Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白

Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白（精选7篇）

Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白 篇1

Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达增多是矽肺纤维化形成的重要环节之一。细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)家族重要成员,近年来发现磷酸化ERK1/2可促进成纤维细胞合成Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白[1,2]。转化生长因子 -β1(transforming growth factro-β1,TGFβ1)在矽肺肺组织中表达增高,且具有强烈的促胶原蛋白合成能力[3,4]。然而,TGF-β1是否可通过诱导ERK1/2磷酸化来促进胶原蛋白合成,目前并不清楚。 最新研究显示,活性氧(reactive oxygen specie,ROS) 参与细胞内多条信号传导通路的激活[5];而Peroxiredoxin-1(Prx-1)是一种新型过氧化物酶,可有效、 迅速地清除细胞内产生的ROS[6]。因此,本研究利用特异性Prx-1 si RNA转染人肺成纤维细胞,观察其对TGF-β1刺激的Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白表达、ERK1/2磷酸化及ROS水平的影响,以探讨TGF-β1是否可通过ROS来激活ERK1/2通路,促进肺成纤维细胞合成胶原蛋白及Prx-1对其是否有抑制作用,为Prx-1成为矽肺治疗的新靶点提供一些实验依据。

1材料与方法

1.1材料

人胚胎肺成纤维细胞MRC-5(中国科学院细胞库),Prx-1 si RNA、引物(上海吉玛公司合成),M-MLV逆转录试剂盒、SYBR+Tap混合剂 (美国invitrogen公司),TGF-β1(美国Peprotech公司),Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白抗体和 β-actin抗体(武汉博士德生物有限公司),ERK1/2抗体(美国Cell Signaling公司),Prx-1抗体(美国Abcam公司)。

1.2实验分组

MRC-5细胞随机分为4组:对照组(0.4%血清)、 TGF-β1组(5μg/L)、阴性转染组(TGF-β1+ 阴性对照组si RNA)和Prx-1 si RNA转染组(TGF-β1+Prx-1 si RNA),每组样本数为5。阴性转染组和Prx-1 si RNA转染组利用脂质体LipofectamineTM2000将阴性对照si RNA和Prx-1 si RNA转染到MRC-5细胞,培养48 h后用于实验。各组细胞用0.4%血清培养12 h,使其同步化。

1.3实时定量逆转录-聚合酶链反应检测siRNA转染后Prx-1表达

阴性对照si RNA和Prx-1 si RNA转染MRC-5细胞48 h后,弃培养液,利用Trizol提取细胞总RNA,定量后取0.5μg RNA进行逆转录。取1μl c DNA进行实时定量逆转录 - 聚合酶链反应(realtime PCR,RT-PCR)扩增,扩增体系如下:SYRB+Taq混合剂10μl,Prx-1或甘油醛 -3- 磷酸脱氢 酶 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH) 正、反向引物各0.5μl,c DNA 1μl,双蒸水8μl;扩增条件:95℃预变性30 s,95℃变性5 s,60℃退火30 s, 72℃延伸30 s,共40个循环。Prx-1正向引物:5'-C CCCACGGAGATCATTGCTT-3',反向引物:5'-CGAG ATGCCTTCATCAGCCT-3';GAPDH正向引物:5'-AT GAATGGGCAGCCGTTAGG-3',反向引物:5'-TGGAT TTGCCATGGGTGGA-3'。

1.4Westernblot检测Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白、Prx-1、磷酸化ERK1/2表达

各组细胞按照实验设计干预后,TGF-β1刺激48 h检测Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白;3 h检测Prx-1蛋白或0.5 h后检测磷酸化ERK1/2,收集细胞总蛋白,进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium saltpolyacrylamide,SDS-PAGE)并转膜。转膜后,5%牛血清白蛋白封闭1 h,Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白抗体(1∶500稀释),Prx-1抗体(1∶1 000稀释),总ERK1/2抗体 (1∶1 000稀释),磷酸化ERK1/2抗体(p-ERK1/2) (1∶1 000稀释),4℃孵育过夜。Ⅱ抗(1∶3 000稀释)室温孵育2 h,5- 溴 -4- 氯 -3- 吲哚基 - 磷酸盐 (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate,BCIP)/ 氯化硝基四氮唑蓝(p-nitro-blue tetrazolium chloride, NBT)(1∶50稀释)显色3 min。以Image J软件对蛋白表达条带进行灰度扫描及定量分析。Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白和 β-actin的灰度比值作为Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达结果,Prx-1和 β-actin的灰度比值作为Prx-1表达结果,p-ERK1/2和总ERK1/2抗体的灰度比值作为p-ERK1/2表达结果 。

1.5 2,7- 二氯荧光素二乙酸检测ROS水平

2,7- 二氯荧光素二乙酸(2,7-dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA)没有荧光,能自由穿过细胞膜, 进入细胞后被酯酶水解生成二氯荧光黄(dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH),DCFH不能通过细胞膜,但能被细胞内的ROS氧化生成7- 二氯荧光素 (7-dichlorofluorescein,DCF),DCF可发出荧光。因此DCF的荧光量可以反映细胞内ROS水平。本实验中, 各组细胞按照设计干预后,TGF-β1刺激24 h, 0.25%胰蛋白酶消化,制成单细胞悬液,加入DCFHDA,终浓度为10μmol/L,37℃孵育20min后,磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered salines,PBS)洗3次, 去掉未进入细胞内的DCFH-DA,计数10 000个细胞,荧光酶标仪测定激发波长488 nm和发射波长525 nm处的荧光强度。

1.6统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,行t检验和单因素方差分析,P <0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1Prx-1siRNA转染肺成纤维细胞对Prx-1mRNA表达的影响

为下调肺成纤维细胞Prx-1 m RNA水平,本研究设计3个不同靶基因位点的特异性Prx-1 si RNA [Prx-1 si RNA (209)、Prx-1 si RNA (289) 和Prx-1 si RNA(453)],分别转染细胞。RT-PCR结果显示,未转染组(单一用脂质体处理)和阴性转染组(阴性对照si RNA)的Prx-1 m RNA的表达水平比较,差异无统计学意义。与阴性转染组比较,3种Prx-1 si RNA转染后,肺成纤维细胞内Prx-1 m RNA的表达均不同程度地下降,其对Prx-1 m RNA的抑制率分别为83%、77%和92%。依据抑制率将Prx-1 si RNA(453) 用于最终实验。见附表。

注:1)与未转染组比较,P >0.05;2)与阴性转染组比较,P <0.05

2.2Prx-1siRNA转染对TGF-β1诱导的Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达的影响

