Ⅰ型胶原纤维（精选7篇）
Ⅰ型胶原纤维 篇1
1 前言
Ⅰ型胶原蛋白是皮肤、骨骼、肌腱的结构蛋白, 是一种多领域广泛使用的生物材料, 诸如手术缝合线、化妆品、伤口愈合和皮革制造。如此广泛的应用, 更加强了对胶原耐生物降解和耐热稳定性机理研究的必要性, 这些研究也将对胶原在工业和生物技术上的应用产生深远的影响。纤维素是一种已经广泛应用的天然聚合物。大量的纤维素衍生物通过化学方法改性得到。高氯酸氧化纤维素在温和的水性条件下制备, 它的特征是, 吡喃葡萄糖环苷键特异性裂解于C2-C3位上, 使每个单元得到两个醛基。因此, DAC是一种含有醛基的开链聚合物。如果在氧化过程中没有其它键断裂, 它的相对分子质量将与氧化前的纤维素相当。
胶原是一种具有突出特征的蛋白质, 每个胶原分子由三条肽链 (两条α1链, 一条α2链) , 缠绕在一起形成长约30μm直径150nm的右旋三股螺旋卷曲结构。胶原分子组成具有良好强度和稳定性的微纤维。分子链内、链间氢键和水参与的氢键共同成就了胶原结构的稳定性。胶原蛋白会受到微生物的侵蚀和降解。因此, 以胶原蛋白为基础发展的应用材料, 都要使他们抗微生物降解。胶原的热稳定性和关于胶原变性温度的各种影响因素已经得到广泛研究。众所周知, 胶原可以用各种交联剂 (如植物多酚、金属离子和醛) 发生交联, 使其耐酶降解性能及热稳定性都得到提升。近年来, 环境友好型的交联化学品呼声越来越高。六价铬、甲醛和戊二醛都是致癌的。改性多糖可生物降解, 在毒理学上是可接受的。DAC是由纤维素改性得到的生物高分子, 由于它能够使胶原稳定且来源丰富、价格低廉、生态环保受到了人们的关注。胶原对化学药品和酶的稳定性以及其湿热稳定性的高低由很多因素所决定。此次研究, 将DAC作为一种交联剂与鼠尾肌腱纤维的Ⅰ型胶原作用, 研究其交联效应及Ⅰ型胶原的湿热稳定性和耐胶原酶解能力。这是模型研究, 其展示的经过DAC处理的Ⅰ型胶原的热稳定性和耐酶解能力, 也适用于其他来源的胶原, 这些胶原更易用于生物加工。
2 实验材料和方法
2.1 实验材料
Ⅰ型胶原酶购于Sigma化学公司, 使用前根据Keller和Mandl的方法, 先用Sephadex G-200进行凝胶过滤提纯。实验所用化学品均为分析纯, 购于印度SRL化学公司。
2.2 实验方法
2.2.1 Ⅰ型胶原的制备
鼠尾取自6个月大的雄性白鼠, 在-20℃的条件下冰冻。由于它纯度高, 具有可利用的残留赖氨酸和胶原含量高, 是一种研究交联剂的理想材料。从冰冻器中取出鼠尾解冻, 取出肌腱。在4℃下, 用0.9%的NaCl溶液洗涤取出的胶原, 去除粘性可溶性蛋白。鼠尾肌腱用去离子水充分洗涤后, 储存于-20℃的条件下, 当作胶原纤维使用。根据Chandrakasan等描述得方法分离出酸溶鼠尾肌腱Ⅰ型胶原溶液, 步骤包括用醋酸提取和用NaCl盐析。使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 测定所制备胶原的纯度。根据Woessner的方法, 通过测定羟脯氨酸的含量来确定溶液中的胶原含量。
2.2.2 DAC的制备
根据早期报道的改性方法制备DAC。纤维素 (约100 g) 用5mol/L的盐酸水解 (10 h, 85℃) , 水解后的纤维素悬浮于去离子水中, 然后在冰水浴中冷却。在磁力搅拌器搅拌下向样品中加入120g高碘酸钠。反应过程中溶液pH值保持为4, 温度为35℃, 在避光条件下反应48 h后便得到含量99%的DAC。产物用叔丁醇 (样品∶溶剂为1∶3) 离心分离萃取。用碘量法测定上层清液中的碘。产物在同体积的叔丁醇中重新悬浮分散, 然后多次离心分离直至所有含碘化合物被分离除去。将产物在30℃下干燥。用碘量法来测量未消耗的高碘酸盐, 从而确定样品的氧化程度;双醛含量用早期报道的方法测定。DAC溶解度低, 因此, 试验中所使用的DAC均经过了高压蒸汽处理 (将10%的DAC悬浮于蒸馏水中, 在120℃, 15磅压力下处理2 h) 。
2.2.3 交联胶原的制备
鼠尾肌腱纤维用4℃的双重蒸馏水充分水洗, 放到1%的DAC溶液中, 在24℃, pH8的条件下反应24 h。交联后的胶原样品充分水洗后放置24 h后, 进行湿热稳定性、DSC和耐胶原酶解试验。
2.2.4 DAC的表征
用含折光指数检测器的凝胶色谱 (Jasco MX 2080-31) 测定DAC的相对平均相对分子质量。凝胶色谱分析用8μm材料填充的水性凝胶-OH柱 (内径7.5mm, 柱长300 mm) , 去离子水作为流动相, 流速为1 mL/min。用示差折光检测器检测控制溶液的洗脱情况。凝胶色谱柱用相对分子质量为580、5900、6300、504000、1112000 Da的多聚糖标准品校正。样品装柱之前先用薄膜过滤器 (0.45μm) 过滤。每次装样品20μL (质量浓度约为0.1%) 。
2.2.4. 1 水解程度。
将50 mL高压蒸汽处理过的DAC溶液离心10 min。用蒸馏水洗涤沉淀物两次, 然后在空气中干燥 (30℃) 24 h。分别计算高压蒸汽处理与未高压蒸汽处理样品的水分含量。通过高压蒸汽处理前后DAC的质量变化来确定水解程度。
2.2.5 交联胶原的表征
2.2.5.1 交联率
DAC稳定胶原的交联率, 用三硝基苯磺酸 (TNBS) 检测胶原中的ε-氨基来确定, 即用TNBS测定交联前后赖氨酸的有效含量来得到交联率。交联与未交联胶原溶液中赖氨酸上未反应的ε-氨基基团与TNBS反应会形成一种可溶性配合物。在60℃的去离子水中, 将1 mL 4% (w/v) 的碳酸氢钠溶液与1 mL刚配制的0.5% (v/v) 的TNBS溶液加入到1 mL酸溶胶原溶液 (浓度为5 mg/mL) 与1 mL各种浓度 (0%～2%) 的DAC (在pH值7及4℃下储存24 h) 中混合加热4 h。取1 mL此混合溶液在40℃下与3 mL 6 M的HCl反应1.5 h, 稀释后在334nm处测量吸光度。天然胶原溶液也在相同参数条件下用TNBS处理。所有的实验都做三个平行样。交联率用式 (1) 计算。
2.2.5. 2 热稳定性
2.2.5.2.1 湿热收缩
DAC处理后胶原纤维的湿热稳定性用微收缩测试仪测定。胶原纤维长度收缩到原始长度的1/3时的温度, 计为胶原的收缩温度。当在水浴条件下测定时, 收缩温度也被视称为湿热稳定性。切下一小块纤维用水润湿, 置于带槽显微镜的载玻片上。将载玻片翻面置于上方安装有显微镜的加热装置上。一边加热一边观察, 升温的速率为2℃/min。
2.2.5.2.2 差式扫描量热法 (DSC) 。
经过DAC处理的胶原和未经处理的胶原的热稳定性用差示扫描量热仪Netzsch DSC 200 PC进行分析。所有的测试都在氮气保护的情况下进行。用铟作标准对温度进行校正。加热速率控制在5℃/min。研究两种胶原在收缩过程中与相转变相关的的峰值变性温度 (TD) 、焓变 (ΔH) 、收缩速率 (ko) 以及活化能 (Ea) 。
2.2.5.3 耐胶原酶作用
用细菌性胶原酶降解两种胶原, 然后通过计算释放到溶液中的羟脯氨酸进行分析。胶原酶处理过程在pH值7.2的0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液和0.04 mol/L CaCl2缓冲液中进行 (胶原∶酶比为50∶1) 。通过检测从不溶胶原释放出的可溶性羟脯氨酸来确定两种胶原的裂解情况。羟脯氨酸的含量 (%) 用Woessner法测定。此测定方法是将羟脯氨酸氧化为吡咯-2-羧酸, 而吡咯-2-羧酸与对二甲氨基苯甲醛形成的络合物在557 nm处呈现最大吸光度。胶原降解率计算公式见式 (2) 。
3 结果与讨论
用99%的高碘酸氧化纤维素得到含92%双醛和3%可溶物的DAC。高碘酸特定地裂解多糖上邻近的乙二醇结构, 形成双醛衍生物。这个反应常用来阐明多糖的结构。高碘酸突出的优点是它的氧化具有特定性。通过控制所用高碘酸的量就能很容易地控制氧化程度, 可使氧化程度在0%～100%范围内, 从而调节DAC醛衍生物的含量。在给定条件下, 一个α-乙醇基团消耗一分子的高碘酸, 反应的速率主要由α-乙醇基的空间位置来决定。尽管氧化反应在水溶液中进行, DAC在多相分散体系 (叔丁醇∶水比为3∶1) 中也会沉淀出来。氧化后的DAC在水中的溶解度很低。DAC突出的特点是, 即使氧化完全也不溶于水或一般溶剂。DAC的不溶性归因于其未反应的羟基与醛基之间半缩醛的形成。但是, DAC在120℃、15磅压力下高温蒸汽处理后具有明显的可溶性, 水解程度可以达到54.6%, 冷却至室温也不会产生明显的沉淀, 稳定性可以一直保持。由于水是化学品材料转移进胶原内部的主要介质, 因此交联剂的水溶性很重要。
3.1 DAC的相对分子质量分布
pH值4.5时高温蒸汽处理10%的DAC会得到4种低聚物, 其中最重要的一种组分含量约为52%, 相对分子质量为790 Da (见表1) 。蒸汽处理时的高温高压条件会使DAC水解。通过计算高压蒸汽处理前后DAC质量的减少情况, 计算出水解程度为54.6%。早期的报告也显示, 在热机械应力作用下纤维素的相对分子质量会降低。由于双醛基团的存在, 高碘酸氧化纤维素在碱性条件下很容易降解。通过凝胶色谱证实在pH 8时, 高压蒸汽处理DAC会进一步水解。在此种情况下, 得到的主要组分含量为81%, 相对分子质量为580 (见表1) 。
3.2 DAC与胶原交联
