胶原诱导关节炎

2024-05-11

胶原诱导关节炎（精选9篇）

胶原诱导关节炎篇1

类风湿性关节炎是以慢性、对称性、多滑膜关节炎和关节外病变为主要临床表现, 尚未明确病因的全身性炎症性自身免疫炎性疾病[1]。目前, 类风湿性关节炎的治疗以迅速缓解疼痛症状为主, 但其副作用较强, 有一定的局限性。我国传统中药具有毒副作用小等特点, 在类风湿性关节炎的治疗方面有广泛的应用前景。白藜芦醇 (RES) 是一种多酚类化合物, 其生物学功能主要有抗肿瘤、抗菌消炎、抗氧化、抗自由基等。目前针对RES的研究热点之一是其抗炎作用。本文研究RES对类风湿关节炎是否具有治疗作用, 初步探讨其作用机制。

1 材料与仪器

白藜芦醇 (纯度>80%, 湖南省洪江华光生物有限责任公司, 批号:20130205) ;BCA蛋白定量试剂盒 (Pierce公司) ;牛II型胶原、大鼠TNF-α、IL-6ELISA检测试剂盒 (Sigma公司) ;弗氏不完全佐剂 (美国Sigma公司) 。实验动物:健康雄性4月龄SD大鼠, 体重250~275g, , 由由江江西西中中医医药大学实验动物中心提供, 标准环境饲养, 许可证号SCXK (赣) 2012-0016。

2 方法

2.1 实验分组及给药方案

将SD大鼠随机分为6组:正常组, CIA模型组, RES低剂量组 (20mg·kg-1) 、中剂量组 (40mg·kg-1) 、高剂量组80mg·kg-1) 和阳性对照组 (布洛芬10mg·kg-1) 。各用药组于致炎后第21~35天灌胃给药, 每天1次, 正常组和CIA模型组灌胃给予等容量的0.5%羧甲基纤维素钠。

2.2 大鼠CIA模型制备与评价[3]

牛II胶原500μg溶于0.05mol·L-1醋酸0.2mL中, 与等体积弗氏完全佐剂混合充分, 注射至大鼠尾根部皮下。初次致敏后第21天, 再次大鼠尾根部皮下注射同体积试剂。每日观察关节皮下结节、红肿程度等情况。评价标准:4分:全部足爪肿胀;3分:踝关节以下的足爪肿胀;2分:足趾和趾关节有肿胀;1分:趾关节有红肿;0分:无红肿。

2.3 足爪容积测定及病理检查

足爪仪测定致炎前每只小鼠左后足容积, 自第21天起, 每4天测定1次相应足容积, 肿胀度= (Vt-Vn) /Vn×100%, Vn指模型前足容积, Vt指模型后足容积。第35天处死小鼠后, 剪取左踝关节制病例切片待查。

2.4 血清中炎性因子的检测

第1次免疫后35天麻醉大鼠, 眼底静脉丛取血, 分离取血清, 并按照ELISA试剂盒说明操作, 检测血清中IL-6、TNF-α水平。

2.5 统计学处理

运用SPSS13.0软件进行统计分析, 数据以表示, 组间比较采用t检验, P<0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 RES对大鼠多发性关节炎指数的影响

RES可剂量依赖性地抑制CIA大鼠继发性足肿胀, 其足爪肿胀度明显轻于模型组, 差异具有统计学意义 (0.05或) , 见表1。

3.2 病理切片观察

常规HE染色病理切片显微镜检发现:健康对照组滑膜关节结构完整, 关节软骨表面完整, 腔内无渗出液, 滑膜组织正常;CIA模型组大鼠镜下可见滑膜关节结构破坏, 关节间隙狭窄, 可见炎性细胞浸润, 并且伴有血管翳形成。CIA阳性对照组可见滑膜关节结构较完整, 关节间隙清晰。见图1。

(±s, n=6)

注:与模型组比较, *P<0.05, **P<0.01。

A:健康对照组;B:CIA模型组;C:CIA阳性药物组

3.3 RES对炎性因子表达的影响

经ELISA法检测, 相较于正常组, CIA模型组炎性因子IL-6、TNF-α的表达明显增加, 而RES给药组可呈剂量依赖性地抑制促炎因子的表达, 见表2。

(±s, n=6)

注:与正常组比较, *P<0.05, **P<0.01;与模型组比较, #P<0.05, ##P<0.01。

4 讨论

本研究观察了RES对各实验组大鼠体重的影响。经RES治疗35天后, 正常对照组、CIA模型组、CIA阳性对照组、及RES高、中、低剂量组大鼠平均体重比较发现:各实验组两两比较平均体重均无统计学差异 (P>0.05) , 表明RES对SD大鼠无明显毒副作用。此外, 已经出现关节炎症状的CIA大鼠使用RES处理35天, 其关节炎指数、足爪容积及滑膜组织病理评分与模型组比较明显下降, 与阳性对照药物布洛芬比较, 下降稍缓, 提示RES对CIA大鼠的关节炎有抑制作用, 其作用强度不及布洛芬。本研究首次通过实验动物模型显示RES对CIA大鼠的关节炎有抑制作用, 机制可能与其调节CIA大鼠异常免疫功能有关。

摘要：目的:研究白藜芦醇 (RES) 对大鼠胶原诱导性关节炎 (CIA) 的作用及其机制。方法:建立牛Ⅱ型胶原蛋白大鼠CIA模型, 测定大鼠足爪炎症肿胀度, HE染色对关节组织进行检查, ELISA法检测血清中炎症因子IL-6、TNF-α水平。结果:灌胃给予RES能减轻CIA大鼠的关节炎症状, 降低血清中IL-6、TNF-α水平, 且呈现剂量依赖性趋势 (P<0.05或P<0.01) ;HE检查发现RES可改善局部关节炎症状。结论:RES对CIA大鼠具有治疗作用, 该机制可能与其调节CIA大鼠异常免疫功能有关。

关键词：胶原性关节炎,白藜芦醇,炎症,免疫功能

参考文献

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胶原诱导关节炎篇2

【关键词】类风湿性关节炎；维药野西瓜；CIA大鼠模型；TNF-α

【中图分类号】R59322 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）20-0009-04

类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一种以累积周围关节为主的多系统慢性炎症性自身免疫疾病，可导致不可逆的关节软骨和骨破坏，甚至关节畸形和残疾[1]。RA的发病机制至今仍未证实，近年来研究显示RA的发病机制可能与感染、遗传和内分泌等有关，但临床上依然缺乏特异性治疗措施，尚无治愈方法。维药野西瓜（Capparis Spinosal）广泛分布于新疆天山南北，其为新疆维吾尔医治疗类风湿性关节炎、痛风及疮毒等疾病的外敷用药，具有祛风除湿，止痛消痛的作用。研究通过构建大鼠Ⅱ型胶原诱导型关节炎模型（Type Ⅱ Collagen Induced Arthritis，CIA），观察维药野西瓜外敷法对CIA型关节炎大鼠左足踝关节肿胀程度、组织病理、细胞因子TNF-α在血清与组织中的表达，对维药野西瓜抗胶原型关节炎大鼠模型的效果及作用机制进行初步探讨。

1 仪器与材料

11 动物清洁级雌性Wistar大鼠40只，7～9周龄，体重（200±15）g，由新疆医科大学实验动物中心提供。

12 仪器游标卡尺（最小刻度为02mm，上海精密仪器厂）； Labsystems Dragon wellscanMK3酶标仪。

13 材料维药野西瓜（新疆新特药有限公司提供，新疆医科大学药学院生药系鉴定）；雷公藤多甙片（批号：140701，上海复旦复华药业有限公司）；酸溶性型牛Ⅱ胶原（美国Sigma公司）；弗氏完全佐剂（Freunds Complete Adjuvent，FCA，美国Sigma公司）；ELISA大鼠TNF-α定量试剂盒（ebioscience公司）；anti-TNF-α抗体（武汉博士德公司）；DAB显色试剂盒（北京金杉公司）。

2 方法

21 动物模型的分组、构建及给药将40只Wistar雌性大鼠随机分为4组：空白对照组（NS）、模型组、雷公藤甙治疗组及野西瓜治疗组。根据参考文献[2]，配制IFA：完全佐剂（FCA）石蜡=1∶[KG-*3/5]2，造模前模型组将酸溶性型牛Ⅱ胶原与IFA等体积进行混合、乳化。在大鼠左侧后足跖肉垫处皮内注射 01mL混悬乳剂致敏，背部皮内注射005mL混悬乳剂致敏，每天测量足趾肿胀程度，7d后在鼠尾根部注射相同乳剂加强1次。正常对照组在相同的部位注射 01mL灭菌石蜡。致敏2周后，成功建立CIA型关节炎大鼠模型，参照关节炎指数评分标准[3]对模型复制效果进行评估，评分达6分以上的大鼠用于实验。阳性对照组给予雷公藤甙（001mg/kg）灌胃治疗；治疗组为维药野西瓜粗提取物加白酒及蛋清混匀（45°白酒∶[KG-*3/5]蛋清=1∶[KG-*3/5]2，5%维药野西瓜打粉粗提物），用纱布包裹于大鼠左后足踝进行治疗，隔日一次换药；正常对照组及模型组以生理盐水灌胃，每日一次。

22 取材治疗25d后取材，处死大鼠，采取大鼠腹主动脉采血，将其左右足踝关节的滑膜组织用10%甲醛溶液进行固定。

23 观察检测用游标卡尺每日测量大鼠左后足踝关节的上下径并记录数据，观察其肿胀程度（精确至02mm）；同时镜下观察大鼠左后足踝关节滑膜组织病理切片（HE染色）变化，ELISA法观察血清中TNF-α的变化，免疫组化法观察足踝关节组织TNF-α的表达水平。

24 免疫组化结果评分采取每张切片随机观察具有代表性的10个高倍镜视野，根据胞膜胞质染色程度及染色细胞百分比进行评分：基本不着色者为0分，着色淡者为1分，着色适中者为2分，着色深者为3分；着色细胞占计数细胞百分比≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，>50%为3分。将每张切片着色程度得分与着色细胞百分比得分相乘为其最后得分，0～1分为阴性（-），2～3分为弱阳性（+），≥4分为强阳性（++）。

25 统计学方法采用统计软件SPSS170进行数据分析，用均数加减标准差（x[TX-*3]±s）表示，计量资料经方差齐性检验，方差齐则采用方差分析的方法，两两比较采用SNK法；等级资料进行Kruskal-Wallis H test秩和检验；方差不齐，则采用秩和检验。P<005表示差异有统计学意义。

3 结果

31 对CIA大鼠足踝关节肿胀程度的影响维药野西瓜对CIA大鼠踝关节的急性炎症反应有较好抑制作用。与空白对照组比较，造模后第14天（药前）各组踝关节均明显肿胀（P<001），表明造模成功。用药第25天后，雷公藤甙组及维药野西瓜对大鼠右足踝关节肿胀均有明显的缓解作用（P<005）。

32 组织病理切片观察 HE染色组织切片镜下可见，正常组大鼠关节组织无淋巴细胞浸润及毛细血管的增生；CIA大鼠模型组可见到淋巴细胞浸润，同时滑膜细胞增殖，毛细血管的增生，软骨组织破坏严重；而雷公藤甙治疗组和维药野西瓜外敷组镜下观察可见软骨组织破坏减轻，淋巴细胞浸润明显改善。见图1～4。