Western blot结果显示,对照组Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达微弱,表达值分别为(0.18±0.03)和(0.20± 0.02)。与对照组比较,TGF-β1组的Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达增强,表达值分别为(0.44±0.06)和(0.38± 0.04),是对照组2.44和1.85倍,差异有统计学意义 (P =0.000)。与TGF-β1组比较,阴性转染组的Ⅰ、 Ⅲ型胶原蛋白表达值为(0.41±0.06)和(0.38±0.05), 差异无统计学意义 (P =0.432和0.783),但Prx-1 si RNA转染进一步增强Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达,分别为(0.57±0.07)和(0.52±0.05),差异有统计学意义(P =0.008和0.002)。见图1。

2.3Prx-1siRNA转染对TGF-β1诱导的Prx-1蛋白表达的影响

Western blot结果显示,对照组Prx-1蛋白表达值为(0.17±0.04)。与对照组比较,TGF-β1组的Prx-1蛋白表达明显增高,表达值为(0.42±0.06), 差异有统计学意义(P =0.000)。与TGF-β1组比较, 阴性转染组Prx-1蛋白表达水平为(0.47±0.09),差异无统计学意义(P =0.338),但Prx-1 si RNA转染组为(0.02±0.00),表达明显下降,差异有统计学意义 (P =0.000)。见图2。

2.4Prx-1siRNA转染对TGF-β1诱导的ROS水平的影响

对照组的荧光强度为(87.47±6.32),与对照组比较,TGFβ 1组的荧光强度增强为(122.50 ± 8.18),差异有统计学意义(P =0.000) 。 与TGFβ 1组比较,阴性转染组的荧光强度为(116.72 ± 10.37),差异无统计学意义 (P =0.310),但Prx-1 si RNA转染组为 (145.92 ± 11.56),差异有统计学意义(P =0.000) 。

2.5 Prx-1 si RNA转染对TGFβ 1诱导的pERK1/2表达的影响

总ERK1/2在各组的表达差异无统计学意义(P > 0.05)。对照组p-ERK1/2的表达很弱,表达值为(0.25± 0.03)。TGF-β1刺激后p-ERK1/2表达增强,表达值为(0.84±0.07),为对照组的3.36倍,差异有统计学意义(P =0.000)。与TGF-β1组比较,阴性转染组的p-ERK1/2表达值为(0.80±0.08),差异无统计学意义(P =0.458),但Prx-1 si RNA转染组p-ERK1/2的表达水平明显上升,表达值为(1.26±0.09),差异有统计学意义(P =0.000)。见图3。

3讨论

矽肺是我国最常见的职业病之一,其发病机制是吸入的二氧化硅粉尘颗粒在肺组织内激活肺泡巨噬细胞,使其释放多种细胞因子,该细胞因子作用于肺成纤维细胞,引起细胞增殖及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白合成增加,导致肺组织纤维化。在分泌的众多细胞因子中,TGF-β1致纤维化作用很强。研究表明,TGF-β 首先与细胞表面的TGF-β1受体结合,将信号传递到细胞内,然后在细胞内通过激活细胞内信号传导通路来调节细胞的生物学活性[4]。

本研究中笔者发现,TGF-β1刺激肺成纤维细胞48 h后,Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达明显高于对照组,说明TGF-β1可诱导肺成纤维细胞合成Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白;同时TGF-β1组的p-ERK1/2表达也较对照组增高,提示ERK1/2通路的激活在TGF-β1诱导的肺成纤维细胞合成Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白中发挥重要作用。ZHANG等[7]报道在博来霉素诱导的大鼠肺纤维化模型中,纤溶酶原激活抑制剂在抑制ERK1/2通路激活后,肺组织内Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达也明显下降。HUANG等[1]最近报道,利用女性压力性尿失禁患者的原代阴道成纤维细胞抑制ERK1/2通路后,阴道成纤维细胞分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的能力也明显下降。

研究发现,ROS是细胞内传导通路的重要成员之一[5],而且进一步研究显示,ROS是MAPK家族激活强有力的诱导剂[8,9],分析该作用可能与ROS抑制MAPK磷酸酶的活化有关,通过抑制MAPK磷酸酶来延长激活的MAPK存在的时间[10]。作为一种新型的过氧化物酶,Prx-1能够很强地清除细胞内ROS的能力。Prx-1含有2个保守的有还原活性的过氧化半胱氨酸和可溶性半胱氨酸,过氧化半胱氨酸攻击双氧水H2O2,失去质子同时被氧化成半胱氨酸次磺酸,半胱氨酸次磺酸与可溶性半胱氨酸缩合形成二硫键,细胞中的二硫键还原酶将半胱氨酸次磺酸还原成过氧化半胱氨酸,从而完成还原反应,降低H2O2浓度[11]。

本研究中,TGF-β1刺激肺成纤维细胞24 h后, 细胞内ROS水平明显高于对照组,说明TGF-β1可刺激肺成纤维细胞生成ROS。但当Prx-1 si RNA干预后,TGF-β1诱导的prx-1蛋白表达被明显抑制, 同时ROS水平、磷酸化ERK1/2及Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白表达水平明显升高。说明Prx-1 si RNA通过提高ROS水平进一步激活ERK1/2通路,从而促进TGFβ1诱导的Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白合成,也进一步证实在TGF-β1诱导的肺成纤维细胞合成Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的过程中,ROS激活的ERK1/2通路发挥重要的促进作用。

综上所述,TGF-β1可通过ROS激活ERK1/2通路,诱导肺成纤维细胞合成Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白,而低表达Prx-1可通过提高ROS水平进一步加强TGFβ1的这种作用,说明Prx-1可通过削弱ROS来抑制ERK1/2介导的TGF-β1作用。

Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白 篇2

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小鼠胚胎成纤维细胞 (NIH3T3) 购于中国典型培养物保藏中心;DMEM培养基购于Hyclone公司;新鲜特等优质胎牛血清 (FBS) 购自杭州四季青公司;重组ADAMTS-1 购自Abcam公司;RNA提取试剂盒购于康为世纪;逆转录试剂盒、c DNA合成试剂盒购于Fermants公司;Ⅰ型胶原蛋白抗体由广州威佳科技有限公司提供试用装;TGF-β 单克隆抗体及HRP- 标记的羊抗兔二抗购自康为世纪;BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIPA裂解液、PMSF购于碧云天生物技术研究所。