Bowes和Cater曾经报道, 胶原中的氨基能够与双醛发生交联。单醛与胶原的氨基发生Mannich反应, 最可能生成亚甲基和希夫碱类化合物。甲醛不能与相邻胶原肽链上的氨基进行有效交联。要形成有效交联, 用作交联剂的分子应当含有双官能团, 以使两个多肽链间产生反应。因此, 双醛是一种很好的胶原交联剂。乙二醛能与精氨酸基团反应, 是一种效果突出的交联剂。戊二醛是另一种常用作交联的双醛化合物, 它主要与蛋白质的赖氨酸基团发生反应。据文献报道, 能与戊二醛发生交联的典型双分子模型主要有, N-烷基-1, 4-二氢吡啶 (在pH>7) 和2, 6-二取代的四氢吡喃以及2, 6-二芳基氨基四氢吡喃。因此, DAC交联就是胶原中赖氨酸和羟赖氨酸的氨基及精氨酸的侧基与DAC反应 (见图1) 。在低pH条件下氨基一般带阳电荷, 因此醛基与蛋白质反应的最佳pH一般要求高于蛋白质的等电点 (IEP) 。胶原的等电点是6.7, pH高于这个值胶原带负电, 其氨基就可以与醛基发生反应。早期的研究表明, pH为8是醛基与胶原反应的可行条件。pH越高交联后的胶原收缩温度越高。在pH为4.5和6时, 收缩温度分别为64℃和71℃, 而pH为8时, 收缩温度为80℃ (见表2) 。由表2也可以看出, 在pH为8时用DAC处理后胶原的耐胶原酶稳定性提高了93%。随着pH的升高, 氨基酸 (如精氨酸和赖氨酸) 侧链基团中未带电荷的氨基 (NH2) 含量也会升高, 由于醛基可以与胶原蛋白的氨基反应产生共价交联, 这也有利于DAC通过醛基基团固定于胶原上。如表1所示, 在pH值8的条件下高温蒸汽处理的DAC相对分子质量更低。在这个pH条件下, 各组分的相对分子质量也越低, 其渗透于扩散效果就越好, 也就越易与胶原反应。
3.3 DAC的交联率
用TNBS测定DAC对胶原的交联能力。各种浓度的DAC交联对胶原稳定性的影响, 见表2。可以看出, 通过与胶原的氨基形成交联, 交联率随DAC的浓度的增大而增强。根据早期的报道, 天然胶原中每1000个氨基酸残基分子含33 mol氨基基团。浓度为0.2%的DAC交联度可达到36%而浓度为0.6%时, 交联度可达到52%。随DAC中醛基基团的增加, 胶原中赖氨酸的氨基减少, 胶原受DAC交联的程度提高, 稳定性提高。但是, 浓度为0.6%及以上时DAC的交联率明显提高, 会引起分子链内及链间的交联 (见图1) 。然而, 当DAC浓度为1%时, 能与胶原氨基交联的醛基达到最大值, 因此, 大于1%时交联率为一个恒定值。高pH值与高DAC浓度有助于高的交联, 因有大量的醛基可与胶原的氨基反应。DAC与胶原之间强的交联能力归因于二者之间强的结合能力, DAC可与胶原形成共价与非共价相互作用。因此, DAC中醛基与胶原的氨基形成的共价交联以及羟基形成的氢键, 都提高了胶原的热稳定性和耐酶解稳定性。
3.4 DAC交联胶原的湿热稳定性
交联胶原的热稳定性是交联效果的表征。加热会使胶原纤维的结构网络收缩。提高胶原基质耐湿热能力是使其稳定的重要方面之一。胶原收缩至原始长度1/3时的温度为62℃, 也称作胶原的湿热收缩温度。在此温度下胶原基质出现明显收缩, 是由于蛋白质的稳定结构失去。交联会引起纤维脱水, 使胶原的协同单元尺寸发生变化, 分子结构变得紧实。胶原蛋白质具有较高的变性温度, 根本的原因在于其聚集态的长程相互作用。DAC交联胶原使湿热稳定性明显提高。由表2可以知, 随着DAC浓度和pH的提高, 胶原基质湿热稳定性也提高。因此, 通过与氨基形成共价交联和形成氢键, DAC交联的胶原中增加了长程有序的结构, 这有利于提高胶原纤维的湿热稳定性。
在pH8下用DAC交联胶原的热力学参数, 如变性温度 (TD) 、焓变 (ΔH) , 活化能 (Ea) 与反应速率常数 (ko) 见表3。用DSC测定出天然的和经DAC交联的鼠尾肌腱纤维的变性温度 (见图2) 与相应胶原湿热收缩温度有相同的趋势 (见表2) 。胶原纤维的湿热收缩温度在水浴条件下测定, DSC则是在无水条件下测定。由于实验条件的差异, 用DSC测定出的变性温度要略高于湿热收缩温度。湿热收缩温度测定的原理在于加热条件下螺旋结构会发生转变, 这取决于水合作用的程度。从表3可以看出, DAC交联后胶原的焓变也增加。焓变 (ΔH) 升高, 意味着发生了交联, 需要更多的能量使螺旋结构发生转变。也可以看出, 与天然胶原相比, 经过DAC交联后鼠尾肌腱胶原纤维的变性温度、焓变都明显升高。这可能是由于共价键的作用使分子间的交联数的明显增加。与天然纤维相比, 交联后鼠尾肌腱纤维发生相变时的活化能也会升高。要使DAC交联过的胶原熔融就需要更多的能量。反应速率常数 (ko) 取决于破坏分子间氢键所需的能量及其引起的分子内部结构无序程度。由于结构改变所需熵减少, 热稳定性的提高与交联度的提升相关。焓变与相变相关, 即意味着热力学过程与二级、三级和四级结构有关联, 这种复合焓变与胶原各个层次结构的有序程度都有关。总的来说, 基于加热变性过程中样品的焓变, DSC法是测定胶原稳定性时一个客观可靠的方法。DSC法也间接提供了DAC与胶原反应的信息, 即交联机理。
3.5 DAC交联胶原纤维的耐胶原酶分解能力
胶原的三股螺旋结构对酶降解 (胶原酶除外) 有抵抗作用。本文通过分析在胶原酶作用下胶原的水解速率, 来研究DAC交联胶原抗酶降解的能力。胶原酶优先裂解胶原分子非极性区-Gly-Pro-X-Gly-Pro-X-序列中的X-Gly键 (X是一种最常见的中性氨基酸) 。取自溶组织梭状芽孢杆菌的胶原酶能够在多个位点裂解胶原。用胶原酶降解天然胶原和经DAC交联鼠尾肌腱胶原纤维, 测定了它们不同时间的水解性 (利用羟脯氨酸的释放量检测) 。与天然纤维相比, DAC交联胶原纤维的降解率明显减少。培养反应96 h后, DAC交联鼠尾肌腱纤维降解率为7%, 而天然胶原降解率达99%。由表2知, 胶原耐胶原酶解的稳定性随着DAC的浓度和pH的升高而增强。DAC与胶原反应形成共价键和氢键。胶原与DAC反应保护了胶原中能被胶原酶识别的活性位点, 因而抗酶解稳定性提高。高压蒸汽处理后的DAC, 双醛分子变小, 更容易扩散渗透进入胶原内部与之反应。这就保障了经过蒸汽处理的DAC小分子与胶原有更好的反应性, 从而提高胶原的耐热与耐酶解稳定性。DAC交联胶原耐酶解稳定性的显著提高, 是由于DAC能够很好地与胶原反应, 形成共价键和氢键交联。
4 结论
此次研究把DAC作为交联剂, 为它对胶原稳定性的影响建立了一个可能的理论机制。研究证实, DAC可以使胶原的热收缩温度有明显的提升。由天然胶原和经DAC交联胶原的DSC图谱可知, 胶原吸热相变过程与其内部的晶格和有序性的变化有关。DAC交联胶原具有耐胶原酶解稳定性的能力, 并且在较高pH下这种能力更强。发生交联的胶原越多, DAC处理后的胶原热稳定性及耐胶原酶解能力也越强。DAC的浓度和pH越高, 交联就越容易进行, 这是由于存在大量的醛基能与胶原的氨基发生反应。DAC与胶原的高交联度, 归因于DAC能与胶原形成强烈的共价与非共价相互作用。
Ⅰ型胶原纤维 篇2
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
小鼠胚胎成纤维细胞 (NIH3T3) 购于中国典型培养物保藏中心;DMEM培养基购于Hyclone公司;新鲜特等优质胎牛血清 (FBS) 购自杭州四季青公司;重组ADAMTS-1 购自Abcam公司;RNA提取试剂盒购于康为世纪;逆转录试剂盒、c DNA合成试剂盒购于Fermants公司;Ⅰ型胶原蛋白抗体由广州威佳科技有限公司提供试用装;TGF-β 单克隆抗体及HRP- 标记的羊抗兔二抗购自康为世纪;BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIPA裂解液、PMSF购于碧云天生物技术研究所。
1.2 实验方法
1.2.1 NIH3T3的体外培养和分组
NIH3T3用含10%胎牛血清的DMEM在5%二氧化碳 (CO2) 、37℃下恒温培养, 0.25%胰蛋白酶消化、传代;将细胞均匀接种在6孔板上, 待细胞亚融合后改用无血清的DMEM培养液同步化饥饿12 h, 依实验要求共分正常对照组、低浓度组 (1 nmol) 、中浓度组 (10 nmol) 和高浓度组 (20 nmol) 4组, 每组10个样本。刺激24 h后检测COL1、TGF-β1水平, 实验重复3次。
1.2.2 RT-PCR
各组采用试剂盒法提取总RNA, 每10 cm2加入1 mL Buffer RLT, 裂解, 室温下5min;以每1 mL Buffer RLT加入200μL氯仿摇匀, 室温下2 min, 4℃离心12 000 r/min 10 min;取上清液移至新EP管, 加入等体积的70%乙醇;将液体移入装有收集管的吸附柱中, 4℃离心12 000 r/min, 20s;加入700μL Buffer RW1, 4℃离心12 000 r/min, 20s;加入500μL Buffer RW2, 4℃离心12 000r/min, 2 min, 吸附柱室温晾干, 置去酶离心管中, 加入30μL RNase-Free water, 4℃离心12 000 r/min, 1 min, 收集RNA溶液。用核酸蛋白分析仪鉴定RNA纯度和量, 所用RNA的OD260/OD280均在1.8~2.0之间, 表示样品为纯RNA。获得的RNA按逆转录试剂盒说明书进行操作, 加入总RNA 5μL、Primer oligo1μL、DEPC处理的水6μL、5×buffer 4μL、Ribolock Rnase inhibitor 1μL、10 mmol dNTP mix 2μL、M-Mu LV 1μL, 70℃5 min, 42℃60 min, 70℃5 min, 合成cDNA。产物置于-70℃保存, 以备PCR扩增。引物均由上海生物工程技术有限公司合成。总反应体系为20μL。目的基因COL1上游引物:5'-GACAGACTGGCAACCTCAAGAA-3', 下游引物:5'-GGATGGAGGGAGTTTACACGAA-3', 产物长度273 bp。反应条件:94℃预变性2 min, 94℃变性20 s, 56.8℃退火1min, 72℃延长30 s, 循环30次, 最后72℃延伸10min。目的基因TGF-β1上游引物:5'-GACCGCAACAACGCAATCTATG-3', 下游引物:5'-TATTCCGTCTCCTTGGTTCAGC-3', 产物长度300 bp。反应条件:94℃预变性3 min, 94℃变性30 s, 54℃退火30 s, 72℃延长1 min, 循环30次, 最后72℃延伸5 min。内参β-actin上游引物:5'-TGTCCCTGTATGCCTCTGGT-3', 下游引物:5'-GGTCTTTACGGATGTCAACG-3', 产物长度459 bp。在相同的条件下同管扩增β-actin。扩增结束后, 各组PCR产物取5μL进行琼脂糖凝胶电泳, EB染色, Alpha Imager 3400凝胶成像分析系统成像, Photoshop CS5软件测定各组吸光灰度值, 计算目的/内参灰度比值。
