；次生胚
中图分类号 S565.9 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.08.006
Abstract Induction of oil palm somatic embryogenesis is the most critical cultural process in oil palm tissue culture. Rapid proliferation of oil palm can be effectively realized through the establishment of oil palm secondary embryogenesis regeneration in tissue culture. Several factors that affecting induction of oil palm somatic embryos and regeneration of secondary embryogenesis were compared systematically to establish a secondary oil palm somatic embryo regeneration system. The results showed that there is great difference in induction rate of somatic embryogenesis between different oil palm genotypes， and the woody plant medium （WPM） is the best basic medium in proliferation of oil palm secondary embryos.
Keywords oil palm ； somatic embryogenesis ； embryo ； secondary embryogenesis
油棕是世界上重要的热带木本油料作物，通过组培可对获得的优良单株进行快速繁殖，从而大幅度缩短育种、育苗时间。次生胚发生途径是指由原始体胚细胞（originally formed somatic embryos）或者初生胚状体（primary somatic embryos）发育获得体细胞胚的植物再生途径，许多植物在通过体胚发生途径获得离体再生植株过程中，初生体细胞胚的萌发率非常低，远远低于次生胚状体的萌发率。因此通过建立高频的次生胚状体途径获得离体再生植株的研究在单子叶和双子叶植物组织培养技术研究中都有广泛的报道。李洪清等[1]以木薯成熟的胚状体子叶为外植体材料建立次生胚再生体系，每个外植体材料可获得32.5个次生胚状体。孙艳香等[2]以苜蓿无菌苗下胚轴为外植体材料建立次生胚再生体系，筛选获得2个具有较强次生胚发生能力的株系。Giridhar等[3]以咖啡的叶片和茎为外植体材料建立植株再生体系，通过MS培养基添加三十烷醇成功获得高频的咖啡的次生胚。油棕组织培养技术最早由法国科学家Rabechault等[4]于1976年研究获得成功，随后在东南亚地区、南美洲地区的多家研究机构和公司有成功的报道[5]。目前马来西亚、印度尼西亚、哥斯达黎加等国已经开始油棕组培苗的商业化生产[6]。在20世纪80年代中国已有开展油棕组织培养相关的研究。崔元芳等[7]以油棕胚为外植体材料获得愈伤组织并建立植株再生体系。龚峥等[8]以油棕叶片为外植体材料成功获得愈伤组织。邹积鑫等[9]以油棕叶片为外植体材料建立植株再生体系并获得完整植株。虽然目前国内相关的研究已经取得了较大进展，但尚未得到广泛的应用和系统的研究，特别是不同油棕单株的体胚发生效率不一致，影响植株再生频率较低。鉴于此，本研究以前期建立的油棕离体再生体系为基础，对油棕3个品系优株的胚状体诱导及次生胚的增殖开展研究，旨在筛选获得最佳的油棕体胚及次生胚的增殖方法。
1 材料与方法
1.1 材料
以油棕易碎胚性愈伤组织为材料。油棕母树来自农业部儋州油棕种质资源圃，品种为RYL2、RYL4、RYL6，材料来源是由油棕幼嫩的叶片培养获得，详细方法参照邹积鑫等[11]采用的愈伤组织诱导方法。愈伤组织诱导是将叶片接种到MS培养基（添加5 mg/L 2，4-D、10 mg/L TDZ和质量分数为3%的蔗糖）获得，再将愈伤组织接种到MS培养基（添加0.1～1.0 mg/L 2，4-D）中获得易碎胚性愈伤组织。所有的培养基均添加6 g/L的琼脂，并将pH调至5.8，121℃高压灭菌15 min。 易碎胚性愈伤组织在光照培养条件下培养，温度为（28±2）℃，每1个月继代1次。
1.2 方法
1.2.1 油棕初生胚状体的诱导
选择3种不同品系的油棕愈伤组织接种到油棕初生胚状体培养基中进行诱导培养，基本培养基为木本植物培养基（WPM），并附加4种不同种类的植物激素：二氯苯氧乙酸、毒莠定、麦草畏、萘乙酸，其浓度为1 mg/L，每个处理50个，重复3次。将接种好的培养物置于光培养室中培养，培养温度为（28±1）℃，光照强度为3 000 lx，光照时间为12 h/d，每2个月继代培养1次，统计培养1～4个月的出胚情况，每月统计1次。
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1.2.2 油棕次生胚状体的诱导及增殖
将培养2～4个月后的油棕初生胚状体切分成8～12 mm小块，接种到培养基中进行次生胚状体的诱导和增殖。基本培养基为MS、WPM、Y3培养基（附加2，4-D 0.1 mg/L和200 mg/L椰子水），每处理重复3次，培养温度为（28±1）℃，光照强度为3 000 lx，光照时间为12 h/d，每2个月继代培养1次，每月统计次生胚状体的生长情况。
2 结果与分析
2.1 不同培养因素对油棕胚状体诱导的影响
愈伤组织接种至初生胚状体诱导培养基后，培养1个月开始观察到愈伤组织逐渐膨大（图1-A），分化成心形胚组织，接着心形胚组织继续分化，顶部不断变尖成鱼雷型胚组织，最终形成芽的前体组织（图1-B）。品种、植物激素种类以及培养时间的多元方差分析和多重比较结果见表1、2。3个因素对油棕胚状体诱导的影响效果为：植物激素种类>品种>培养时间，其中4种植物激素的种类对油棕胚诱导率的影响达显著差异，不同油棕品种胚状体培养4个月后平均诱导率为2.5%～11.83%。RYL02材料中，植物激素对胚状体诱导率效果为：二氯苯氧乙酸>毒莠定>麦草畏>萘乙酸。RYL04材料中，植物激素对胚状体诱导率效果为：毒莠定>二氯苯氧乙酸>麦草畏>萘乙酸。RYL06材料中，获得的平均出胚率最高达11.83%，植物激素对胚状体诱导率效果为：二氯苯氧乙酸>毒莠定>麦草畏>萘乙酸。3个不同品种对油棕胚诱导率的影响达显著差异，其中RYL2品种与RYL4品种间无显著差异。油棕胚的出胚率随时间的增加而增加，但不同时间培养对油棕胚诱导率无显著差异。
2.2 不同培养因素对油棕次生胚诱导的影响
初生胚接种到次生胚培养基后，在胚状体表面开始形成小的突起，突起不断的生长变大，形成白色次生胚状体，次生胚状体继续分化形成鱼雷型胚，然后逐渐形成芽的前体（图1-C、1-D）。培养2个月后不同处理产生的次生胚个数为14.0～31.6个，RYL02在M3培养基中获得的次生胚数最高为31.6个，RYL04在M3培养基中获得的次生胚数最高为29.6个，RYL06在M2培养基中获得的次生胚数最高为31.6个。对品种、培养基类型、培养时间的多元方差分析和多重比较分析结果见表3、4。在诱导次生胚的培养过程中，培养基的种类对次生胚诱导的影响达显著差异，而品种类型对次生胚诱导的影响差异不显著，次生胚的数量随着时间的增加而不断增加，3种处理对次生胚诱导数量的影响大小为：培养基>培养时间>品种。
3 讨论与结论
通过体胚发生途径建立油棕组织培养技术体系，其初生胚的诱导比较困难，且诱导率也比较低，因此胚的诱导是整个油棕组织培养过程中最关键的技术环节，这一现象在其他的棕榈科植物，如椰子、海枣、槟榔等同样发生[10-12]。植物外源激素对油棕胚的诱导影响作用很大，二氯苯氧乙酸即2，4-D在油棕胚的诱导中，作用效果明显。近年来，关于油棕组织培养技术的报道中，2，4-D、毒莠定、麦草畏等植物外源激素都有使用，但2，4-D的使用更加广谱。本实验结果表明，2，4-D在初生胚诱导的过程中通用性较好，在3种不同基因型的油棕品系中，胚诱导率圴达到了比较高的水平。但在后续芽诱导的培养实验中，笔者发现，使用毒莠定的出芽率及芽发育的质量效果会更好。
次生胚诱导和增殖途径是油棕实现体胚增殖很有效的一种途径，可以弥补前期油棕初生胚诱导率较低的缺点，实现油棕组培苗数量上的大规模繁育。从本实验的结果看，在油棕次生胚培养阶段，不同基因型即不同油棕品种差异的影响不显著，如果在前期能够培养获得油棕初生胚，后期的次生胚培养可通过比较一致的方法进行增殖培养。同时，基本培养基的组成成分对油棕次生胚的诱导和再生具有显著的影响。本实验所选择的3种基本培养基中，MS是通用性较强的培养基[13]；WPM是针对木本植物培养的基本培养基[14]；Y3培养基的成分比较复杂，常用于椰子等棕榈植物的组织培养[15]。从诱导效果来看，WPM培养基和Y3培养基的作用明显优于MS培养基，这表明在无机盐相对较低的环境下可能比较利于次生胚的诱导；而WPM和Y3培养基比较，前者的组分相对后者简单，更利于大规模的商业化生产。
参考文献