1.2 实验方法

1.2.1 NIH3T3的体外培养和分组

NIH3T3用含10%胎牛血清的DMEM在5%二氧化碳 (CO2) 、37℃下恒温培养, 0.25%胰蛋白酶消化、传代;将细胞均匀接种在6孔板上, 待细胞亚融合后改用无血清的DMEM培养液同步化饥饿12 h, 依实验要求共分正常对照组、低浓度组 (1 nmol) 、中浓度组 (10 nmol) 和高浓度组 (20 nmol) 4组, 每组10个样本。刺激24 h后检测COL1、TGF-β1水平, 实验重复3次。

1.2.2 RT-PCR

各组采用试剂盒法提取总RNA, 每10 cm2加入1 mL Buffer RLT, 裂解, 室温下5min;以每1 mL Buffer RLT加入200μL氯仿摇匀, 室温下2 min, 4℃离心12 000 r/min 10 min;取上清液移至新EP管, 加入等体积的70%乙醇;将液体移入装有收集管的吸附柱中, 4℃离心12 000 r/min, 20s;加入700μL Buffer RW1, 4℃离心12 000 r/min, 20s;加入500μL Buffer RW2, 4℃离心12 000r/min, 2 min, 吸附柱室温晾干, 置去酶离心管中, 加入30μL RNase-Free water, 4℃离心12 000 r/min, 1 min, 收集RNA溶液。用核酸蛋白分析仪鉴定RNA纯度和量, 所用RNA的OD260/OD280均在1.8~2.0之间, 表示样品为纯RNA。获得的RNA按逆转录试剂盒说明书进行操作, 加入总RNA 5μL、Primer oligo1μL、DEPC处理的水6μL、5×buffer 4μL、Ribolock Rnase inhibitor 1μL、10 mmol dNTP mix 2μL、M-Mu LV 1μL, 70℃5 min, 42℃60 min, 70℃5 min, 合成cDNA。产物置于-70℃保存, 以备PCR扩增。引物均由上海生物工程技术有限公司合成。总反应体系为20μL。目的基因COL1上游引物:5'-GACAGACTGGCAACCTCAAGAA-3', 下游引物:5'-GGATGGAGGGAGTTTACACGAA-3', 产物长度273 bp。反应条件:94℃预变性2 min, 94℃变性20 s, 56.8℃退火1min, 72℃延长30 s, 循环30次, 最后72℃延伸10min。目的基因TGF-β1上游引物:5'-GACCGCAACAACGCAATCTATG-3', 下游引物:5'-TATTCCGTCTCCTTGGTTCAGC-3', 产物长度300 bp。反应条件:94℃预变性3 min, 94℃变性30 s, 54℃退火30 s, 72℃延长1 min, 循环30次, 最后72℃延伸5 min。内参β-actin上游引物:5'-TGTCCCTGTATGCCTCTGGT-3', 下游引物:5'-GGTCTTTACGGATGTCAACG-3', 产物长度459 bp。在相同的条件下同管扩增β-actin。扩增结束后, 各组PCR产物取5μL进行琼脂糖凝胶电泳, EB染色, Alpha Imager 3400凝胶成像分析系统成像, Photoshop CS5软件测定各组吸光灰度值, 计算目的/内参灰度比值。

1.2.3 Western blotting

按实验分组条件处理后, 收集细胞, 用预冷PBS洗涤3次, 加入细胞蛋白裂解液100μL, 冰浴裂解30min, 4℃离心20000r/min, 15 min, 收集上清液。BCA蛋白定量法测定蛋白含量。波长490 nm处紫外分光光度计测吸光度, 以﹝ (样本孔OD值-对照孔OD值) ×1893.021-42.306﹞×10-3计算各样本蛋白含量。测得蛋白含量最低的样品加20μL, 再根据蛋白量相等原则计算出其他样品上样量, 用去离子水将总体积补足至20μL, 移至EP管中, 加入适量体积的5×上样缓冲液, 100℃变性5~10min, 然后进行10%SDS-PAGE电泳, PVDF膜转印2 h, 行Western blotting检测。以5%脱脂奶粉封闭2 h, 分别加入一抗 (1︰100, 1︰750) 4℃过夜, 孵育二抗 (1∶1 000) 1 h, 采用ECL显色法显色;凝胶成像系统扫描分析, Photoshop CS 5.0软件测定各组灰度值, 以COL1/APDH、TGF-β1/GAPDH显影条带灰度值的比值表示COL1、TGF-β1的相对蛋白含量。实验重复3次。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0 软件进行统计学分析, 所有实验数据以均数±标准差 (±s) 表示, 组间比较用单因素方差分析, P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ADAMTS-1 对Ⅰ型胶原蛋白的影响

RT-PCR及Western blotting结果显示, 加入ADAMTS-1 刺激后COL1 m RNA水平及蛋白水平均降低, 并且随着ADAMTS-1 浓度升高, 成纤维细胞中COL1 m RNA水平、蛋白水平也逐渐降低, 见图1。

2.2 ADAMTS-1 对TGF-β 的影响

RT-PCR及Western blotting结果显示, 加入ADAMTS-1 刺激后TGF-β m RNA水平及蛋白水平均降低, 并且随着ADAMTS-1 浓度升高, 成纤维细胞中TGF-β m RNA水平、蛋白水平也逐渐降低, 见图2。

A:COL1的RT-PCR结果以及关于COL1与β-actin灰度比的统计条图;B:COL1的Western blotting结果以及关于COL1与GAPDH灰度比的统计条图。1) 与对照组比较, P<0.05;2) 与低浓度组比较, P<0.05;3) 与中浓度比较, P<0.05

A：TGF-β 的 RT-PCR 结果以及关于 TGF-β 与 β-actin 灰度比的统计条图；B：TGF-β 的 Western blotting 结果以及关于 TGF-β与 GAPDH 灰度比的统计条图。1）与对照组比较，P <0.05；2）与低浓度组比较，P <0.05；3）与中浓度比较，P <0.05

3 讨论

近20 余年来, 肺纤维化的发病率和死亡率在世界各地均呈上升趋势, 国外报道, IPF的发病率约为14~43 人/10 万, 确诊后中位生存期3~5 年, 严重危害人类健康[4]。该病的形成机制复杂, 尚不完全清楚, 临床上缺乏有效的治疗手段。历来应用皮质类固醇和环磷酰胺、硫唑嘌呤等免疫抑制剂及秋水仙碱等抗纤维化制剂治疗, 但疗效欠佳。因此, 研究该病的发病机制, 阐明其病理生理过程, 寻找有效的治疗药物和靶点成为目前国内外学者研究的热点。以往都致力于致肺纤维化因子的研究, 很少对拮抗纤维化的因子进行探讨。