1.2.3 Western blotting
按实验分组条件处理后, 收集细胞, 用预冷PBS洗涤3次, 加入细胞蛋白裂解液100μL, 冰浴裂解30min, 4℃离心20000r/min, 15 min, 收集上清液。BCA蛋白定量法测定蛋白含量。波长490 nm处紫外分光光度计测吸光度, 以﹝ (样本孔OD值-对照孔OD值) ×1893.021-42.306﹞×10-3计算各样本蛋白含量。测得蛋白含量最低的样品加20μL, 再根据蛋白量相等原则计算出其他样品上样量, 用去离子水将总体积补足至20μL, 移至EP管中, 加入适量体积的5×上样缓冲液, 100℃变性5~10min, 然后进行10%SDS-PAGE电泳, PVDF膜转印2 h, 行Western blotting检测。以5%脱脂奶粉封闭2 h, 分别加入一抗 (1︰100, 1︰750) 4℃过夜, 孵育二抗 (1∶1 000) 1 h, 采用ECL显色法显色;凝胶成像系统扫描分析, Photoshop CS 5.0软件测定各组灰度值, 以COL1/APDH、TGF-β1/GAPDH显影条带灰度值的比值表示COL1、TGF-β1的相对蛋白含量。实验重复3次。
1.3 统计学方法
采用SPSS 13.0 软件进行统计学分析, 所有实验数据以均数±标准差 (±s) 表示, 组间比较用单因素方差分析, P <0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 ADAMTS-1 对Ⅰ型胶原蛋白的影响
RT-PCR及Western blotting结果显示, 加入ADAMTS-1 刺激后COL1 m RNA水平及蛋白水平均降低, 并且随着ADAMTS-1 浓度升高, 成纤维细胞中COL1 m RNA水平、蛋白水平也逐渐降低, 见图1。
2.2 ADAMTS-1 对TGF-β 的影响
RT-PCR及Western blotting结果显示, 加入ADAMTS-1 刺激后TGF-β m RNA水平及蛋白水平均降低, 并且随着ADAMTS-1 浓度升高, 成纤维细胞中TGF-β m RNA水平、蛋白水平也逐渐降低, 见图2。
A:COL1的RT-PCR结果以及关于COL1与β-actin灰度比的统计条图;B:COL1的Western blotting结果以及关于COL1与GAPDH灰度比的统计条图。1) 与对照组比较, P<0.05;2) 与低浓度组比较, P<0.05;3) 与中浓度比较, P<0.05
A：TGF-β 的 RT-PCR 结果以及关于 TGF-β 与 β-actin 灰度比的统计条图；B：TGF-β 的 Western blotting 结果以及关于 TGF-β与 GAPDH 灰度比的统计条图。1）与对照组比较，P <0.05；2）与低浓度组比较，P <0.05；3）与中浓度比较，P <0.05
3 讨论
近20 余年来, 肺纤维化的发病率和死亡率在世界各地均呈上升趋势, 国外报道, IPF的发病率约为14~43 人/10 万, 确诊后中位生存期3~5 年, 严重危害人类健康[4]。该病的形成机制复杂, 尚不完全清楚, 临床上缺乏有效的治疗手段。历来应用皮质类固醇和环磷酰胺、硫唑嘌呤等免疫抑制剂及秋水仙碱等抗纤维化制剂治疗, 但疗效欠佳。因此, 研究该病的发病机制, 阐明其病理生理过程, 寻找有效的治疗药物和靶点成为目前国内外学者研究的热点。以往都致力于致肺纤维化因子的研究, 很少对拮抗纤维化的因子进行探讨。
ADAMTS-1 意为含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶, 是继基质金属蛋白酶MMP后新发现的一类Zn2+依赖的分泌型金属蛋白酶, 是ADAMTS家族的第一个成员, 1997 年由KUNO等人[5]在小鼠结肠癌基因差异显示和筛选中发现并命名, 在哺乳动物组织中广泛表达, 可由巨噬细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞等多种细胞合成和分泌。与多种疾病有关, 如肿瘤浸润[6]、动脉粥样硬化[7]、椎间盘退变[8]、哮喘[9]、关节炎[10]等。郭春艳[11]通过动物实验发现ADAMTS-1 与心肌纤维化密切相关, 本课题组肖兴洲等人[3]也发现在肺纤维化大鼠肺部组织中ADAMTS-1 的表达降低, 推测ADAMTS-1具有抗纤维化作用。
从本实验检测各组COL1 m RNA及蛋白表达的结果来看, 对照组COL1 的表达较各ADAMTS-1 浓度组高, 并且ADAMTS-1 浓度越高, COL1 表达越低。该结果说明ADAMTS-1 可以降低成纤维细胞内Ⅰ型胶原蛋白的表达。
细胞外基质包括Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、纤连蛋白和蛋白多糖。肺纤维化是各种致纤维化因素和抗纤维化因素之间的平衡被打破, 细胞外基质积聚, 最后疤痕组织形成的结果。所以, ADAMTS-1 通过降低Ⅰ型胶原蛋白可能具有一定的抗纤维化作用。
纤维化的重要调节因子包括:细胞因子 (IL-13、IL-21 和TGF-β1) 、趋化因子 (MCP-1 和MIP-1β) 、血管生成因子 (VEGF) 、生长因子 (PDGF) 、过氧化物酶体增殖物激活受体 (PPARs) 、急性期蛋白 (SAP) 、半胱氨酸蛋白酶、肾素- 血管紧张素- 固酮系统 (血管紧张素Ⅱ) 。在众多调节因子中, TGF-β1是公认的最重要的调控因子, 是诱导器官纤维化的总开关。在组织损伤或炎症时, TGF-β1促进成纤维细胞分化成肌成纤维细胞, 肌成纤维细胞表达 α- 平滑肌肌动蛋白 (α-SMA) 、钙调蛋白和细胞外基质, 促使细胞外基质过度积聚, 疤痕形成, 导致纤维化。本实验检测TGF-β1m RNA及蛋白的表达发现, 各ADAMTS-1 浓度组TGF-β1的表达较对照组低, 并且ADAMTS-1 浓度越高, TGF-β1的表达越低。证明ADAMTS-1 能够降低成纤维细胞内TGF-β1的表达。ADAMTS-1 降低Ⅰ型胶原蛋白, 下调TGF-β1可能是其潜在机制。
TGF-β1可由各种细胞合成, 以转化生长因子-转化生长因子结合蛋白复合体的形式分泌。在纤维蛋白溶酶、活性氧、血小板反应素-1 和酸性物质蛋白水解作用下, TGF-β1与转化生长因子结合蛋白 (LTBP) 分离, 具有活性, 与相应的受体识别结合, 激活下游的信号通路, 发挥其功能[12]。目前, 下游部分分子途径已经被确认, 包括Smad途径、PI3K/Akt途径和MAPK途径[13]。ADAMTS-1 是否下调或者抑制TGF-β1的下游信号通路, 下调或者抑制TGF-β1的哪条下游信号通路, 目前并不明确, 还有待进一步实验研究。探索拮抗纤维化的因子在纤维化过程中的变化规律并进行外源性的干预, 可能为寻求拮抗纤维化的方法开辟新的思路。
摘要：目的 探讨含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶 (ADAMTS-1) 对小鼠肺成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白 (COL1) 表达的影响及可能的机制。方法 应用细胞培养技术进行小鼠肺成纤维细胞培养, 利用ADAMTS-1为刺激因子, 将培养的细胞分为空白组、低、中、高浓度组, 应用逆转录-多聚酶链反应技术 (RT-PCR) 观察COL1 mRNA、转化生长因子β1 (TGF-β1) mRNA在各组中的表达情况;采用蛋白质印迹法 (Western blotting) 观察各组细胞COL1、TGF-β1的变化。结果 与空白组相比, 低浓度组、中浓度组、高浓度组的COL1、TGF-β1表达水平下降, 其中高浓度组表达水平最低 (P<0.05) 。结论 ADAMTS-1能降低COL1的表达, 抑制TGF-β1是其抗纤维化作用的可能潜在机制。
Ⅰ型胶原纤维 篇3
本研究旨在构建COL1A1 C端甘氨酸重复序列基因(氨基酸1 000~1 189)的真核表达载体,转染CHO细胞进行表达,并检测其与鼠成纤维细胞表面Endo180是否能够相互作用,为深入研究COL1A1基因的生物学功能提供了依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
p APtag-4质粒、prcol1α1质粒、E.coli GH2感受态、中国仓鼠卵巢细胞(二氢叶酸缺陷型,dhfr-/-)、鼠胚胎成纤维细胞(Rat-1)由Gene Hunter公司提供。
1.1.2 试剂
DL5000 DNA marker、限制性内切酶、r Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶购于Takara公司;胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自OMEGA公司;引物合成和DNA测序由TSINGKE公司完成;Fu GENE 6购自Roche公司;兔抗人AP多克隆抗体购自Gene Hunter公司;HRP标记的羊抗兔Ig G二抗购自Southern Biotch公司;Reagent A(含氯化镁、二乙醇胺、BSA和对硝基苯磷酸酯)购自Gene Hunter公司;Reagent S(氯化硝基四氮唑兰)购自Sigma公司;胎牛血清购自Bovogen公司。其他试剂和耗材均购自国内生物公司。