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细胞因子诱导的杀伤 篇7
1资料与方法
1.1研究对象
选取普外科2010年5月 -2012年12月收治的胰腺肿瘤患者共30例。其中男18例,女12例,年龄40~70岁。全部患者都是胰腺肿瘤确诊病例,全部病例按国际抗肿瘤联盟(UICC)标准给予分期(TNM分期),Ⅰ~Ⅱ期9例,Ⅲ期12名,Ⅳ期9例。全部患者卡氏评分≥60分,心、肾、肝脏功能均正常。所有均是根 治手术后 患者 , 术后给予 采自自身 的DC-CIK细胞输注,全部患者在输注DC-CIK细胞前, 医生都与家属及患者本人进行沟通,本人及家属均表示同意,并签字。
1.2主要试剂
rh INF-γ 购自上海克隆生物技术公司,抗人CD3单克隆抗体购自e Bioscience公司,人rh IL-4、rh IL-2、 rh IL-1a、rh GM-CSF购自Pepro Tech公司,Ficoll液、 人无血清培养基AIM-V购自美国GIB-CO公司, FITC标记鼠抗人CD3、CD127单克隆抗体、PE标记鼠抗人CD8、CD4、CD56单克隆抗体、PE-Cy5标记鼠抗人CD25单克隆抗体和同型对照Ig Gα1购自美国BD公司,人IFN-γ、IL-4酶联免疫吸附试验 (ELISA)试剂盒购自晶美生物工程有限公司,rh GMCSF(注射用重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子)购自厦门特宝生物工程股份有限公司。
1.3实验方法
1.3.1树突状细胞的制备所有操作严格遵守标准程序。采集患者外周血2×109~3×109个单个核细胞及血浆80 ml(Kabi Fresenius,German)。经Ficoll Hypaque(Gibco,USA)分离单个核细胞后,离心洗涤重悬,调整细胞浓度为2×106~4×106个 /ml铺入6孔板,培养箱中孵育2 h后,收集悬浮细胞至另一个50 ml离心管继续培养;第3天补加树突状细胞 (dendritic cells,DC)培养液;第5天加入肿瘤特异性抗原(终浓度为20~80μg/ml),诱导后12~16 h加入肿瘤坏死因子(TNF-α,500 U/ml);第8天收集细胞,离心,洗涤,用含有10%患者自身血浆的生理盐水重悬,总体积为100 ml,静脉回输患者,共4次,回输时间选择在2次DC回输之间。
1.3.2细胞因子诱导的杀伤细胞制备将经Ficoll Hypaque(Gibco,USA)分离的单个核细胞重悬于含10% FBS的RPMI 1640培养液中,以2×106个 /ml铺入培养瓶,补加 γ- 干扰素(INF-γ,1 000 U/ml), 置于37℃、5%二氧化碳培养箱中孵育;次日补加CD3单抗(0.5μg/ml)及白细胞介素 -2(IL-2,1 000 U/ml) 继续培养;第3天用10%FBS的RPMI-1640培养液进行补液;第11~12天收集细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer,CIK)细胞,离心, 生理盐水洗涤3次。用含有10%患者自身血浆的生理盐水重悬,总体积为100 ml,经静脉回输患者,共4次,回输时间选择在2次DC回输之间。
1.3.3 DC-CIK回输后效果分析如果输入DC-CIK后患者有发热等不舒服的感觉,各项化验有一定的改变,且对患者的生活有严重的影响,这些是评价的指标。
1.3.4患者血液中免疫指标细胞对采集及分析在回输DC-CIK之前7 d抽取患者血液,并于输注DC -CIK细胞后14 d再次抽取血液,经过处理后,分别加入管中,小管中加入血液及相应的抗体,血液加100μl,抗体量为10μl,抗体分别是CD3-FITC、 CD127-FITC、CD4-PE、CD8-PE、CD56-PE、CD25PE-Cy5,用Ig Gα1做相应的对照,2者经过反应后, 时间是15 min,反应后再次经过处理,上仪器检测, 检测后行记录数据分析总结。
1.3.5检测Th1/Th2按前述回输DC-CIK之前7 d抽取患者血液,并于输注DC-CIK细胞后14 d再次抽取血液,经过离心等处理后,留取患者血清,置入冰箱低温冷冻备用。取ELISA试剂盒,按操作程序测定IFN-γ 与IL-4血清中的含量,操作务求规范严密。
1.4统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析,计量资料用均数±标准差(±s)表示,实验设计为自体配对均数的t检验,P <0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1效果及副反应
总体上,DC-CIK注入人体后,多数患者状态有明显改善,进食增加、精力恢复、乏力倦怠症状消失, 其中有个例患者有暂时的体温升高现象,均未超过39℃,时间较短,应用药物后,体温下降至正常,并没有反复,全部患者无皮疹瘙痒等不良症状,各项化验指标也未见显著变化。
2.2患者免疫指标评价
DC-CIK注入人体后,患者CD3+、CD4+百分比增加,CD8+百分比下降,CD4+/CD8+数值提高;标志CD3+CD56+细胞数量提升;标志CD127low Treg CD25+CD4+细胞比例下降,相比注入CIK-DC细胞前,差异有统计学意义(P <0.05或P <0.01)。见表1。
2.3细胞因子比较
CIK-DC细胞输注组IFN-γ 含量提高,IL-4含量减少,差异有统计学意义(P <0.01)。见表2。
3讨论
胰腺癌是消化道常见肿瘤,恶性程度高,治疗困难,晚期放化疗都难以延长生存期,临床及科研都在多方探索有效的疗法。治疗的主要难度在于复发和转移,手术前治疗重点在局部,术后治疗重点在于全身,近年开展的生物治疗是有希望的全身治疗办法。
自身防御机制在抗肿瘤过程中发挥着不可替代的作用,T细胞在自身防御的过程中发挥着重要作用,癌症之所以能发生、发展,在于机体免疫状态有了问题,导致免疫监视减弱,正常状态下,人体免疫细胞量和功能都协调一致,能够发挥正常的免疫机制,当这种平衡被打破,免疫功能在一定程度上的缺失,至使肿瘤产生免疫逃逸。实验证明,DC-CIK的输注可以改善患者的免疫状态,是一种有效的支持治疗。患者免疫状态的改善对患者的无病生存期及带瘤生存期的延长都有一个良好的预期。DC细胞是启动、调控和维持免疫应答的中心环节。通过体外活化培养负载肿瘤抗原的DC细胞,当细胞数量达到一定数量后回输给患者,可诱导机体产生强烈的抗肿瘤免疫反应[4]。最新研究显示,DC细胞与CIK细胞共培养后,提高细胞的增殖速度和杀伤活性,且使其对肿瘤细胞的杀伤作用更具特异性。对于血液、消化、呼吸等多个系统肿瘤细胞均有杀伤作用。 CIK细胞最初是指在正常人体外周血中只占1%~ 5%的CD3+CD56+的T淋巴细胞,目前国内外制备的用于过继免疫治疗的CIK细胞,实际上是体外扩增以CD3+CD56+、CD3+CD8+为主的异质性细胞群[5]。该细胞群具有广泛的非MHC限制的极强的溶瘤活性。CIK增殖能力强,细胞毒作用强,对肿瘤细胞的识别能力很强,能精确“点射”肿瘤细胞,但不会伤及 “无辜”的正常细胞。能消除残留微小的转移病灶, 对手术后或放化疗后患者效果显著,因此,CIK细胞被认为是新一代的肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。
本文结果表明经过以往的治疗后,机体的免疫力受到不同程度的打击和抑制,有些已不能进行下一步治疗。经过DC-CIK细胞的提取和输注后, CD3+、CD4+含量和CD4+/CD8+数值升高,共表达CD3+CD56+细胞含量显著提高。CIK细胞对肿瘤细胞有直接的杀伤,在体内受某些淋巴因子作用后,CIK细胞大量释放具有细胞毒性的胞浆颗粒到胞外,这些颗粒直接破坏瘤细胞,进入体内活化的DC-CIK细胞分泌多种细胞因子,如干扰素 γ、TNF-α 和IL-2等,不仅对肿瘤细胞有直接抑制作用,而且还可通过调节免疫系统间接杀伤肿瘤细胞。
1995年SAKAGUCHI等人首先提出CD4+CD25+Treg,引起免疫界越来越多的关注。CD4+CD25+Treg细胞可以维持自身免疫耐受,由于肿瘤抗原是自身抗原量或质的改变,因此,可以推测CD4+CD25+Treg细胞可以抑制肿瘤免疫的发生。研究发现无论癌症患者还是肿瘤动物模型,其外周CD4+CD25+Treg细胞数量及功能均不同程度地增高,与患者死亡率增加,存活率降低密切相关。去除CD4+CD25+Treg细胞, 利于诱导对多种肿瘤抗原的免疫应答,证明CD4+CD25+Treg细胞可以抑制体内抗肿瘤免疫反应。因此,CD4+CD25+Treg细胞可能在肿瘤逃逸、促进肿瘤的生长中发挥重要作用,也可能是肿瘤疫苗和免疫增强剂难以奏效的原因。
文献显示CD4+CD25+CD127lowTreg是人体自有的,可以识别身体内被激活的T淋巴细胞[6],对Treg尤其可以区别,其特异性在目前发现的细胞标志中可以说是高的,而这种技术的发现,已经在临床中得到应用,效果良好。应用流式细胞术三色标记法检测患者血液里CD4+CD25+CD127lowTreg含量,可以对Treg在血液中的含量反映得更精准。上述研究检测DC-CIK细胞输注前后血液中CD4+CD25+CD127lowTreg含量,可以看出胰腺肿瘤患者输注DC-CIK前血液中CD4+CD25+CD127lowTreg含量较多。DC-CIK细胞输注2星期,患者血液中CD4+CD25+CD127lowTreg含量减少。因而,CIK细胞以减少Treg含量的方式增强患者的免疫功能。