33 外周血中TNF-α含量变化由图5可知，与正常对照组外周血中TNF-α含量（518±101）ng/mL比较，模型组大鼠外周血中TNF-α含量（608±135）ng/mL明显升高，差异有统计学意义（t=-2582，P<005）。雷公藤甙治疗组大鼠外周血中TNF-α含量为（475±74）ng/mL、维药野西瓜治疗组大鼠外周血中TNF-α含量为（439±26）ng/mL，均明显低于模型组，差异有统计学意义（t值分别为-3265、-2601，P<005）。

34 足踝关节组织中TNF-α表达水平变化由图6可见，CIA关节炎大鼠模型组足踝关节组织中TNF-α表达明显升高（Z=-300，P<005）。与模型组相比，雷公藤甙治疗组及维药野西瓜治疗组大鼠踝关节组织中TNF-α表达水平明显下降（Z值分别为-2449、-2362，P<005）。

4 讨论

类风湿性关节炎的临床表现主要为关节滑膜慢性炎症反应，该病具有诊断不易，易反复发作的特点。治疗不佳的患者可随着病情发展，逐渐侵害关节，直至关节畸形，甚至功能丧失，因此早期干预有利于延缓病情进展，对改善患者预后具有重要意义[2]。RA从组织病理变化上而言可能涉及关节腔滑膜炎症、细胞增生、炎性细胞浸润、肉芽肿形成、软骨及骨组织破坏等多个环节，目前尚无特效治疗措施[3]。

维吾尔医药用植物野西瓜，因多分布于新疆南北坡地而最早报道于《新疆中草药》，其维文名为：开派、菠里科果，在沙特阿拉伯做为传统药物常被用作治疗风湿病、关节炎和痛风等；在维吾尔医学中，野西瓜被认为具有祛风除湿、散寒除湿、消肿止痛的功效，常被作为治疗类风湿性关节炎的药物。近年来，野西瓜经过粗提取后的临床应用已引起国内外研究者的关注。有研究已表明[4]，维药野西瓜可缓解佐剂型关节炎大鼠的关节肿胀，降低外周炎性因子的水平。Ⅱ型胶原诱导型关节炎模型（type Ⅱ collagen induced arthritis）由Trentham等于1977年首次建立，并随研究的不断深入和相关实验的大量重复，目前已成为公认的研究人类类风湿关节炎的经典模型[5]。CIA模型在病证表现性更加的稳定、持久[6]，并更接近于人类的RA模型，具有研究的代表性和经典性。实验依据参考文献[2]，免疫2周后成功构建CIA大鼠模型。参照关节炎指数评分标准[7]对模型的复制效果进行评估，评分达6分以上。结果显示：与对照组比较，造模后第2周（给药前）各组踝关节均明显肿胀，CIA大鼠模型制备较为成功（P<001）。药物干预第25天时，模型组CIA大鼠足踝关节直径为（1005±05）mm，雷公藤治疗组及野西瓜治疗组大鼠足踝关节的肿胀程度明显减轻，分别为（933±08）mm、（872±07）mm，差异具有统计学意义（P<005）。从组织切片上也可以看出，野西瓜治疗组大鼠软骨组织破坏减轻，淋巴细胞浸润得到明显改善。

肿瘤坏死因子（TNF-α）通常由单核细胞及巨噬细胞分泌。做为主要前炎症因子，TNF-α对关节实质细胞和内皮细胞具有广泛作用，在形成RA炎症、新生血管生成和骨质减少过程中起着重要作用[8]：TNF-α可促进趋化因子的合成和分泌、增加细胞黏附分子的表达，从而加速淋巴细胞和单核细胞的募集[9]。TNF-α也可促进提呈抗原肽的MHCⅡ类分子表达，通过促进对自身抗原的反应激活T细胞，继而诱导结缔组织细胞，包括滑膜成纤维细胞和软骨细胞产生前列腺素E2（PGE2）和基质金属蛋白酶（MMP），致滑膜炎症和增生、软骨破坏[10]。TNF-α还可促进 RA滑膜细胞的凋亡[10]。有研究显示RA患者血和病变关节滑液中 TNF-α水平随同期关节炎活动指数的改善而显著下降，使用抗 TNF-α单抗治疗后，RA患者病变关节内的滑膜炎和软骨破坏得以抑制，患者症状体征明显减轻[10]。实验中利用ELISA实验及免疫组化实验，试图从血清学水平及组织学水平上分别对CIA大鼠血清及组织中TNF-α的表达情况进行检测。结果显示，药物处理25天后，正常对照组血清中TNF-α含量为（518±101）ng/mL，CIA模型组大鼠血清中TNF-α为（608±135）ng/mL，与正常组相比明显升高，且差异有统计学意义（P<005）；雷公藤甙治疗组大鼠外周血中TNF-α为（475±74）ng/mL，维药野西瓜治疗组为（439±26）ng/mL，与CIA模型组相比，两者均明显降低（P<005），但两者之间差异无统计学意义。结果提示维药野西瓜可通过降低CIA大鼠血清中TNF-α水平起到抗RA的作用。免疫组化技术是利用抗原抗体特异性反应对组织细胞中的特定抗原（或抗体）进行定位和定性的一种染色技术，具有直观的特点。免疫组化实验结果显示CIA模型组大鼠在关节滑膜组织上TNF-α表达明显增高（P<005）；与模型组相比，雷公藤甙治疗组及维药野西瓜治疗组大鼠踝关节组织中TNF-α表达水平明显下降（P<005）。ELISA及免疫组化实验结果提示抑制血清及足踝关节组织中TNF-α的表达可能是维药野西瓜抗类风湿性关节炎的作用机制之一。

综上所述，维药野西瓜可有效减轻CIA大鼠模型的足趾肿胀程度，缓解病理损害，其机制可能与降低血清及组织中的TNF-α水平有关。RA 的发病机制目前尚未明确，临床治疗手段较局限，通过现代的研究手段和方法运用，来发掘特色维药的独特治疗效果，有利于进一步研究并阐明维药野西瓜在抗类风湿关节炎中的作用及机制，以期在类风湿性关节炎的研究及诊治上取得新进展。

参考文献

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胶原诱导关节炎篇3

关键词：金雀异黄素,滑膜微血管密度,基质金属蛋白酶

风湿性关节炎(RA)的主要病理特点是在炎性环境中受各种炎性细胞因子如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)和血管内皮生长因子(VEGF)的刺激,关节成纤维样滑膜细胞(FLS)显著增殖和微血管新生[1,2],并进一步产生基质金属蛋白酶(MMPs)、蛋白溶解酶类及前列腺素等物质,破坏关节软骨及骨结构,从而导致关节畸形及功能障碍[3]。如能在发病早期及时进行有效的干预,则对RA的病情控制具有重要意义。笔者前期工作发现,金雀异黄素(Gen)能够调节RA成纤维样滑膜细胞凋亡蛋白的表达,抑制其增殖,并能降低Ⅱ型胶原诱导型关节炎(CIA)大鼠成纤维样滑膜细胞分泌IL-1β、TNF-α等炎性细胞因子[4,5,6]。本研究应用体内实验进一步观察Gen对CIA大鼠发病的预防作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用南京医科大学实验动物中心提供的雌性SD大鼠(清洁级),4周龄,体重为(120±20)g,动物许可证号:SCXK(苏)2007-0001。

1.2 实验材料

鸡Ⅱ型胶原、完全弗氏佐剂、二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司;DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司;Gen纯品(纯度≥99%)购于上海融禾医药科技发展有限公司;IL-1、TNF-α、VEGF、MMP-1、MMP-2、MMP-9抗体,辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗购于美国CST公司;其余试剂均为进口分装或市售分析纯。

1.3 药物的配制

参照文献[4]配制Ⅱ型胶原乳剂及Gen混悬液。

1.4 实验方法

1.4.1 动物模型的建立

1.4.1. 1 实验动物分组及处理

24只大鼠随机分成三组:空白对照组、模型对照组及Gen预防用药组,每组8只大鼠。Gen预防用药组大鼠在造模前1周开始每天胃内灌注Gen混悬液1 m L。空白对照组以及模型对照组大鼠每天灌注等量羧甲基纤维素钠。

1.4.1. 2 造模

模型对照组和Gen预防用药组大鼠左后足趾皮下注射0.1 m LⅡ型胶原乳剂,并于3周后在尾根部进行多点加强注射,空白对照组注射等量的注射用水。

1.4.2 动物模型的评价

关节炎指数(AI)评分及关节肿胀度测定,参照文献[4]。

1.4.3 免疫组化检测

在给药4周后处死所有大鼠,常规病理学及免疫组化法检测滑膜炎症及血管新生,参照文献[7]用Mouse Anti-CD31标记滑膜微血管,进行滑膜微血管密度(MVD)测定。

1.4.4 免疫印迹(Western blot)法检测

造模4周后处死大鼠,心脏采血5 m L,分离血清,参照文献[8]检测Gen预防性用药后CIA大鼠血清炎性因子(IL-1β、TNF-α)、血管新生相关调节因子(VEGF、MMP-1、MMP-2、MMP-9)表达的变化。每个实验样本重复3次。

1.5 统计学方法

采用SPSS 10.0统计学软件进行数据分析,计量资料数据用均数±标准差(±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠造模后一般情况

造模组大鼠造模后当天后肢注射部位开始出现肢体肿胀,随后发现对侧和前肢关节也出现了肿胀,以后肢关节肿胀更为明显,部分大鼠关节表面皮肤充血且有关节活动障碍。造模组大鼠与空白对照组大鼠相比,精神萎靡,进食减少,运动迟缓,体重增长减慢,毛发缺少光泽。

2.2 三组大鼠关节炎指数比较

AI评分结果显示,空白对照组大鼠无关节炎性反应,从造模后1周开始,模型对照组的AI评分均明显高于空白对照组(P<0.05);从第3周开始Gen预防用药组AI评分低于模型对照组(P<0.05),见图1。分析足肢肿胀程度结果发现,CIA大鼠关节肿胀于造模后开始增加,模型对照组于第3周达到高峰,Gen预防用药组于第2周达到高峰,以后逐渐降低。见图2。

与空白对照组比较,·P<0.05;与模型对照组比较,*P<0.05

2.3 各组大鼠血清中IL-1β、TNF-α表达比较

模型对照组大鼠IL-1β、TNF-α的表达均明显高于正常对照组(P<0.05),Gen预防用药组IL-1β、TNF-α的表达均明显低于模型对照组(P<0.05),但仍高于空白对照组大鼠(P<0.05)。见图3。

与空白对照组比较,*P<0.05;与模型对照组比较,·P<0.05

2.4 各组大鼠血清中VEGF表达比较

研究发现,与空白对照组相比,模型对照组大鼠VEGF表达明显升高(P<0.05),Gen能明显抑制CIA大鼠血清中VEGF表达(P<0.05),但仍高于空白对照组。见图4。

与空白对照组比较,*P<0.05;与模型对照组比较,·P<0.05

2.5 各组大鼠关节滑膜免疫组化结果及MVD比较

采用Mouse Anti-CD31标记关节滑膜组织中的内皮细胞,计数大鼠关节滑膜组织中单位密度的微血管数(图5~6)。统计结果显示,模型对照组大鼠关节滑膜中的微血管数目明显多于空白对照组(P<0.05);Gen预防用药组大鼠的关节滑膜微血管数目仍高于空白对照组,但明显低于模型对照组(P<0.05)。