1.1.3 仪器
PCR仪(Bio-Rad);电泳仪(北京JUNYI电泳仪公司);冷冻离心机(Eppendorf公司);凝胶成像系统(Bio-Rad公司);CO2恒温培养箱(Thermo Fisher公司)。
1.1.4 培养基
胎牛血清购自Hyclone公司;DMEM高糖培养基和IMDM培养基均购自Hyclone公司。
1.2 方法
1.2.1 COL1A1 C端甘氨酸重复序列基因的获取
根据NCBI数据库中鼠COL1A1的c DNA序列设计一对用于扩增COL1A1 C端甘氨酸重复序列基因(氨基酸1 000~1 189)的引物,上游引物P1:5'-GTAGATCTGGACGTGAGGGG-3',下划线为BglⅡ酶切位点,下游引物P2:5'-GGTCTAGATTT-GAAGCTGAAGTCG-3',下划线为XbaⅠ酶切位点。以含有COL1A1的c DNA全长的质粒prcol1α1为模板,以P1、P2为上下游引物,用r Taq DNA聚合酶进行PCR扩增目的基因。PCR扩增条件为:94℃、5 min;94℃、30 s,58℃、1 min,72℃、1 min,循环数30;72℃、5 min。PCR产物经过2%琼脂糖凝胶电泳后割胶回收。
1.2.2 真核表达质粒p AP-Gly的构建和鉴定
用BglⅡ和XbaⅠ双酶切甘氨酸重复序列基因和真核表达载体p AP-tag4,将酶切后的p AP-tag4和甘氨酸重复序列分别进行割胶回收。将纯化的p AP-tag4和甘氨酸重复序列基因(1∶10)经T4DNA连接酶16℃连接过夜,并转化E.coli GH2感受态,使用含有氨苄和四环素双抗的固体LB培养板挑取单菌落培养,提取质粒,然后进行PCR鉴定、双酶切鉴定以及送到TSINGKE公司基因测序鉴定,得到测序完全正确的p AP-Gly重组质粒(图1)。
1.2.3 重组质粒转染CHO细胞
将生长状态良好的CHO(dhfr-/-)细胞经胰酶消化后用血球计数板计数,以每孔5×104细胞密度铺到六孔板中,培养时加入1×次黄嘌呤与胸腺嘧啶(HT)至IMDM培养基中,放入5%CO2孵箱中37℃培养24 h。当CHO(dhfr-/-)细胞长到50%~70%汇合度时,按照Roche公司提供的Fu GENE 6操作说明书进行转染,阴性对照为转染空质粒p AP-tag4的CHO(dhfr-/-)细胞,空白对照为无转染的CHO(dhfr-/-)细胞。转染72 h后进行蛋白水平鉴定。
1.2.4 AP活性测定检测AP-Gly蛋白在细胞中的表达
转染72 h后,收集六孔板中细胞培养基,5 000r/min离心5 min,取上清检测培养基中的AP活性。具体AP活性测定方法如下:取50μL含有AP-Gly蛋白的细胞培养基(以50μL IMDM培养基作为负对照),然后加入等体积AP反应底物2×Reagent A,立即放入37℃水浴锅并计时,待溶液变成黄色后,用100μL 0.5 mol/L Na OH终止反应,然后加入800μL双蒸水,利用酶标仪读取溶液OD405。根据公式54×OD405/(T·V)计算AP活性,其中T为水浴时间(min),V为样品体积(μL),AP活性单位是U/m L。
1.2.5 Western Blot鉴定AP-Gly蛋白的表达
将上述检测到有AP活性的AP或AP-Gly细胞培养基用PBS均调至相同AP活性,分别用加巯基乙醇和不加巯基乙醇两种蛋白上样缓冲液处理,沸水煮5 min,蛋白经过8%SDS-PAGE分离并且转PVDF膜。使用5%脱脂奶粉室温封闭1h,加入兔抗人AP多克隆抗体(1∶2 000)室温孵育2 h或4℃孵育过夜,TBST洗膜3次,加入羊抗兔Ig G二抗(1∶5 000)室温孵育1 h,TBST洗膜3次。加入ECL显影液,在凝胶成像仪(Bio-Rad)上拍照。
1.2.6 Rat-1细胞原位染色
取出Rat-1细胞六孔板培养皿并且弃掉培养基,用预冷的1 m L的HBHA(5 mmol/L KCl,0.44mmol/L KH2PO4,0.49 mmol/L Mg Cl2·6H2O,136mmol/L Na Cl,0.4 mmol/L Na H2PO4,5%BSA)清洗细胞1次,每孔中分别加入1U/m L的AP或AP-Gly细胞培养基,于4℃避光孵育90min,弃掉上述细胞培养基,用1 m L HBHA溶液在10 min内清洗细胞至少5次,每孔加入500μL固定液(60%acetone,3%formaldehyde,20 mmol/L HEPES p H7.5),固定细胞30 s,迅速弃掉固定液,加入1 m L HS溶液(1.6 mmol/L Na Cl,20 mmol/L HEPES p H 7.5)清洗细胞2次,加入1 m L HS溶液,将培养皿放在65℃水浴锅20 min(去除内源AP),然后弃掉HS溶液,每孔加入500μL AP显色底物Reagent S,于37℃孵箱显色2 h,直到在显微镜下观察到实验组细胞染成蓝紫色,而负对照组没有出现染色情况。
1.2.7 Rat-1细胞定量染色
取出Rat-1细胞六孔板培养皿并且弃掉培养基,用预冷的1 m L的HBHA清洗细胞1次,然后每孔中分别加入1 U/m L的AP或AP-Gly细胞培养基,于4℃避光孵育90 min,弃掉上述细胞培养基,加入200μL细胞裂解液(10 mmol/L Tris-HCl p H8.0,1%Triton×100)放置5 min后,将细胞刮下来,收集细胞液到1.5 m L离心管中,于4℃离心机最大转速离心2 min,收集上清,BCA法测定上清中Rat-1细胞全蛋白浓度,与此同时,将剩余上清于65℃孵育20 min(去除内源AP),最后按照上述AP活性测定方法测定各实验组上清中AP活性。
1.2.8 Rat-1细胞全蛋白的提取
取出Rat-1细胞培养皿并且弃掉培养基,用5m L预冷的PBS清洗细胞1次,再加入1 m L预冷PBS,将细胞刮下来,收集细胞液到1.5 m L离心管中,用4℃离心机2 000 r/min离心2 min,弃上清,然后在离心管中加入200μL预冷的细胞裂解液(10mmol/L HEPES,p H 8.0,10 mmol/L KCl,0.1 mmol/L EDTA,0.1 mmol/L EGTA,1 mmol/L PMSF,1mmol/L DTT,0.3%NP40),于4℃裂解细胞30min,4℃离心机最大转速离心10 min,收集上清。用BCA方法测定全蛋白浓度。
1.2.9 AP-Gly与Rat-1全蛋白的配体受体亲和印迹实验
将Rat-1全蛋白分别用加巯基乙醇和不加巯基乙醇的两种蛋白上样缓冲液处理,沸水煮5 min,上述蛋白经过8%SDS-PAGE分离并且转PVDF膜后,用5%脱脂奶粉封闭1 h后,TBST洗膜3次,分别用等AP活性的AP、AP-Gly、AP-Coll细胞培养基孵育,室温孵育2 h或者4℃摇过夜,TBST洗膜3次,往膜上滴加入AP反应底物Reagent S,直到出现蓝紫色目的条带,用双蒸水反复冲洗PVDF膜终止反应,在凝胶成像仪上拍照。
1.2.1 0 统计学分析
每次实验均独立重复3次,数据以平均数±标准误差(mean±SEM)表示,使用Graph Pad Prism5.0统计学软件进行单因素方差分析,组间两两比较采用t检验分析并作图,当P<0.05时具有统计学意义,*P<0.05,**P<0.01。
2 结果与分析
2.1 COL1A1 C端甘氨酸重复序列基因的PCR扩增
利用合成的引物以含COL1A1 c DNA全长的prcol1α1质粒为模板进行PCR扩增C端甘氨酸重复序列全长,利用2%琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物在500 bp~750 bp之间可见约570 bp的特异性单一条带,基因大小与预期相符合(图2)。
Note:M:DNA marker DL5000;1:C-terminal glycine repeats gene.
2.2 重组质粒p AP-Gly的PCR鉴定
将C端甘氨酸重复序列基因扩增产物与p AP-tag4载体连接,转化E.coli GH2感受态,进行菌液PCR鉴定。2%琼脂糖凝胶电泳结果可见约500 bp~750 bp处存在C端甘氨酸重复序列的的基因片段,说明重组质粒中含有C端甘氨酸重复序列基因(图3)。
Note:M:DNA marker DL5000;1-16:Electrophoretic profile of PCRproduct of p AP-Gly.
2.3 重组质粒p AP-Gly的双酶切鉴定
重组质粒用限制性内切酶BglⅡ和XbaⅠ双酶切后进行2%琼脂糖凝胶电泳分析,结果可见约5 500 bp的空质粒p AP-tag4片段和约570 bp的C端甘氨酸重复序列基因的目的片段,显示重组质粒构建成功(图4)。对上述鉴定正确的质粒进行测序并且在NCBI上进行BLAST比对,编码框完全正确,将测序正确的克隆命名为p AP-Gly。
Note:M:DNA marker;1:p AP-Gly with endonuclease.
2.4 Western Blot检测融合蛋白的表达
转染p AP-Gly重组质粒于CHO(dhfr-/-)细胞中,收集细胞培养基进行Western Blot检测。Western Blot结果中,重组质粒组可检测到约77k Da大小条带(可能是由于存在表达提前终止现象,故还有一条略小条带),空质粒组检测到67k Da条带(图5)。
注:1:AP(加巯基乙醇);2:AP(不加巯基乙醇);3:AP-Gly(加巯基乙醇);4:AP-Gly(不加巯基乙醇)。Note:1:AP(+β-Me);2:AP(-β-Me);3:AP-Gly(+β-Me);4:AP-Gly(-β-Me).
