成骨诱导机制（通用6篇）
成骨诱导机制 篇1
随着我国经济的迅猛发展, 我国对各种骨缺材料修复的利用率也开始飞速提升, 目前采用的骨缺修复材料技术无法满足现代人们的需要, 不能良好解决目前复杂的骨损伤问题, 大量实践表明, 自体骨与异体骨移植具有诸多局限性, 工作人员通过模仿天然骨本身的成分、结构特性及生物矿化过程进行研究, 并针对性的对其进行调整, 获取了良好的新型仿生人工骨修复, 目前市场上急需大量的骨缺损修复材料, 为了获取更多更优质的股组织再生修复材料, 医学人员需要对其积极探索[1]。
1 仿生骨修复支架材料的作用及其现状
1.1 仿生骨修复支架材料的作用
人体在正常生活中会出现骨组织疾病和缺损的状况, 由于此种疾病会造成机体的结构和功能障碍, 对患者的正常生活造成影响。由于人体具有一定的自愈功能, 患者出现小面积的骨缺损可以通过适当的治疗而痊愈, 但严重性骨损伤便需要采用外来材料进行辅助治疗骨组织。仿生骨修复支架材料在损坏骨骼的修复工作中具有重要作用, 目前优异生物矿化材料需要采用有机分子调控无机分子, 国内外均出现了天然的生物体结构及组合材料, 传统的仿生学设计可以适当的采用材料组合的方法去模拟生物体系, 天然矿化组织均由生物大分子等物质组成, 其在生长过程中会出现一定的有序性[2]。
1.2 仿生骨修复支架材料的现状
随着我国医学技术的进步, 采用各种方式进行骨损伤治疗, 目前使用较为广泛的方法为自体骨移植、异体骨移植、人工合成骨移植。根据大量的治疗经验表明。目前临床上最具有效果的治疗方式属于自体骨移植, 其与人体的兼容性高, 出现排斥概率较低, 但自体骨移植技术进行取材时就难以获取丰富的材料, 并会在一定的程度上影响人体治愈后的活动, 后期的疼痛感也十分明显, 造成患者的痛苦, 因此, 随着医疗改革的脚步, 此种方式逐渐被淘汰。目前采用较为广泛的骨质材料一般为小牛骨、猪骨。其与人体的通行也十分的有利, 且疼痛感较低, 但购买的成本极高, 且进行加工处理的步骤也较为繁琐, 因此, 此种方式也无法大范围的应用。医学技术人员针对市场的需求及各种原因考虑, 正在积极的研究探讨一种在结构上高度模拟天然骨组织基质, 这种骨组织具有良好的生物兼容性与骨再生诱导能力, 以为仿生骨修复支架材料提供良好的治疗材料[3,4]。
2 仿生多级孔生物活性玻璃支架材料及其成骨诱导机制的研究
2.1 仿生多级孔生物活性玻璃支架材料的设计
由于毛海绵可以将物质形成孔隙结构, 并在特殊的环境下可以有利于生成羟基磷灰石的作用。笔者所在医院采用以聚丙三醇、聚乙二醇、聚丙三醇相互构成的共聚物和毛海绵作为模板, 制造出一种具有多级孔生物活性玻璃微管支架材料, 用于骨损伤的修复治疗工作。笔者所在医院采用扫描电镜对此材料进行观察, 分析其结构, 发现该支架材料呈现出多级孔。促使骨损伤修复需要考察材料的相容性、载药性、细胞增殖性。由于生物相容性可以从细胞的增值能力中得以体现, 笔者所在医院截取仿生多级孔生物活性玻璃支架材料的部分, 在其表层培养MC3T3-E1 细胞, 并对其增值能力进行检测, 判断其生物的相容性。笔者所在医院采用地塞米松 (DEX) 进行试验, 发现其具有良好的载药性, 通过仔细的分析与调查, 发现此材料的多孔结构是塑造给药环境的重要支柱[5,6]。
2.2 仿生多级孔生物活性玻璃支架材料成骨诱导机制
以上的试验证明了多级孔MBG微管支架材料具有良好的生物相容性、载药性、促再生性。此种材料的构成较为简单, 生产价格较为低廉, 可以在骨损伤修复应用中具有良好的应用前景, 其仿生多孔的特性可以持续给药, 促进骨组织的持续修复与治疗, 多孔支架材料与纳米纤维支架材料结合可以在骨修复的应用中提高治疗有效率, 促使成骨诱导机制的塑造。
在具体的实践过程中, 笔者发现选择使用这种材料进行治疗的前提是先确定生物玻璃及其复合材料的生物相容性, 大量实验表明, HAP材料对温度的要求并不严格, 通常实验过程中采用模拟体液的方式进行测验, 目前的技术无法保证仿生材料在高温的环境下不发生相变与脆裂[7]。因此, 工作人员需要模拟出自然界磷灰石的矿化机制, 在相对温和的环境下进行材料的培育, 由溶胶制成的HAP晶体具有力学性能差、热稳定性差等特点, 将具有其属性的玻璃生物材料置入人体中时, 材料表面会呈现出一层磷酸钙的薄膜, 具有这种薄膜的材料可以良好的与人体骨骼结合, 并促进骨骼的愈合与再生, 复合材料可以在一定的程度上提高生物玻璃与高分子复合材料的活性与细胞亲和性, 目前采用玻璃活性生物材料在临床医学上广泛应用于人工骨与人工牙的治疗中。大量的资料表明, 采用此种材料的骨修复速度在一定的程度上高于自体骨, 工作人员将药物投入多孔生物玻璃结构中, 并置入生物体的关键部位, 密切观察药物释放的时间与作用时间, 由于其用药特点, 此种材料还广泛应用于生物活性玻璃中的抗生素与抗骨肿瘤药物中, 生物活性材料不仅补填骨损伤的部位, 还通过缓慢的释放药效来降低损伤部位发炎的概率[8,9]。
3 PLLA纳米纤维支架材料及其成骨诱导机制的研究
随着我国分子化学与物理的进步, 人们开始重视对纳米纤维支架材料的研究, 根据材料结构决定其作用, 从化学的角度来讲, 可以通过改变其排列方式、纤维取向来调整干细胞的分化方向。笔者所在医院在此基础上采用静电纺丝技术对左旋聚乳酸 (PLLA) 进行处理, 将金属平板、滚筒作为接收装置, 以制造出无纺和平行排列的纳米纤维支架材料。调查研究表明, 纤维取向可以影响人体骨髓间充质干细胞 (BMSCs) 的形貌, 具体为: (1) 于无纺材料上培养的细胞呈现出无规则、多分枝的形貌; (2) 于平行材料上培养的细胞与纤维排列平行[10]。笔者所在医院根据以上资料开始培养细胞, 定时提取细胞RNA, 采取q RT-PCR进行检测, 结果表明, 无纺纳米纤维材RUNX2、BMP2、OPN、COL1A1、SPARC和BSP等成骨基因明显高于平行材料。
PLLA纳米材料具有模拟天然细胞外基质的结构, 工作人员采用多种方式对此种材料的表面结构进行研究, 发现PLLA纳米材料会根据不同温度的变化而改变自身形态, 其内部的高分子链发生相应的化学变化, 因此, 在具体应用此种材料的过程中, 工作人员需要先将此种材料进行处理, 改善其亲疏水性与细胞亲和性, 细胞的培育对温度及亲水性的要求较高, 因此, 工作人员采用此种材料进行临床治疗时需要对其细胞的相容性与亲水性进行检测与评估, 具体内容为采用三维PLLA纳米纤维支架进行性能改变, 将具有枪机型的-COOH基团与此种材料紧密结合, 增加细胞的增值速率及活性[10,11]。