人体的免疫结构中,细胞因子有着重要的地位。 从产生细胞因子和其功能作用的区别,细胞可区分为Th1细胞与Th2细胞。Th1的细胞作用是使人免疫力更强,这类细胞可以分泌诸如IFN-γ、IL-2等因子;Th2细胞分泌诸如IL-4、IL-10等因子,在体液免疫中发挥关键效能。健康状态下,人体处在一个免疫平衡状态,Th1、Th2分别分泌增强免疫和抑制免疫的因子[7],互相制衡。肿瘤患者疾病的开始及进展均有Th1参与的免疫机能伴随。上述通过检测两类细胞因子在血液中的含量,可以看出输注DC-CIK细胞的患者,IFN-γ 含量增加,IL-4含量减少。显示DC-CIK细胞输注在一定程度上影响着Th1/Th2的平衡,保持人体免疫状态的平衡,促进免疫系统对肿瘤的免疫反应。
总之,DC-CIK细胞输注对增强胰腺肿瘤患者T淋巴细胞生理效能,减少患者血液中Treg的含量, 同时使Th1/Th2的比例保守一个相对稳定的水平起到关键作用。但是,上述论述所涉范围有限,DC-CIK细胞对胰腺肿瘤患者更深层次的作用及效果还有待揭示。
摘要：目的 探究树突状细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞(DC-CIK)细胞输注对胰腺肿瘤患者的影响。方法对30例经病理证实的胰腺肿瘤患者输注自体DC-CIK细胞,每例均在输注前、后抽取血液,应用流式细胞技术测量T细胞亚群和CD4+CD25+CD127low调节性T细胞(Treg)的改变;ELISA法测量IFN-γ和IL-4数值的变化。结果 患者输注后外周血CD3+、CD4+、CD3+CD56+T细胞含量增加,CD4+/CD8+含量增加,CD8+T细胞含量减少(P<0.01);CD4+CD25+CD127low Treg减少(P<0.01);Th1细胞因子IFN-γ含量较输注前增加,而Th2细胞因子IL-4含量减少(P<0.01)。结论 DC-CIK细胞输注可以改善胰腺肿瘤患者的免疫机能,加强人体的抗肿瘤免疫应答,是治疗胰腺肿瘤患者的一个方法。
细胞因子诱导的杀伤 篇8
关键词：肺癌,树突状细胞,细胞因子诱导的杀伤细胞,护理
树突状细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞 (DC-CIK) 抗瘤治疗是一种自体免疫细胞回输疗法, 通过对自体免疫细胞进行体外激活和扩增, 并加入多种生长因子, 然后重新输回肿瘤病人体内[1], 通过激活自身免疫反应杀伤肿瘤细胞, 从而达到治疗的目的。与放化疗相比, DC-CIK抗瘤疗法具有损伤小、安全、不良反应少等优点, 尤其是对于一些年老体弱、机体抵抗力较弱不能耐受放化疗的老年病人, 更是首选。目前, DC-CIK抗瘤疗法在国内甚至国际的生物治疗领域都具有良好的前景, 更是开辟了治疗癌症的新途径。为了促进DC-CIK抗瘤疗法的规范化, 探讨有效的护理方法, 我院对40例晚期肺癌病人实施DC-CIK抗瘤治疗, 现将护理总结如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择2013年1月—2014年1月我院收治的40例晚期肺癌病人, 其中男28例, 女12例;年龄39岁~68岁 (32.7岁±8.9岁) ;均经病理学诊断为Ⅲ期、Ⅳ期肺癌, 其中鳞癌26例, 腺癌8例, 大细胞癌6例;均无放化疗及手术指证, 均实施DC-CIK抗瘤治疗。
1.2 治疗方法
每位病人实施DC-CIK治疗2个疗程, 共回输12次, 每次输注细胞数不低于5×109个。DC细胞采用皮下注射, 按病人实际情况选择注射部位, 隔日1次, 每次1 mL, 共4次;CIK细胞采用静脉回输, 每次100mL, 隔日1次, 共2次。注意在单核细胞和淋巴细胞分离和培养过程中必须保证严格无菌, 所有细胞均经检验合格后再将细胞回输给病人[2]。
2 护理
2.1 心理护理
主动与病人进行沟通, 了解病人的实际需求。由于治疗方法比较新颖, 家属及病人对于治疗方法缺乏一定的认识和了解, 存在一些疑惑和焦虑心理[3]。术前应该主动向病人介绍DC-CIK抗瘤治疗的操作程序、疗效、风险性、优越性、毒副反应等, 让病人有一个大致的了解, 并介绍国内外相关成功案例, 消除病人的不确定感和不安全感。告知病人外周静脉采血50mL~80mL在人体的正常耐受范围内, 对人体没有影响。细胞回输后出现体温升高的现象也不用担心, 体温很快可自行缓解或使用解热药后降至正常水平, 消除病人的担忧和恐惧。建议病人通过聆听一些舒缓的轻音乐或是阅读一些笑话、杂志等分散注意力, 避免过度焦虑和紧张。告诉病人家属要多关心、留意病人的言行举止, 一旦发现异常及时通知医护人员, 认真做好陪护工作。告诉病人大多数肿瘤通过此方法治疗后可以得到很好控制, 改善生活质量, 提高病人治疗的信心。鼓励病人以积极乐观的心态对待疾病, 主动配合医生和护士的工作。
2.2 细胞回输护理
做好细胞回输前的准备工作, 认真核对病人的信息和各项检查结果, 同时检查分离培养细胞的存活情况。保证无菌操作, 认真核对细菌、真菌、支原体和内毒素检查结果。回输CIK细胞时注意事项:细胞回输尽量在半小时之内完成, 在回输过程中密切监测病人的生命体征, 一旦发现异常情况立即停止输注, 回输结束后仍用生理盐水行管路冲洗, 减少细胞损失, 拔除静脉通路, 停止心电监护;回输后由当班护士将回输袋送回实验室妥善保管。
2.3 并发症皮疹的护理
对于细胞回输后出现皮肤瘙痒、身上有红斑的病人, 告诉病人不要慌张, 这是由于机体对DC-CIK细胞溶液某些成分的轻微变态反应。嘱病人不要抓挠, 以免皮肤破溃后诱发感染, 可以遵医嘱应用异丙嗪25mg肌肉注射。
2.4 胃肠道护理
对治疗后出现恶心、呕吐无法进食的病人, 首先做好病人的安慰工作, 如果病人仍然克服不了, 可以遵医嘱给予甲氧氯普胺10mg每天3次口服。详细记录病人呕吐次数、量及呕吐物颜色、性质, 观察有无水电解质紊乱, 鼓励病人呕吐后适当进食。指导病人练习腹式呼吸以减轻恶心感, 防止误吸造成吸入性肺炎。
2.5 发热护理
定期测量病人体温, 一般治疗24h内很多病人会出现体温升高的现象, 无寒战。部分病人体温可以自行恢复正常。对于体温持续升高的病人可以采用物理降温的方法, 给病人进行温水、酒精擦浴, 擦拭过程中注意动作要轻柔, 避免损伤病人的皮肤造成刺激和感染。也可以适当补液或口服一些解热药, 但避免使用糖皮质激素降温。
2.6 日常生活护理
为病人提供科学的饮食指导, 鼓励病人多进食高蛋白、低脂肪、易消化、好吸收的食物, 饮食上要清淡, 忌油腻、忌辛辣。多食富含维生素和膳食纤维的食物, 如水果、青菜等, 促进胃肠蠕动, 防止便秘。病人身体好转后可以进行适当运动, 注意运动强度和运动量要适宜, 尽量选择一些户外比较舒缓的运动, 如慢走、太极拳等, 不仅可以呼吸新鲜的空气, 锻炼心肺功能, 还能促进全身血液循环, 增强身体的抵抗力。嘱病人保证充足的睡眠和休息, 规律作息, 防止过度劳累, 保持充沛的精力和体力。在日常生活中尽量要求病人自己独立完成一些力所能及的事情, 如吃饭、穿衣等, 锻炼病人的肢体功能, 增强病人的自理能力, 有利于提高病人的生活质量和适应社会的能力。
3 结果
40例病人顺利完成2个疗程治疗, 13例病情部分缓解, 27例病情稳定;治疗后1例病人出现皮疹, 经过药物治疗4h后病情得到明显缓解。2例病人出现恶心、呕吐, 及时服药及补充水电解质后可以正常进食。6例病人出现一过性发热反应, 其中3例自行缓解, 另外3例通过物理及药物降温后体温很快恢复正常。
4讨论
从20世纪80年代初, 美国国立癌症研究所Rosenberg博士建立淋巴因子激活的杀伤细胞 (LAK) 用于肿瘤治疗, 开创了肿瘤生物治疗新纪元。它是一种全新的肿瘤生物治疗方法, 利用自身的免疫细胞杀伤癌细胞, 不仅可以避免放化疗所带来的巨大副反应, 还能明显抑制肿瘤细胞的增殖及生长[4], 能够有效控制病情发展, 延长病人的生存时间及生活质量, 是目前治疗晚期癌症的一种有效方法。由于其治疗方法比较新颖, 在CIK细胞回输治疗恶性肿瘤的过程中对护理人员的要求也较高, 护理人员除了具备常规的专业知识外, 还需要了解心理学、营养运动学等相关知识, 关注病人的需求, 为病人提供良好的护理服务。
本组病人结果显示, 病人经过治疗和精心的护理以后, 疗效较为显著, 对术中出现的并发症也得到及时有效解决。治疗过程的顺利实施与治疗后的显著疗效与护理有密切的关系。通过有效的心理辅导可以缓解病人的紧张情绪, 解开病人的疑惑, 使病人对治疗更加放心。科学的心理支持不仅增强了病人治疗的信心, 同时也加强了护理人员与病人之间的交流, 使病人对护理人员更加信任, 主动配合各项检查及治疗[5]。治疗过程中护理人员认真负责的态度和专业娴熟的技能可以确保手术的顺利进行, 将手术风险降至最低, 最大可能地确保病人的安全。术后并发症的护理可以防止感染发生, 促进病人早日康复。对于日常生活方面, 充分体现了护理工作中以人为本的核心精神。主动关心病人, 为病人提供生活上的帮助和指导, 让病人更好地适应周围的环境和生活, 有效提高病人的生活质量。
参考文献
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[4]陈进.DC-CIK生物联合治疗晚期肿瘤56例护理与观察[J].齐鲁护理杂志, 2011, 17 (1) :59-62.