2.5 细胞原位染色检测AP-Gly与Rat-1细胞表面的相互作用
为了检测AP-Gly融合蛋白是否能够和Rat-1细胞表面结合,用1 U/m L AP-Gly的细胞培养基去孵育Rat-1细胞90 min(负对照为含AP蛋白的细胞培养基),最后加入AP反应底物Reagent S于37℃孵箱显色。细胞原位染色分析表明:AP-Gly与Rat-1细胞表面能够发生结合,催化AP底物Reagrnt S发生颜色反应,而负对照却没有颜色变化(图6)。
2.6 细胞定量染色分析AP-Gly与Rat-1细胞全蛋白的相互作用
为了进一步证实AP-Gly融合蛋白能够与Rat-1细胞相互作用,我们进行细胞定量染色分析,用1 U/m L AP-Gly的细胞培养基去孵育Rat-1细胞90 min(负对照为含AP蛋白的细胞培养基)。细胞定量染色结果表明:实验组在Rat-1全蛋白量基本一致的情况下(图7A),AP-Gly融合蛋白能够和Rat-1全蛋白结合,催化AP底物Reagent A发生颜色变化,因而在波长为405 nm下具有很强的吸光值,而AP蛋白不能够与Rat-1全蛋白结合,所以在405nm下基本没有吸光值(表1)。AP-Gly与Rat-1细胞全蛋白的结合和AP对照组具有极显著差异(*P<0.05,**P<0.01)(图7B)。
2.7 配体受体亲和印迹实验
之前我们实验室用AP标签亲和标记了COL1A1的C端区域(氨基酸1 000~1 453),融合蛋白命名为AP-Coll,且证实了AP-Coll能够和Rat-1细胞表面的Endo180结合[10]。通过配体受体亲和印迹实验,我们进一步探究AP-Gly融合蛋白是否同样和Rat-1细胞表面的Endo180结合。
注:A:两组Rat-1细胞全蛋白量基本相同;B:AP-Gly能够与Rat-1全蛋白结合,与AP组有极显著差异。Note:A:Normalization of whole cell extract of Rat-1 cells;B:Bound AP activity.
将加巯基乙醇和不加巯基乙醇处理过的Rat-1全蛋白经8%SDS-PAGE分离并转PVDF膜后,5%脱脂牛奶封闭过后,分别用含有等活性的AP、AP-Gly、AP-Coll蛋白的细胞培养基室温孵育2h或4℃过夜孵育后,TBST清洗3次,用AP底物Reagent S滴加在PVDF膜上显色。结果表明:AP-Gly实验组并没有出现蓝紫色条带,而AP-Coll实验组能够在150 k Da~250 k Da之间出现蓝紫色条带(Endo180大小为180 k Da),AP负对照组也没有出现蓝紫色条带(图8)。我们推测AP-Gly融合蛋白应该是和Rat-1细胞表面2种或2种以上的蛋白组成的复合物结合。
Note:M:protein marker;1:whole cell extract(+β-Me);2:whole cell extract(-β-Me).
3 讨论
细胞外基质的重塑对发育、稳态以及出生后组织重塑都有很重要的作用,同样与肿瘤发生、许多细胞增生疾病紧密相关。Ⅰ型胶原蛋白作为细胞外基质成分中的重要一员,一直备受科学家的关注。Ⅰ型胶原蛋白是由(α1)2α2组成的异源三聚体。前体Ⅰ型胶原蛋白是由N端肽、中间的(Gly-X-Y)n甘氨酸重复序列、C端肽三部分组成的三股螺旋结构。在前体Ⅰ型胶原蛋白分泌到细胞外后,特定的蛋白酶分别将N端肽和C端肽剪切,形成只有(Gly-X-Y)n甘氨酸重复序列的成熟Ⅰ型胶原蛋白。最近的研究表明,Ⅰ型胶原蛋白的N端肽能够作为诊断肺癌骨转移过程中的一个代谢指标,患者尿液中的N端肽比正常人高[11]。COL1A1C端肽中一个氨基酸的替换将会导致致死性的成骨生成缺陷以及许多骨骼疾病[12]。COL1A1基因中第2 317个碱基由G替换为T的新生错义突变,第773个氨基酸由Gly转换为Cys,导致了非常严重的并且威胁终生的成骨生成缺陷[13]。COL1A1基因不仅与成骨生成密切相关,并且在乳腺癌细胞和内皮细胞的定向迁移过程中也起着很重要的作用[14]。
Endo180是Ⅰ型胶原蛋白的一个极其重要的受体,它与Ⅰ型胶原蛋白的相互作用与胶原蛋白的内吞、降解以及细胞粘附、肿瘤迁移等均有密切的联系。Endo180的表达常见于成纤维细胞和内皮细胞中。前期研究中,笔者课题组证实了COL1A1基因C端区域(氨基酸1 000~1 453)能够和鼠胚胎成纤维细胞表面的Endo180受体结合,并且它们的结合与细胞粘附紧密相关。但是,仅仅COL1A1C端甘氨酸重复序列是否参与细胞粘附还有待进一步研究。
本实验成功获得了COL1A1 C端甘氨酸重复序列基因(氨基酸1 000~1 189),构建了C端甘氨酸重复序列基因的真核表达质粒p AP-Gly,并在CHO细胞中成功表达,Western Blot分析转染重组质粒的细胞培养基可以检测到与预期一致的77 k Da蛋白。细胞原位染色表明AP-Gly能够与鼠成纤维细胞结合。细胞定量染色实验表明,AP-Gly与鼠成纤维细胞表面结合能力很强,相对于AP有极显著差异(**P<0.01)。配体受体亲和印迹实验表明,AP-Gly并不是和成纤维细胞表面的Endo180结合,也不能和成纤维细胞全蛋白中的任何一种单一蛋白结合,我们推测与其结合的受体蛋白很有可能是2种或2种以上的蛋白组成的复合物。
Ⅰ型胶原纤维 篇4
1材料和方法
1.1 材料与试剂
MRC-5细胞株购自中国科学院上海细胞生物学研究所;DMEM培养基为Gibco公司产品;胎牛血清购自PAA公司;recombinant MIF (rMIF) 、TGF-β1 ELISA试剂盒购自R&D 公司;TrizolRNA抽取试剂为Invitrogen公司产品, 逆转录试剂盒购自Fermentas生物技术有限公司;PCR引物由上海英骏公司合成;鼠抗人Ⅰ型胶原抗体购自Santa Cruz;HRP-兔抗鼠IgG (Ⅱ抗) 购自北京博奥森生物技术有限公司;Rho激酶抑制剂Y27632购自BioSource公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养及分组。
MRC-5细胞培养于加入10%胎牛血清的DMEM培养液中, 放置于37℃、5%CO2培养箱中。实验分为实验组和对照组, 实验组分别加入100μg/L的rMIF。
1.2.2 RT-PCR方法检测Ⅰ型胶原mRNA的表达。
使用6孔板, 对照组和实验组孵育完成后收集细胞, Trizol提取总RNA, 用紫外分光光度计检测纯度。反应分2步进行:取5μl总RNA, 在M-MLV逆转录酶作用下合成DNA;再取1μl逆转录产物进行PCR扩增反应。Ⅰ型胶原上游引物为5’-GCTGGCTACTTCTCGCTCTG-3’, 下游为5’-AGCAGTTGGAGGCTGTGGG-3’, 产物大小267 bp; GAPDH上游引物为5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’, 下游引物:5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’, 产物大小450 bp。 PCR反应条件: 94℃预变性5 min, 94℃ 1min, 53℃ 45s, 72℃ 1min, 进行36个循环, 最后72℃延伸10min。每一PCR反应重复3次。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离, 紫外透射反射仪观察扩增产物的大小及亮度并摄影。使用IPP6.0图像分析软件对扩增条带进行分析, 以平均灰度值代表相应基因的表达量, 并除以GAPDH灰度值, 所得数值作为各扩增产物mRNA的相对表达量。
1.2.3 Western blotting检测Ⅰ型胶原蛋白表达。
用预冷PBS洗细胞3次, 加入200μl蛋白裂解液, 刮起细胞, 4℃12 000×g离心15min, 吸取上清, BCA法测定总蛋白浓度。取40μg的上述样品加样至15%的SDS-PAGE凝胶, 电泳, 待溴酚蓝接近凝胶底部时停止电泳, 用转移缓冲液把凝胶上蛋白质转移至硝酸纤维膜上, 膜在室温下用5%脱脂奶粉封闭液封闭1h, 加入1∶500稀释的鼠抗人Ⅰ型胶原抗体及β-actin单克隆抗体于4℃孵育12h, 然后加辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗 (1∶10 000) 室温孵育1h, TBST洗膜后用ECL液显影, 以β-actin为内参照, 用IPP6.0图像分析软件对Ⅰ型胶原蛋白进行半定量分析。
1.2.4 ELISA法检测培养上清中TGF-β1蛋白表达。
取对数生长期MRC-5细胞1×103个接种于6孔板中, 培养24h;换无血清培养基, 继续培养24h, 使细胞进入生长静止期;吸弃各孔培养基, 换为终浓度为100μg/L rMIF的含10%胎牛血清的DMEM 2ml, 分别培养6、12、24、28h;分别收集细胞培养上清液, 4℃下3 000×g离心10min, 收集上清。按试剂说明书测定TGF-β1蛋白浓度。
1.3 统计学处理
所有数据采用均数±标准差
2结果
2.1 培养的MRC-5形态
如图1所示, 光镜下见MRC-5细胞生长旺盛, 分布密集, 多呈长梭形、细胞走向趋于一致, 近于排列, 并有一定的弧形。高倍镜下可见长梭形细胞的细胞体饱满、有2～3个扁平而长的突起, 细胞核较大, 呈卵圆形且多居中。
2.2 rMIF对MRC-5培养上清TGF-β1蛋白浓度的影响
如图2、表1所示, 与同一时间点未加rMIF的对照组比较, 100μg/L 的rMIF刺激MRC-5细胞6h、12h、24h、48h后, 细胞培养上清中的TGF-β1浓度无显著变化 (P>0.05) 。
细胞培养上清TGF-β1浓度 (pg/mL) (x±s, n=6)
rMIF刺激促进MRC-5细胞Ⅰ型胶原mRNA转录, 拮抗Rho激酶抑制此促进作用 如图3所示, 100μg/L 的rMIF刺激48h后, MRC-5细胞Ⅰ型胶原mRNA合成显著增加 (P<0.01) ;Rho拮抗剂预刺激后, rMIF促进Ⅰ型胶原mRNA合成能力显著减弱 (P<0.01) 。
注:与对照组比较, P均>0.05。
注:1:标记;2对照组;3:+RMIF (100μg/L) ;4:+Y27632 5:+rMIF+Y27632。
2.4 100μg/L rMIF刺激促进MRC-5细胞Ⅰ型胶原蛋白合成, 拮抗Rho激酶抑制此促进作用 如图4所示, 100μg/L 的rMIF刺激48h后, MRC-5细胞Ⅰ型胶原蛋白合成显著增加 (P<0.01) ;Rho拮抗剂预刺激后, rMIF促进Ⅰ型胶原蛋白合成能力显著减弱 (P<0.01) 。