医用材料对材料的化学性质、物理性质具有一定的要求, 由于PLLA材料本身具有的表面惰性、疏水性。造成其应用具有一定的局限性, 不利于广泛的推广, 医学专家通过不懈的研究, 发现采用低温大气等离子体技术可以调节无纺PLLA纳米纤维材料的化学性质, 提高成骨分化, 保持骨骼活性。笔者所在医院采用离子体对纳米纤维材料进行处理, 持续10~15 min, 检测其表面化学性质, 发现可以通过控制处理时间来提高纳米纤维材料表面的氨基基团、亲水性。q RT-PCR分析显示仪是一种专用的分析检测机器, 工作人员采用此种机器观测到5 min是材料各状态改良最为明显的时间节点。纳米纤维材料的BMP2、RUNX2、ALP、COL1A1、OPN、OCN的表明均有效提高。其中ALP活性检测达到最高值[12,13]。
因此, 笔者所在医院发现无纺纳米纤维调控的成骨分化与化学诱导成分诱导的成骨分化具有一定相似性。调查研究表明, 纳米拓扑结构的特殊性, 促使细胞内部发生力学传导效应, 从而激发成骨分化。通过一段处理技术可以有效的改良PLLA纳米纤维表面特性、生物相容性、成骨活性, 加强新型骨修复材料的研发与设计[14,15]。因此, 工作人员可以通过调控支架材料的拓扑结构来控制细胞的修复程度。采用无纺排列的纳米纤维在修复骨损伤的临床治疗上具有明显优势。
基于两种材料的特点与优势, 笔者所在医院将负载DEX的MBG材料和经等离子体处理5 min的PLLA纳米纤维材料复合处理, 将其应用于狗大腿骨损伤的缺损部位。检验其治疗骨损伤恢复的效果, 根据狗正常恢复的时间规律, 分别于4、12 周对狗治疗位置的骨组织进行取样检测, 结果表明, 狗骨组织恢复良好, 新生骨组织与周围正常骨组织良好的接合, 无不良反应。因此, 可以证明MBG微管材料和经等离子体处理后的PLLA纳米纤维材料的复合治疗可有效提高治疗有效率, 降低不良反应发生率。极具推广价值。
综上所述, 笔者所在医院根据获取的资料及自身多年的研究经验分别设计了仿生多级孔生物活性玻璃支架材料、PLLA纳米纤维支架材料为主的仿生骨修复支架材料, 采用等离子技术改良材料的活性, 采用检测机制评估其生物相容性和成骨诱导能力, 并根据其成骨诱导机制原理与优点将其投用于动物的体内进行骨缺损修复实验, 手术完成后, 评估修复效果。结果表明, 发现MBG材料和纳米纤维材料均可以通过各种技术处理, 提高其相容性、生物活性、成骨活性。从而有效地提高材料应用于人体治疗的骨损伤修复效果。
摘要：社会经济的发展带动着人们生活水平的提高, 人们对仿生骨修复支架材料的设计及其成骨诱导机制的了解度与安全性提出了一定要求, 仿生骨修复支架材料应用在西方国家骨损伤治疗工作中已经越来越普遍, 由于各种客观原因, 我国目前的仿生材料修复工作存在诸多问题, 不能有效的解决目前人体组织修复工作, 融合部分也相继出现不兼容性的状况。本文通过对仿生人工骨修复材料进行概述, 分析探讨了仿生多级孔生物活性玻璃支架材料、PLLA纳米纤维支架材料及其成骨诱导机制的研究, 希望对相关研究者有一定启发。
关键词：仿生骨修复支架材料,设计,成骨诱导机制,仿生材料
成骨诱导机制 篇2
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1实验动物SPF级雌性SD大鼠65只,其中3月龄60只,体重255~290 g,1月龄5只,体重90~95 g, 购于上海斯莱克实验动物有限责任公司[许可证号: SCXK(沪):2007-0005;合格证号:2007000532861]。
1.1.2主要仪器CO2培养箱(BB16/BB5060型;美国Thermo公司)、超微量蛋白核酸酶分析仪(ND-2000C型;美国Thermo公司)、倒置显微镜(Olympus IX70;日本Olympus株式会社)、多用电泳仪(DYY-12型;美国Bio-Rad公司)、凝胶成像系统(GEL DOC2000;美国Bio-Rad公司)、PCR仪(S1000型;美国Bio-Rad公司)、PVDF膜(美国Bio-Rad公司)。
1.1.3主要试剂LG-DMEM培养基、胎牛血清、0.25% 胰蛋白酶购于美国Hyclone公司;SD大鼠BMSCs成骨诱导分化培养基购于广州赛业生物科技有限公司; 茜素红-S粉购于美国Sigma公司;Axin-2、Fzd-2和 β-actin兔抗大鼠单克隆蛋白抗体购于美国CST公司;BCA蛋白分析试剂盒购于美国Pierce公司。
1.1.4实验药物龟鹿二仙胶由鹿角胶6 g、 龟甲9 g、 枸杞子9 g、人参6 g组成,药材选用培力药业有限公司“农本方”浓缩中药配方颗粒,各药物浓缩比例及人与大鼠体表面积换算[6]后的等效剂量见表1。
1.2实验方法
1.2.1龟鹿二仙胶含药血清制备60只3月龄大鼠从腹腔入路切除双侧卵巢,分为A、B两组,各30只。 术后第二天开始8∶00 am和2∶00 pm灌胃,A组灌服人等效剂量的龟鹿二仙胶[1080 mg/(kg·d)],B组灌服等容积生理盐水,连续7 d。 最后一次灌胃2 h后腹主动脉取血,1000 r/min离心15 min后取上层血清并将同组血清混合,56℃水浴灭活,0.22 μm滤器过滤后分装,-20℃保存备用。
1.2.2 BMSCs分离及培养1月龄SD大鼠断颈法处死后,75%乙醇浸泡5 min,游离股骨和胫骨并显露骨髓腔, 用含10%胎牛血清的LG-DMEM培养基反复冲洗骨髓腔,200目滤网过滤冲洗液,置于CO2培养箱记为F1。48 h后首次全量换液,后每2天换液,至细胞融合80%~90%时传代。 首次传代时,计数并调整细胞浓度,以1×105个/瓶传至25 m L培养瓶,后每2天换液,至融合80%~90%时1∶4比例传代,至F3代。
1.2.3 BMSCs形态观察自F1代开始,倒置显微镜每天观察BMSCs生长情况。
1.2.4 MTT法检测龟鹿二仙胶含药血清对BMSCs增殖影响F3代细胞以4×103个/孔密度传至96孔培养板,细胞分组及干预条件,见表2。 细胞贴壁后血清饥饿24 h,加入相应条件培养基1 d后,每组取8孔,每孔加入浓度为5 mg/m L的MTT液,37℃孵育4 h,吸除残余MTT液,每孔加入100 μL的DMSO溶解淡蓝色结晶,570 nm波长测OD值,连测8 d,观察龟鹿二仙胶含药血清对生长曲线的影响并选择促进增殖作用最明显的浓度进行后续实验。
1.2.5龟鹿二仙胶含药血清对BMSCs成骨分化的影响F3代细胞以1×104个/孔接种于6孔培养板,将细胞分为10% FBS(LG-DMEM+10%胎牛血清)组、10% KB (LG-DMEM+10% 大鼠空白血清) 组、10% GLEX (LG-DMEM+10%龟鹿二仙胶含药血清)组和Classica [LG-DMEM+10%胎牛血清+地塞米松(1×10-8mol/L)+ β-甘油磷酸钠(10 mmol/L)+维生素C(50 mg/L)]组饥饿24 h后更换条件培养基,每2天全量换液。