细胞因子诱导的杀伤 篇9
关键词：三维适行放疗,细胞因子诱导杀伤细胞,局部晚期非小细胞肺癌
非小细胞肺癌 (NSCLC) 约占原发性肺癌患者总数的80%。由于早期诊断较为困难, 确诊时约40%患者已进入晚期, 仅20%左右的患者可以采取手术根治[1]。局部晚期非小细胞肺癌是指尚未远处转移, 局部肿瘤进展而不能手术的Ⅲ期病变, 约占全部非小细胞肺癌的1/3以上, 是临床最常见的疾病阶段。放疗在局部晚期NSCLC的治疗中具有非常重要的作用, 但是治疗5年生存率只有5%左右, 中位生存期约6～11个月[2]。为进一步提高治疗效果, 石家庄市第一医院对住院及门诊40例局部晚期NSCLC采用三维适行放疗 (3D-CRT) 后联合细胞因子诱导杀伤细胞 (CIK) 治疗方案, 并设40例住院及门诊病例单独采用3D-CRT治疗作为对照, 现将研究结果报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集2006年6月至2009年6月石家庄市第一医院80例患者, 经病理学或组织细胞学证实为Ⅲa期或Ⅲb期非小细胞肺癌 (UICC2002分期标准) 。卡式评分 (KPS) ≥70;有可测量或可评价的病灶;无严重内科疾病;血常规、肝肾功能正常。将患者随机分为联合治疗组和对照组各40例, 联合治疗组患者男28例, 女12例, Ⅲa 18例, Ⅲb 22例, 年龄38～75岁;对照组患者男26例, 女14例, Ⅲa 19例, Ⅲb 21例, 年龄40～77岁。两组资料具有可比性。
1.2 治疗方法
联合治疗组行3D-CRT联合CIK治疗, 对照组行单独3D-CRT。3D-CRT治疗方法:患者取仰卧位, 双手交叉置于头顶, MED-TEC体膜固定。以治疗体位行定位CT扫描, 并将CT重建图像输入系统, 采用上海拓能公司维纳斯适行调强放疗计划系统设计治疗计划。靶区定义遵循国际辐射单位和测定委员会 (ICRU) 62号文件定义, 临床靶区体积 (CTV) 包括原发灶、同侧肺门和纵膈淋巴引流区, CT片肺窗显示大体肿瘤体积 (GTV) 外1cm作为边界。CTV外放1.5cm为PTV。采用4～6个野进行适行放疗。治疗计划优先采用剂量体积直方图 (DVH) 。计划照射剂量60～70Gy。每次2～2.5Gy, 每天1次, 每周5d。CIK治疗:三维适形放射治疗后, 如无严重放射性肺炎或其他合并症, 则1周内抽取自体静脉血行CIK细胞培养, 具体过程如下: (1) 包被:用250mL纤维连续片段+100mLCD3+20mLPBS包被过夜。 (2) 抽取外周血用Ficol分离并收集单个核细胞, 用PDS洗涤3次, 将细胞 (不少于3×107) 悬浮于GT551培养基中。当天加入IFN-r、IL-2 1000U mL、2%～3%自体血浆。24h后加入rhIL-1、IL-2 100U/mL培养。以后隔天加入IL-2和1%～3%自体血浆。 (3) 第6～8天作细菌、真菌、病原体培养。 (4) 第10～14天细胞数达到6～8×109时经生理盐水洗3次, 加入1%人血白蛋白生理盐水中回输。一般分4～6次回输, 之前半小时予苯海拉明20mg肌内注射。
1.3 观察指标
近期疗效参照WHO实体瘤疗效评定标准。完全缓解 (CR) :肿瘤全部消失维持至少4周, 无新病灶出现;部分缓解 (PR) :肿瘤消退50%以上, 维持至少4周, 无新病灶出现;无变化 (NC) :肿瘤消退不足50%, 或增大25%以下;病变进展 (PD) :肿瘤增大25%以上, 或有新病灶出现。总有效率为CR+PR病例占可评价病例的百分数, 局部控制率为CR+PR+NC病例占占可评价病例的百分数。生存时间为开始治疗之日计算到患者死亡或最后一次随访止。在末次随访时仍存活者生存时间计算截尾值[3]994-997。
1.4 统计学处理
采用采用SPSS12.0统计软件进行数据分析, 组间比较采用χ2检验, 以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 近期疗效
联合治疗组患者临床症状均有不同程度缓解, 总有效率 (CR+PR) 明显好于对照组 (χ2=4.53, P<0.05) , 见表1。
2.2 中位生存期比较
联合治疗组为21个月, 对照组为13个月 (P<0.05) ;生存率比较:1年生存率分别为72.5%和47.5% (P<0.05) , 2年生存率分别为37.5%和22.5% (P>0.05) 。
2.3 不良反应情况
主要不良反应为放射性肺炎及放射性食管炎, 两组间不良反应无明显区别 (P>0.05) 。
3 讨论
注:与对照组比较, χ2=4.53, P<0.05
肺癌是最常见的恶性肿瘤之一, 居各类肿瘤病死率之首。非小细胞肺癌 (NSCLC) 约占肺癌的75%～80%, 其中1/3的患者属于局部晚期Ⅲ期 (LA-NSCLC) , 其中约80%已失去手术时机。放射治疗对于局部晚期NSCLC是比较重要的手段之一, 但由于肿瘤内存在乏氧细胞, 使放射敏感性降低, 再加上肿瘤周围正常组织和器官 (食管、脊髓和肺) 照射剂量的限制, 无法继续增加放射剂量, 导致肺癌局控率降低, 影响生存率。
放疗的基本目标是提高治疗增益比, 即将放射剂量最大限度集中到病变区域内, 杀灭肿瘤细胞, 减少或避免周围正常组织器官不必要的照射[4]。3D-CRT技术较好的改善了肿瘤组织与周围正常器官的剂量关系, 使放射线剂量在三维方向上分布, 并与肿瘤靶区高度一致, 在对肿瘤组织放疗的同时, 最大限度保护周围正常器官, 减少局部复发率及并发症的发生。王颖杰等[5]通过对91例NSCLC患者进行适行放疗, 结果表明适行放疗效果明显优于常规放疗。
细胞因子诱导的杀伤细胞 (cytoking induced killer, CIK) 是将人外周血单个核细胞在体外通过多种细胞因子共同培养一段时间后获得的一群异质细胞, 其效应细胞主要为CD3+CD+56细胞。该种细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子, 兼有T淋巴细胞的抗肿瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤的优点, 又被称为NK细胞样T淋巴细胞。CIK细胞可以识别肿瘤细胞, 并与肿瘤细胞直接接触释放颗粒酶B、穿孔素等直接杀伤肿瘤;同时CIK细胞表达Fas分子, 并通过Fas/FasL途径诱导细胞凋亡;CIK细胞可分泌TNF-α、IFN-γ等炎性细胞因子抑制肿瘤生长并激活免疫系统, 提高患者自身抗肿瘤能力[6]。
谢强等[7]研究表明放疗联合CIK明显提高鼻咽癌患者体内穿孔素和颗粒酶的水平, 为CIK联合放射治疗提供了实验室依据。本组研究结果显示3D-CRT联合CIK治疗局部晚期非小细胞肺癌近期疗效较好, 有效率为77.5%, 明显优于单独三维适行放疗组。在中位生存期、1年生存率, 联合治疗组均明显优于对照组, 且没有增加不良反应。因此, 3D-CRT联合CIK是一种治疗局部晚期非小细胞肺癌的较好方法。
参考文献
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细胞因子诱导的杀伤 篇10
关键词：细胞治疗,标准化,规范化
目前细胞免疫研究和治疗正在全世界如火如荼地开展,而且也取得了巨大的成就,特别值得一提的是,近两届诺贝尔生理学医学奖得主所从事的科研工作都与细胞免疫紧密相关。众所周知,细胞是人体的结构和功能单位,是维持人体正常生命体征的关键。许多疾病的发生发展都与不同原因导致的细胞不同程度的受损相关;细胞治疗通俗的基本理念就是运用现代高科技手段,将不健康的、有病的人体细胞修补好,使之重新健康起来的治疗方法。而体细胞治疗是指应用人的自体、同种异体或异种(非人体)的体细胞,经体外操作后回输(或植入)人体的治疗方法。这种体外操作包括细胞在体外的传代、扩增、筛选以及药物或其他能改变细胞生物学行为的处理。经过体外操作后的体细胞可用于疾病的治疗,也可用于疾病的诊断或预防[1,2]。
世界首个前列腺癌症治疗性疫苗———Provenge于2010年4月29日获美国FDA批准上市销售。该疫苗既联合运用了树突状细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞(DC-CIK)免疫细胞的治疗方案,这在一向反对干细胞研究与应用的美国是史无前例的,它震动了全世界的医疗界。目前已有的细胞治疗的种类有:淋巴因子激活的杀伤细胞(lymphokine-activated killer cell,LAK);肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating cells,TIL);CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞(anti-CD3 antibody-activated killer cell,CD3-AK);细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cell,CIK);树突状细胞(dentritic cell,DC);DC和CIK共培养进行治疗(DC-CIK);共激活T细胞(anti-CD3/anti-CD28 monoclonal antibody-coactivated T cells,Co ACTs);自然杀伤细胞(nature killer cell,NK);自然杀伤T细胞(nature killer T cell,NKT);级联激活的外周血淋巴细胞(cascade priming PBL,CAPRI);抗原识别受体(TCR)为TCRγδ的T细胞(γδT);外周血造血干细胞移植。CIK细胞溶瘤作用是并不受癌症组织类型限制,因此对任何一种癌症均有杀灭作用。国外已经将DC-CIK用于临床治疗晚期难治性肿瘤,如肝癌、胰腺癌、食道癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌、肾癌、膀胱癌、乳癌、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌、白血病、鼻咽癌、黑色素瘤等。该疗法既可单独使用,也可以作为手术、化疗和放疗后的有力辅助手段,效果显著。结合手术切除、介入、射频、氩氦刀等治疗,可清除不能用手术切除的极微小瘤灶或是体内散存的瘤细胞,在延缓或阻止肿瘤的转移或复发方面有重要作用;对于部分暂时不适宜做手术、介入或其他治疗的肿瘤患者,也可以先进行CIK细胞治疗,提高身体功能状况,改善生活质量,争取其他治疗机会。