ADAMTS-1 意为含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶, 是继基质金属蛋白酶MMP后新发现的一类Zn2+依赖的分泌型金属蛋白酶, 是ADAMTS家族的第一个成员, 1997 年由KUNO等人[5]在小鼠结肠癌基因差异显示和筛选中发现并命名, 在哺乳动物组织中广泛表达, 可由巨噬细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞等多种细胞合成和分泌。与多种疾病有关, 如肿瘤浸润[6]、动脉粥样硬化[7]、椎间盘退变[8]、哮喘[9]、关节炎[10]等。郭春艳[11]通过动物实验发现ADAMTS-1 与心肌纤维化密切相关, 本课题组肖兴洲等人[3]也发现在肺纤维化大鼠肺部组织中ADAMTS-1 的表达降低, 推测ADAMTS-1具有抗纤维化作用。

从本实验检测各组COL1 m RNA及蛋白表达的结果来看, 对照组COL1 的表达较各ADAMTS-1 浓度组高, 并且ADAMTS-1 浓度越高, COL1 表达越低。该结果说明ADAMTS-1 可以降低成纤维细胞内Ⅰ型胶原蛋白的表达。

细胞外基质包括Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、纤连蛋白和蛋白多糖。肺纤维化是各种致纤维化因素和抗纤维化因素之间的平衡被打破, 细胞外基质积聚, 最后疤痕组织形成的结果。所以, ADAMTS-1 通过降低Ⅰ型胶原蛋白可能具有一定的抗纤维化作用。

纤维化的重要调节因子包括:细胞因子 (IL-13、IL-21 和TGF-β1) 、趋化因子 (MCP-1 和MIP-1β) 、血管生成因子 (VEGF) 、生长因子 (PDGF) 、过氧化物酶体增殖物激活受体 (PPARs) 、急性期蛋白 (SAP) 、半胱氨酸蛋白酶、肾素- 血管紧张素- 固酮系统 (血管紧张素Ⅱ) 。在众多调节因子中, TGF-β1是公认的最重要的调控因子, 是诱导器官纤维化的总开关。在组织损伤或炎症时, TGF-β1促进成纤维细胞分化成肌成纤维细胞, 肌成纤维细胞表达 α- 平滑肌肌动蛋白 (α-SMA) 、钙调蛋白和细胞外基质, 促使细胞外基质过度积聚, 疤痕形成, 导致纤维化。本实验检测TGF-β1m RNA及蛋白的表达发现, 各ADAMTS-1 浓度组TGF-β1的表达较对照组低, 并且ADAMTS-1 浓度越高, TGF-β1的表达越低。证明ADAMTS-1 能够降低成纤维细胞内TGF-β1的表达。ADAMTS-1 降低Ⅰ型胶原蛋白, 下调TGF-β1可能是其潜在机制。

TGF-β1可由各种细胞合成, 以转化生长因子-转化生长因子结合蛋白复合体的形式分泌。在纤维蛋白溶酶、活性氧、血小板反应素-1 和酸性物质蛋白水解作用下, TGF-β1与转化生长因子结合蛋白 (LTBP) 分离, 具有活性, 与相应的受体识别结合, 激活下游的信号通路, 发挥其功能[12]。目前, 下游部分分子途径已经被确认, 包括Smad途径、PI3K/Akt途径和MAPK途径[13]。ADAMTS-1 是否下调或者抑制TGF-β1的下游信号通路, 下调或者抑制TGF-β1的哪条下游信号通路, 目前并不明确, 还有待进一步实验研究。探索拮抗纤维化的因子在纤维化过程中的变化规律并进行外源性的干预, 可能为寻求拮抗纤维化的方法开辟新的思路。

摘要：目的 探讨含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶 (ADAMTS-1) 对小鼠肺成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白 (COL1) 表达的影响及可能的机制。方法 应用细胞培养技术进行小鼠肺成纤维细胞培养, 利用ADAMTS-1为刺激因子, 将培养的细胞分为空白组、低、中、高浓度组, 应用逆转录-多聚酶链反应技术 (RT-PCR) 观察COL1 mRNA、转化生长因子β1 (TGF-β1) mRNA在各组中的表达情况;采用蛋白质印迹法 (Western blotting) 观察各组细胞COL1、TGF-β1的变化。结果 与空白组相比, 低浓度组、中浓度组、高浓度组的COL1、TGF-β1表达水平下降, 其中高浓度组表达水平最低 (P<0.05) 。结论 ADAMTS-1能降低COL1的表达, 抑制TGF-β1是其抗纤维化作用的可能潜在机制。

Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白 篇3

本研究旨在构建COL1A1 C端甘氨酸重复序列基因(氨基酸1 000~1 189)的真核表达载体,转染CHO细胞进行表达,并检测其与鼠成纤维细胞表面Endo180是否能够相互作用,为深入研究COL1A1基因的生物学功能提供了依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

p APtag-4质粒、prcol1α1质粒、E.coli GH2感受态、中国仓鼠卵巢细胞(二氢叶酸缺陷型,dhfr-/-)、鼠胚胎成纤维细胞(Rat-1)由Gene Hunter公司提供。

1.1.2 试剂

DL5000 DNA marker、限制性内切酶、r Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶购于Takara公司;胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自OMEGA公司;引物合成和DNA测序由TSINGKE公司完成;Fu GENE 6购自Roche公司;兔抗人AP多克隆抗体购自Gene Hunter公司;HRP标记的羊抗兔Ig G二抗购自Southern Biotch公司;Reagent A(含氯化镁、二乙醇胺、BSA和对硝基苯磷酸酯)购自Gene Hunter公司;Reagent S(氯化硝基四氮唑兰)购自Sigma公司;胎牛血清购自Bovogen公司。其他试剂和耗材均购自国内生物公司。

1.1.3 仪器

PCR仪(Bio-Rad);电泳仪(北京JUNYI电泳仪公司);冷冻离心机(Eppendorf公司);凝胶成像系统(Bio-Rad公司);CO2恒温培养箱(Thermo Fisher公司)。

1.1.4 培养基

胎牛血清购自Hyclone公司;DMEM高糖培养基和IMDM培养基均购自Hyclone公司。

1.2 方法

1.2.1 COL1A1 C端甘氨酸重复序列基因的获取

根据NCBI数据库中鼠COL1A1的c DNA序列设计一对用于扩增COL1A1 C端甘氨酸重复序列基因(氨基酸1 000~1 189)的引物,上游引物P1:5'-GTAGATCTGGACGTGAGGGG-3',下划线为BglⅡ酶切位点,下游引物P2:5'-GGTCTAGATTT-GAAGCTGAAGTCG-3',下划线为XbaⅠ酶切位点。以含有COL1A1的c DNA全长的质粒prcol1α1为模板,以P1、P2为上下游引物,用r Taq DNA聚合酶进行PCR扩增目的基因。PCR扩增条件为:94℃、5 min;94℃、30 s,58℃、1 min,72℃、1 min,循环数30;72℃、5 min。PCR产物经过2%琼脂糖凝胶电泳后割胶回收。