1.2.6碱性磷酸酶(ALP)比活性检测细胞培养第7 14、21天后,比色法测细胞培养液ALP活性。 按试剂盒操作说明测各管吸光度值, 计算各测试管ALP活性。 另用紫外分光光度计以595 nm波长测OD值,测定蛋白浓度(mg/L),ALP比活性(U/mg)=ALP浓度/总蛋白浓度。
1.2.7 BMSCs钙结节染色诱导21 d后,PBS洗涤细胞,10%福尔马林固定45 min,蒸馏水缓慢冲洗2遍, 晾干后每孔加入新鲜配制的茜素红-S染液(p H=4.2) 1 m L,37℃遮光孵育30 min,蒸馏水反复冲洗,干燥后显微镜下观察并拍照。
1.2.8 RT-PCR法检测Fzd-2和Axin-2基因的表达诱导21 d后,Trizol法提取细胞总RNA, 测定浓度后取总RNA 1 μg,用Revert Aid TM c DNA第一链合成试剂盒,20 μL反应体系逆转录为c DNA为PCR模板。 PCR反应体系为20 μL, 由Dream Taq Green PCR Master Mix(2×) 10 μL、nuclease-free Water 8.2 μL、 前后引物各0.4 μL和c DNA 1 μL组成。 上海生工生物工程有限公司合成引物,见表3。 反应条件:94℃预变性3 min,94℃变性30 s,退火,72℃延伸45 s,完成各自循环后,72℃再延伸10 min。 取PCR产物5 μL行琼脂糖凝胶电泳20 min, 以Image Lab 3.0软件分析图像,以目的条带和内参GAPDH的灰度值比值进行分析。
1.2.9 Western blot法检测Fzd-2和Axin-2蛋白的表达诱导21 d后提取细胞总蛋白,BCA法测蛋白浓度。 蛋白变性每孔取20 μg,聚丙烯酰胺凝胶电泳,TBST液洗涤后室温封闭1 h,加入稀释后的兔抗大鼠Fzd-2(1∶200)、Axin-2(1∶1000)、β-actin(1∶1000)一抗,4℃摇床过夜后湿式转膜,TBST洗涤,加入二抗,室温孵育1 h。 TBST洗涤后将PVDF膜置于显影垫片, 在PVCF膜蛋白面滴加显影液,1 min后显影。 美国UVP分析仪对胶片扫描, 目标蛋白灰度值与 β-actin灰度值之比作为目的蛋白表达水平的相对值。
1.3统计学方法
采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析,计量资料数据用均数±标准差(±s)表示,组间比较用单因素方差分析,两组间比较采用t检验;计数资料用率表示,以P < 0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 BMSCs形态学观察
3~4 d后可见少许细胞贴壁,呈细长外形,部分有突起。 6~8 d后,细胞簇状生长,10 d左右细胞形态均一,按一定方向紧密排列,呈典型旋涡状。 传代细胞增殖快,每5~6天即可铺满瓶底。 至F3代时,细胞形态一致,均匀贴壁于瓶底。 见图1。
2.2龟鹿二仙胶含药血清促进BMSCs增殖和成骨分化
2.2.1 MTT结果除DMEM组外,其余各组OD值自第2天起即显著增高, 其中10%的GLEXJ组增高明显,显著高于其余各组,说明10%浓度的龟鹿二仙胶含药能促进BMSCs增殖。 见图2。
2.2.2 ALP比活性的比较各组细胞ALP比活性随时间延长而增高, 且10%的GLEXJ组和Classical组显著高于10%的KB组和10%的FBS组,差异有统计学意义(P < 0.05),随着培养时间的延长,该两组细胞培养液ALP比活性增加更明显,差异有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01), 但10%GLEXJ组ALP比活性与Classical比较,差异无统计学意义(P > 0.05)。 见图3
2.2.3钙结节染色10%FBS组和10%KB组细胞因互相重叠致形态不规则,茜素红染色未见钙结节形成。10%GLEXJ组和Classical组细胞密度大,梭形外观不明显,细胞重叠,形状、排列极不规则,呈明显的团簇样聚集,茜素红染色可见数个明显的橘红色钙结节着色(白色箭头)。见图4(封三)。
2.3 Fzd-2和Axin-2 m RNA的表达10%GLEXJ组Fzd-2 m RNA表达水平显著高于10%FBS组、10%KB组和Classical组, 差异有统计学意义(P < 0.05),而10%KB组、10%FBS组和Classical组之间无显著性差异(P > 0.05)。 10%GLEXJ组Axin-2 m RNA的表达水平显著低于10%FBS组、10%KB组和Classical组,差异有高度统计学意义(P < 0.01)。 见图5。
2.4 Fzd -2和Axin -2蛋白表达10% GLEXJ组Fzd-2蛋白表达显著高于10%FBS组、10%KB组和Classical组,差异有高度统计学意义(P < 0.01),而10% FBS组、10% KB组和Classical组间无显著性差异10%GLEXJ组和Classical组Axin-2蛋白水平显著低于10%FBS组和10%KB组,差异有统计学意义(P < 0.0或P < 0.01);10%GLEXJ组Axin-2蛋白表达水平显著高于Classical组,差异有统计学意义(P < 0.05)。 见图6。
3讨论
中医认为“肾藏精,精生髓,髓养骨”,肾精和骨之间关系密切。 女性绝经后肾中精气衰微致使骨骼失去濡养引起“骨痿不能起于床”、“腰脊不举”等[7,8],与现代医学中骨质疏松症临床表现相似[9,10], 而骨质疏松症的发生与BMSCs关系密切。 研究表明“补肾”中药具有“壮骨”功能,推测其与促进BMSCs增殖[11]作用相关。本实验结果显示浓度为10%的龟鹿二仙胶含药血清具有促进BMSCs增殖的作用, 说明龟鹿二仙胶增加骨密度的作用与其增强BMSCs增殖有关。
同时,BMSCs可在体内某些因素的作用下向成骨细胞分化,并参与和维持骨的构建过程[12,13]。 “补肾”中药除了能促进BMSCs增殖外, 还能诱导其向成骨细胞分化[1,2]。 本研究结果显示龟鹿二仙胶含药血清组ALP比活性显著增高,茜素红染色可见橘红色钙结节形成, 表明龟鹿二仙胶含药血清能诱导BMSCs向成骨细胞分化。 而在BMSCs向成骨细胞分化过程中,受多条信号通路[14,15,16]的调控。 研究表明,Wnt/β-catenin信号通路可通过诱导成骨细胞分化方式促进骨形成[17]且中药可通过对该通路相关因子基因和蛋白的表达的影响参与BMSCs成骨分化的过程[18,19]。 在Wnt/β- catenin信号通路中,Fzd是一种跨膜蛋白, 与通路的激活密切相关,而Axin-2与BMSCs成骨分化关系密切,敲除Axin-2基因能增加骨祖细胞、增加成骨标志物表达并能加速骨化[20]。 本实验中龟鹿二仙胶含药血清诱导BMSCs向成骨细胞分化过程中,Fzd-2 m RNA和蛋白表达水平显著升高, 而Axin-2活性受到显著的抑制。 所以,龟鹿二仙胶可通过调控Fzd-2和Axin- 2的活性激活Wnt/β-cateinin信号通路促进BMSC向成骨细胞分化。