在国外,细胞治疗有严格的评审机构和评审标准以及相关标准规范。欧洲是European Medicines Agency(EMA)负责评审,美国是Food and Drug Administration(FDA)负责评审。这些评审机构已建立了一套评审标准。任何要开展细胞治疗的研究机构和研究者,需要向这些评审机构提交一系列的相关资料。评审机构要组织一批相关领域的专家,对提交的资料,尤其是对项目的科学性、伦理性、前期的研究成果和项目的设计等方面,进行严格的评审,提出评审意见和是否同意相关项目的开展。而我国目前已出台一些相关的管理规范,例如《细胞移植治疗技术管理规范》、《人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》,但缺少更为科学和详细评审标准和相关联的标准和规范。没有评审标准,很难让科学家和临床医生开展相关的研究工作,没有相关联的标准和规范,也很难让免疫细胞制剂的生产单位保证产品的质量。因此,我国目前不仅急需建立一套评价体系,而且需要一套相关联的标准和规范。
由于缺少相关的评审标准和评审机制,我国目前细胞治疗处于非常混乱的局面。一方面,一些负责任的医疗单位和研究机构,严格地根据国际标准,开展细胞治疗的临床试验研究和临床应用。而很多医疗机构和生物技术公司,受利益的驱动,加上研究人员急功近利,完全不考虑项目的科学性和伦理,无序地开展细胞治疗的临床应用。在国内外造成非常负面的影响,扰乱了我国细胞治疗生物治疗的秩序,受到国内国际的广泛批评。所以,出台细胞治疗的相关技术标准、规范是非常必要的,并且由相关机构对相关项目进行审批。现已开展相关治疗的医院主要集中在京沪穗等大型城市、苏鲁鄂豫等地或者一些军方医院。非但其数量远远不能满足广大患者的需要,而且由于没有统一的标准的建立和推广,临床应用中的安全性存在巨大隐患。就数量来说,目前能够接受相关治疗的病例远不足癌症病例存量的1%。就技术的标准化而言,开展相关业务的医院、生物技术公司能力参差不齐,急待业务素质的整体提升。就技术本身的安全性、效果而言,它更有必要成为癌症治疗的标准化治疗,因为它相对手术、放化疗而言不但没有对患者身体造成确定性的整体伤害还能提高患者整体免疫力并显著提升生存质量。因此,在有关机构提供服务的同时,需要注意并注重完善整套治疗方法的标准化程序,并推而广之。下面笔者根据多年在标准化和规范化相关的经验,结合DCCIK细胞免疫治疗进行探讨。
1 生产的标准化和规范化
与常规的药品一样,所有影响产品质量的行动都要在标准操作程序(standard operating procedure,SOPs)中有所叙述。加工过程中的所有的重要参数都必须在分批流程记录(batch run sheets)上记录入档,要达到生产的标准化和规范化的要求,首先,用于免疫治疗的免疫细胞生产的标准化和规范化必须严格遵照《人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》,包括体细胞的采集、分离和检定;体细胞的体外操作;体细胞制剂的检定与质量控制等相关项目规定的内容开展[3]。其次,用于免疫治疗的免疫细胞生产的标准化和规范化必须保证四个特性:定性,定量,定效,定质。
1.1 定性
在用于免疫治疗的免疫细胞生产过程中首先要保证产品的安全性。安全性标准化和规范化必须从严格的SOPs来进行。比如加入标准浓度的生长因子,必须对其生长行为必须予以监测,若细胞株在传代过程中发生异常,如失去对该生长因子的依赖,则不能再使用该细胞株,需重新培养或者重新分离。另外,对同种异体细胞或者异种细胞必须十分慎重,提供免疫学方面和安全性方面的证据,否则不建议开展,这属于规范的范畴。毒性检验的标准化是安全性标准化的关键。CIK细胞质检CIK细胞质检必须包括无菌检测(需氧菌检测,厌氧菌检测,真菌检测,支原体检测)、细胞活率检测和热源检测。
1.2 定量
细胞表型检测可以通过流式细胞仪检测CD3+CD56-及CD3+CD56+细胞数量,有报道,CIK细胞的杀伤活性主要来自CD3+CD56+双阳性细胞[4]。虽然现在还没有正式的数量指导标准出台,但业内专家普遍认为数量要至少要达到109个,才符合CIK细胞治疗的要求。研究表明,当输注的CIK细胞数达到一定数量时就可出现明显的治疗效果,其效果并不随着输注细胞增加而呈线性增大,到达一定程度后,过量反而会给患者带来副作用。CIK细胞输注数量:每次输注的细胞数不应<2×109个,每疗程输注细胞数应>1×1010个。
1.3 定效
用于免疫治疗的免疫细胞的有效性的标准化和规范化内容包括:(1)细胞的表型检测,如CIK细胞的形态及表面标记在显微镜下细胞呈圆形,体积增大,胞质饱满,折光性好,有颗粒,核增大,细胞表面有很多突起和伪足。(2)CIK细胞杀伤活性检测,如采用噻唑蓝(MTT)法或乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定杀伤活性,当效,靶比为20∶1时,应保证C1K细胞对自然杀伤细胞(NK)敏感肿瘤株K562细胞的杀伤率大于50%,对NK不敏感肿瘤株Raji细胞的杀伤率大于30%。
1.4 定质
标准化的生产程序是生产用于免疫治疗的免疫细胞所必须的,每批生产的细胞制剂在输入患者之前必须保证数量和质量的稳定性。在整个生产过程中除了标准化的操作外,还必须要有严格的而且规范的细胞制剂制备记录,如细胞的分离操作记录、细胞诱导操作记录、细胞的扩增培养操作记录、细胞制剂的制备标准操作记录、细胞制剂生产清场操作记录等,这些都是保证细胞制剂质量稳定性的因素。
另外,即使目前的技术可以对所有的重要参数进行全面测试,细胞治疗产品仍然有两个重要特性对生产过程产生很大的影响,需要特别注意。一是短储存期(比获得出厂试验最终结果需要的时间要短的多),二是在患者输入前不可能再进行最后一次无菌消毒。因此,生产过程必须在无菌条件下进行。要特别强调的是,在生产过程中要对生产环境、原材料、操作者的质量严加控制,以确保在移植时产品的安全性。
2 细胞制剂运输与储存的标准化和规范化
细胞治疗产品的储存是一个富有挑战性的问题,“疗效取决于质量”。免疫细胞制剂是生物制剂,这些产品是活的有机体,他们的功效取决于保持生存能力,需在低温环境中保藏和运输。这就要求免疫细胞制剂生产相关机构需要按照《药品流通监督管理办法》第十九条规定“药品说明书要求低温、冷藏储存的药品,药品生产、经营相关机构应当按照有关规定,使用低温、冷藏设施设备运输和储存”[5]。如果不按规定执行将产生严重的医疗事故。由于目前不仅在细胞制剂缺乏相应的运输和储存标准,而且在整个国内医药低温物流(冷链)因标准缺失,面临着安全与发展的双重考验。不过,相对于整个医药冷链物流基础设施薄弱、标准缺失、监管缺位等面临着的尴尬局面,免疫细胞制剂生产相关机构由于已经经过评审机构和专家的资格审查,从而本身具有的较高的资质条件,因而能够较好地“高要求,严标准”地实施制剂的运输和储存。但在运输与储存冷链物流方面必须严格参照2012年12月1日国家质检总局、国家标准委发布的《药品冷链物流运作规范》(GB/T 28842-2012)实施。另外,笔者认为仍需从以下几个内容进行进一步的规范化。
2.1 标准化的冷链运输
细胞制剂生产相关机构、经营相关机构、物流相关机构应制订符合细胞制剂运输、配送管理的规章制度,配备有确保细胞制剂温度要求(冷藏2~8℃)的设施、设备和运输工具。配送时,要在规定的保温时限内进行送达,配送途中不得开启冷藏设备或冷藏箱,保证全程全封闭冷藏运输。细胞制剂从收货转移到规定的贮藏环境的时间应在30 min内。另外,温度记录显示仪必须全程检测温度变化。
2.2 标准化的冷链包装
由于细胞制剂是直接注射使用,因此在保持低温冷藏的前提下,还需要保证包装的无菌隔离作用。制剂的包装外面必须具有明显的冷藏标记、准确而详实的产品信息(如条形码信息等),实现标准化冷链的可追溯。
细胞治疗产品的生产成本很高,通常批量的规格很小,而且产品大多是劳动密集型的,发展冷冻细胞库(原始细胞库和工作细胞库)是目前对保存同种异源细胞产品的主要选项。发展标准化和规范化的冷链运输和保存也是控制成本、赢得时间和质量安全的关键因子。
3 细胞治疗操作的标准化和规范化
3.1 标准化治疗中心
治疗中心的基本配置包括:治疗环境的布局设定,患者管理系统(如热线、患者数据库及储存备份),相应的急救设备与规程等。
3.2 标准化和规范化的临床治疗操作
在临床治疗方面,每名患者必须配备一名经专业技术培训并考试合格的执业护士和具有开展细胞技术临床应用相关专业临床诊疗经验的副主任及以上专业技术职务任职资格的主管医师,治疗医师必须经过卫生行政部门认可的自体免疫细胞治疗技术系统培训并考核合格。另外,临床治疗过程中必须有标准的安全程序以及副作用处理。
3.3 病案管理的标准化和规范化
医院病案是患者在诊疗过程中由医疗、护理、医技人员共同完成的记录文件,是评价医疗、护理、医技等质量的客观依据,是临床教学、医学研究、医院管理必不可少的资料,更是处理医疗纠纷、伤残鉴定、医疗保险的有效证据。(1)做好病案管理的基础工作,比如清晰的患者记录和预约安排,齐全的患者资料等。(2)用现代化的信息系统促进病案管理规范化、标准化。采用现代化的管理方式可以很好地促进病案管理规范化、标准化。建立病案信息动态管理系统,进行统计分析。
4 小结与展望