3讨论
MIF既是一种细胞因子, 又是一种源于垂体的激素, 还可作为糖皮质激素生理活动的负反馈调节剂, 具有广泛的生物学功能的细胞因子。MIF可促进血管平滑肌细胞合成Ⅰ、Ⅲ型胶原 mRNA和Ⅰ型胶原蛋白, 参与高血压血管重构[7], 与动脉内膜增厚有关[8]。Sasaki等[9]发现MIF还可促进肾小球纤维化形成。提示MIF在胶原合成和器官纤维化中具有重要作用。以MIF拮抗剂ISO-1治疗慢性哮喘小鼠, 可减轻气道重塑, 提示MIF在气道重塑中起重要作用[6]。但MIF如何参与该过程, 机制未明。
成纤维细胞 (fibroblast, FB) 气道黏膜下的主要结构细胞之一, 其产生的胶原纤维、弹性纤维和网状纤维等沉积于基底膜, 使气道壁进一步增厚。哮喘患者增厚的基底膜层主要是由Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ胶原纤维和成肌纤维细胞产生的纤维连接蛋白组成[1]。Ⅰ型胶原的沉积促使管壁增厚和僵硬, 与α-平滑肌肌动蛋白一起被认为是早期气道重塑的重要指标[2]。因此作者探讨了MIF与Ⅰ型胶原合成之间的关系。本研究结果表明, rMIF可促进Ⅰ型胶原mRNA和蛋白合成。这提示MIF可能通过促进成纤维细胞Ⅰ型胶原合成而参与哮喘的气道重塑。MIF导致MRC-5细胞Ⅰ型胶原表达增多的机制尚不清楚。最近发现, MIF可激活Rho激酶途径[10]。在调控血管紧张素Ⅱ刺激大鼠心肌成纤维细胞增殖与胶原合成中, Rho激酶具有重要作用[11]。Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶 (Rho associated coiled coil forming protein kinase, ROCK) 是Rho蛋白的下游靶效应分子之一。Y27632是在细胞生物学和药理学研究中广为应用的ROCK抑制剂。本研究在rMIF刺激MRC-5细胞前预先用Y27632处理, 观察其对rMIF促进Ⅰ型胶原合成中的影响。结果显示, rMIF诱导MRC-5细胞Ⅰ型胶原合成的能力可被Y27632所抑制。由于Y27632只特异性作用于Rho激酶, 因此本结果提示Rho激酶信号通路可能参与了rMIF诱导的MRC-5细胞Ⅰ 型胶原合成。
TGF-β1是一个很重要的促纤维化细胞因子, 在哮喘气道重塑中起重要作用。哮喘患者气道TGF-β1表达增加, 与病情的严重程度和上皮下纤维化程度相关[12]。TGF-β1可诱导鼠成纤维细胞向成肌纤维细胞转化[13], 增加胶原Ⅰ和Ⅲ合成而引起肺纤维化[14]。Holgate等报道TGF-β1可促进成纤维细胞增殖、胶原合成、细胞外基质积聚及向肌成纤维细胞表型分化[15,16]。在人细胞上, Batra等[17]的研究提示TGF-β1的促纤维化机制是通过提高成纤维细胞生长、胶原产生和促进成纤维细胞转化成成肌纤维细胞以产生更多的胶原和细胞外基质等而实现的。本研究也探讨了rMIF刺激MRC-5细胞后TGF-β1的表达。结果显示, 100μg/L的rMIF刺激6h、12h、24h、48h后, 细胞培养上清中的TGF-β1浓度无显著变化。这提示rMIF诱导MRC-5细胞胶原合成可能与TGF-β1的作用无关。之前笔者在哮喘小鼠肺中观察到TGF-β1表达增加, 拮抗MIF可使小鼠TGF-β1表达下调[6], 与本实验结果不大一致。究其原因有: (1) rMIF未影响到MRC-5细胞培养上清中TGF-β1蛋白水平, 但未必不影响其mRNA和细胞内蛋白水平, 应进一步检测上述2个指标; (2) 巨噬细胞、上皮细胞、成纤维细胞和EOS均能分泌TGF-β1。rMIF对MRC-5分泌TGF-β1无影响, 但不能除外影响巨噬细胞、上皮细胞、EOS等分泌TGF-β1进而影响了哮喘小鼠肺TGF-β1的表达; (3) 体内实验和体外实验的差别。究竟何种原因所致有待进一步研究。
总之, MIF可能通过Rho途径刺激成纤维细胞胶原Ⅰ型合成从而在哮喘气道重塑的发病机制中发挥重要作用。
摘要：目的:观察重组巨噬细胞移动抑制因子 (rMIF) 对人胚肺成纤维细胞 (MRC-5) 的作用, 探讨哮喘气道重塑的发生机制。方法:100μg/L的rMIF刺激MRC-5细胞6h、12h、24h、48h后, ELISA法测定细胞培养上清中TGF-β1蛋白含量;100μg/L的rMIF作用于MRC-5细胞48h, RT-PCR法检测Ⅰ型胶原mRNA表达, Western blotting检测Ⅰ型胶原蛋白合成;100μg/L的rMIF刺激MRC-5细胞48h, 刺激前0.5h加入Rho激酶特异性抑制剂Y27632, RT-PCR法检测Ⅰ型胶原mRNA表达, western blotting法检测Ⅰ型胶原蛋白表达。结果:与对照组比较, 100μg/L的rMIF对细胞培养上清TGF-β1蛋白含量无显著影响 (P>0.05) ;100μg/L的rMIF可显著促进Ⅰ型胶原mRNA (P<0.01) 和蛋白 (P<0.01) 合成。Y27632预刺激后, 100μg/L的rMIF促进Ⅰ型胶原mRNA和蛋白合成能力显著减弱 (P均<0.01) 。结论:MIF可能通过Rho途径刺激人肺成纤维细胞Ⅰ型胶原合成从而在哮喘气道重塑的发病机制中发挥重要作用。
Ⅰ型胶原纤维 篇5
1 材料与方法
1.1研究对象
随机选取白求恩国际和平医院口腔科就诊的牙周病患者60 人, 共计77 颗观察牙。患者平均年龄42. 3岁, 男、女各30 名。所有研究对象3 个月内无使用抗生素类药物、避孕药物史, 无全身系统疾病, 女性非妊娠及哺乳期, 无吸烟史。所有观察牙牙体无龋损及充填物。
1. 2 全口牙周情况检查及记录内容
1. 2. 1菌斑指数 ( plaque index, PLI) 据Quigley-Hein标准分为0 ~ 5 级［5］, 0: 无菌斑; 1: 牙颈部有散在菌斑; 2: 牙颈部菌斑薄而连续呈带状, 宽度小于1mm; 3: 菌斑占牙面1 /3 以下; 4: 菌斑覆盖面介于1 /3~ 2 /3之间; 5: 菌斑占牙面2 /3 以上。
1. 2. 2 牙龈指数 ( gingival index, GI) 据Loe-Silness标准将钝头牙周探针尖接触牙龈边缘, 牙龈组织只被轻轻的触及, 观察出血情况。据出血程度分为0 ~ 3级［6］。0: 正常牙龈; 1: 轻度炎症, 探诊不出血, 仅有轻度的水肿和颜色的改变; 2: 中度炎症, 牙龈红肿, 表面光亮, 探诊时出血; 3: 重度炎症, 红肿明显, 可有溃疡形成, 有自发性出血倾向。
1. 2. 3 牙周袋探诊深度 ( probing depth, PD) 统一采用Williams刻度的牙周探针, 探测从袋 ( 或龈沟) 底到龈缘的距离, 探诊牙周袋 ( 或龈沟) 的最深点记录为探诊深度［5］, 结果以mm为单位, 四舍五入。
为便于比较, 按牙周袋最大探诊深度分为浅牙周袋、中牙周袋、深牙周袋3 个等级资料组, 确定4 ~ 6mm为浅牙周袋组, 大于6 mm但小于8 mm为 ( 包括6mm、8 mm) 中牙周袋组, 8 mm以上为深牙周袋组。1. 2. 4附着丧失 ( attachment loss, AL) 统一采用Williams刻度的牙周探针, 测量牙周袋深度后, 当探针尖沿牙根面退出时, 探寻釉牙骨质界位置, 测得釉牙骨质界到龈缘的距离［5］, 结果以mm为单位, 四舍五入。
附着丧失= 袋深- 釉牙骨质界到龈缘的距离。
若牙龈退缩, 附着丧失= 袋深+ 釉牙骨质界到龈缘的距离
为便于比较, 将附着丧失分为无附着丧失、轻度附着丧失、中度附着丧失、重度附着丧失4 个等级资料, 确定0 mm为无附着丧失, 1 ~2 mm ( 包括2 mm) 为轻度附着丧失, 3 ~4 mm ( 包括4 mm) 为中度附着丧失, 大于4 mm为重度附着丧失。
1. 3 龈沟液样本的采集和保存
龈沟液取样方法采用Lamster［6］描述的方法。首先以卷棉隔湿取样牙位, 用消毒手动器械去除受试牙的龈上菌斑, 然后轻轻以气枪吹干受试牙牙面及周围牙龈黏膜, 再用2 个已称重的专用2 mm × 10 mmWhatman滤纸条轻轻插入受试牙的近中颊和远中舌侧牙周袋 ( 或龈沟) 内, 至有轻微阻力为止, 留置30 s后取出 ( 舍去带血或被唾液污染的标本) , 放入已称重的Eppendorf管中再次称重, 减去原重量, 用比重 ( 约1mg / μl) 换算成体积。称重后的样本立即加入100 μlPBS缓冲液, 放于- 30 ℃ 冰箱保存待检测。
1. 4 龈沟液中CTX的检测
采用酶联免疫吸附法 ( enzyme-linked immunosor-bent assay, ELISA) 对龈沟液中CTX水平进行检测。
所有的样本收集完毕后, 将冷冻样本在室温下解冻; 漩涡震荡器震荡2 min; 间隔5 min再次震荡2min; 3 000 r / min离心10 min后取上清液用于检测CTX。使用CTX酶联免疫试剂盒 ( Adlitteram Diagnos-tic Laboratories, 美国) 测定CTX水平。
1. 5 统计分析
应用SPSS 11. 0 软件, 采用秩和检验Kruskal-Wal-lis方法进行统计学分析, P < 0. 05 认定为差异具有统计学意义。
2 结果
2. 1 菌斑指数与龈沟液CTX测定值的关系
菌斑指数不同分值所对应的龈沟液CTX的浓度见图1, 秩和检验H =40. 992, P =0. 000; 提示菌斑指数不同分值所对应的龈沟液CTX浓度差异有统计学意义。因菌斑指数为0 和5 在临床检查结果中未出现, 将其余4 个菌斑指数分别经Nemenyi秩和检验进行两两比较; 菌斑指数1 与2、1 与3、1 与4、2 与3、2与4 组间, P <0. 05, 差异有统计学意义, 而菌斑指数3与4 组间, P >0. 05, 差异无统计学意义。
2. 2 牙龈指数与龈沟液CTX浓度测定值的关系
因牙龈指数为1 的样本数仅2 例, 将牙龈指数为0 和1 的合并为一组, 分别与牙龈指数为2、3 所对应的龈沟液中CTX浓度测定值比较 ( 图2) , 秩和检验H= 30. 987, P = 0. 000。经Nemenyi秩和检验进行该指数组间两两比较, 牙龈指数为0 和1 组与2、0 和1 组与3、2 与3 组组间P <0. 05, 差异有统计学意义。