与空白对照组比较,*P<0.05;与模型对照组比较,▲P<0.05

2.6 各组大鼠血清中MMP-1、MMP-2、MMP-9表达比较

研究发现,与空白对照组相比,模型对照组大鼠MMP-1、MMP-2、MMP-9的表达均明显升高(P<0.05);而Gen预防用药组大鼠血清中MMP-1、MMP-2、MMP-9的表达水平明显低于模型对照组,但仍高于空白对照组(P<0.05)。见图7。

3 讨论

Gen是大豆中生物活性最强的异黄酮之一,现已证实Gen可用于预防和治疗多种疾病[9,10,11,12]。TNF-α、IL-1β是RA发生的重要炎性细胞因子。TNF-α和IL-1β相互协同下促进RA关节滑膜组织增生;诱导关节成纤维样滑膜细胞和软骨细胞产生胶原酶和前列腺素E2;增加血管内皮细胞黏附分子表达,促使血管生成;影响糖蛋白的代谢,抑制骨形成,最终导致关节结构破坏[13]。本研究发现,模型对照组大鼠与空白对照组相比,其血清中IL-1β、TNF-α的表达明显增高(P<0.05);预防性给予Gen干预后,IL-1β、TNF-α表达明显降低,但并未恢复到正常水平,提示Gen能够通过部分调节CIA大鼠体内炎症因子的表达而预防RA的发病。

血管新生失去控制是RA滑膜增生以及关节软骨侵蚀的主要因素。研究表明,VEGF能促进新生血管的生成[14]。Yi等[15]研究证实,RA患者血清、关节滑膜组织和滑膜液中VEGF含量与疾病活动度具有相关性。RA病程中VEGF可诱导关节滑膜毛细血管内皮细胞增殖和迁移,引起关节滑膜血管新生及血管翳形成,并能通过增加毛细血管的通透性而促进炎性物质的渗出。新生血管形成的过程中首先是毛细血管内皮下基底膜被MMPs等物质降解,提示MMP-1、MMP-2、MMP-9在促进RA关节滑膜血管新生的过程中发挥重要作用[16,17,18]。关节滑液及滑膜组织中过量表达的MMP-1、MMP-2、MMP-9可通过降解关节软骨成分直接参与RA关节软骨基质的分解,最终导致骨结构破坏[19]。Sbardella等[20]研究表明,测定血清中MMPs含量可以间接反映关节滑液中MMPs的变化情况。本实验结果显示:Gen预防用药组大鼠滑膜组织中的MVD明显多于空白对照组(P<0.05),但与模型对照组比明显减少(P<0.05);Gen预防性干预后,可以明显抑制CIA大鼠血清中VEGF表达(P<0.05);且CIA大鼠血清中MMP-1、MMP-2、MMP-9表达水平明显减低(P<0.05)。这表明Gen可以通过下调CIA大鼠体内的VEGF、MMP-1、MMP-2、MMP-9的表达抑制关节滑膜血管新生,并可直接阻止关节软骨及骨的破坏以达到防止RA的发病的目的。

与空白对照组比较,*P<0.05;与模型对照组比较,·P<0.05

胶原诱导关节炎篇4

【关键词】热痹康汤；关节炎，胶原诱导性；基质金属蛋白酶-3；实验研究；动物；大鼠

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种病因尚不明确的主要累及关节，以慢性、对称性多关节炎为突出临床表现的全身性自身免疫疾病。活动期的RA患者血清中基质金属蛋白酶-3（matrix metalloproteinase-3，MMP-3）水平明显升高，提示MMP-3在RA的发病中起着重要的作用。本实验采用牛Ⅱ型胶原蛋白（CⅡ）和弗氏不完全佐剂诱导胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠模型，观察热痹康汤对大鼠血清MMP-3的影响，探讨热痹康汤治疗RA的作用机理。

1 实验材料

1.1 实验动物雌性Wistar大鼠50只，体重（100±10） g，购于广西中医药大学实验动物中心。

1.2 实验试剂弗氏不完全佐剂、牛Ⅱ型胶原蛋白（由美国Chondrex公司生产）；MMP-3检测试剂盒（由南京建成生物工程研究所生产）。

1.3 实验药品热痹康汤（由广西中医药大学附属瑞康医院新药研发中心制备提供），药物组成：秦艽15 g、防风10 g、桂枝10 g、威灵仙10 g、制川乌10 g、地龙10 g、桑枝15 g、葛根15 g、忍冬藤15 g、青风藤15 g、黄柏20 g、苍术15 g；甲氨蝶呤片【由上海医药（集团）有限公司信谊制药总厂生产，生产批号20070121】。

2 方法

2.1 动物造模及分组 50只Wistar大鼠适应性喂养7天后，造模方法参照文献[1]方法进行：在无菌条件下，用0.1 mol·L-1冰醋酸充分溶解牛II型胶原蛋白（浓度为4 mg·L-1），置冰箱4 ℃过夜后，再与等体积弗氏不完全佐剂（1 mg·mL-1）混合、震荡至充分乳化，制成CⅡ乳剂，置冰箱4 ℃保存备用。实验时于每只大鼠颈、背部多点皮内注射CⅡ乳剂0.25 ml，14天后再次注射（方法和剂量同上）。造模成功后（评分4分以上）随机分为模型组、甲氨蝶呤组、热痹康汤高剂量组、热痹康汤中剂量组、热痹康汤低剂量组共5组，每组10只。

2.2 给药模型组给予生理盐水2 ml·（100 g）-1灌服，每天1次；甲氨蝶呤组予灌服甲氨蝶呤药液2.7 mg·kg-1，每只约0.405 mg，每周1次；热痹康汤各剂量组，分别灌服热痹康汤（含生药16 g·kg-1、

8 g·kg-1、4 g·kg-1）2 ml·（100g）-1，每天2次。共治疗28天。

2.3 项目检测

2.3.1 关节肿胀评分参照有关文献[2]采用0～4级关节评分法。0分：无关节炎；1分：小趾关节轻度肿胀；2分：小趾关节和足跖肿胀；3分：踝关节以下的足爪肿胀；4分：包括踝关节在内全部关节肿胀；关节指数积分越高，关节症状越严重。评分4分以上为造模成功。

2.3.2 MMP-3检测治疗结束后，腹腔注射水合氯醛将各组大鼠麻醉，腹主股动脉抽血，分离血清并放置冰箱-20 ℃保存备测。MMP-3的测定采用ELISA試剂盒，并按试剂盒说明进行检测。

2.4 统计学方法采用SPSS17.0软件进行数据分析，所有数据以表示，不同组间用方差分析及t检验。

3 结果

治疗28天后热痹康汤各剂量组MMP-3水平均有降低，与模型组相比，差异有统计学意义

（P < 0.05）；热痹康汤高、中剂量组与甲氨蝶呤组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

4 讨论

RA是一种系统性、全身性的免疫性疾病。其基本病理改变是滑膜炎，出现滑膜炎症、增厚、血管翳形成、软骨及软骨下骨质破坏，最终导致关节畸形。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是一组在结构上具有极大同源性，能降解几乎所有细胞外基质成分的酶，主要参与组织重建与修复、炎症反应、伤口愈合、软骨基质的降解和骨吸收等，在关节炎等病理状态下，使基质发生不可逆的降解以及关节内炎症反应逐步加重，MMPs的异常表达可促进RA的发生和发展。

MMP-3是金属蛋白酶类的主要成员之一，是导致软骨降解最重要的蛋白酶，它在滑膜、软骨和软骨下骨的细胞外间质的降解中有着重要的作用，影响软骨的降解，使软骨基质崩解，从而导致软骨的破坏[3]。MMP-3能激活胶原蛋白酶、间质胶原酶及进一步的酶链反应，作用于软骨引起骨组织的破坏。同时，炎性浸润的滑膜细胞滑膜绒毛样生长形成血管翳；血管翳沿软骨表面逐渐侵入与软骨紧密黏连形成软骨-血管翳，促使软骨变性和进一步破坏[4]。国外有研究表明，在早期的RA患者中，外周血清MMP-3水平较正常人明显升高，并且与ESR、CRP、放射学评分、关节功能评定呈正相关[5，6]。

MMP-3在RA关节破坏中发挥着极其重要的作用，它是RA早期疾病活动的一个重要预测因子和炎症标志物，可作为反映病情活动指标以及滑膜损害和预后的预测指标。

热痹康汤是庞学丰教授治疗类风湿关节炎的经验方，具有清热利湿、除痹止痛之功效。我们用热痹康胶囊治疗湿热型RA患者发现，该药能明显降低患者的C-反应蛋白、类风湿因子、血沉、免疫球蛋白等实验室检测指标，能明显改善患者的临床症状以及关节功能，无明显毒副作用[7]。动物实验表明，热痹康汤能降低CIA大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-6的水平，升高IL-4的水平[8，9]。本研究结果表明，热痹康汤能降低CIA大鼠血清MMP-3的水平，能减轻关节滑膜的炎症，是其治疗类风湿关节炎的作用机理之一。

nlc202309030555

5 参考文献

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[3]Cawston T，Billington C，Cleaver C，et al.The regulation of MMPs and TIMPs in cartilage turnover[J].Ann N Y Acad Sci，1999，878（1）：120-129.

[4]Ainola MM，Mandelin JA，Liljestrom MP，et al.Pannus invasion and cartilage degradation in rheumatoid arthritis：Involvement of MMP-3 and interleukin-1β[J].Clin Exp Rheum，2005，23（5）：644-650.

[5]Yamanaka H，Matsuda Y，Tanaka M，et al. Serum matrix metalloproteinase 3 as a predictor of the degree of joint destruction during the six month after measurement， in patient with early rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheum，2000，43（4）：852-858.

[6]YoungMin S，Cawston T，MarshallN，et al.Biomarkers predict radiographic progression in early rheumatoid arthritis and perform well compared with traditional markers[J].Arthritis Rheum，2007，56（10）：3236-3247.

[7]庞学丰，蒙宇华.热痹康胶囊治疗湿热型类风湿关节炎86例疗效观察[J].广州中医药大学学报，2003，20（2）：106-108.

[8]劉欢，庞学丰，吴燕红，等.热痹康汤对胶原诱导性关节炎大鼠血清IL-1β及IL-4的影响[J].江西中医学院学报，2012，24（1）：55-57.

[9]庞学丰，龙朝阳，刘欢，等.热痹康汤对胶原诱导性关节炎大鼠血清TNF-α及IL-6的影响[J].广西中医药，2012，35（2）：51-52.