成骨诱导机制 篇3
1 资料与方法
1.1 一般资料
本研究纳入216 例患者, 入选基本标准为闭合性损伤并资料完整且能够得到随访进行功能评估的患者。其中男139 例, 女77 例;年龄18～62 岁, 平均38.4 岁。胫腓骨骨折 (包括胫骨平台骨折) 103 例, 股骨干骨折36 例, 尺桡骨干骨折18 例, 肱骨干骨折17 例, 锁骨骨折14 例, 骨不连7 例, 脊柱椎间融合13 例, 良性骨肿瘤8 例。
1.2 手术方法
本组病例大多数是在完成骨折内固定, 术野充分止血后, 将瓶装的DTM倒入小药杯中, 用生理盐水反复清洗至少三遍备用。针对不同部位骨折或不同手术, DTM植入主要有三种方式:骨干骨折, 用刮匙刮取适量的DTM置于明胶海绵上, 以明胶海绵为载体植于骨折断端;塌陷性骨折以及骨良性肿瘤刮除后的空腔, DTM与自体骨粒混匀植于缺损处;脊柱椎间融合, DTM与自体骨粒混匀后置于椎间融合器里再植入椎间隙。根据具体情况于低位处放置负压引流管。
1.3 术后观察指标
术后观察体温、引流量及切口愈合情况;术后1周测血磷、血钙、网织红细胞水平并与术前指标相比;1周内摄片检查, 以初步评价骨折稳定性。
1.4 疗效评价
术后1、4、8、12、16、24、32周摄片检查, 评价修复区新骨生成量, 骨愈合后可停止摄片检查。
2 结 果
本组患者术后均获随访, 时间8～26个月, 平均11.6个月。212 例切口Ⅰ期愈合, 4 例出现切口感染, 经换药后于术后4周内愈合, 未出现深部感染;术后1周测血磷、血钙、网织红细胞水平, 与术前相比无明显差异;骨折在2个月内愈合96 例 (44.44%) , 3个月内愈合67 例 (31.02%) , 4个月内愈合31 例 (14.35%) , 4个月以上愈合18 例 (8.33%) 、延迟愈合2 例 (0.93%) , 骨不连2 例 (0.93%) 。
3 讨 论
骨质愈合是一个复杂的生理过程, 在这个过程中通过骨的再生来恢复结构的完整性。骨再生除了受全身内分泌激素的调节外, 局部生长因子如骨形态发生蛋白 (bone morphogenetic proteins, BMPs) 对骨折愈合发挥了非常重要的作用[1]。BMPs主要存在于骨膜细胞、骨基质细胞和骨细胞, 是一类能够启动成骨分化, 并作用于成骨整个过程的细胞因子[2]。但是BMPs弥散能力较强, 易于被组织酶类降解, 直接将其植入体内, 易被血流冲刷掉, 并迅速弥散、转运、降解而不能充分发挥其生物学活性[3]。因此需要一种合适的载体以延缓BMPs释放速度, 同时要求载体在体内能够降解, 抗原性弱, 并具有支架能力。
脱钙人牙基质材料是以口腔临床治疗中拔除的废弃人牙为原料, 经过特殊工艺进行制取的, 能诱导骨生长, 促进骨组织形成, 完成骨修复治疗的一种医用活性生物材料。DTM本身是BMPs、胶原及其它蛋白多糖成分的复合物, 是BMPs载体的天然混合物, 因此它具有明显的天然结合优势。有研究表明, 当DTM植入人体后, 在植入区发出基因调控信号诱导未分化间充质细胞聚集、增殖, 并不可逆转的分化为软骨组织及成骨细胞, 达到局部新骨组织修复重建的目的[4]。此外, 据动物实验及临床观察, DTM具有以下几个特点[5]:a) 是一种新型医用活性生物基质材料, 具有稳定可靠的诱导成骨功能。b) 无菌, 并经病毒核酸灭菌, 故无病毒感染的可能性。c) 无热原、无致敏、无刺激、无毒性、无抗原性、无排斥反应, 使用安全。d) 重金属含量极微, 长期留存体内, 对组织细胞无不良影响。e) DTM系颗粒剂, 使用方便, 故可满足不同类型的骨系疾病的治疗需要。
对于骨折、骨缺损, 尤其粉碎性骨折, 为了达到加速骨质愈合, 大多采取植入自体、异体骨或人工骨。目前已有不少关于DTM在骨科领域应用的临床研究, 罗玉琛等[6]报道DTM可促进四肢骨折愈合。刘天盛等[7]采用DTM代替髂骨治疗四肢陈旧性骨折取得良好的临床疗效。本研究中接受DTM治疗的病例均为成年人, 创伤患者为闭合性损伤, 病因包括四肢骨干骨折、骨折不愈合、脊柱融合、良性骨肿瘤。在临床观察中未发现明显DTM相关不良反应, 术后4例出现切口感染, 经加强换药后愈合, 无深部感染, 术后1周的血磷、血钙、网织红细胞水平较术前亦无明显差异。在所有患者中, 4个月内骨性愈合率为89.81%;有2 例股骨干骨折延迟愈合, 经震波治疗后术后8个月愈合;有1例胫骨中下段骨折及1 例肱骨干骨折发生骨不连, 行二期手术植骨内固定。在发生骨折延迟愈合及不愈合的病例中, 除去体质因素, 我们发现大多与手术操作有关, 对于相对简单的骨折类型内固定不够坚强, 而对于较复杂类型的骨折因过分追求精确复位忽略了对骨膜等软组织的保护。
通过对本组患者的临床观察, 我们认为DTM明显促进骨质愈合, 且临床应用中未见排异、感染等不良反应。本研究不足之处在于, 回顾性研究其科学性不如前瞻性研究, 骨折部位、类型的不均一性难免会对结果产生影响。
摘要：目的 探讨骨诱导成骨材料 (脱钙人牙基质) 在骨修复治疗中的临床作用。方法 对2007年1月至2010年12月采用内固定结合脱钙人牙基质治疗216例骨科疾患的临床资料及临床疗效进行回顾性分析。结果 本组216例患者均获随访, 随访时间8～26个月, 平均11.6个月。术后4例出现切口感染, 经换药后4周内愈合;术后1周测血磷、血钙、网织红细胞水平较术前无明显差异;骨折在2个月内愈合96例 (44.44%) , 3个月内愈合67例 (31.02%) , 4个月内愈合31例 (14.35%) , 4个月以上骨折愈合18例 (8.33%) 、延迟愈合2例 (0.93%) , 骨不连2例 (0.93%) 。结论 脱钙人牙基质明显促进骨折愈合, 无局部及全身不良反应, 有较好的临床疗效。
关键词：脱钙人牙基质,骨修复,临床评价
参考文献
[1]Chalmers J, Gray DH, Rush J.Observations on theinduction of bone in soft tissues[J].J Bone JointSurg (Br) , 1975, 53 (1) :36.
[2]Mundy GR, Boyce B, Hughes D, et al.The effects ofcytokines and growth factors on osteoblastic cells[J].Bone, 1995, 17 (2) :71-75.