1.2.2 真核表达质粒p AP-Gly的构建和鉴定

用BglⅡ和XbaⅠ双酶切甘氨酸重复序列基因和真核表达载体p AP-tag4,将酶切后的p AP-tag4和甘氨酸重复序列分别进行割胶回收。将纯化的p AP-tag4和甘氨酸重复序列基因(1∶10)经T4DNA连接酶16℃连接过夜,并转化E.coli GH2感受态,使用含有氨苄和四环素双抗的固体LB培养板挑取单菌落培养,提取质粒,然后进行PCR鉴定、双酶切鉴定以及送到TSINGKE公司基因测序鉴定,得到测序完全正确的p AP-Gly重组质粒(图1)。

1.2.3 重组质粒转染CHO细胞

将生长状态良好的CHO(dhfr-/-)细胞经胰酶消化后用血球计数板计数,以每孔5×104细胞密度铺到六孔板中,培养时加入1×次黄嘌呤与胸腺嘧啶(HT)至IMDM培养基中,放入5%CO2孵箱中37℃培养24 h。当CHO(dhfr-/-)细胞长到50%~70%汇合度时,按照Roche公司提供的Fu GENE 6操作说明书进行转染,阴性对照为转染空质粒p AP-tag4的CHO(dhfr-/-)细胞,空白对照为无转染的CHO(dhfr-/-)细胞。转染72 h后进行蛋白水平鉴定。

1.2.4 AP活性测定检测AP-Gly蛋白在细胞中的表达

转染72 h后,收集六孔板中细胞培养基,5 000r/min离心5 min,取上清检测培养基中的AP活性。具体AP活性测定方法如下:取50μL含有AP-Gly蛋白的细胞培养基(以50μL IMDM培养基作为负对照),然后加入等体积AP反应底物2×Reagent A,立即放入37℃水浴锅并计时,待溶液变成黄色后,用100μL 0.5 mol/L Na OH终止反应,然后加入800μL双蒸水,利用酶标仪读取溶液OD405。根据公式54×OD405/(T·V)计算AP活性,其中T为水浴时间(min),V为样品体积(μL),AP活性单位是U/m L。

1.2.5 Western Blot鉴定AP-Gly蛋白的表达

将上述检测到有AP活性的AP或AP-Gly细胞培养基用PBS均调至相同AP活性,分别用加巯基乙醇和不加巯基乙醇两种蛋白上样缓冲液处理,沸水煮5 min,蛋白经过8%SDS-PAGE分离并且转PVDF膜。使用5%脱脂奶粉室温封闭1h,加入兔抗人AP多克隆抗体(1∶2 000)室温孵育2 h或4℃孵育过夜,TBST洗膜3次,加入羊抗兔Ig G二抗(1∶5 000)室温孵育1 h,TBST洗膜3次。加入ECL显影液,在凝胶成像仪(Bio-Rad)上拍照。

1.2.6 Rat-1细胞原位染色

取出Rat-1细胞六孔板培养皿并且弃掉培养基,用预冷的1 m L的HBHA(5 mmol/L KCl,0.44mmol/L KH2PO4,0.49 mmol/L Mg Cl2·6H2O,136mmol/L Na Cl,0.4 mmol/L Na H2PO4,5%BSA)清洗细胞1次,每孔中分别加入1U/m L的AP或AP-Gly细胞培养基,于4℃避光孵育90min,弃掉上述细胞培养基,用1 m L HBHA溶液在10 min内清洗细胞至少5次,每孔加入500μL固定液(60%acetone,3%formaldehyde,20 mmol/L HEPES p H7.5),固定细胞30 s,迅速弃掉固定液,加入1 m L HS溶液(1.6 mmol/L Na Cl,20 mmol/L HEPES p H 7.5)清洗细胞2次,加入1 m L HS溶液,将培养皿放在65℃水浴锅20 min(去除内源AP),然后弃掉HS溶液,每孔加入500μL AP显色底物Reagent S,于37℃孵箱显色2 h,直到在显微镜下观察到实验组细胞染成蓝紫色,而负对照组没有出现染色情况。

1.2.7 Rat-1细胞定量染色

取出Rat-1细胞六孔板培养皿并且弃掉培养基,用预冷的1 m L的HBHA清洗细胞1次,然后每孔中分别加入1 U/m L的AP或AP-Gly细胞培养基,于4℃避光孵育90 min,弃掉上述细胞培养基,加入200μL细胞裂解液(10 mmol/L Tris-HCl p H8.0,1%Triton×100)放置5 min后,将细胞刮下来,收集细胞液到1.5 m L离心管中,于4℃离心机最大转速离心2 min,收集上清,BCA法测定上清中Rat-1细胞全蛋白浓度,与此同时,将剩余上清于65℃孵育20 min(去除内源AP),最后按照上述AP活性测定方法测定各实验组上清中AP活性。

1.2.8 Rat-1细胞全蛋白的提取

取出Rat-1细胞培养皿并且弃掉培养基,用5m L预冷的PBS清洗细胞1次,再加入1 m L预冷PBS,将细胞刮下来,收集细胞液到1.5 m L离心管中,用4℃离心机2 000 r/min离心2 min,弃上清,然后在离心管中加入200μL预冷的细胞裂解液(10mmol/L HEPES,p H 8.0,10 mmol/L KCl,0.1 mmol/L EDTA,0.1 mmol/L EGTA,1 mmol/L PMSF,1mmol/L DTT,0.3%NP40),于4℃裂解细胞30min,4℃离心机最大转速离心10 min,收集上清。用BCA方法测定全蛋白浓度。

1.2.9 AP-Gly与Rat-1全蛋白的配体受体亲和印迹实验

将Rat-1全蛋白分别用加巯基乙醇和不加巯基乙醇的两种蛋白上样缓冲液处理,沸水煮5 min,上述蛋白经过8%SDS-PAGE分离并且转PVDF膜后,用5%脱脂奶粉封闭1 h后,TBST洗膜3次,分别用等AP活性的AP、AP-Gly、AP-Coll细胞培养基孵育,室温孵育2 h或者4℃摇过夜,TBST洗膜3次,往膜上滴加入AP反应底物Reagent S,直到出现蓝紫色目的条带,用双蒸水反复冲洗PVDF膜终止反应,在凝胶成像仪上拍照。

1.2.1 0 统计学分析

每次实验均独立重复3次,数据以平均数±标准误差(mean±SEM)表示,使用Graph Pad Prism5.0统计学软件进行单因素方差分析,组间两两比较采用t检验分析并作图,当P<0.05时具有统计学意义,*P<0.05,**P<0.01。

2 结果与分析

2.1 COL1A1 C端甘氨酸重复序列基因的PCR扩增

利用合成的引物以含COL1A1 c DNA全长的prcol1α1质粒为模板进行PCR扩增C端甘氨酸重复序列全长,利用2%琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物在500 bp~750 bp之间可见约570 bp的特异性单一条带,基因大小与预期相符合(图2)。

Note:M:DNA marker DL5000;1:C-terminal glycine repeats gene.