胶原诱导关节炎篇5

1 材料与方法

1.1 实验动物

6~8 周龄雌性BALB/c小鼠30 只,SPF级,购于武汉大学动物实验中心(合格证号:No.42000500006615),饲养于武汉大学人民医院动物房。

1.2 主要试剂及仪器

鸡Ⅱ型胶原(CⅡ)、完全弗氏佐剂(CFA)、冰醋酸购于Sigma公司,重组小鼠Gal-9 和抗小鼠Tim-3 单抗(Tim-3 m Ab)购于Pepro Tech公司,白介素(IL)-10和转化生长因子-β(TGF-β)酶联免疫吸附法试剂盒购于R&D公司,PCR仪购于北京东胜公司。

1.3 小鼠CIA造模及分组

将鸡Ⅱ型胶原(CII)加入0.1 mol/L冰醋酸,冰浴中搅拌溶解, 配成2 mg/m L溶液,4℃冰箱过夜后,将CⅡ溶液与完全福氏佐剂(CFA)按1∶1 等体积混合制成乳化剂;取CⅡ乳化剂50 μL,于小鼠背部及尾根部多点皮下注射,1 周后按上述方法、相同剂量加强免疫1 次;初次免疫后第6 天,即加强免疫的前1 天,按照尾静脉输注不同药物进行分组: ①激活组(n=10): 尾静脉输注含Gal-9 (5 μg/m L) 的PBS 100 μL;②阻断组(n=10):尾静脉输注含Tim-3 m Ab(10 μg/m L)的PBS 100 μL;③对照组(n=10):尾静脉输注PBS100 μL。

1.4 关节炎指数(arthritic index,AI)

采用0~4 级评分法[10],0 分:无红肿;1 分:趾关节轻度肿胀;2 分:趾关节及足跖肿胀;3 分:踝关节以下足爪肿胀;4 分:包括踝关节在内全部足爪肿胀。AI为4 只足爪的累计评分,数值越高,代表关节炎越严重,初次免疫后每周记录1 次,共记录4 次。

1.5 酶联免疫吸附试验(ELISA)法测抗炎因子

初次免疫后第28 天对每只小鼠眼眶取血0.8~1.0 m L , 全血37℃ 恒温箱静置1 h , 放入离心管,2000 r/min离心15 min, 吸取上清, 按照ELISA试剂盒说明测IL-10 和TGF-β 浓度。

1.6 PCR测Th17和Treg标志性蛋白ROR-γt、Fox P3

1.6.1引物

由Pub Med基因库获取全基因序列,由北京擎科新业公司设计并合成。ROR-γt m RNA上游引物:5'-CATTCAGTATGTGGTGGAGTTTGC-3',下游引物:5'-GACTA GGACGACTTCCATTGCTC-3',扩增片段为109 bp;Fox P3 m RNA上游引物:5'-GTACAC-CC AGGAAAGACAGCAAC-3',下游引物:5'-CTC-GAAGACCTTCTCACAACCA-3',扩增片段为104 bp;以持家基因β-actin为内参,上游引物:5'-CAC-GATGGAGGGGCCGGACTCATC-3',下游引物:5'-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3',扩增片段为240 bp。

1.6.2 RT-PCR

造模后第28天颈椎脱臼法处死小鼠,取左前足踝关节滑膜,Trizol法提取组织总RNA,以Gene Copoeia公司逆转录试剂盒合成c DNA;PCR扩增后取5μL产物加入1μL DNA上样缓冲液,2%琼脂糖凝胶电泳检测样品,每份样品行3次重复检测,Quantity One 4.62图像分析软件行光密度值测定,ROR-γt和Fox P3的表达量以目的片段与内参β-actin的相对比值表示。

1.7 统计学方法

采用统计软件SPSS 19.0 对数据进行分析, 正态分布计量资料以均数±标准差(±s)表示,多组间比较采用方差分析,两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示,采用 χ2检验。以P < 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AI情况

三组小鼠初次免疫后, 四只足爪均出现轻度肿胀,局限于趾间关节,药物干预及加强免疫后,激活组肿胀加重不明显,阻断组关节肿胀最严重,出现强直畸形,对照组介于二者之间。初次免疫后第28 天,即加强免疫后第21 天,激活组、阻断组、对照组AI值分别为(7.12±1.53)、(13.82±2.12)、(10.88±1.84)分,差异有高度统计学意义(P < 0.01)。见图1。

与对照组比较,**P<0.01

2.2 抗炎因子情况

ELISA检测小鼠血清IL-10 和TGF-β 浓度,激活组IL-10、TGF-β 分别为(12.88±2.23)、(27.61±4.52)ng/L,阻断组为(4.26±1.79)、(12.35±2.42)ng/L, 对照组为(7.49±1.70)、(21.33±2.07)ng/L,激活组浓度均明显高于对照组,阻断组均明显低于对照组,差异有高度统计学意义(P < 0.01)。见图2。

与对照组比较,**P<0.01;IL-10:白介素-10;TGF-β:转化生长因子-β

2.3 Th17 和Treg标志物情况

2.3.1 PCR

RT-PCR扩增ROR-γt和Fox P3的电泳结果显示,无引物二聚体,无非特异扩增,测序后结果与基因库相比较,确定为所需目的基因。见图3。

2.3.2 PCR光密度值测定

三组小鼠滑膜组织ROR-γt m RNA的相对表达量:激活组为(0.265±0.074),阻断组为(0.972±0.143),对照组为(0.536±0.125),激活组较对照组降低(P<0.01),阻断组较对照组增高(P<0.01);Fox P3 m RNA相对表达量:激活组为(1.203±0.228),阻断组为(0.135±0.026),对照组为(0.419±0.102),激活组较对照组增高(P < 0.01),阻断组较对照组降低(P < 0.01)。见表1。

a:激活组;b:阻断组;c:对照组

注:与对照组比较,**P < 0.01

3 讨论

RA是以多关节受累为主要表现的自身免疫病,滑膜组织分泌大量细胞因子,募集免疫细胞[11]; 各种炎症因子与细胞互相激活,导致RA不断进展,迁延不愈[12]。幼稚T细胞(naive T cell,Tn)受到诱导后分化为Th1、Th2 和Th17,其中Th17 在介导自身免疫性炎症的过程中发挥重要作用[13]。研究发现,Th17 主要分泌IL-17,起到募集炎症细胞的作用,而ROR-γt是Th17的特异性标志物,在自身免疫疾病中均发现IL-17 和ROR-γt表达量升高,与Th17 活动增强有关[12,13]。 Treg由Tn分化而来,是负性免疫调节细胞,具有抗炎和抑制自身免疫功能,Fox P3 是其特异性标志物[14]。由此可见,Th17 与Treg是调控自身免疫反应的两种关键细胞,Th17/Treg平衡对于维持免疫稳态意义重大。

Tim-3 为近年新发现的受体分子,主要表达于Th1、Th17、Treg等细胞,具有调控细胞增殖、分化及凋亡的作用[4,15]。在诸多自身免疫病的动物模型中,当Tim-3与其天然配体Gal-9 结合后,激活的Gal-9/Tim-3 通路可诱导免疫耐受,缓解炎性反应[5,6,7,8,15]。作为公认理想的RA动物模型,小鼠CIA成功模拟了RA的病理生理特点和免疫学微环境[16],为探讨Gal-9/Tim-3 通路对RA的影响提供必需条件。本实验发现,阻断组小鼠关节病变较对照组严重, 而激活组较对照组减轻,证明阻断Gal-9/Tim-3 通路会加重CIA炎症,激活该通路则可有效遏制关节炎进展。有文献报道,Gal-9/Tim-3 通路使抗炎因子IL-10 和TGF-β 表达增加,拮抗炎症介质作用, 减轻组织病变[9,17]; 本实验以ELISA法测三组小鼠血清IL-10 和TGF-β 浓度, 证实了该结论。关于抗炎介质表达增加的途径,很可能是活化的Tim-3 分子多途径诱导Th17 凋亡, 激活Treg,触发了强大的免疫耐受效应[14,18]。本实验中,激活组滑膜组织ROR-γt表达下降,Fox P3 表达上升,而阻断组ROR-γt上升,Fox P3 下降, 说明激活Gal-9/Tim-3 通路确实能恢复Th17/Treg平衡, 重建免疫稳态。总之,本实验发现激活Gal-9/Tim-3 通路对CIA具有缓解作用, 并证实其机制很可能是通过恢复Th17/Treg平衡,上调抗炎因子表达,从而实现自身免疫耐受,这为人类RA的治疗提供了新的靶点。

摘要：目的探讨激活或阻断Gal-9/Tim-3信号通路对小鼠胶原诱导性关节炎的影响及其机制。方法 6~8周龄雌性BALB/c小鼠30只,建立Ⅱ型胶原诱导性关节炎模型,造模后第7天加强免疫。于加强免疫前1 d随机分为激活组、阻断组、对照组,每组10只,分别经尾静脉输注半乳糖凝集素-9(Gal-9)、阻断剂Tim-3单抗、PBS。造模后28d观察三组小鼠踝关节变形程度,记录关节炎指数,ELISA法检测血清抗炎因子白介素-10(IL-10)、转化生长因子β(TGF-β)水平,RT-PCR检测踝关节滑膜组织辅助性T细胞(Th17)、调节性T细胞(Treg)标志性蛋白ROR-γt、Fox P3表达量。结果加强免疫后,三组小鼠出现不同程度关节变形,造模后第28天关节炎指数:激活组为(7.12±1.53)分、阻断组为(13.82±2.12)分、对照组为(10.88±1.84)分,差异有高度统计学意义(P<0.01);血清IL-10、TGF-β水平:激活组[(12.88±2.23)、(27.61±4.52)ng/L]明显高于对照组[(7.49±1.70)、(21.33±2.07)ng/L](P<0.01),阻断组[(4.26±1.79)、(12.35±2.42)ng/L]明显低于对照组(P<0.01);RT-PCR结果显示:ROR-γt m RNA在滑膜组织的表达情况激活组明显低于对照组(P<0.01),阻断组明显高于对照组(P<0.01);Fox P3 m RNA表达情况激活组明显高于对照组(P<0.01),阻断组明显低于对照组(P<0.01)。结论激活Gal-9/Tim-3通路可缓解小鼠胶原诱导性关节炎,阻断该通路则加重炎性反应,作用机制可能与该通路抑制Th17,活化Treg有关。

胶原诱导关节炎篇6

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要试剂

1.1.1实验动物与分组

健康清洁级Wistar雄性大鼠60只,体重(120±15)g,由南京医科大学动物实验中心提供。实验过程中对动物的处置遵循中华人民共和国科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》。动物在实验前适应性喂养1周,每笼3只,动物房温度在23~25℃,湿度在40%~60%,12 h明暗交替。采用完全随机法,随机取16只分为正常组,anti-IL-22-对照组,其余大鼠采用Ⅱ型胶原和弗氏不完全佐剂制备RA模型,将造模成功的16只大鼠随机分为RA组,anti-IL-22-RA组。

1.1.2主要试剂

DMEM培养基及胎牛血清(FetalBovine Serum,FBS)购自Gibco公司,ELISA试剂盒(R&D公司),流式抗体CD4PECy5、IFN-γFITC、IL-17PE及IL-22APC(BD公司),IL-22、U6、GAPDH及STAT3引物购自上海吉玛生物技术有限公司,Trizol(Invotrogen公司),Real-time PCR试剂盒(ROCHE公司),anti IL-22封闭抗体、抗IL-22抗体及抗STAT3抗体(Abcam公司),抗β-actin抗体(Santa Cruz公司),羊抗兔二抗(Santa Cruz公司),CCK-8购自上海博谷生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1动物模型制备

取适量Ⅱ型胶原溶于0.1 mol/L的乙酸溶液中,使其最终浓度为2 mg/ml,放置于4℃冰箱中摇晃过夜,次日与等量的弗氏不完全佐剂于冰上充分乳化,达到油包水状态则为乳化完全。于大鼠左后跖底部注射0.2 ml/只的乳剂,7 d之后在尾根追0.2 ml/只,进而诱发类风湿性关节炎模型[5]。模型成功的标准为大鼠食量减少,毛色略黄无光泽,行动迟缓,体重减轻,足爪红肿,足垫增厚,不能负重,甚至出现跛行。