[3]Prolo DJ, Rodrigo JJ.Contemporary bone graftphysiology and surgey[J].Clin Orthop Relat Res, 1985 (200) :322.
[4]田敏, 孙磊.骨折折愈合与骨诱导生因子[J].骨与关节损伤杂志, 2003, 11 (11) :787-788.
[5]黄旭尔, 刘才.脱钙骨基质治疗长骨骨折延迟愈合及骨不连的远期临床观察[J].中华创伤外科杂志, 2003, 19 (5) :297-299.
[6]罗玉琛, 肖刚, 吴春辉, 等.DTM (骨又生) 促进骨折愈合的临床观察[J].生物骨科材料与临床研究, 2008, 2 (5) :39-41.
成骨诱导机制 篇4
1 材料和方法
1.1 材料
HG-DMEM培养基 (美国Gibco) 、胎牛血清 (FBS) 、Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶、二甲基亚砜 (DMSO) 、MTT、地塞米松、左旋抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、1, 25- (OH) 2VitD3、骨钙素 (OC) 多克隆抗体、Ⅰ型胶原多克隆抗体 (美国Sigma) , SP免疫组化试剂盒 (北京中杉) , 倒置相差显微镜 (日本Olympus) 。
1.2 方法
1.2.1 ADMSCs的分离培养
外科手术条件下获取人腹部皮下脂肪组织, PBS清洗、剪碎, 0.1% I型胶原酶37℃消化50min, 1000r/min离心10min, 弃上清及上层组织, 加入完全培养液 (含10%FBS、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的HG-DMEM培养基) , 于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。待生长至70%～80%融合时, 0.25%胰蛋白酶消化传代。
1.2.2 ADMSCs的冻存复苏
消化收集生长状态良好的第4代ADMSCs, 加入冻存液 (含20%FBS、10%DMSO、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的HG-DMEM培养基) , 调整密度为1×106个/ml, 先于-20℃预冷2h, 再转入液氮中。6月后于40℃水浴中快速冻融, 置CO2培养箱内培养。倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长情况。
1.2.3 检测存活率
将复苏后的细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液按9∶1混匀, 光镜下计数被染成蓝色的死细胞数和拒染的活细胞数, 计算存活率:细胞存活率 (%) =活细胞数/ (活细胞数+死细胞数) ×100%。
1.2.4 绘制生长曲线
分别消化收集冻存前、后的ADMSCs, 调整密度为2×107个/ml, 接种于96孔板, 每孔200μl, 自第2d起每天取1板, 各孔内加入5mg/mL MTT 20μl, 37℃孵育4h后加入DMSO 150μl, 温和振荡10min。酶标仪490nm波长处测得吸光度 (OD) 值, 连测8d。以细胞数量 (OD值) 为纵坐标, 时间 (天) 为横坐标绘制细胞生长曲线。
1.2.5 成骨诱导
待复苏后ADMSCs生长至70%融合时, 加入成骨诱导培养液 (含10%FBS、10-8mol/L地塞米松、50mg/L左旋抗坏血酸、10mmol/L β-甘油磷酸钠、10mmol/L 1, 25- (OH) 2VitD3的HG-DMEM培养基) , 隔天换液。对照组仅常规换液。
1.2.6 免疫细胞化学染色
诱导后第14d时, 丙酮固定细胞, 以1∶100稀释一抗, 按SP免疫组化试剂盒说明书步骤行骨钙素 (OC) 、Ⅰ型胶原染色, 然后DAB显色, 苏木素复染, 乙醇脱水, 二甲苯透明, 中性树胶封片观察。
1.2.7 统计学处理
实验数据采用SPSS 10.0软件进行统计学分析, 组间比较采用单因素方差分析 (one-way ANOVA) , P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 复苏后ADMSCs的形态及存活率
倒置相差显微镜下观察复苏后的ADMSCs为成纤维细胞样生长, 排列具有方向性, 呈平行样、旋涡样或辐射样, 与冻存前比较无明显差别, 传代后仍保持旺盛的生长状态, 如图1所示。经台盼蓝拒染试验检测, 细胞存活率较高, 为 (92.83±2.34) %。
2.2 冻存前后ADMSCs的生长曲线
MTT法绘制细胞生长曲线呈“S”形, 第1、2天为潜伏期, 第3天进入对数生长期, 第7天达顶峰, 第8天略有减少。冻存前后无明显差别, 如图2所示。
2.3 成骨鉴定
复苏后ADMSCs经成骨诱导14d时, 免疫细胞化学染色方法检测骨组织标志物骨钙素 (OC) 及Ⅰ型胶原, 结果显示诱导组阳性表达, 对照组阴性, 如图3所示。
(a) OC阳性表达 (b) I型胶原阳性表达
3 讨论
脂肪间充质干细胞以其取材方便、来源充足、体外易于分离培养、不存在伦理道德问题, 且具有低免疫原性等优点[7], 在再生医学, 特别是骨组织工程领域有着非常广阔的应用前景[8,9], 是较胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞更为理想的种子细胞。如果有科学的方法能够将ADMSCs在体外长期保存, 并保留其生物学性状的稳定, 就可以在需要的时候进行择期自体细胞移植, 或者同种异体细胞移植, 使骨组织再生, 有助于运动系统功能的恢复。
在本实验中, 采用人体脂肪组织作为实验材料, 更具临床实用意义。采用二甲基亚砜 (DMSO) 作为冻存细胞的保护剂, 配合“慢冻快融”的方法实现了ADMSCs的冻存复苏过程。实验表明, 复苏后的ADMSCs存活率较高, 能够保持稳定的一般生物学性状及成骨分化潜能, 证实人ADMSCs可以耐受低温冻存, 为今后建立干细胞库以及临床应用提供实验依据。
参考文献
[1]Aust L, Devlin B, Foster S, et al.Yield of adult human ad-ipose-derived stem cells from liposuction aspirates.[J]Cytotherapy, 2004, 6 (1) :7～14.