2.2 重组质粒p AP-Gly的PCR鉴定

将C端甘氨酸重复序列基因扩增产物与p AP-tag4载体连接,转化E.coli GH2感受态,进行菌液PCR鉴定。2%琼脂糖凝胶电泳结果可见约500 bp~750 bp处存在C端甘氨酸重复序列的的基因片段,说明重组质粒中含有C端甘氨酸重复序列基因(图3)。

Note:M:DNA marker DL5000;1-16:Electrophoretic profile of PCRproduct of p AP-Gly.

2.3 重组质粒p AP-Gly的双酶切鉴定

重组质粒用限制性内切酶BglⅡ和XbaⅠ双酶切后进行2%琼脂糖凝胶电泳分析,结果可见约5 500 bp的空质粒p AP-tag4片段和约570 bp的C端甘氨酸重复序列基因的目的片段,显示重组质粒构建成功(图4)。对上述鉴定正确的质粒进行测序并且在NCBI上进行BLAST比对,编码框完全正确,将测序正确的克隆命名为p AP-Gly。

Note:M:DNA marker;1:p AP-Gly with endonuclease.

2.4 Western Blot检测融合蛋白的表达

转染p AP-Gly重组质粒于CHO(dhfr-/-)细胞中,收集细胞培养基进行Western Blot检测。Western Blot结果中,重组质粒组可检测到约77k Da大小条带(可能是由于存在表达提前终止现象,故还有一条略小条带),空质粒组检测到67k Da条带(图5)。

注:1:AP(加巯基乙醇);2:AP(不加巯基乙醇);3:AP-Gly(加巯基乙醇);4:AP-Gly(不加巯基乙醇)。Note:1:AP(+β-Me);2:AP(-β-Me);3:AP-Gly(+β-Me);4:AP-Gly(-β-Me).

2.5 细胞原位染色检测AP-Gly与Rat-1细胞表面的相互作用

为了检测AP-Gly融合蛋白是否能够和Rat-1细胞表面结合,用1 U/m L AP-Gly的细胞培养基去孵育Rat-1细胞90 min(负对照为含AP蛋白的细胞培养基),最后加入AP反应底物Reagent S于37℃孵箱显色。细胞原位染色分析表明:AP-Gly与Rat-1细胞表面能够发生结合,催化AP底物Reagrnt S发生颜色反应,而负对照却没有颜色变化(图6)。

2.6 细胞定量染色分析AP-Gly与Rat-1细胞全蛋白的相互作用

为了进一步证实AP-Gly融合蛋白能够与Rat-1细胞相互作用,我们进行细胞定量染色分析,用1 U/m L AP-Gly的细胞培养基去孵育Rat-1细胞90 min(负对照为含AP蛋白的细胞培养基)。细胞定量染色结果表明:实验组在Rat-1全蛋白量基本一致的情况下(图7A),AP-Gly融合蛋白能够和Rat-1全蛋白结合,催化AP底物Reagent A发生颜色变化,因而在波长为405 nm下具有很强的吸光值,而AP蛋白不能够与Rat-1全蛋白结合,所以在405nm下基本没有吸光值(表1)。AP-Gly与Rat-1细胞全蛋白的结合和AP对照组具有极显著差异(*P<0.05,**P<0.01)(图7B)。

2.7 配体受体亲和印迹实验

之前我们实验室用AP标签亲和标记了COL1A1的C端区域(氨基酸1 000~1 453),融合蛋白命名为AP-Coll,且证实了AP-Coll能够和Rat-1细胞表面的Endo180结合[10]。通过配体受体亲和印迹实验,我们进一步探究AP-Gly融合蛋白是否同样和Rat-1细胞表面的Endo180结合。

注:A:两组Rat-1细胞全蛋白量基本相同;B:AP-Gly能够与Rat-1全蛋白结合,与AP组有极显著差异。Note:A:Normalization of whole cell extract of Rat-1 cells;B:Bound AP activity.

将加巯基乙醇和不加巯基乙醇处理过的Rat-1全蛋白经8%SDS-PAGE分离并转PVDF膜后,5%脱脂牛奶封闭过后,分别用含有等活性的AP、AP-Gly、AP-Coll蛋白的细胞培养基室温孵育2h或4℃过夜孵育后,TBST清洗3次,用AP底物Reagent S滴加在PVDF膜上显色。结果表明:AP-Gly实验组并没有出现蓝紫色条带,而AP-Coll实验组能够在150 k Da~250 k Da之间出现蓝紫色条带(Endo180大小为180 k Da),AP负对照组也没有出现蓝紫色条带(图8)。我们推测AP-Gly融合蛋白应该是和Rat-1细胞表面2种或2种以上的蛋白组成的复合物结合。

Note:M:protein marker;1:whole cell extract(+β-Me);2:whole cell extract(-β-Me).