细胞治疗是一项新兴技术,它的发展比相对应的监管条件和标准化过程都快。为了保护患者和促进公共卫生的需要,要求供应的产品在质量、安全性和功效上达到适当的要求。因此,在临床批量制备和临床研究开始之前,必须要有合适的程序来确保具有GMP指导方针中所描述的那种恰当的生产监督管理程序,包括产品加工程序、质量控制(QC)和质量保证(QA)。
细胞因子诱导的杀伤 篇11
【关键词】 唑来膦酸；钛微粒；RAW 264.7；共培养分化
doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2016.03.001
Effect of Zoledronic Acid on the Differentiation of Titanium Particle Induced Osteoclast Precursor
Cells RAW 264.7
ZHANG Yi-yuan，LIN Yu，XIAO Li-li，WANG Wu-lian，FENG Er-you
【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of zoledronic acid on the differentiation of titanium particle-induced osteoclast precursor cells RAW 264.7 to probe its possibility in the prevention and treatment of osteoporosis around prosthesis.Methods：RAW 264.7 cells were cultured in vitro.A preparation of titanium particles was made and the MTT method was used to detect the growth curve of RAW 264.7 cells in order to look for the best concentration of zoledronic acid for intervention.Cells Raw 264.7 was divided into three groups：the Ti particles group （0.1% volume ratio of titanium particles + 10% fetal bovine serum culture medium），the Ti+ zoledronic acid group （0.1% volume ratio of titanium particles + 10% fetal bovine serum culture medium + optimal concentration of zoledronic acid） and the control group （10% fetal bovine serum culture medium）.The tartrate resistant acid phosphatase （TRAP） staining was used to observe the morphology of cells.The ELISA method was used to detect the concentration of RANK （receptor activator of NF-κB）.The biochemical method was used to determine the activity of TRAP in the supernatant of cells.The qPCR method was used for the detection of the expressions of TRAP，matrix metalloproteinase 9 （MMP-9），carbonic anhydraseⅡ（CAⅡ） and （NFATcl） mRNA；Western Blot was used to detect the expressions of TRAP，RANK，CtsK and proteins.Results：Titanium particles could stimulate RAW 264.7 to secrete osteoclast differentiation factors and promote the transformation of mononuclear cells to osteoclasts.Zoledronic acid could obviously make a down regulation for the expression of titanium particle-induced RAW 264.7 RANK and the expressions of TRAP，MMP-9，CAⅡ，NFATcl mRNA and proteins.The difference was statistically significant （P < 0.05）.Conclusion：Zoledronic acid can effectively inhibit the differentiation osteoclast precursor cells RAW 264.7，reduce the formation of osteoclast and make a down regulation of the phenotype of osteoclast and the transcription level of functional gene mRNA，which is expected to become a drug for the prevention and treatment of postoperative periprosthetic osteoporosis.
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【Keywords】 zoledronic acid；titanium particle；RAW 264.7；co-culture and differentiation
随着我国人口的老龄化，由于外伤、股骨头坏死、骨质疏松导致髋部骨折的患者不断增加，而人工髋关节置换术（total hip arthroplasty，THA）已经成为恢复髋部功能的主要方式[1]。目前，影响髋关节稳定性、假体使用寿命及增加翻修率的主要原因是THA术后假体周围骨质疏松导致的假体无菌性松动[2]。研究表明，置换后的金属与聚乙烯衬垫因持续磨损而产生大量的含有金属的微粒与亚微粒，脱落的微粒会随着机械微动迁移至骨-假体界面，这些磨损微粒能通过促进破骨细胞分化和骨吸收活性从而引起假体周围骨质疏松[3-4]。唑来膦酸（zoledronate，ZOL）是目前治疗骨质疏松的双膦酸盐类代表药物，主要通过抑制破骨细胞分化、降低骨重建发挥作用[5]。近来研究发现，ZOL能通过抑制假体周围破骨细胞的分化、减缓骨重建的速度增加假体周围骨质量[6]。因此，本实验拟通过研究ZOL干预钛微粒诱导的破骨细胞前体细胞
RAW 264.7，观察其对RAW 264.7分化的影响，以期为临床采用ZOL预防THA术后因假体周围骨质疏松而引起的无菌性松动提供依据。
1 实验材料
1.1 实验药物和细胞 ZOL由北京诺华制药有限公司提供[规格5 mg·（100 mL）-1，进口药品注册证号H20070127]；RAW 264.7采购自广州吉尼欧生物科技有限公司（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）。
1.2 主要试剂和检测仪器 直径平均为（0.91±
0.65）μm钛微粒（北京有色金属公司）；Trizol（invitrogen公司）；RANK ELISA检测试剂盒（西唐公司）；抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒（南京建成生物工程研究所）；PCR引物（上海生工生物工程技术服务技术有限公司）；CtsK、RANK、TRAP、β-actin抗体（Cell Signaling公司）；PrimeScriptTM RT reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqTM PCR Kit（TAKARA公司）；9600型PCR扩增仪（美国PE公司）；7500 Fast实时定量PCR仪（美国ABI公司）；ELx800酶标仪（BIO-TEK公司）。
2 方 法
2.1 干预前钛微粒的预处理 首先将钛微粒置于烤箱，300 ℃6 h，将100 mg钛微粒悬浮于
25 mL质量分数为75%的乙醇中制成混悬液。放在200 r·min-1水平摇床，24 h后离心去上清液。更换乙醇继续振荡24 h，离心去液体，PBS洗涤3次。再次干燥后，置于紫外线中照射24 h。检测处理后的钛微粒内毒素质量分数 < 0.10 EU·mL-1，可以排除内毒素对细胞的影响。最后预处理后的钛微粒置于DPBS中，配制成体积比为0.1%的混悬液即每毫升0.1%（v/v）的混悬液终含钛微粒4.5×107。在干预前须用超声磁力震荡器震荡10 min消除粘连。
2.2 ZOL干预 将RAW 264.7以1×106个每孔密度接种于6孔板，将其放入培养箱过夜。分为
3组：Ti微粒组（0.1%体积比钛微粒+含质量分数为10%的胎牛血清培养基）、Ti+唑来膦酸组（0.1%体积比钛微粒+含质量分数为10%的胎牛血清培养基+最佳浓度唑来膦酸）和对照组（含质量分数为10%的胎牛血清的常规培养基）。干预后连续培养48 h。同时采用TRAP染色，观察是否分化为破骨细胞。
2.3 ZOL对RAW 264.7增殖的影响 将RAW 264.7