[2]Huang J I, Zuk P A, Jones N F, et al.Chondrogenic poten-tial of multipotential cells from human adipose tissue.[J]Plastic and Reconstrictive Surgery, 2004, 113 (2) :585-594.
[3]赵智刚, 唐晓琼, 黎纬明, 等.冻存前后骨髓间充质干细胞的生物学特性和支持造血的研究.[J]中国实验血液学, 2006, 14 (2) :304-307.
[4]沈兴, 余更生, 田杰, 等.兔骨髓间充质干细胞体外分离培养及冻存研究[J].实用医学, 2006, 22 (9) :996-997.
[5]伍耀豪, 刘广鹏, 刘波, 等.应用自体脂肪干细胞修复猪关节软骨缺损的初步实验研究[J].组织工程与重建外科, 2006, 2 (3) :163-166.
[6]刘曦明, 许建中.间充质干细胞修复骨缺损的研究进展[J].南国防医学, 2008, 22 (1) :43-46.
[7]尹烁, 崔磊, 杨平, 等.脂肪干细胞免疫学性状的初步实验观察.[J]组织工程与重建外科, 2006, 2 (1) :38-44.
[8]苏海鹏, 王东, 等.脂肪间充质干细胞的研究进展及临床展望[J].实用骨科, 2008, 14 (2) :100-102.
成骨诱导机制 篇5
本研究利用体外定向诱导人骨髓间质干细胞 (human bone marrow mesenchymal stem cells,h MSCs)分化为成骨细胞的模型和蛋白组学技术,研究h MSCs分化为成骨细胞过程中成骨相关蛋白的表达,对于阐明MSCs分化为成骨细胞的分子机制具有重要意义,也将为临床上治疗骨质疏松、难治性骨损伤等奠定初步的实验基础。
1材料与方法
1.1细胞与试剂
h MSCs来自中山大学中山医学院干细胞与组织工程中心,L-DMEM培养基、H-DMEM培养基均购自美国Gibco BRL公司,Vitamin C、地塞米松购自美国Sigma公司,β- 甘油磷酸钠购自美国Calbiochem公司,溴酚蓝、十二烷基磺酸钠、固相p H梯度胶条(p H 3~10,线性)、蛋白质纯化试剂盒及蛋白质定量试剂盒等均购自瑞典Amersham Biosciences公司。
1.2仪器
倒置显微镜(IX71-22FL/PH,日本OLYMPUS公司),超净工作台(NU-301-630E,美国NUARIE公司),等电聚焦电泳系统 (Ettan IPGphorⅡ,瑞典Amersham Biosciences公司)、垂直电泳系统 (Ettan DALTsix,瑞典Amersham Biosciences公司)、扫描仪 (Typhoon9400,瑞典Amersham Biosciences公司)、 图像分析软件(Image Master TM 2-D Platinum software 5.0,瑞典Amersham Biosciences公司)、全自动斑点处理工作站(Ettan Spot Handing Workstation, 瑞典Amersham Biosciences公司)、基质辅助激光解析离子飞行时间质谱分析仪 (Ettan MALDI-TOF Pro Mass Spectrometry,瑞典Amersham Biosciences公司)等。
1.3方法
1.3.1 h MSCs体外定向诱导分化为成骨细胞及鉴定将传代扩增后至第5代的h MSCs接种于六孔板,实验组每孔加入成骨细胞诱导液(含10-7mol/L地塞米松,10 mmol/L β- 甘油磷酸钠,50μg/ml Vitamin C) 2 ml;对照组每孔加入L-DMEM完全培养液,置培养箱中。碱性磷酸酶染色:取成骨细胞诱导分化第10天的细胞,4%多聚甲醛固定15 min,加入适量碱性磷酸酶染色液在室温下孵育10~20 min,显微镜下观察染色的结果。钙结节染色:取上述诱导分化第18天的细胞,加入适量的茜素红 -S染色10~15 min,显微镜下观察结果。
1.3.2蛋白样品的制备、双向凝胶电泳及图像分析加入裂解液裂解h MSCs及诱导成骨分化7 d的细胞,超声波处理,20000 g,4℃离心30 min,取上清液。按蛋白质纯化试剂盒说明书方法纯化蛋白后,使用蛋白质定量试剂盒,按照说明书方法,对蛋白浓度进行定量。将蛋白样品进行第一向等电聚焦电泳后, 将胶条转移至12.5%浓度的SDS-PAGE胶面上进行第二向电泳,直至胶内电泳指示剂溴酚蓝跑出凝胶下缘10 min后,对凝胶进行荧光染色。用扫描仪对荧光染色的凝胶进行扫描后,利用图像分析软件进行双向凝胶电泳(Two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)图像分析,通过背景消减、斑点检测等,建立h MSCs和诱导成骨分化7 d的凝胶图像,选取ratio≥2.0的差异表达候选蛋白,进行质谱鉴定和生物信息学分析。
1.3.3质谱鉴定和生物信息学分析使用全自动斑点处理工作站对差异蛋白斑点自动进行切割、脱色、 干燥、酶解、加入基质和质谱靶点样等一系列操作。 将点好的质谱靶放入质谱仪,激光源为337 nm波长的氮气激光器,获得样品的肽质量指纹图谱。质谱数据的分析使用Profound软件检索,以MASCOT为搜索引擎在人的NCBInr和Swiss-prot数据库中进行搜索。对所鉴定出的蛋白,依据Gene Ontology的生物过程和分子功能分别对它们分类分析,并绘制成图。
2结果
2.1hMSC成骨诱导分化过程中的形态变化及成骨诱导分化的鉴定
h MSCs加入成骨诱导液后,可见部分细胞由长梭形逐渐变为多角形,体积增大。随着培养时间的延长,这种多角形细胞逐渐增多。随着成骨诱导的进行,细胞持续增殖,开始呈多层重叠生长,细胞之间界限模糊,细胞逐渐聚集形成多个散在的岛状细胞结构,此岛状细胞结构逐渐被分泌的基质所包埋, 13~14 d左右出现钙结节,有明显的钙沉积。对照组加入L-DMEM完全培养液,细胞增殖良好,形态不变,不见致密的岛状细胞结构和钙化结节。见图1。