1.2.2大鼠滑膜R AFLS细胞培养

引颈处死大鼠,无菌条件下取滑膜组织,采用HBSS液反复漂洗组织块3次后剪成约1~2 mm3小块。组织块贴壁培养,待滑膜FLS长出后,胰蛋白酶消化细胞传代培养。采用生长状态良好的第3~5代细胞进行实验。

1.2.3流式细胞术检测大鼠全血中Th22细胞

取新鲜采集的大鼠肝素抗凝的外周血5 ml,制备成单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),将PBMC分别用PBS缓冲液洗1遍并重悬于100μl PBS缓冲液中,加入CD4-PECY5(0.2 mg/ml)、IL-17-PE(0.2 mg/ml)和IL-22-APC(0.25 mg/ml)抗体,4度避光孵育30 min,PBS洗2遍以及,上机检测(BD FACS Calubur),Th22细胞表现为CD4+IL-17-IL-22+细胞群。

1.2.4 R eal-time PCR检测IL-22 m R N A表达水平

新鲜采集的大鼠外周血2 ml,静置6 h后,离心取上清,依照产品说明书,以U6作为内参,检测IL-22 mR NA的表达水平。IL-22引物:正向5'-CGATTGGGGAACTGGACCTG-3',反向5'-GGACGTTAGCTTCTCACTTT-3'。

1.2.5 ELISA检测IL-22蛋白表达水平

取新鲜采集的大鼠外周血2 ml,静置6 h后,离心提取上清液,依照产品说明书,ELISA试剂检测IL-22蛋白表达水平。

1.2.6 CCK-8实验检测R AFLS细胞增殖

将对数生长期的RAFLS细胞以50%的融合率接种至96孔板,每组设置3个复孔,同时设置不含细胞的空白培养基作为对照组,37℃,5%二氧化碳CO2,95%湿度下培养24 h后,分别在培养孔加入10μL CCK-8溶液;孵育2 h,酶标仪检测450 nm的吸光值,每孔实测光密度(optical density,OD)值需减去空白对照组OD值,取3复孔平均值,记录OD值。

1.2.7 R eal-time PCR检测STAT3 m R N A表达水平

将培养至对数生长期的大鼠RAFLS细胞,用Trizol提取各组总RNA,反转录为cD NA,依照产品说明书,以U6作为内参,检测STAT3 mR NA的表达水平。Stat3引物:正向5'-GGAGGAGGCATTCGGAAAGTA-3',反向5'-CTGCAGGTCGTTGGTGTCAC-3'。

1.2.8 Western blot检测STAT3蛋白表达水平

大鼠RAFLS细胞培养至对数生长期,按照蛋白抽提步骤,提取总蛋白;采用BCA法测定总蛋白浓度,经SDS-PAGE电泳后转移到NC膜上,5%脱脂奶粉室温封闭1.5 h,TBST洗涤后,分别加入1∶1 000抗STAT3抗体、1∶500抗β-actin抗体,4℃孵育过夜,TBST洗涤后加入1∶5 000辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗,37℃孵育1 h,再用TBST洗涤,化学发光并曝光成像。Weastern blot检测以β-actin条带作为内参,STAT3条带与其比较,观察STAT3蛋白表达变化。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0 统计软件进行数据分析, 计量资料用均数±标准差( ±s) 表示,两组间差异比较用Student’s t检验,P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 流式细胞术检测大鼠全血中Th22 细胞

Th22 细胞在RA大鼠全血中表达显著高于正常大鼠,差异有统计学意义( P <0.01) ,见图1。

2.2 检测血清中IL-22 m RNA和蛋白表达水平

IL- 22 m RNA细胞在RA大鼠血清中表达显著高于正常大鼠,具有统计学意义( P <0.01) ;蛋白水平表达同样显著高于正常大鼠,具有统计学意义( P <0.01) 。此外,与RA组比较,IL- 22 的中和抗体后能够显著抑制RA小鼠体内IL- 22 的蛋白水平。同时注射IL- 22 的中和抗体亦减低RA小鼠的IL- 22m RNA水平, 可能是体内注射IL- 22 中和抗体后可以通过影响其他一系列的复杂机制来调节的IL- 22的m RNA表达情况。见图2。

2.3 RAFLS细胞增殖实验

RA大鼠注射IL- 22 封闭抗体后,与未注射封闭抗体的RA大鼠比较,RAFLS细胞的增殖能力明显下降,差异有统计学意义( P <0.01) ,见图3。

2.4 Real-time PCR检测STAT3 m RNA表达水平

RA大鼠注射IL- 22 封闭抗体后,与未注射封闭抗体的RA大鼠比较,STAT3 m RNA的表达明显下降,差异有统计学意义( P <0.01) ,见图4。

2.5 Western blot检测STAT3 蛋白表达水平

RA大鼠注射IL- 22 封闭抗体后,与未注射封闭抗体的RA大鼠比较,STAT3 蛋白表达显著下降( 见图5) ,差异有统计学意义( P <0.01) 。

3 讨论

类风湿性关节炎( RA) 是以对称性多关节滑膜炎症为主的慢性自身免疫性疾病,能引起软骨破坏,关节间隙变窄,晚期可出现关节畸形,致残率很高。除了关节炎症的表现外,RA还可能出现广泛的全身性病变,如发热、乏力、体重下降、心包炎、胸膜炎及周围神经病变等[6]。 RA在全球都有发病,发病率平均为1%,我国的发病率为1.3%~1.4%,如果不及时诊治,70%的患者2 年后可能发生不同程度的残疾,平均寿命缩短10~15 年。目前,RA的治疗以主要是以甲氨蝶呤为基础的早期联合用药, 但这只能缓解RA的症状,不能从根本上治愈疾病,且长期使用副作用较大。近年来,临床上应用以TNF- α 为靶向的生物治疗,但效果一般,且价格昂贵[7]。 RA发病机制尚未明确, 故深入研究RA的发病机制对RA治疗至关重要。

Th22 细胞是新近发现的一类独立于Th1、Th2和Th17 细胞的CD4+T淋巴细胞亚群, 以高水平分泌IL- 22 为特点, 是一个终末分化且独立稳定的谱系[8,9],其功能主要通过IL- 22 来实现。 Th22 细胞参与了炎症反应、自身免疫性疾病、肿瘤等的发生发展,在机体免疫调节、宿主防御及组织修复中发挥重要作用。有研究表明,在RA患者的外周血中,IL- 22高表达[10]。本研究运用胶原诱导的大鼠关节炎模型发现,RA大鼠模型全血中Th22 细胞的表达明显高与正常大鼠, 血清IL- 22 基因和蛋白水平的表达同样明显高于正常大鼠,说明在Th22 和IL- 22 参与了RA大鼠的发病。 RA发病机制中FLS起关键作用。增生的FLS释放细胞因子和趋化因子, 如IL- 6、IL- 8、IL- 15 及基质细胞起源因子SDF- 1 等,这些小分子进一步促进了滑膜中白细胞由血管内向滑膜的迁入、活化。 FLS增强了针对关节软骨降解生成特异抗原的免疫应答, 促进了SDF- 1 和其他内皮细胞生长因子,包括成纤维细胞生长因子介导的血管再生[11]。当RA大鼠体内IL- 22 被封闭抗体中和后,RAFLS细胞的增殖显著降低, 说明Th22 和IL- 22 通过影响RAFLS细胞增殖,参与RA的发病。JAK2- Stat3 信号分子是调控细胞增殖分化重要的细胞内信号通路,JAK2 作为上游激酶, 其活化后可以募集胞质中无活性的Stat3 分子,使其酪氨酸磷酸化而形成有活性的二聚体, 进而转移入细胞核, 结合DNA,导致特定靶基因的开启[12,13]。当RA大鼠体内IL- 22 被封闭抗体中和后,RAFLS细胞中STAT3 不管基因水平还是蛋白水平, 表达都是降低的, 提示Th22 和IL- 22 通过STAT3 信号途径, 影响RAFLS细胞增殖。这与Lerman等人的研究是一致的[14]。

综上所述,Th22 细胞作为一种以分泌细胞因子IL- 22 为特征的新型辅助性T细胞, 在RA大鼠模型中,通过IL- 22 影响STAT3 信号途径,从而影响RAFLS细胞的增殖,参与大鼠RA的发病。这为RA的生物靶点治疗提供了理论参考依据。

摘要：目的探讨胶原诱导的大鼠类风湿性关节炎(RA)模型中,Th22和白细胞介素-22(IL-22)的水平及其可能的机制。方法构建胶原诱导的大鼠RA模型后,流式细胞术检测Th22细胞,Real-time PCR检测IL-22 m R N A表达水平,ELISA检测IL-22蛋白表达水平;用IL-22封闭抗体中和R A大鼠体内IL-22后,CCK-8实验检测R AFLS细胞增殖,R eal-time PCR检测IL-22和STAT3 m R N A表达水平,Western blot检测STAT3蛋白表达水平。结果与对照组比较,RA大鼠全血中的Th22细胞和血清IL-22的表达显著增加(P<0.01);用IL-22封闭抗体中和R A大鼠体内IL-22后,与对照组比较,R A大鼠血清IL-22显著下降(P<0.01),R AFLS细胞增殖能力下降(P<0.01),R AFLS细胞中STAT3基因和蛋白水平的表达显著较少(P<0.01)。结论R A大鼠模型中,Th22细胞通过分泌过多的IL-22刺激STAT3信号途径,从而提升R AFLS细胞的增殖能力,参与大鼠RA的发病。

胶原诱导关节炎篇7

芍药苷(paeoniflorin,PEF)是从传统中药芍药干燥根中提取的有效成分,具有多种药理学活性,如降低胆固醇水平,抗血小板聚集以及神经保护效应等[4,5,6]。最近有研究发现,PEF通过抑制肝脏星形细胞的增殖和Ⅰ、Ⅲ型胶原的产生而具有明显的抗肝纤维化效应[7]。但其是否具有抗MF的作用,尚未见文献报道。

心肌成纤维细胞是MF的主要效应细胞,其增殖和胶原合成聚集过多是MF的主要病理基础。有文献报道,过度刺激β肾上腺素能受体可导致心肌胶原的沉积和MF的形成[8]。因此,本实验用β肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素(isoproterenol,ISO)诱导大鼠心肌成纤维细胞的增殖和胶原的产生,观察PEF对ISO诱导的细胞增殖和胶原产生的影响,并初步探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

DMEM培养基、胎牛血清和胰蛋白酶购自Gibco公司;Trizol Reagent购自Invitrogen公司;ISO购自Sigma公司;CT-1和β-actin抗体购自Abcam;逆转录试剂盒购自MBI公司;MTT及活性氧检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所;Ⅰ、Ⅲ型胶原ELISA试剂盒购自上海蓝基生物科技有限公司;PEF(纯度≥98%)购自杨凌东科麦迪森制药有限公司;其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

主要仪器有5%二氧化碳培养箱(SANYO,Japan);倒置显微镜(Olympus,Japan);7500型实时荧光定量PCR仪及分析软件SDS(Applied Biosystems,USA)。