3 讨论

细胞外基质的重塑对发育、稳态以及出生后组织重塑都有很重要的作用,同样与肿瘤发生、许多细胞增生疾病紧密相关。Ⅰ型胶原蛋白作为细胞外基质成分中的重要一员,一直备受科学家的关注。Ⅰ型胶原蛋白是由(α1)2α2组成的异源三聚体。前体Ⅰ型胶原蛋白是由N端肽、中间的(Gly-X-Y)n甘氨酸重复序列、C端肽三部分组成的三股螺旋结构。在前体Ⅰ型胶原蛋白分泌到细胞外后,特定的蛋白酶分别将N端肽和C端肽剪切,形成只有(Gly-X-Y)n甘氨酸重复序列的成熟Ⅰ型胶原蛋白。最近的研究表明,Ⅰ型胶原蛋白的N端肽能够作为诊断肺癌骨转移过程中的一个代谢指标,患者尿液中的N端肽比正常人高[11]。COL1A1C端肽中一个氨基酸的替换将会导致致死性的成骨生成缺陷以及许多骨骼疾病[12]。COL1A1基因中第2 317个碱基由G替换为T的新生错义突变,第773个氨基酸由Gly转换为Cys,导致了非常严重的并且威胁终生的成骨生成缺陷[13]。COL1A1基因不仅与成骨生成密切相关,并且在乳腺癌细胞和内皮细胞的定向迁移过程中也起着很重要的作用[14]。

Endo180是Ⅰ型胶原蛋白的一个极其重要的受体,它与Ⅰ型胶原蛋白的相互作用与胶原蛋白的内吞、降解以及细胞粘附、肿瘤迁移等均有密切的联系。Endo180的表达常见于成纤维细胞和内皮细胞中。前期研究中,笔者课题组证实了COL1A1基因C端区域(氨基酸1 000~1 453)能够和鼠胚胎成纤维细胞表面的Endo180受体结合,并且它们的结合与细胞粘附紧密相关。但是,仅仅COL1A1C端甘氨酸重复序列是否参与细胞粘附还有待进一步研究。

本实验成功获得了COL1A1 C端甘氨酸重复序列基因(氨基酸1 000~1 189),构建了C端甘氨酸重复序列基因的真核表达质粒p AP-Gly,并在CHO细胞中成功表达,Western Blot分析转染重组质粒的细胞培养基可以检测到与预期一致的77 k Da蛋白。细胞原位染色表明AP-Gly能够与鼠成纤维细胞结合。细胞定量染色实验表明,AP-Gly与鼠成纤维细胞表面结合能力很强,相对于AP有极显著差异(**P<0.01)。配体受体亲和印迹实验表明,AP-Gly并不是和成纤维细胞表面的Endo180结合,也不能和成纤维细胞全蛋白中的任何一种单一蛋白结合,我们推测与其结合的受体蛋白很有可能是2种或2种以上的蛋白组成的复合物。

Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白 篇4

1 材料与方法

1.1 实验材料及试剂

小鼠前成骨样细胞株MC3T3-E1购于浙江大学医学院病原生物学教研室;小鼠IGF-1购于Peprotech Asia公司 (为10 μg 无菌冻干粉剂, 按产品说明先溶于0.1 mL 无菌的0.1 mol/L乙酸中, 以0.02 mL体积分装后-20 ℃保存, 使用时以无血清DMEM稀释至设定的浓度) ;兔抗小鼠Ⅰ型胶原蛋白抗体购于武汉博奥森公司;生物素标记羊抗兔二抗试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司;胎牛血清 (杭州四季青生物公司) ;DMEM培养基 (自配:DMEM粉剂13.4 g, NaHCO3粉剂2.5 g, 青霉素粉剂0.1 g, 链霉素粉剂0.1 g, 去离子水1 000 mL) ;DAB (北京中杉金桥生物技术有限公司) ;4-甲基偶氮四唑蓝粉剂 (MTT) 、二甲基亚砜 (DMSO, 美国Sigma公司) 。寡核苷酸引物, TrizolRNA提取试剂盒, dNTP-M-MLV反转录酶, PCR marker (fermentas) , DNA聚合酶, 引物, Beta 引物 (上海生工) ;分光光度计 (U-2001, HITACHI, 日本) ;PCR热循环仪 (Gene Amp 9600, PE 公司, 美国) ;垂直电泳槽 (Bio-Rad公司, 美国) ;电泳仪 (Bio-RadPower/PAC200, 美国) 。

1.2 方法

1.2.1 细胞株传代培养

小鼠MC3T3-E1成骨样细胞置于37 ℃饱和湿度、体积分数5%CO2培养箱中传代培养, 待细胞融合至70%～80%, 用0.25%胰蛋白酶消化, 离心后计数备用。

1.2.2 细胞增殖能力测定

第2代成骨细胞以5×104/mL的密度分别植入3块96孔板中, 每板接种30孔, 每孔100 μL, 用含10%胎牛血清的DMEM培养24 h后换无血清DMEM再培养24 h (此为清洗期) 。对照组仍使用无血清DMEM培养;试验组分别用含不同浓度IGF-1 (1 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL) 的无血清DMEM培养, 每组6孔, 在设定的培养时间 (3板分别为24 h、48 h、72 h) 结束前4 h 每孔加入MTT (5 mg/mL) 20 μL, 继续培养4 h, 吸弃孔内培养液, 加入DMSO 150 μL, 振荡10 min 使结晶物充分溶解, 490 nm 波长测定OD值。

1.2.3 免疫细胞化学方法检测I型胶原蛋白表达

第2 代成骨细胞以3×104/mL的密度植入事先置有盖玻片 (盖玻片经多聚赖氨酸处理) 的6孔板中, 每孔2 mL, 用含10%FBS的DMEM培养24 h后换无血清DMEM再培养24 h。对照组仍使用无血清DMEM 培养, 试验组培养液为含50 ng/mL IGF-1的无血清DMEM, 培养48 h后, 爬有细胞的盖玻片经PBS清洗, 5%的丙酮固定, H2O2 去除内源性过氧化物酶, 加一抗37 ℃ 2 h, 加二抗作用, DAB显色, 苏木素复染细胞核, 中性树胶封片。光镜下观察, 棕黄色为阳性细胞, LEICAQ 5501W图像分析系统进行图像分析。

1.2.4 RT-PCR方法检测IGF-1对成骨细胞I型胶原蛋白mRNA表达的影响

将细胞以1×105 密度种于培养瓶中, 在37 ℃, 5% CO2 浓度, 饱和湿度下培养24 h, 换含不同浓度IGF-1 (0 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL) 的DMEM培养液继续培养24 h, 应用Trizol 提取细胞总RNA后, 用RT-PCR 方法测Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达。细胞总RNA提取和PCR步骤如下。

1.2.4.1 cDNA 第一链合成

采用[TAKARA RNA-PCRKit (AMV) Ver 310]试剂盒, 10 μL反应体系, 样本RNA 5 μL, 随机引物 91 μL, DEPC-水6 μL离心混匀 (70 ℃, 5 min) 后置于冰上, 加入5× buffer 4 μL , RNA inhibitor 1 μL, dNTP 2 μL离心混匀 (25 ℃, 5 min) , 再加反转录酶1 μL, 按下面条件进行:25 ℃ 10 min, 42 ℃ 60 min, 72 ℃ 10 min。