在诱导培养的第10天,进行碱性磷酸酶染色, 实验组可观察碱性磷酸酶染色反应为强阳性,细胞密集区出现紫黑色颗粒,胞浆内有紫黑色的颗粒沉淀;对照组碱性磷酸酶染色阴性或弱阳性反应,见图2。在成骨细胞诱导培养2周后用茜素红 -S检测钙沉积的情况,实验组镜下可见散在大量橘红色的钙结节,为茜素红与钙盐形成的橘红色的复合物,对照组结果为阴性,见图3。
2.2hMSCs及诱导成骨分化7d的总蛋白的双向凝胶电泳及其质谱鉴定
软件分析结果显示,3张h MSCs和3张诱导成骨分化7 d的双向凝胶电泳图谱蛋白质斑点匹配率均达到75%以上,胶的重复性好,蛋白点的分子量主要集中在20~80 k D之间,等电点主要分布在p H 4.0~8.0之间,蛋白点分离良好。
筛选ratio≥2.0的差异表达候选蛋白,经过胶内酶切和多肽提取后,进行质谱鉴定,70多个蛋白质点成功的获得了肽质量指纹图谱。
2.3生物信息学分析
通过数据库搜索,共鉴定出52种差异蛋白质, 其中13种蛋白质在成骨诱导7 d后表达明显上调, 39种蛋白质在成骨诱导7 d后表达明显下调。附表列出了这些蛋白质的相关信息,其中后35种蛋白在相关文献中已有报道[3],从左到右依次是数据库登入号、蛋白质名称及表达情况:上调 / 下调(U/D)。
按照Gene Ontology的分类方式对所有鉴定的蛋白质分类绘图,生物学过程分类中发现参与体内代谢和发育过程的蛋白质分别占37%和31%,分子
3讨论
蛋白质组学方法己被广泛应用于各种组织细胞的生理病理的分子特征的分析[4,5],本研究通过高分辨率的双向电泳技术、质谱分析以及生物信息学技术,成功的鉴定出52种差异蛋白,一些可能是在成人骨髓间质干细胞诱导成骨分化过程中起关键作用的新蛋白。
本研究鉴定出的多种蛋白中,一些是已知的与骨发育有关的蛋白,如Annexin A2和Annexin V, 研究表明,Annexin A2和Annexin V对于启动成骨的矿化过程有着至关重要的作用[6]。Annexin A2与成骨必需的碱性磷酸酶位于细胞膜上的同一脂筏中,Annexin A2能增强碱性磷酸酶的活性,从而有利于成骨的矿化,如果抑制Annexin A2的表达则减弱了成骨的矿化过程[7]。GENETOS等研究发现, Annexin A2和Annexin V可通过调节成骨前体细胞的增殖、分化以及对细胞因子的反应而影响成骨过程[8]。成骨细胞表达Annexin A2,对于移植造血干功能分类中发现具有催化活性和结合功能的蛋白质分别占37%和27%,见图4。细胞在骨髓微环境的黏附、归巢及迁移起到重要的调节作用[9]。研究发现,ERK信号传导通路在成骨分化过程中有重要作用[10,11],而ERK信号通路可激活Annexin A2的表达[12],可能在成骨过程中,成骨诱导剂通过ERK信号通路而作用与Annexin A2,从而使成骨过程顺利进行。
本研究鉴定的蛋白中,一些是与分化发育有关的蛋白,如胞内氯离子通道蛋白4(chloride intracellular channel protein 4,CLIC4),研究表明,CLIC4参与内皮增殖及内皮与上皮的形态建成[13,14],抑制CLIC4的表达将导致细胞的凋亡[15,16],在肌纤维母细胞的分化中,CLIC4通过p38信号通路调节此分化过程[17],而p38信号转导通路在成骨分化中发挥重要的作用[18,19],h MSCs成骨诱导分化过程中,细胞的数量也在不断增加,CLIC4可能有助于细胞增殖以及通过p38信号转导通路而调节h MSCs成骨分化的过程。另外,新生多肽相关复合体 α 多肽的下调表达在h MSCs成骨分化中可能起重要作用,研究表明,caspases能促进成骨分化[20],caspases的激活需要Fas相关死亡域蛋白(fas-associated with death domain protein,FADD)的参与,而新生多肽相关复合体 α 多肽与FADD的结合抑制了FADD的二聚体形成,从而抑制caspases的表达[21],在本试验中,新生多肽相关复合体 α 多肽的表达下调,可能通过调节FADD的二聚体形成、增强caspases的表达进而促进成骨分化过程。对于所鉴定出的蛋白的具体作用机制还有待于进一步的实验研究。
成骨诱导机制 篇6
1材料与方法
1.1一般材料2例健康献髓者同意后各采4～6 ml骨髓。
1.2方法
1.2.1人骨髓MSCs的分离、培养[2]无菌条件下抽骨髓4～6 ml,马上注入离心管中(10 ml离心管中准备2 ml无血清DMEM-肝素液,浓度50 U/ml)将骨髓-DMEM混合液沿管壁缓慢注入预置Percoll分离液的离心管中,骨髓与分离液的比例为1:1,离心20 min(2000 r/min),吸取中间层云雾状细胞层置于另一离心管中,0.9%氯化钠注射液洗涤2次。把得到的骨髓有核细胞进行培养。细胞培养条件:含0.1胎牛血清的DMEM-LG培养基,细胞接种密度为3.0×105 cells/ml。细胞置于37℃,体积分数为0.05的CO2饱和湿度孵箱内培养,接种72 h后首次换液去除未贴壁细胞。以后三四天换液一次。原代细胞汇合后用含0.02%EDTA的胰蛋白酶消化细胞,按1:1比例进行传代接种培养。
1.2.2人骨髓MSCs的鉴定(1)观察形态学:用倒置光学显微镜观察人骨髓MSCs在原代及传代过程中的细胞形态及生长情况。(2)流式细胞仪分析法:取第三代人骨髓MSCs用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化收获细胞,至少2×105个细胞与抗CD29、CD44、CD34、CD45、HLA-DR单克隆抗体室温下反应30 min,PBS洗涤2次,后与FITC标记的二抗避光反应15 min,细胞洗涤后悬浮于PBS中,用流式细胞仪检测MSCs表面是否有上述分子的表达。