1.3 试验方法

1.3.1 原代心肌成纤维细胞的培养

取出生1周以内的SD大鼠10只,断颈处死,用75%酒精浸泡消毒;开胸取心脏,仔细去除血管、心房及周围结缔组织;取心尖部心室肌剪成0.5 mm×0.5 mm×0.5mm～1.0 mm×10 mm×1.0 mm大小的组织块,用PBS清洗2次;将组织块移入离心管,并加入0.25%胰蛋白酶2 m L,37℃水浴中消化5 min;轻轻吹打,吸取上层混悬液移弃;再加入胰蛋白酶2 m L于组织中消化5 min,沉淀,收集上清液加入含20%胎牛血清的DMEM中终止消化,吹打收集上清液。重复上述步骤3次。将收集的上清液于1 000 r/min离心10 min,弃上清,加入含20%胎牛血清的DMEM培养基,吹散后接种于培养瓶中,置培养箱(5%二氧化碳、37℃)中培养1.5 h,弃去上清液,换新鲜培养基,继续培养。用差速贴壁法纯化细胞,至第四代获取纯度大于95%的心肌成纤维细胞用于实验。

1.3.2 实验分组

实验共分为5个组:正常组:细胞中不加任何试剂;ISO损伤组:细胞中加入10-5mol/L的ISO;低剂量PEF+ISO组:先加入10μmol/L的PEF孵育细胞2 h,然后加入10-5mol/L的ISO;高剂量PEF+ISO组:先加入100μmol/L的PEF孵育细胞2 h,然后加入10-5mol/L的ISO;高剂量PEF组:细胞中加入100μmol/L的PEF。以上各组ISO的处理时间均为48 h。

1.3.3 MTT检测细胞增殖活性

以传代方法将细胞接种于96孔板中培养。待细胞融合成单层,换以含1%胎牛血清的DMEM培养基同步化12 h后,即可按前述进行分组处理,药物作用相应时间后,每孔加入MTT(5 mg/m L)20μL,放入培养箱中继续孵育4 h,终止培养,吸弃上清液,加入二甲基亚砜(DM-SO)150μL/孔,振荡10 min,490 nm波长下测吸光度(OD)值。

1.3.4 Real-time PCR检测Ⅰ、Ⅲ型胶原和CT-1m RNA的表达

应用Trizol提取各处理组细胞总RNA,取1μg总RNA在20μL反应体系中逆转录合成c DNA;取c DNA进行PCR扩增,用以检测Ⅰ、Ⅲ型胶原和CT-1 m RNA的表达,引物序列见表1。

1.3.5 ELISA法检测上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量

细胞完成相应处理后,收集细胞培养上清液于离心管中。用ELISA法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量,操作严格按照说明书进行。

1.3.6 Western blot检测CT-1蛋白的表达

药物处理完毕后,用RIPA裂解液提取细胞总蛋白,分装并保存于-70℃冰箱中备用。以BCA法测定蛋白浓度,取40μg待测蛋白行SDS-PAGE电泳,10 V半干式电转膜25 min,将蛋白质转移至PVDF膜上。TBST配制的5%脱脂牛奶室温封闭1 h后加入CT-1单克隆抗体(1∶100)4℃过夜,漂洗后与1∶500稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗室温反应1h,洗膜后加发光剂显影,定影,洗片。用凝胶成像分析系统进行灰度扫描,以同一标本β-actin的产物灰度值作为内参,并计算出相对值。

1.3.7 ROS的测定

细胞处理完毕后,吸弃培养板中的培基,用无血清的DMEM洗涤细胞2次;加入适当体积稀释好的DCFH-DA(用无血清DMEM培养液以1∶1 000稀释,使终浓度为10μmol/L),加入的体积以能充分盖住细胞为宜;37℃细胞培养箱内孵育20 min;用无血清细胞培养液洗涤细胞3次,以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA;在488 nm激发波长,525 nm发射波长下检测荧光强度。

1.4 统计学分析

用SPSS 12.0统计软件进行统计学处理,所有数据均以均数±标准误(x±s)表示,两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用One-way ANOVA和Newman-Keuls-test多重比较t检验,双侧P<0.05认为差异有显著性。

2 结果

2.1 PEF对ISO诱导心肌成纤维细胞增殖活性的影响

MTT结果显示:ISO处理体外培养的心肌成纤维细胞后可明显诱导细胞的增殖,与正常对照组相比差异具有显著性(P<0.01);预先应用不同浓度的PEF孵育细胞后,可明显抑制ISO的上述效应,但单独应用PEF对成纤维细胞的增殖活性并无明显影响(图1)。

2.2 PEF对ISO诱导成心肌纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达和含量的影响

由于MF主要与Ⅰ型和Ⅲ型胶原的沉积有关,因此我们检测了心肌成纤维细胞中Ⅰ型和Ⅲ型胶原m RNA表达的变化。Real-time PCR结果显示:ISO可显著上调Ⅰ、Ⅲ型胶原m RNA的表达,与正常对照组相比差异具有显著性(P<0.01);预先孵育不同剂量的PEF后可显著下调Ⅰ、Ⅲ型胶原m RNA的表达(图2)。细胞培养上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原的蛋白含量也呈现一致的变化(图3)。

2.3 PEF对ISO诱导心肌成纤维细胞CT-1mRNA和蛋白表达的影响

由于CT-1是MF过程中的关键因子,因此我们检测了CT-1 m RNA和蛋白的表达。结果显示:ISO处理心肌成纤维细胞后可明显上调CT-1 m RNA和蛋白的表达,与正常对照组相比差异具有显著性(P<0.01),预先应用不同浓度的PEF处理后可明显抑制ISO的上述效应,但单独应用PEF对CT-1m RNA和蛋白的表达并无明显影响(图4、5)。

2.4 PEF对ISO诱导成心肌纤维细胞ROS产生的影响

结果显示:ISO处理成纤维细胞后可明显增加细胞内ROS的水平,与正常对照组相比差异有显著性(P<0.01);预先应用不同浓度的PEF孵育细胞后,可明显抑制ISO诱导的ROS的产生,但单独给予PEF对细胞内ROS的产生并无明显影响(图6)。

3 讨论

MF是以心肌成纤维细胞增殖和间质胶原过度沉积为特征的一种病理状态,也是心脏的一种代偿反应。当心肌细胞数量减少时,心肌间质增生,胶原纤维过量聚集以弥补心肌细胞的不足。胶原在间质中异常堆积可增加心脏的僵硬度,导致顺应性降低和舒张充盈下降;细胞间和细胞周围胶原纤维的增加,可限制细胞运动和降低心肌收缩性;胶原纤维过量聚集还可引起心肌组织电传播异常,引发心律失常,这些最终将导致心力衰竭的发生。因此,阐明MF的病理生理机制,以寻求有效的防治措施,将会明显延缓心力衰竭的发生。

CT-1是PENNICA等[9]人在1995年首次从小鼠心脏发育的胚胎干细胞中克隆出的一种新基因,因其编码产物能够诱导心肌细胞肥大,故而命名。CT-1的分子量为21.5 kD,是细胞因子白细胞介素-6超家族中的一员。在心脏、骨骼肌、卵巢、肾脏等多种组织细胞中均存在CT-1的表达,这对维持机体正常的生长发育是必需的。但在某些病理状态下,CT-1的过度表达参与了多种疾病的发生[10,11]。有研究发现,在醛固酮诱导的MF动物模型中,CT-1的表达水平显著上调,敲除CT-1则可明显抑制心肌胶原的沉积和纤维化的形成[12]。同样,外源性给予CT-1也能明显诱导大鼠MF的形成[13]。以上研究结果说明,CT-1在MF过程中有着重要的作用,是一种新的致纤维化因子,可作为抗纤维化治疗的一个靶目标[13]。

PEF是一种单萜类糖苷化合物,是从传统中药处方芍药根中提取的一种主要活性单体成分,在中枢神经系统、免疫系统以及血液系统均有着有益的生物学效应。最近有文献报道,PEF在体内和体外均能明显抑制细胞的增殖和胶原的产生,从而改善肝脏纤维化[14,15]。因此推测,PEF可能具有抑制MF的作用。本实验中笔者观察到,预处理PEF可明显抑制ISO诱导的心肌成纤维细胞增殖和胶原产生。由于CT-1是一种重要的致纤维化因子,因此认为PEF抑制细胞增殖和胶原合成的作用可能与CT-1有关。进一步的研究发现,PEF抑制细胞增殖和胶原合成的同时,CT-1的m RNA和蛋白表达也明显降低。以上研究结果说明,PEF可能通过下调CT-1的表达进而抑制ISO诱导的心肌成纤维细胞增殖和胶原产生。

有研究发现,过氧化氢、氯化钴以及低氧均能明显上调CT-1的m RNA和蛋白表达,提示CT-1的表达受活性氧(reactive oxygen species,ROS)的调节[16]。另有文献报道,在培养的人脐静脉内皮细胞,PEF通过减少细胞内ROS的产生明显抑制过氧化氢诱导的细胞凋亡[17],提示PEF还具有抗氧化特性。此外,ZHANG等[18]发现,ISO诱导的大鼠MF与ROS的过量产生密切相关。基于以上的研究,笔者推测:本实验中PEF抑制CT-1的表达可能与降低细胞内ROS的产生有关。本实验也确实观察到,PEF下调CT-1表达的同时,细胞内ROS的水平也明显降低。以上结果说明,PEF可能通过抑制ROS的产生进而下调CT-1的表达。

综上所述,PEF能明显抑制ISO诱导的心肌成纤维细胞增殖和胶原合成,其机制可能与减少细胞内ROS的产生进而下调CT-1的表达有关。

摘要：目的观察芍药苷(PEF)对异丙肾上腺素(ISO)诱导心肌成纤维细胞增殖和胶原产生的影响,并探讨其机制。方法体外培养的心肌成纤维细胞,待细胞生长到融合状态时加入不同浓度的PEF(10或100μmol/L)预处理2 h,然后加入ISO(10-5mol/L)作用48 h。用四唑盐比色实验(MTT)检测细胞增殖活性;实时荧光定量PCR检测Ⅰ、Ⅲ型胶原和心肌营养素-1(CT-1)mRNA表达;酶联免疫吸附法(ELISA)检测上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量;Western blot和DCFH-DA荧光法分别检测CT-1蛋白和细胞内活性氧(ROS)的水平。结果 ISO能明显诱导心肌成纤维细胞的增殖,并能显著增加Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达和含量,同时CT-1的mRNA和蛋白表达以及细胞内ROS的水平也显著升高,而预先应用不同浓度的PEF处理后,上述效应明显减弱。结论 PEF能抑制ISO诱导的心肌成纤维细胞增殖和胶原产生,其机制可能与降低细胞内ROS的产生进而下调CT-1的表达有关。

胶原诱导关节炎篇8

近年来, 大量的文献资料显示, 羊软骨Ⅱ型胶原蛋白 (CⅡ) 不但在RA和骨肿瘤的病理研究方面扮演着重要角色[3,4], 而且在治疗RA中也有着广阔的应用前景[5,6,7,8]。国内外均有通过口服CⅡ诱导免疫耐受治疗RA动物模型的研究报道[9,10], 但对羊源CⅡ的预防和治疗效果研究报道较少。本试验采用弗氏完全佐剂制作AA小鼠动物模型, 然后以预防和治疗两种方案灌胃给予羊软骨CⅡ, 测定致炎后小鼠血清中白细胞介素-1β (IL-1β) 、一氧化氮 (NO) 、超氧化物歧化酶 (SOD) 、丙二醛 (MDA) 含量及免疫器官胸腺、脾脏指数的变化, 旨在为CⅡ对小鼠佐剂性关节炎的抑制作用研究提供理论依据。