细胞以104·mL-1的密度接种于96孔培养板中，过夜后弃去旧培养液，分别加入含0，10-9，10-8，10-7，10-6，10-5，10-4，10-3，10-2，10-1 mol·L-1的培养基，每个浓度设8孔，培养72 h，加入四唑盐液（5 g·L-1）20 μL每孔，37 ℃孵育4 h后吸去上清液，加入DMSO液体150 μL每孔，在摇床上振荡10 min，用酶标仪选择490 nm波长测定各孔吸光度值（A），其值与细胞数量成正比。比较不同ZOL对RAW 264.7增殖的影响，并找出最佳的干预RAW 264.7的浓度。
2.4 ELISA法检测培养液RANK浓度 取干预48 h
后离心，分别取细胞与培养液，细胞用TX-1000
裂解后，按照试剂盒说明书，在待测96孔板中分别加入样品、标准品、空白液各100 μL，加样后，置于温箱37 ℃30 min，洗板并加入酶标偶合液100 μL，37 ℃20 min。洗板后加入底物、终止液50 μL，与酶标仪上长读取OD值。样本均设复孔。
2.5 生化法检测细胞液TRAP浓度 取干预48 h后培养液加入试管，每管0.05 mL，将蒸馏水0.05 mL、
0.1 mg·mL-1酚标准应用液0.05 mL加入空试管中，再加入缓冲液、基质液各0.5 mL充分混匀，37 ℃水浴15 min，最后加入1.5 mL显色剂，立即混匀，520 nm，0.5 cm光径比色，空白管调零，测各管
吸光度。
2.6 qPCR法检测TRAP、MMP-9、CAⅡ、NFATcl
mRNA表达 见表1。
采用Trizol法提取细胞总RNA，计算出抽提后的RNA浓度，取500 ng提取后的RNA，按试剂盒说明书进行逆转录。设复孔在7500 Fast实时定量PCR仪上按进行cDNA扩增，得到扩增曲线、CT值、溶解曲线，每个指标每个样本均设3个复孔。使用7500 system SDS 软件将得到的CT值换算成最终数据。
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2.7 Western Blot法检测细胞中RANK、MMP-9、
NFATcl蛋白的表达 提取总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，以每泳道上样30 μg蛋白，质量分数为12%的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用半干转法将蛋白转印至PVDF膜。在室温下封闭30 min，加入一抗封1 h。每次40 mL洗液漂洗膜6次，即：1 min 2次，20 min 2次，5 min 2次。然后将二抗室温封闭30 min，洗膜5次。AP化学发光底物与膜在室温下孵育反应5 min，压片曝光、显影。采用Phoretix 1D生物电泳图像分析系统分析胶片中蛋白的条带，计算机自动读取并记录每条带的光密度值。
2.8 统计学方法 采用SPSS 18.0软件进行统计分析。计量资料以表示，首先比较样本是否呈正态分布，并检验方差齐性，多组之间比较先采用F检验，而后进行q检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
3 结 果
3.1 ZOL干预后RAW 264.7细胞形态 显微镜下观察发现，与钛微粒共培养后部分RAW 264.7细胞核增多，伪足增多，细胞间排列不齐，有伪足。干预后的细胞采用抗酒石酸酸性磷酸酶染色，发现细胞的胞浆部位形成棕红色沉淀，细胞核染色成阴性。其中Ti微粒组最为明显，Ti+ZOL组次之，对照组无明显改变。见图1。
3.2 ZOL促RAW 264.7细胞增殖情况 MTT法检测后绘制RAW 264.7细胞增殖曲线图发现，细胞在ZOL浓度为0～10-6 mol·L-1之间无明显变化，之后随着浓度增加细胞增殖能力逐渐降低。因此确定浓度为10-6 mol·L-1 ZOL为干预最佳浓度。
3.3 各组RAW 264.7细胞中RANK、TRAP表达 Ti微粒组中RANK、TRAP表达最高，Ti+ZOL组次之，对照组最低，两两比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。
3.4 各组RAW 264.7细胞中TRAP、MMP-9、CAⅡ、NFATcl基因表达 qPCR结果表明，Ti微粒组及Ti+ZOL组的TRAP、MMP-9、CAⅡ、NFATcl的RNA表达均高于未含钛颗粒的正常组，且Ti微粒组的TRAP、MMP-9、CAⅡ、NFATcl表达高于Ti+ZOL组，各组间比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表3。
3.5 各组RAW 264.7细胞中RANK、MMP-9、NFATcl蛋白表达 各组RANK、MMP-9、NFATcl蛋白表达量情况以Ti微粒组的蛋白表达含量最高，Ti+ZOL组次之，对照组最低。各组比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图3。
4 讨 论
THA是治疗晚期髋关节疾病的理想方法。目前，影响假体长期生存率的原因主要是假体松动，假体周围骨量的丢失与松动具有显著的关系[7-8]。THA假体植入后假体周围磨损颗粒激活循环血单核细胞并将其募集至假体周围，破骨细胞前体细胞也聚集在异物单核细胞群周围，引发破骨细胞前体细胞向破骨细胞分化，因此，破骨细胞前体细胞在假体周围骨质疏松中扮演重要角色。虽然手术技术、假体材料及制作工艺较之前有明显的改善，但是假体上磨屑颗粒的产生却是无法避免的。要解决假体周围骨质疏松导致的假体松动，除了改进假体材料与制作工艺以尽量减少磨屑颗粒产生和提高手术技术外，如何抑制因磨屑颗粒导致破骨细胞的活化，实现延长假体使用寿命，减少关节翻修率就显得尤为重要。
TRAP主要存在于巨噬细胞、破骨细胞、单核吞噬细胞等细胞中，是破骨细胞重要的酶组化识别标志[9]。MMP-9在破骨细胞中特异性高表达，可特异性地降解非矿化的软骨和释放细胞外基质结合的血管内皮生长因子，发挥其直接趋化、活化破骨细胞的作用，同时还在破骨细胞迁移过程中发挥重要的作用，是破骨细胞移动到骨表面的关键因素[10]。RANK则位于破骨前体细胞上，能被RANKL识别，RANKL与破骨细胞受体结合后，诱导破骨细胞的形成和活化[11]。NFATcl是RANKL介导的破骨细胞分化过程中最重要的因子，能活化RANKL/RANK途径的下游，促进破骨细胞前体细胞RAW 264.7向破骨细胞分化，并诱导破骨细胞的各种特异性基因的表达，如TRAP、CAⅡ等[12]。本研究结果显示，与钛微粒共培养后，RAW 264.7中RANK、TRAP、MMP-9、CAⅡ、NFATcl的表达较对照组有显著性提高（P < 0.05），提示钛微粒能促进单核细胞向破骨细胞转化。
ZOL是双膦酸盐类中最新一代的制剂，通过其含氮杂环能与骨骼紧密结合来抑制假体磨屑颗粒引起的破骨细胞功能活化带来的骨溶解，从而达到改善假体的生物学固定效果[13]。研究表明，ZOL能抑制THA术后假体无菌性松动狗模型的假体周围骨溶解，并且提高假体周围的骨密度，从而改善皮质骨生物力学性能，并且还能保护膜内成骨；同时ZOL还可以显著提高植入的带有生物型羟基磷灰石涂层假体周围骨的骨密度及生物力学参数[14-15]。此外，ZOL还能抑制整合素αv、β3在破骨细胞中基因的表达，从而影响破骨细胞在黏附、细胞骨架重排以及骨吸收中的作用[16]。本实验在采用ZOL干预后，干预组与钛微粒组比较，RAW 264.7细胞和细胞液中RANK的表达，TRAP、MMP-9、CAⅡ、NFATcl mRNA和蛋白的表达均明显下降（P < 0.05）。表明ZOL可能是通过RANKL/RANK途径，阻滞RANK受体的结合，抑制NFATcl的表达，并下调RAW 264.7细胞中TRAP、MMP-9的表达，最终抑制破骨细胞的分化成熟，从而降低破骨细胞的骨吸收功能。
总之，本研究采用ZOL对钛微粒诱导的破骨细胞前体细胞RAW 264.7干预，发现ZOL能抑制RAW 264.7向破骨细胞分化；但ZOL对关节假体周围骨吸收的长期作用到底如何，且对假体上磨屑颗粒的产生炎症因子是否有抑制作用，均有待于进一步研究。
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收稿日期：2015-10-29；修回日期：2016-01-12
细胞因子诱导的杀伤 篇12
1 材料与方法
1.1 实验材料与试剂
1.1.1 实验材料
人Bel-7404肝癌细胞株购于中国科学院上海细胞生物研究所。
1.1.2 实验试剂
RPMI 1640培养液、胎牛血清(FCS)购于Hyclone公司(美国);Ficoll分离液(1.077 g/m L)购于天津美德生物科技有限公司;T细胞尼龙毛柱为美国GIBCO公司产品,脂多糖(LPS)为Sigma产品;重组人rhGM-CSF、rhIL-4购自Pepro Tech公司;IL-12、IFN-γELISA检测试剂盒购于Boatman Biotech;MTT购自Sigma Chemical Co;FITC标记的CD1a、HLA-DR、CD80,PE标记的CD83、CD86,FITC标记的鼠免疫球蛋白亚型IgG1,k均为美国Immunotech公司产品;丝裂霉素C(Mitomycin C)购自Solarbio公司;LDH 4 h释放法细胞毒性分析试剂盒(CyTo96 NoRn-Radioactive Cytotoxicity Assay)为美国Promega公司产品。
1.2 实验方法
1.2.1 DCs的体外培养、扩增及鉴定
取健康人外周血200 m L,肝素抗凝,常规分离单个核细胞(PBMC),RPMI 1640完全培养基重悬细胞,置37℃、5%CO2培养箱培养4 h后,吸出未贴壁细胞(供分离T淋巴细胞用),留下贴壁细胞,加入含rhGM-CSF(100 ng/mL)、rhIL-4(50 ng/mL)细胞因子的10%FCS的RPMI 1640培养液,隔日半对量换液(吸弃30%,加入50%),同时加细胞因子(首次浓度的1/2),收集培养7 d的细胞即为DCs,通过光镜、电镜及流式细胞术等进行鉴定。