1.2.3人骨髓MSCs向成骨细胞的诱导分化取生长良好的第3代人骨髓MSCs,消化后调整细胞数量为3.5×103/孔,接种于96孔培养板,置于37℃,体积分数为0.05的CO2饱和湿度孵箱内培养,24 h细胞大部分贴壁,吸取原培养基。分为3组,每组4孔,每孔200μl,对照组采用基础诱导培养液:地塞米松(10-8 mol/L)、β-甘油磷酸钠(10 mmol/L)、L-抗坏血酸培养(50μg/L);大黄素组采用基础诱导培养液+大黄素(10-6 mol/L)培养;大黄素+rhTGF-β1组:采用基础诱导培养液+大黄素(10-6 mol/L)+rhTGF-β1 (5 ng/ml)培养。每三四天换液1次。
1.2.4鉴定成骨细胞(1)形态学观察:细胞形态及生长情况用倒置光学显微镜观察。(2)四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定人骨髓MSCs增殖能力传代培养于96孔培养板的三组细胞于第4、8、12、16天,在各孔中加入MTT 20μl,置37℃孵箱内培养4 h,加入10%DMSO 150μl终止反应,用酶联免疫检测仪测定各孔在570 nm波长的吸光度A值,计算4孔A值的平均数。(3)测细胞总蛋白质及细胞内ALP活性:传代培养于96孔培养板的三组细胞于第4、8、12、16天,在各孔中加入2%TritonX-100 150μl,4℃冰箱过夜,裂解细胞,分别取50μl测细胞总蛋白质及细胞内ALP活性。最后计算每克蛋白质的ALP活性。
1.3统计学处理所有数据用均数±标准差(±s)表示,使用SPSS 13.0统计软件对数据进行重复测量资料的方差分析,不同组之间两两比较采用SNK法,试验组与对照组之间比较采用Dunnett t检验。
2结果
2.1人骨髓MSCs的形态学特征
2.1.1倒置光学显微镜观察经Percoll分离液分离后培养的骨髓单个核细胞,大部分于48 h内即贴壁。细胞呈圆形有小的胞浆突起,72 h后大多数细胞有胞浆突起,残留的各种类型的血细胞5 d后通过完全换液逐渐除去,1周左右以长梭形细胞为主,胞浆丰富,核大、核染色质细、核仁明显,培养至12～14 d细胞出现90%融合,呈成纤维细胞样形态,胰蛋白酶消化传代的细胞于24 h内完全贴壁,形态与原代细胞相似,人骨髓MSCs增殖迅速,7 d左右达到融合。
2.1.2流式细胞结果CD34、CD45、HLA-DR表达为阴性CD29、CD44表达为阳性。
2.2成骨细胞的形态学特征倒置光学显微镜观察:对照组、大黄素组、大黄素+rhTGF-β1组诱导培养后,对照组细胞增殖速度略低。大黄素组、大黄素+rhTGF-β1组的细胞增殖速度较快。三组细胞均有数个突起,突起的个数及形态各不相同。诱导培养5～7 d后细胞汇合成单层,细胞突起互相连接,并可重叠生长而不发生细胞间的接触抑制现象,重叠生长的细胞逐渐形成细胞结节。
2.3大黄素+rhTGF-β1培养体系对人骨髓MSCs增殖及分化的影响,详见表1。
2.4大黄素+rhTGF-β1培养体系对人骨髓MSCs分化的影响,详见表2。
注:与对照组比较,*P>0.05,#P<0.05,与大黄素组比较#P<0.05
注:与对照组比较,*P<0.05,#P<0.01;与大黄素组比较#P<0.01
3讨论
人骨髓MSCs研究是当今生物医学的热门课题,近年来随着医疗技术的快速发展,人骨髓MSCs被广泛地用于基础研究和临床诊治。包括组织再生和修复、基因治疗、细胞治疗等方面有广阔的应用前景。
人骨髓MSCs分离方法有:密度梯度离心法、贴壁分离筛选法、流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法。本实验结合淋巴细胞密度梯度离心法和贴壁筛选法来分离获取相对较高纯度的人骨髓MSCs。本实验通过流式细胞分析显示,细胞表达骨髓MSCs相对特异性抗原CD44和CD29,而CD34、CD45、HLA-DR阴性,本实验所得结果与Meirelles等[3]报道的骨髓MSCs表面标志CD29、CD44、CD166、CD105等阳性,不表达CD34、CD45、CD11a、CD14等相似,证明所分离培养扩增的细胞确为骨髓MSCs。
体外培养骨髓MSCs使其增殖并向成骨细胞分化,主要依赖于一定的培养条件。因此控制好培养条件就成为体外诱导分化为成骨细胞的关键。本实验分别采用基础诱导培养液、基础诱导培养液+大黄素(10-6 mol/L)、基础诱导培养液+大黄素(10-6 mol/L)+rhTGF-β1 (5 ng/ml)等不同培养体系诱导人骨髓MSCs,比较不同条件对人骨髓MSCs向成骨细胞分化的影响。结果显示:用基础诱导培养液加大黄素和rhTGF～β1培养体系培养的人骨髓MSCs的增殖作用与其他两个培养体系培养的人骨髓MSCs比较均有显著差异。基础诱导培养液加大黄素和rhTGF-βl培养体系培养的人骨髓MSCs的碱性磷酸酶活性与其他两个培养体系培养的人骨髓MSCs比较均有显著差异。综上所述,基础诱导培养液加rhTGF-β(15 ng/ml)和大黄素(10-6 mol/L)培养体系是比较好的成人骨髓MSCs体外诱导为成骨细胞的培养体系。
参考文献
[1]Grove JE,Bruscia E,Krause DS.Plasticity of bone marrow - derived stem cells.Stem Cells,2004,22(4):487 -500.
[2]Majumdar MK.Thiede MA,Mosca JD,et al.Phenotypic and functiona l comparison of cultures of marrow - derived mesenchymal stem cells(MSCs) and stromal cells.J Cell Physiol,1998,176:57 -66.