1 材料

KM系雄性小鼠 (合格证号为8010078) , 6周龄, 160只, 体重为20 g左右, 购自河北省试验动物中心;新鲜羊肋软骨, 购自保定市肉联厂。

一氧化氮检测试剂盒、丙二醛检测试剂盒和超氧化物歧化酶检测试剂盒, 均购自南京建成生物工程研究所;白细胞介素-1β检测试剂盒, 购自解放军总医院科技开发中心放免研究所。

2 方法

2.1 羊软骨CⅡ的制备

以新鲜羊肋软骨为原料, 按照参考文献[11]中的方法自行制备羊软骨CⅡ。

2.2 预试验

取100只体重为20 g左右的KM系雄性小鼠进行羊软骨CⅡ灌胃剂量的筛选试验。结果表明0.6 mL/d为最佳灌胃剂量, 采用该剂量进行正式试验。

2.3 正式试验

取60只KM系雄性小鼠随机分为4组, 即对照组 (A组) 、预防组 (B组) 、治疗组 (C组) 、模型组 (D组) , 每组设15个重复。每组除正常饲喂外, A组每天灌胃生理盐水, 在第31天于小鼠右后足跖部注射生理盐水0.1 mL;B组每天灌胃0.6 mL羊软骨CⅡ, 在第31天于小鼠右后足跖部注射弗氏完全佐剂0.1 mL诱导小鼠致炎;C组前30 d每天灌胃生理盐水, 在第31天再对小鼠以同样方法致炎 (同B组) , 致炎后每天灌胃0.6 mL羊软骨CⅡ;D组在第31天同法致炎, 全程每天灌胃生理盐水。

2.4 测定指标

血样的采集与处理:致炎后第24天摘除小鼠眼球放血, 用1.5 mL安瓿管接血, 直至血放尽为止, 取血前禁食12 h。采集的血液于 37 ℃放置30 min, 4 ℃过夜后3 000 r/min离心15 min, 分离血清, 于-20 ℃保存, 用于各指标的测定。

血清指标的测定:按照相应试剂盒的方法测定。

小鼠胸腺、脾脏指数的测定:致炎后第24天, 将各组小鼠脱颈椎处死, 称体重, 解剖, 取胸腺和脾脏, 在滤纸上浸干血液后称重, 用于计算胸腺指数和脾脏指数。计算公式:胸腺 (脾脏) 指数=胸腺 (脾脏) 重 (mg) /小鼠体重 (g) ×10。

2.5 数据分析

采用单因子四水平设计, 应用SPSS软件包的 One-Way ANOVA程序进行单因素试验的方差分析, 差异显著时用LSD检验法进行组间的多重比较。

3 结果与分析

3.1 灌胃羊软骨CⅡ对小鼠血清指标的影响

3.1.1 小鼠血清IL-1 β含量的测定结果见图1。

注:与对照组比较, *表示差异显著 (P<0.05) , **表示差异极显著 (P<0.01) 。

由图1可以看出:模型组小鼠血清IL-1β含量极显著高于对照组 (P<0.01) ;预防组和治疗组小鼠血清IL-1β含量均低于模型组;与对照组相比, 预防组和治疗组均差异显著 (P<0.05) , 其中治疗组更明显。说明致炎可使小鼠血清中致炎因子IL-1β含量升高, 致炎前后口服羊软骨CⅡ均可抑制致炎小鼠血清IL-1β含量的升高, 且预防效果优于治疗效果。

3.1.2 小鼠血清NO含量的测定结果见图2。

注:与对照组比较, **表示差异极显著 (P<0.01) ;与模型组比较, #表示差异显著 (P<0.05) 。

由图2可以看出:模型组小鼠血清NO含量极显著高于对照组 (P<0.01) ;预防组和治疗组小鼠血清NO含量均显著低于模型组 (P<0.05) ;预防组和治疗组间差异不显著 (P>0.05) 。说明弗氏完全佐剂诱导的小鼠佐剂性关节炎可使小鼠血清NO含量升高, 预防组和治疗组均可显著抑制致炎小鼠血清NO含量的升高。

3.1.3 小鼠血清MDA含量及SOD活性的测定结果见图3、图4。

注:与对照组比较, *表示差异显著 (P<0.05) ;与模型组比较, #表示差异显著 (P<0.05) 。

注:与对照组比较, *表示差异显著 (P<0.05) ;与模型组比较, #表示差异显著 (P<0.05) ;与预防组比较, △表示差异显著 (P<0.05) 。

由图3、图4可知:模型组小鼠血清MDA含量显著高于对照组 (P<0.05) ;SOD活性显著低于对照组 (P<0.05) ;预防组和治疗组小鼠血清MDA含量均显著低于模型组 (P<0.05) , 且两组差异不显著 (P>0.05) 。预防组和治疗组SOD活性均显著高于模型组 (P<0.05) , 预防组效果显著优于治疗组 (P<0.05) 。说明通过致炎造模可以使小鼠血清MDA含量升高, 降低小鼠血清SOD活性;预防和治疗两种方案均可降低小鼠血清MDA含量及提高小鼠血清SOD活性, 且前者效果更佳。

3.2 灌胃羊软骨CⅡ对小鼠胸腺指数、脾脏指数的影响 (结果见表1)

注:与对照组比较, *表示差异显著 (P<0.05) ;与模型组比较, #表示差异显著 (P<0.05) 。

由表1可见:模型组小鼠的胸腺重和脾脏重与对照组相比有降低的趋势, 且其指数均低于对照组;预防组和治疗组小鼠胸腺重和脾脏重与模型组相比均有升高的趋势, 两组小鼠胸腺指数高于模型组, 且预防组和模型组相比差异显著 (P<0.05) ;预防组和治疗组小鼠脾脏指数显著高于模型组 (P<0.05) 。试验结果表明, 模型组与对照组相比小鼠胸腺及脾脏的生长均受到抑制, 而预防和治疗两种方案对小鼠胸腺及脾脏的恢复均有促进作用, 并且前者效果更好。说明灌胃羊软骨CⅡ可以明显促进免疫器官的生长, 进而增强机体免疫力。

4 讨论

IL-1β是一种由单核巨噬细胞产生的重要细胞因子和多肽调节因子, 主要在细胞免疫激活中发挥调节作用。据报道, IL-1β是RA发病机理中居中心地位的促炎症细胞因子, 在RA或实验性关节炎滑膜病变中起着重要的致病作用[12,13]。潘新[14]通过试验发现, 膝关节原发性骨性关节炎患者血清中IL-1水平明显高于正常对照组, 且血清中IL-1浓度和关节液内IL-1浓度呈高度正相关。本试验结果显示, 小鼠致炎后血清中IL-1β含量与对照组相比明显升高, 灌胃羊软骨CⅡ可抑制致炎小鼠血清IL-1β水平的升高, 且预防组比治疗组效果更佳, 说明血清IL-1β水平与炎症应答反应有关, 灌胃羊软骨CⅡ可以减轻佐剂性关节炎的炎症反应。

近年来研究表明, NO与机体特异性免疫反应、自身免疫密切相关。尤其引人注目的是, 在RA或动物实验性关节炎时, 体内NO的代谢产物NO2-/NO3- 浓度升高, 特别是关节液中有大量NO生成, 显示出NO与RA关系密切[15]。在本试验中, 模型组小鼠血清NO浓度明显高于对照组, 而预防组和治疗组小鼠血清中NO浓度均低于模型组, 且预防组效果更明显, 说明NO参与了免疫炎症反应, 灌胃羊软骨CⅡ可降低NO产生, 抑制炎症反应的进行。

骨性关节炎患者体内氧自由基含量增高, 关节内过量的氧自由基抑制软骨细胞增殖引起软骨细胞死亡, 抑制软骨基质蛋白多糖和胶原的合成, 加速软骨基质的降解, 导致软骨细胞损伤;相反减少关节液内自由基含量, 可减轻关节软骨损伤, 延缓疾病发展, 改善临床症状。在正常情况下, 由于体内存在自由基清除剂, 如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化酶及过氧化氢酶等, 体内自由基的产生与清除保持相对平衡。近年来的研究认为, 氧自由基损伤透明质酸, 使其发生解聚, 改变滑液黏度, 是RA的发病机制[16,17]。MDA是机体受自由基攻击后产生的脂质过氧化产物, SOD是超氧阴离子的清除剂, 测定MDA含量和SOD活性可间接反映体内氧自由基的高低。由本试验结果可知, 模型组小鼠血清MDA含量较对照组明显升高 (P<0.05) , SOD活性显著降低 (P<0.05) ;预防组和治疗组均能明显抑制MDA和SOD的变化趋势, 说明致炎可使关节内氧自由基生成增加, 灌胃羊软骨CⅡ可抑制氧自由基的生成。

胶原诱导关节炎篇9

【关键词】硬皮病；肺纤维化；红花水煎液；胶原含量；博莱霉素；小鼠

【ABSTRACT】Objective：To probe the effects of safflower decoction on pulmonary fibrosis by observing the staining pathological changes of HE and MASSON and the distribution of MASSON staining collagen content in bleomycin-induced mice with scleroderma.Methods：Thirty-two BALB/C mice were randomly divided into 4 groups：a blank control group，a model control group，a prednisone group and a safflower group，8 rats in each.Except for the blank control group，mouse models with scleroderma were established in other groups.Rice in the Prednisone group were given intragastric administration with 0.2 mL prednisone suspension，while those in the safflower group were given safflower decoction in the same way.Mice in the blank control group and the model control group were also given intragastric administration with saline of he same volume.HE and MASSON stainings were used to observe the pathological changes of lung in each group.IPP6.0 image analysis software was used to determine the distribution of MASSON staining collagen content，and SPSS17.0 software was used for statistical analysis.Results：Compared with the blank control group，the collagen content in lung tissue of mice in the model control group significantly increased（P < 0.05）.Compared with the model control group，the collagen content in lung tissue of mice in the prednisone group and the safflower group significantly decreased （P < 0.05）.The difference of collagen content between the prednisone group and the safflower group was not statistically significant（P > 0.05）.Conclusion：Safflower can effectively reduce the lung collagen content in bleomycin-induced mice with scleroderma，with a function of against pulmonary fibrosis.