2. 3 牙周探诊深度与龈沟液CTX测定值的关系
牙周探诊深度所对应龈沟液中CTX浓度见图3, 秩和检验H = 15. 485, P = 0. 000; 经Nemenyi秩和检验组间两两比较, 浅牙周袋组与中牙周袋组、浅牙周袋组与深牙周袋组龈沟液中CTX浓度测定值P <0. 05, 差异具有统计学意义; 而中牙周袋组与深牙周袋组间龈沟液中CTX浓度测定值P >0. 05, 差异无统计学意义。
2. 4 附着丧失与龈沟液CTX测定值的关系
由于轻度附着丧失样本数太少, 无附着丧失和轻度附着丧失合并为一组, 与中度附着丧失组、重度附着丧失组所对应的龈沟液中CTX浓度测定值比较 ( 图4) , 秩和检验H = 26. 822, P = 0. 000。经Nemenyi秩和检验组间两两比较, 无附着丧失和轻度附着丧失组与中度附着丧失组、无附着丧失和轻度附着丧失组与重度附着丧失组龈沟液CTX浓度测定值比较P <0. 05, 差异有统计学意义。中度与重度附着丧失组龈沟液CTX浓度比较P >0. 05, 差异无统计学意义。
2. 5 相关性分析
菌斑指数, 牙龈出血指数, 牙周袋深度, 附着丧失水平与龈沟液中CTX浓度存在统计学相关性 ( 表1) 。
注: Spearman秩相关系数 ( R) ①P <0. 05, ② P <0. 01
3 讨论
龈沟液是通过牙龈沟内上皮和结合上皮从牙周结缔组织渗入到龈沟内的液体［7 －8］, 因此检测牙周炎患者龈沟液的成分是目前最常用的评价牙周病变活动期的方法之一。CTX是Ⅰ型胶原C端代谢产物的一种, 在骨胶原纤维降解时不受到破坏, 能完整的释放入血, 并在血清中检测出来［9］。现已有研究证实血清中CTX水平的增高与骨吸收疾病如骨质疏松、骨髓瘤等有高度的相关性［2，10］, 与牙槽骨密度的减低和丧失也有相关性［11］, 唾液中可检测到的CTX可能与牙周病中牙槽骨的吸收有相关性［12］。
菌斑指数、牙龈指数、牙周探诊深度、附着丧失水平, 都是临床上常用的检测牙周病的指标。本研究中发现, 以上指标的各组之间对应的龈沟液CTX浓度有统计学差异, 检查结果与龈沟液中CTX的浓度有一定的相关性。说明CTX可能成为监测牙周病变程度的一个指标, 这可能是与牙周组织破坏过程中, I型胶原的降解水平分不开的。然而菌斑指数、牙龈指数、牙周探诊深度、附着丧失水平与龈沟液中CTX浓度的直线相关关系的可能性都不高, 说明上述临床指标并不能直接反映I型胶原的降解水平, 只是临床不同部位的表现。而作为牙周组织重要组成部分的I型胶原, 它的降解却是会反映出牙周组织的破坏。所以作为I型胶原的降解产物CTX对于快速检测牙周组织的破坏可能更有诊断意义。
I型胶原分子间通过羟赖氨酸、赖氨酸残基及其衍生物的共价结合形成吡啶交联, 构成稳定的胶原纤维, 其在破骨细胞的作用下降解成吡啶交联、I型胶原吡啶交联羧基端肽 ( carboxyterminal propeptide of type Iprocollagen, ICTP) 、I型胶原的氨基端交联肽 ( N-ter-minal telopeptides of type I collagen) 和CTX［2，13］。降解产物中, 目前口腔领域研究较多的是ICTP［2，14］。由于ICTP中含有吡啶交链 ( pyridinoline, Pyr) 结构, 与II型胶原可能产生交叉反应, 而CTX与吡啶结构无关, 所以CTX对于评价I型胶原的破坏具有更好的特异性。
Ⅰ型胶原纤维 篇6
关键词：柴胡皂苷a,星状细胞,Ⅰ型胶原,基质金属蛋白酶
慢性胰腺炎(Chronicpancreatitis)是一种难治性消化系统疾病。近年来,其发病率随着胆道系统疾病、饮酒过量、高脂血症等患者的增加而呈上升趋势,而且各种类型的慢性胰腺炎均可增加患者发生胰腺癌的可能性[1,2]。慢性胰腺炎严重影响人民的健康状况和生活质量,慢性胰腺炎的治疗已成为迫切需要解决的问题。慢性胰腺炎的特征性病理变化是胰腺实质纤维化,胶原合成增多和/或降解减少是导致胰腺纤维化的根本原因。防止纤维化的发展是目前慢性胰腺炎治疗中亟待解决的难题,也是消化内、外科领域极力攻克的重要课题之一。目前国内外尚无有效治疗胰腺实质纤维化的药物。活化的胰腺星状细胞(Pancreaticsatellitecell,PSC)是胰腺纤维化的主要效应细胞。MMP13是一种锌依赖性蛋白酶,主要负责降解Ⅰ型胶原,与胰腺纤维化关系密切。文献报道,体外研究发现柴胡及其单体成分可抑制星形细胞活化及多种相关细胞因子的生成从而发挥抗肝纤维化作用[3,4,5]。肝星形细胞和胰腺星状细胞在结构和功能上都有一定的相似性,这为研究柴胡及其单体治疗慢性胰腺炎纤维化提供了思路。本实验探讨柴胡皂苷a对体外培养的大鼠胰腺星状细胞Ⅰ型胶原和MMP13表达的影响,为柴胡皂苷a在慢性胰腺炎治疗中的应用提供理论依据。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1实验动物:清洁级健康雄性Wistar大鼠,体重300~350g,购自中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所动物实验中心,动物合格证号SCXK-(军)2009-003。
1.1.2实验设备与器材:链蛋白酶、DNaseⅠ、GB-SS(Gey’sbalancedsaltsolution)购自Sigma公司,批号1001519915;胶原酶P购自Roche公司,批号11104229;Nycodenz购自Axis-Shield公司;DMEM培养基、胎牛血清购自Gibco公司,批号9WF0091E;ELISA试剂盒购自Cusabio公司,批号U13012613;MMP-13(H-230):sc-30073购自Santa CruzBiotechnology,Inc,批号F1312;柴胡皂苷a(HPLC≥98%)自北京神州科创生物科技有限公司。冷冻离心机来自湘仪,型号H2050R;细胞培养箱来自Thermo,型号371;酶标仪来自上海科华实验系统有限公司,型号ST360;电泳仪来自北京市六一仪器厂,型号DYY-6C。
1.1.3PSC的制备:采用体重300~350g的雄性Wistar大鼠。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉,备皮,消毒,固定。沿腹部正中线开腹,无菌取出胰腺。胰腺洗涤2次,剪碎,用GBSS消化液(含0.02%链蛋白酶,0.05%胶原酶P,0.1%DNaseI)37℃水浴消化20min,消化的后细胞悬液用100μm滤网过滤,DMEM培养基洗涤后,细胞重悬于9.5ml含5%FBS的GBSS中,与8ml28.7%Ny-codenz溶液混匀。缓慢加入6ml含5%FBS的GBSS制成Nycodenz梯度,4℃1400g离心20min,Nycodenz与GBSS液面之间的白色絮状的模糊带即为PSC。吸取细胞,DMEM培养基洗2次,用含20%胎牛血清的培养基重悬细胞,用台盼蓝染色计数细胞成活率。将细胞接种于培养瓶中,第2天换成含10%FBS的培养基,以后隔天换液[6]。
1.2方法
1.2.1ELISA法检测培养液上清Ⅰ型胶原含量:取对数生长期细胞,接种于六孔板中,培养24h后,分别加入0、5、10μg/ml浓度的柴胡皂苷a培养24h,收集培养液,离心后取上清。按照ELISA试剂盒说明检测培养液上清Ⅰ型胶原含量。
1.2.2Westernblot法检测细胞MMP13表达:从星状细胞中抽提总蛋白,行聚丙烯酰胺凝胶电泳2h,将蛋白转移至PVDF膜上,用5%脱脂奶粉封闭1h,孵育MMP13(稀释度为1∶1000)、GAPDH抗体,4℃过夜,次日洗膜,敷二抗,最后使用化学发光法显影。
1.3统计学分析采用SPSS17.0软件进行统计学分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,三组之间的比较用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1柴胡皂苷a对PSC分泌Ⅰ型胶原的影响与对照组相比,低浓度和高浓度柴胡皂苷a组大鼠胰腺星状细胞Ⅰ型胶原分泌水平均降低(P<0.05),与低浓度柴胡皂苷a组相比,高浓度柴胡皂苷a组下降更显著(P<0.05)。见表1。
注:与对照组比较,*P<0.05;与低浓度柴胡皂苷a组比较,△P<0.05。
2.2柴胡皂苷a对PSC基质金属蛋白酶-13表达的影响重复实验3次,结果显示低浓度和高浓度柴胡皂苷a组MMP13的表达较对照组均升高(P<0.05),与低浓度柴胡皂苷a组相比,高浓度柴胡皂苷a组上升更显著(P<0.05)。见图1。
注:与对照组比较,*P<0.05;与低浓度柴胡皂苷a组比较,#P<0.05。
3讨论
胰腺实质纤维化是慢性胰腺炎的基本病理改变,胰腺星状细胞是纤维化的效应细胞。在正常情况下,胰腺星状细胞呈静止状态,当胰腺组织受到损伤,发生炎症反应或氧化应激时,星状细胞则被激活,转化为成肌纤维细胞,分泌胶原,发挥连接、修复功能;但大量的胰腺星状细胞被激活,合成和分泌大量的Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白等细胞外基质组分[7],破坏了胶原合成和降解的动态平衡,即胶原合成增多和/或降解减少,导致胰腺纤维化。胶原降解主要受基质金属蛋白酶(Matrixmetalloproteinases,MMPs)调控。MMPs家族是一簇锌依赖性蛋白酶,其主要功能是降解细胞外基质成分,在胰腺纤维化过程中起重要作用。目前已发现26种MMPs,按照作用底物不同,可分为6类,即间质胶原酶、基质溶解素、明胶酶、膜型金属蛋白酶、基质水解素和其他MMPs。其中MMP13属于间质胶原酶类,主要负责降解Ⅰ型胶原,与胰腺纤维化关系密切。
本试验结果显示,柴胡皂苷a抑制胰腺星状细胞Ⅰ型胶原的分泌,呈浓度依赖性,低浓度与高浓度柴胡皂苷a组星状细胞培养液中Ⅰ型胶原分泌量均较对照组显著降低。Westernblot结果显示低浓度和高浓度柴胡皂苷a组MMP13的表达较对照组均升高,与低浓度柴胡皂苷a组相比,高浓度柴胡皂苷a组上升更显著。柴胡皂苷a能够减少胰腺星状细胞Ⅰ型胶原分泌,起作用与诱导MMP13的表达,促进胶原降解有关。
参考文献
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[3]朱兰香,刘世增,顾振纶.柴胡皂苷的药理作用及抗肝纤维化的应用〔J〕.中草药,2002,33(10):U005-U006.