1.2.2 Kinectin-MBP的制备、分离及纯化
详细过程见参考文献[4]。麦芽糖结合蛋白(MBP)的制备与Kinectin融合蛋白相似,但所用的质粒为不插入任何目的基因的空质粒。
1.2.3 Kinectin-MBP致敏DCs的制备
DCs培养的第6天,加入Kinectin-MBP 0.2 m L(100μg/m L)共培养,另设MBP组作为比较,过夜收获悬浮和轻度贴壁的细胞即为致敏DCs,同时将细胞调成1×105/m L备用。
1.2.4 IL-12、IFN-γ的检测
分别收集正常培养至第6天、第8天的DCs以及经Kinectin-MBP、MBP致敏后的DCs(培养至第8天)的上清液,采用ELISA方法检测IL-12、IFN-γ含量。
1.2.5 致敏DCs体外诱导的自体淋巴细胞增殖效应
收集培养第8天的各组DCs作为刺激细胞,完全培养基调整细胞密度为2×106/m L后,分别重新铺入2板六孔板,其中一板加入丝裂霉素C25μg/m L,37℃孵育45 min,生理盐水洗涤3次,完全培养液悬浮;另外一板留后继诱导CTL用。将1.2.1步骤中吸出的未贴壁细胞经尼龙毛过柱后即为纯化的T淋巴细胞,将细胞调成1×105/m L后作为反应细胞,以每孔1×105个加入96孔板,分别将刺激细胞和反应细胞(DCs∶T)按1∶10、1∶50和1∶100的比例加入各孔反应细胞中,每孔设3个复孔,终体积为200μL。同时以T淋巴细胞+1640完全培养液作为阴性对照,置37℃、5%CO2培养箱培养96 h后,每孔加入MTT(5 mg/m L)20μL,再继续培养4h,离心弃上清,加入DMSO 150μL/孔,轻微震荡,10 min后酶标仪检测各孔的A490值。细胞增殖指数(SI)=实验孔OD值/空白对照孔OD值,以此评价DCs刺激自体T淋巴细胞增殖的能力。
1.2.6 致敏DC诱导自体T淋巴细胞增殖分化为CTL
于6孔培养板中加入自体T淋巴细胞(1×106个/孔)作为效应细胞,其中一孔细胞量为1.1×106个/孔作为对照组;分别以培养至第8天的各组致敏DC作为刺激细胞,以1×105个/孔加入各组T淋巴细胞孔,同时加入IL-2,终浓度为200 u/mL,置37℃、5%CO2培养箱培养,分别于培养的第3、6天半量换液,同时补足IL-2终浓度为200 u/mL。第7天收集细胞,即为DC-CTL。
1.2.7 致敏DC诱导的CTL对BEL-7404肝癌细胞杀伤活性的检测
采用乳酸脱氢酶(LDH)4 h释放法,严格按照试剂盒说明书操作。在效靶细胞混合培养前,分别对其进行活力测定,细胞成活率达95%以上方可进行下一步的杀伤实验。效应细胞共分为4组:分别标记为Kinectin-MBP-DC-CTL、MBP-DC-CTL、DC-CTL,同时设立对照CTL组(即NoDC-CTL),靶细胞为Kinectin表达阳性的7404肝癌细胞株。
1.3 统计学方法
采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。计量资料数据以均数±标准差表示,组间差异用方差分析,检验水准为α=0.05。
2 结果
2.1 DCs鉴定结果
正常人PBMC经培养4 h获得贴壁细胞,加入rhGM-CSF和rhIL-4培养到7～9 d,可见大量悬浮状细胞,细胞体积大且形态不规则,出现许多短的毛刺状突起,即为DCs。扫描电镜可见细胞表面较粗糙,形态显不规则状,并有大量皱褶和不规则的突起(见图1、2)。流式结果CD1a表达率为47.47%,HLA-DR为45.84%,CD80、CD83、CD86分别为50.88%、56.25%及69.72%(见图3)。
2.2 各组细胞因子检测结果
Kinectin-MBP与DCs共培养组(Kinectin-MBP-DCs)上清液IFN-γ和IL-12的浓度明显高于MBP孵育组(MBP-DCs)和正常培养DCs组(P<0.01);而正常培养DCs组其上清液IFN-γ和IL-12的分泌量在培养第6天、第8天无明显变化(P>0.05),结果见表1。
2.3 致敏DCs体外诱导的自体T淋巴细胞增殖效应
Kinectin-MBP致敏的DCs在刺激细胞与效应细胞比例为1∶10时,可诱导自体混合淋巴细胞较强的增殖反应,SI值为(46.80±4.48),显著高于MBP致敏DCs组(31.69±0.17)、非致敏DCs组(26.70±0.16)以及正常培养T细胞对照组(11.21±3.57)(均P<0.000),结果见表2。
2.4 致敏DCs诱导的CTL对肝癌细胞的杀伤作用
在实验设置的3种不同的效靶细胞比例条件下,经Kinectin-MBP致敏的DCs所诱导的CTL对7404肝癌细胞具有明显的细胞毒作用,其杀伤率在效靶比为25∶1时达最高峰(65.0±1.47)%,显著高于MBP组(21.83±0.27)%、DC组(3.60±2.35)%和正常对照组(2.07±1.54)%(均P<0.01)。在效靶比分别为10∶1及50∶1时,杀伤活性也较高,但是在效靶比为10∶1时,MBP组也具有较高的杀伤率,各组杀伤结果见表3。
注:1)与MBP-DCs组比较,P<0.05;2)与DCs组(第6天组和第8天组)比较,P<0.05;3)与DCs组(第6天组和第8天组)比较,P<0.05
注:1)与T细胞对照组比较,P<0.05;2)与MBP-DCs组比较,P<0.05;3)与DCs组比较,P<0.05
注:覮与对照组比较,P<0.05
3 讨论
近年来,伴随免疫学、分子生物学的快速发展,以免疫治疗为代表的肿瘤生物治疗已成为肿瘤治疗的研究热点。体外运用抗原物质等致敏DCs后回输体内作为新型肿瘤疫苗则成为肿瘤生物治疗的另一崭新手段,在国外,DCs肿瘤疫苗作为该崭新手段已进入临床试验阶段[5]。目前,研究者们在以DCs为基础的肝癌免疫治疗方面也进行了多方面的研究[6,7,8],这为肝癌的免疫治疗提供了一个崭新的平台。
Kinectin是生物进化过程中保留下来的一种细胞内膜蛋白,其穿膜区域镶嵌在内质网质膜上,属细胞器蛋白质,其主要功能是与动力蛋白Kinesin结合而参与囊泡的转运,为Kinesin的受体。Kinectin还与一些细胞内的功能及信号蛋白相关联,如整合素、RhoG家族蛋白、EF1复合体等,这些蛋白在细胞的分裂、分化及骨架构建中都发挥着极其重要的作用[9]。目前对Kinectin的研究主要集中在生化特性、运输功能、信号转导关系以及与疾病的关系等方面。关于Kinectin与肝癌方面研究目前报道较少,除课题组报道其相应抗体在肝癌患者中有较高的阳性率外[3],另有研究报道在HCC患者血清中也筛查到了抗Kinectin抗体,在Kinectin的4个选择拼接区中,包含有D2区域(即V4区域)的Kinectin在肝癌中有过度表达,可能与肝癌的发生密切相关[10]。课题组前期已成功制备并分离纯化出Kinectin-MBP[4],笔者研究在前期研究的基础上,探讨经Kinectin-MBP致敏的DCs诱导的自体T淋巴细胞产生特异性抗肝癌效应,为将Kinectin蛋白运用于以DCs为基础的肝癌临床免疫治疗奠定理论基础。
笔者的研究结果表明,经GM-CSF和IL-4诱导、LPS刺激培养10 d后的DCs,表达较高水平的HLA-DR、CD80和CD86分子(表达率分别为45.33%、50.37%和69.17%),结合形态学鉴定结果,以及所借鉴实验方法的成熟度,可确定已成功培养出DCs。实验对Kinectin-MBP、MBP致敏的DCs以及正常培养DCs的上清液进行了IL-12和IFN-γ的检测,结果显示,Kinectin-MBP组IL-12和IFN-γ的分泌量明显高于MBP组及未致敏组,表明Kinectin-MBP可激活DC产生较高水平的IL-12和IFN-γ。而IL-12是促进Th1分化的最主要的细胞因子,可进一步促进T淋巴细胞发挥Th1效应,达到抗肿瘤作用;FIN-γ具有上调肿瘤细胞抗原提呈分子及共刺激分子表达的作用,这种作用不仅能够加强DCs的抗原提呈功能,同时也能够提高CTLs对肿瘤细胞的识别能力及杀伤活性。
此外,MTT法检测各组T淋巴细胞增殖情况,发现Kinectin-MBP致敏DCs组能有效刺激T淋巴细胞的增殖,明显高于未致敏组及MBP孵育组,具有较强的刺激同种T细胞增殖的能力;且Kinectin-MBP致敏DCs可诱导CTL的产生;CTL对Kinectin阳性表达的7404肝癌细胞株产生较明显的杀伤作用,这种杀伤作用在一定范围内随效应细胞的增加而增加,在效靶比为25∶1时杀伤率达最高峰[为(65.00±1.47)%],显著高于MBP-DC-CTL组、DC-CTL组及No-DC-CTL组[分别为(21.83±0.27)%、(3.60±2.35)%及(2.07±1.54)%,均P<0.001]。
笔者实验为排除MBP在其中所起的杀伤作用,另设MBP致敏DCs诱导组作为对照,发现MBP组在效靶比为10∶1时,杀伤率可达(49.83±3.28)%,但在效靶比为25∶1时,其杀伤率仅为(21.83±0.27)%,这就提示在进行肿瘤的免疫治疗时,有一个理想临界点,高于或者低于该临界值,都可直接关系到免疫效应的杀伤结果,故需要摸索好合适的效靶比例,才可达到理想的临床治疗效果。此外,为排除肝癌细胞自然溶解的可能,在进行杀伤之前,采用台盼蓝对细胞进行活细胞记数,细胞活性达95%以上方可用来进行杀伤实验;同时,为排除DCs以及T细胞的非特异性杀伤,还设立了未致敏DCs组以及正常培养T淋巴细胞组作为对照,结果均未见明显的杀伤作用(P<0.05),这就表明,Kinectin融合蛋白作为肝癌相关蛋白性的抗原致敏的DCs在体外具有比较明显的抗肝癌活性。这为肝细胞癌的免疫治疗提供了实验依据,对其他肿瘤的治疗也有一定的借鉴作用,为临床肿瘤的免疫治疗提供了一个可行性方案。
参考文献
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