【Keywords】 scleroderma；pulmonary fibrosis；safflower decoction；lung；collagen content；bleomycin；mice

硬皮病（scleroderma）是一种原因不明，临床上以局限性或弥漫性皮肤增厚和纤维化为特征，也可累及内脏（肺、心、消化道等器官）的结缔组织疾病。其发病机制核心为成纤维细胞合成过多的胶原，导致皮肤和内脏的纤维化。国内外文献报道，博莱霉素诱导的硬皮病小鼠模型与临床硬皮病患者组织病理改变和免疫组化变化极为相似，适用于对硬皮病皮肤和肺纤维化及血管病变的研究[1-3]。本实验在博莱霉素诱导的小鼠硬皮病模型下用红花水煎液干预治疗，探讨红花治疗硬皮病肺纤维化的

nlc202309090310

作用。

1 实验材料

1.1 实验动物 BALB/C小鼠32只，雌性，6～8周，SPF级，体质量18～22 g，来自广西医科大学动物实验中心，实验动物生产许可证号SCXK（桂）2014-0002，实验动物使用许可证号SYXK（桂）2014-0003。

1.2 实验药品、试剂与仪器注射用盐酸博莱霉素（日本化药株式会社，生产批号440392）；醋酸泼尼松片（广东华南药业集团有限公司，生产批号150301）；红花（南宁生源中药饮片有限责任公司，生产批号140901）。以上药品均来自广西医科大学第一附属医院药房。HE染色试剂盒（南京建成生物工程研究所，生产批号20160106，产品序号D006）；Masson染色试剂盒（南京建成生物工程研究所，生产批号20160106，产品序号D026）；OLYMPUS正置荧光显微镜（日本OLYMPUS，规格型号BX53）。

1.3 给药剂量根据人体与动物药物等效剂量换算方法，醋酸泼尼松用量为0.09 mg·d-1，红花用量为30 mg·d-1。

1.4 药品制备博莱霉素溶于高压灭菌后的pH = 7.2磷酸盐缓冲液（PBS）中，制备成质量分数为200 μg·mL-1的博来霉素磷酸盐缓冲液保存备用。醋酸泼尼松片用蒸馏水溶解配成0.45 mg·mL-1混悬液备用。红花采用常规方法煎煮成质量分数为0.15 g·mL-1的红花水煎液保存备用。

2 方法

2.1 动物分组和处理将32只小鼠随机分为空白对照组、模型对照组、醋酸泼尼松组、红花组，每组8只。按照参考文献[1-3]方法剃除小鼠背部被毛约1.5 cm×1.5 cm，适应性喂养2 d后开始实验。空白对照组用PBS 0.1 mL皮下注射，模型对照组、醋酸泼尼松组和红花组予博莱霉素磷酸盐缓冲液0.1 mL背部皮下注射，4组均为每日1次，连续注射28 d。造模同时即行药物干预，空白对照组和模型对照组予生理盐水0.2 mL灌胃，醋酸泼尼松组予醋酸泼尼松混悬液0.2 mL（含醋酸泼尼松0.09 mg）灌胃，红花组予红花水煎液0.2 mL（含红花30 mg）灌胃，各组小鼠均每日灌胃1次，共28 d。实验结束后，禁食12 h，水合氯醛腹腔注射处死小鼠，取左肺置于甲醛中固定，制成石蜡切片。

2.2 病理学检查小鼠肺组织石蜡切片经HE和MASSON染色后进行病理检查，分析各组之间肺组织病理形态学改变。

2.3 肺纤维化评分根据HE染色病理形态学变化，参照Szapiel等[4]的方法，将肺纤维化分级及评分如下：（-），评0分，无明显炎症改变，极少炎性细胞浸润，极少成纤维细胞生成；无胶原纤维生成。（+），评1分，轻度炎症改变，较少量炎性细胞浸润，较少成纤维细胞增生；较少胶原纤维生成，病变范围小于组织的20%。（++），评2分，中度炎症改变，较多成纤维细胞增生；较多胶原纤维生成，受累面积占组织的20%～50%。（+++），评3分，重度炎症，大量成纤维细胞增生；大量胶原纤维生成，面积 > 50%。

2.4 MASSON染色肺组织胶原定量每张切片选取6个不重复的阳性视野（×200倍），MASSON染色以蓝色胶原沉积为阳性信号。用IPP 6.0图像分析软件分析，进行灰度变换，使蓝色阳性面与背景分开，进行胶原定量分析，计算肺组织胶原沉积面积与视野内肺组织总面积的比值，并取平均值。

2.5 统计学方法采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料以表示，方差齐性检验后采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK（方差齐）或Games-Howell（方差不齐）检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组小鼠一般情况比较实验过程中各组均无死亡。空白对照组小鼠精神状态佳，进食、进水正常，活动灵敏度强，攻击性强，体质量未见明显减轻，背部毛发光泽发亮，再生较快，背部皮肤柔软，易被提起。与空白对照组比较，模型对照组小鼠精神较差，进食、进水减少，活动灵敏度降低，攻击性降低，体质量略减轻，背部毛发极少或完全不生，背部皮肤增厚，坚实发紧，不易捏起；醋酸泼尼松组和红花组小鼠精神一般，体质量稍减轻，行为灵敏度下降，攻击性降低，背部毛发有不同程度再生，再生速度慢，皮肤有紧绷感，未感明显增厚，不易被提起。醋酸泼尼松组和红花组小鼠一般情况差异不明显，但2组小鼠身体状况明显好于模型对照组。

3.2 各组小鼠肺组织HE和MASSON染色病理变化比较肉眼观察空白对照组小鼠肺呈粉红色，形态正常，弹性好，HE和MASSON染色后镜下观察肺组织结构清晰完整，未见炎症细胞浸润和胶原沉积。肉眼观察模型对照组小鼠肺为灰白色或苍白色，体积缩小，硬度增加，弹性较差，镜下可见肺泡间隔增宽，肺泡破坏、融合明显，炎症细胞大量浸润，MASSON染色可见蓝色的胶原纤维数量明显增多。肉眼下醋酸泼尼松组和红花组小鼠肺颜色暗淡，肺肿胀，体积增大，弹性一般，镜下可见部分肺泡间隔增宽，部分肺泡破坏、融合，少量炎症细胞浸润，蓝色胶原纤维较多；但与模型对照组比较，2组小鼠肺组织纤维化程度明显减轻。见图1、图2。

3.3 各组小鼠肺纤维化程度评分比较空白对照组小鼠肺组织结构正常，无炎症细胞浸润，肺泡间隔无明显增宽，未见炎症和纤维化表现。模型对照组肺泡壁厚度明显增加，肺泡结构破坏甚至消失，肺泡间隔纤维化显著。醋酸泼尼松组和红花组虽然也有纤维化表现，但较模型对照组明显减轻。与空白对照组比较，模型对照组纤维化评分明显增高（P < 0.05）。醋酸泼尼松组和红花组纤维化评分明显高于空白对照组（P < 0.05），但显著低于模型对照组（P < 0.05）。醋酸泼尼松组和红花组纤维化评分比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

3.4 各组小鼠肺组织胶原含量比较与空白对照组比较，模型对照组、醋酸泼尼松组及红花组胶原含量明显增加（P < 0.05）；与模型对照组比较，醋酸泼尼松组和红花组胶原含量显著降低（P < 0.05）。

nlc202309090310

醋酸泼尼松组和红花组胶原含量比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

4 讨论

硬皮病是一种以皮肤和内脏器官进行性纤维化的全身性疾病，涉及皮肤、关节、肌肉、肺、心脏等多个部位的损害。硬皮病中肺纤维化的发生率仅次于皮肤、外周血管及食管，肺纤维化早期多没有症状，直到硬皮病晚期，肺的损害可以成为患者死亡原因。糖皮质激素是目前临床上治疗硬皮病最具性价比的药物，对硬皮病所致关节炎、肌炎、心包炎、心肌损害、肺间质病变的炎症期有一定疗效[5]，但其副作用亦明显。由于肺纤维化治疗难度大，预后差，因此加强对硬皮病肺纤维化的研究，缓解和控制其进行性发展，具有重要的现实和社会意义。

肺纤维化的病理特点是肺泡上皮的损伤，胶原纤维的合成增加，细胞外基质（ECM）的沉积。细胞因子[如转化生长因子-β（TGF-β）、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素等]、氧化应激（OS）、热休克蛋白47（HSP47）等可引起肺组织炎症和胶原过度表达，ECM沉积，最终形成肺纤维化，影响肺功能[6]。

红花是一种经典的活血化瘀中药，具有抗血栓、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种药理作用[7-8]。Wang等[9]发现，在博莱霉素诱导的肺纤维化大鼠模型中，红花黄色素（SY）显著降低肺组织中羟脯氨酸含量，降低TGF-β1和α-平滑肌肌动蛋白的表达，抑制成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，最后达到抗肺纤维化的效果。张亚丹等[10]以TGF-β1诱导NIH/3T3细胞为模型，发现羟基红花黄色素A（HSYA）可抑制TGF-β1诱导NIH/3T3细胞与肺纤维化相关的信号转导，进而缓解肺纤维化。临床研究表明，红花亦对肺纤维化具有一定的防治作用。赵青文等[11]运用红花治疗特发性肺纤维化患者19例，所有患者经红花治疗后临床自觉症状、肺功能及动脉血气分析结果均有不同程度改善，9例可以进行正常的生活工作，6例可以进行一般日常活动，4例能进行少量室内活动。宋远瑛等[12]将48例特发性肺纤维化患者分为治疗组和对照组，每组24例，对照组使用醋酸泼尼松治疗，治疗组与对照组的基础上加用红花治疗，结果显示，2组患者经治疗后呼吸疾病问卷（圣乔治评分）、动脉血气分析及肺功能均有所改善，治疗组效果较对照组更显著（P < 0.05）。本动物实验通过光镜下肺组织病理观察可看到，模型对照组肺组织炎症细胞广泛浸润，肺泡间隔明显增宽，肺泡结构破坏严重，胶原纤维增生明显，提示小鼠硬皮病模型复制成功。醋酸泼尼松组与红花组炎症细胞浸润较轻，肺泡结构部分破坏，可见纤维化程度较轻，2组纤维化程度差异不明显。通过胶原含量分析可得出，模型对照组小鼠胶原含量显著高于空白对照组（P < 0.05）；而醋酸泼尼松组、红花组与空白对照组比较，胶原含量虽有升高，但较模型对照组低，说明2组肺部纤维化程度轻。但2组作用效果比较差异比较无统计学意义（P > 0.05），说明红花水煎液能有效对抗硬皮病小鼠肺纤维化。以上表明红花无论在临床研究或是动物实验中对肺纤维化的形成均有一定的拮抗作用，但是其抗硬皮病肺纤维化的机制还有待进一步明确。

5 参考文献

[1]Yamamoto T.The bleomycin-induced scleroderma model：what have we learned for scleroderma pathogenesis？[J].Arch Dermatol Res，2006，297（8）：333-344.

[2]Yamamoto T.Animal model of systemic sclerosis[J].J Dermatol，2010，37（1）：26-41.

[3]毛越苹，易娟娟，齐庆，等.博来霉素诱导硬皮病动物模型的建立及免疫学特征检测[J].中国皮肤性病学杂志，2013，27（7）：673-676.

[4]Szapiel SV，Elson NA，Fulmer JD，et al.Bleomycin-in

duced interstitial pulmonary disease in the nude，athymic mouse[J].Am Rev Respir Dis，1979，120（4）：893-899.

[5]曾抗，赖宽，陈平姣，等.硬皮病的治疗及进展[J].实用医院临床杂志，2013，10（1）：21-26.

[6]潘有禄，黄文海，沈正荣，等.肺纤维化发生机制及治疗研究进展[J].中国药学杂志，2012，47（23）：1873-1874.

[7]陈梦，赵丕文，孙艳玲，等.红花及其主要成分的药理作用研究进展[J].环球中医药，2012，5（7）：556-560.

[8]梁娟，吕军影，胡谋波，等.红花水煎液内服对硬皮病小鼠皮肤RORγt表达的影响[J].风湿病与关节炎，2016，5（4）：5-9.

[9]Wang L，Jin M，Zang BX，et al.Inhibitory effect of safflor yellow on pulmonary fibrosis[J].Biol Pharm Bull，2011，34（4）：511-516.

[10]张亚丹，潘瑞艳，臧宝霞，等.羟基红花黄色素A抑制转化生长因子-β1诱导的与肺纤维化相关信号通路的机制研究[J].心肺血管病杂志，2016，35（2）：145-149.