[4]Chiang LC,Ng LT,Liu LT,et al.Cytotoxicity and anti-hepatitis B virus activities of saikosaponins from bupleurum species〔J〕.Planta Medica,2003,69(8):705-709.
[5]Shen H,Huang GJ,Gong Y.Effect of transforming growth factor beta and bone morphogenetic proteins on rat hepatic stellate cell proliferation and transdifferentiation〔J〕.World Journal of Gastroenterology,2003,9(4):784-787.
[6]崔立华,张淑坤,崔乃强,等.大鼠胰腺星状细胞分离培养与鉴定〔J〕.中国中西医结合外科杂志,2014,20(5):504-507.
Ⅰ型胶原纤维 篇7
1 资料与方法
1.1 临床资料
2008年12月至2010年12月来我院就诊的136 例骨质疏松症患者入选。患者随机分为两组, 其中治疗组70 例, 男44 例, 女26 例;年龄48～75 岁, 病程1～6年。疼痛程度为2级的40 例, 3级的30 例;对照组为66 例, 男46 例, 女20 例;年龄46～74 岁, 病程1～7年。疼痛程度为2级的46 例, 3级的20 例。统计学分析, 对照组和治疗组的年龄、性别无统计学意义 (P>0.05) 。研究前向所有患者交代研究情况, 并签署知情同意书。
患者纳入标准:a) 根据文献中各项诊断标准确诊为骨质疏松症[3];b) X线检查显示:多数患者有T11～L3椎体压缩性改变;核磁共振检查显示:T2加权成像未见高信号;c) 患者均存在全身痛或腰背痛, 且疼痛程度大于等于2级。排除标准:a) 患者同时患有严重的心脑血管疾病;b) 患者肝肾功能不良;c) 患者有胃肠道疾病;d) 患者接受过其他影响TRACP5b和CTX的水平的药物治疗;e) 患者为继发性骨质疏松患者。
1.2 治疗方法
对照组:钙尔奇D片, 600mg, 1次/日, 口服, 服用6个月[4]。治疗组:患者除服用钙尔奇D片外, 还服用密骨胶囊, 1 000mg, 2次/日, 口服, 连续6个月。
1.3 试剂盒及仪器
TRACP5b ELISA检测试剂盒 (丹麦, Quidel公司) , CTX ELISA检测试剂盒 (丹麦, NBD公司) , 全自动生化分析仪 (泰诺科贸有限公司) 。
1.4 检测方法
分别于患者服药前和服药后1、3、6个月取其空腹静脉血, 用ELISA法测其血清CTX和TRACP5b的含量。
1.5 统计学处理
测定结果用均数±标准差表示, 每组治疗前后TRACP5b和CTX的水平采用配对t检验, 采用t检验进行组间比较, P<0.05有统计学意义。
2 结果
治疗1个月和3个月后, 治疗组和对照组骨代谢指标均下降, 与服药前相比较有差异 (P<0.05) ;两组组间CTX和TRACP5b水平比较无差异 (P>0.05) 。服药6个月后, 两组骨代谢指标继续下降;服药6个月时, 治疗组和对照组CTX和TRACP5b水平比较有差异 (P<0.05) , 见表1～2。
3 讨论
研究显示我国骨质疏松症的患病率逐年增多, 在老年人中患病率男性为61%, 女性为91%[4]。骨质疏松症主要的病理表现为骨微观结构退化和骨量减少, 这样导致骨骼内支撑物质减少和结构破坏, 容易引起骨折的发生。它是老年性疾病中的一种多见病、常见病, 属中医学骨痿、骨痹范畴。其病因病机为本虚标实, 治疗的方法很多, 西医用药主要有钙尔奇D、阿仑膦酸盐、降钙素等, 但都有不同程度的副作用。中医治疗着眼于标本兼顾, 益气补肾, 强筋壮骨, 且温经通络, 活血止痛。而密骨胶囊就是有此作用的药物之一。
骨质疏松症分为两种类型。一种类型为老年退化性骨质疏松症, 主要表现为低转换型骨丢失, 主要是由于成骨细胞功能衰退, 而破骨细胞活力增强, 导致骨骼重建处于负平衡状态。另一种类型为女性绝经后骨质疏松症, 表现为高转换型骨丢失, 主要是由于女性绝经后雌激素水平降低, 同时伴有年龄增长, 使得成骨时间延长和骨吸收时间缩短。
目前临床上常用的反应骨吸收的指标主要有CTX和TRACP5b。TRACP5b有抵抗酒石酸抑制的作用, 主要来源于破骨细胞, 只有来源于破骨细胞的TRACP5b才具有酶活性。男性进入老年期或者女性进入绝经期后, 血清中TRACP5b会升高, 如果患有骨质疏松症, 其水平升高的更加明显。骨吸收时, TRACP和其他酶一起参与骨质的降解。因此血清抗酒石酸酸性磷酸酶是目前鉴别骨量丢失、诊断骨质疏松症有效且特异的指标, 同时也可以用于骨质疏松症治疗后的疗效观察[6]。Ⅰ型胶原在骨有机质胶原交联中大约占90%。骨吸收时, Ⅰ型胶原被破骨细胞降解, 会释放出不同分子大小的总的N-端交联物和总的C-端交联物, 这可以作为观察骨吸收的指标。Ⅰ型胶原C末端肽是Ⅰ型胶原交联C末端肽B-胶原特殊序列分解片段, 可以特异的反映骨转换骨吸收, 血清中CTX生理变异小, 稳定性好[7]。
本研究对照组使用的钙尔奇D为临床广泛使用的治疗骨质疏松症的药物。临床测试证明钙尔奇D可以帮助更好的吸收钙, 帮助容易受骨质疏松症影响的中年人和老年人, 特别是有晚年骨骼脆弱家族史者, 防治骨质流失, 促进骨骼健康。密骨胶囊主要成分为大豆异黄酮、淫羊藿、碳酸钙、维生素D、鸡蛋壳, 其还含有多种与骨代谢有关的生长因子, 可以刺激促进骨细胞合成, 诱发骨组织修复, 调整骨代谢, 使得骨的合成和吸收达到一个良好的平衡状态。密骨胶囊还可补充成骨过程中所需要的多种微量元素, 包括钙、镁、铁、锌等。另外, 密骨胶囊还有一定的镇痛消炎的效果, 可以减轻患者疼痛, 提高其生活质量[8]。
在治疗的整个过程中, 治疗1个月后骨吸收指标较治疗前即开始下降 (P<0.05) 。治疗组和对照组间比较无差异。服药3个月后, 两组CTX和TRACP5b水平明显下降, 基本达到正常值, 且与服药后1个月时比较有差异 (P<0.05) ;两组间比较, 无差异 (P<0.05) 。服药6个月后, 两组CTX和TRACP5b水平继续下降, 对照组骨吸收指标下降趋缓, 且两组间比较有统计学意义 (P<0.05) 。
从本研究中我们可以发现, 密骨胶囊具有降低骨吸收指标TRACP5b及CTX的作用, 从而抑制了破骨细胞的活性, 使得骨的合成和吸收达到新的平衡, 是临床治疗骨质疏松症的有效的药物。
摘要：目的 观察密骨胶囊对骨吸收参数指标血清抗酒石酸酸性磷酸酶、血清I型胶原C末端肽的影响。方法 临床选择136例原发性骨质疏松症患者随机分为两组, 其中对照组66例给予口服钙尔奇D片, 治疗组70例在对照组基础上给予密骨胶囊口服治疗, 各组均经6个月治疗。分别于患者服药前和服药后1、3、6个月抽血, 用ELISA法测其血清中Ⅰ型胶原C末端肽、血清抗酒石酸酸性磷酸酶含量。结果 用药1个月后, 两组血清骨吸收参数值较治疗前明显下降 (P<0.05) ;用药3个月后, 治疗组骨代谢指标下降非常明显 (P<0.01) , 基本达到正常值;患者服药6个月后, 治疗组血清抗酒石酸酸性磷酸酶与对照组比较有统计学意义 (P<0.05) 。结论 密骨胶囊能够明显降低血清中的Ⅰ型胶原C末端肽和血清抗酒石酸酸性磷酸酶的水平, 阻止骨量丢失, 抑制过高的骨转换, 使骨的代谢达到新的平衡, 提高骨质量, 具有明显的抑制骨吸收的作用。
关键词：原发性骨质疏松症,密骨胶囊,骨转换指标
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