1.2.4.2 PCR步骤 PCR

扩增I型胶原蛋白, 同时扩增Beta作为内参。引物序列如下, Ⅰ型胶原蛋白上游引物:5′-gaagtcagctgcatacacaa-3′, 下游引物:5′-gctgatttttcatcatagcc-3′, PCR 产物为 403 bp 。Beta 上游引物:5′-ctacaatgagctgcgtgtggc-3′, 下游:5′-caggtccagacg caggatggc-3′, PCR 产物为270 bp。反应体系共25 μL , PCR 反应液配置如下:H2O 13.5 μL, 10× buffer2.5 μL, 10 mmol/L dNTP 0.5 μL, primer1 (25 μmol/L) 0.25 μL, primer2 (25 μmol/L) 0.25 μL, Taq 酶1 μL, 25 mmol/L MgCl2 2 μL, cDNA 5 μL。反应条件:94 ℃变性20 s, 52 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 36次循环。

1.2.4.3 PCR产物鉴定与分析

取PCR 扩增产物10 μL和6X 加样缓冲液2 μL点样于15 g/L琼脂糖凝胶, 80 V电压下电泳, 于紫外线箱中观察并照相记录。产物鉴定以PCR marker 为标准。通过Alpha Imager 2200 型凝胶成像分析仪对目的基因和参照基因条带进行像素值测定, 并计算二者比值。

1.3 统计学处理

全部资料采用SPSS 13.0统计软件进行分析, 所有数据以均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$表示, 各组间比较采用单因素差分析 (One-way ANOVE) , 多个样本均数间的多重比较采用LSD-t。P<0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 形态学观察

倒置相差显微镜下, 刚接种的MC3T3-E1细胞呈圆球形, 悬浮状态, 4 h～5 h 后贴壁生长;IGF-1干预24 h后, 正常血清对照组细胞状态良好, 呈短梭形贴壁生长, 融合80%～90%。

2.2 成骨细胞增殖能力测定结果

3 个刺激时间均显示IGF-1浓度0 ng/mL～100 ng/mL, 随着IGF-1浓度的递增, 细胞的OD 值呈现上升的趋势, 其中刺激时间为24 h的细胞, IGF-1 浓度10 ng/mL组、50 ng/mL组、100 ng/mL组与对照组比较有统计学意义 (P<0.05) , 再对各浓度试验组之间两两比较, IGF-1浓度10 ng/mL与50 ng/mL组和100 ng/mL组间比较也有统计学意义 (P<0.05) , 而50 ng/mL与100 ng/mL两组之间差异无统计学意义;刺激时间为48 h的细胞, 所有4个浓度的试验组与对照组比较有统计学意义 (P<0.05) , 进一步分析显示, 各浓度实验组之间的差异均有统计学意义 (P<0.05) ;刺激时间为72 h的细胞, 所有4个浓度的试验组与对照组比较都有统计学意义 (P<0.05) 。再对各浓度试验组之间两两比较, 除1 ng/mL与10 ng/mL 之间的差异无统计学意义, 其余均有统计学意义 (P<0.05) 。详见表1。

与0 ng/mL比较, 1) P<0.05

2.3 免疫组化方法检测成骨细胞I型胶原蛋白表达

成骨细胞MC3T3-E1经50 ng/mL IGF-1刺激48 h后, I型胶原蛋白的表达明显增加。对照组与试验组各随机取片3 张, 每张玻片随机取10 个视野, 经LEICAQ 5501W 病理分析软件分析显示, 0 ng/mL组为162.93±5.076, 50 ng/mL组为136.07±8.968, 试验组I 型胶原蛋白平均灰度较对照组降低16.5 % (P<0.001) 。

2.4 RT-PCR半定量方法检测I型胶原蛋白mRNA表达

通过对MC3T3-E1 I型胶原蛋白mRNA表达的半定量RT-PCR检测发现, 随着药物浓度的增加, 细胞I型胶原蛋白mRNA的水平逐渐增加, 各用药组与对照组相比较, 光密度比值明显增加, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。提示IGF-1可以促进MC3T3-E1 I型胶原蛋白mRNA的表达, 且具有剂量依赖性。

3 讨 论

随着人口老龄化, 骨质疏松的发病率越来越高, 我国60岁以上人群的发病率已达10%, 因此, 对骨质疏松的预防和治疗显得尤为重要。成骨细胞是骨的形成、骨骼发育与生长的重要细胞, 它能向其周围产生胶原纤维和基质, 并且有促进基质钙化的功能。

胰岛素样生长因子作为体内激素调节轴的一个重要环节, 可不依赖于其他因素, 独立地影响骨基质的形成及细胞增殖。Goad等[2]进行体内实验, 将60只小鼠分别皮下注射IGF-1、GH及安慰剂, 4周后分别测量其胫骨、腓骨的骨矿含量及骨体积, 观察到注射IGF-1的小鼠, 其骨的长度、面积及骨矿含量均高于对照组, 充分证明IGF-1在体内有促进骨形成的作用。本研究的结果显示, IGF-1能明显增加培养的大鼠成骨细胞数量, IGF-1的浓度为1 ng/mL～100 ng/mL, 作用时间为24 h、48 h和72 h呈浓度依赖性, 并且作用时间在48 h和72 h, 这种作用更为显著。通过细胞免疫化学和RT-PCR的方法观察IGF-1对小鼠成骨样细胞MC3T3-E1 I 型胶原蛋白合成的影响, 结果发现经过IGF-1的刺激后成骨细胞I 型胶原蛋白的合成明显增加 (P<0.001) 。I 型胶原蛋白是成骨细胞分泌的一种基质蛋白, 是骨胶原的重要组成部分, 经矿化后为骨骼提供支架。很早就有学者通过3H-脯氨酸掺入法测定体外培养的大鼠成骨细胞胶原合成的能力[3], 证明IGF-1使培养基中I 型胶原蛋白的降解减少, IGF-1对大鼠成骨细胞这种作用与其促增殖作用无关, 因为在使用DNA 合成抑制剂羟基脲时这种作用仍然存在;Thomas等[4]使用IGF-1 刺激体外培养的人骨髓基质细胞 (hMSC, 能诱导分化为成骨细胞) 发现IGF-1 能促进分化的hMSC 和成熟的成骨细胞I 型胶原的基因表达, 在基因水平证实了IGF-1 促进骨基质的合成, 本研究通过细胞免疫化学的方法在蛋白质水平证实了IGF-1 明显增加I 型胶原蛋白的合成, 促进了骨形成。有研究证实[5], IGF -1可以抑制成骨细胞中胶原酶的合成, 降低骨胶原的降解。

IGF-1对骨形成的可能作用:一是直接影响成骨细胞的分化功能, 如增加骨胶原的形成;二是使骨原细胞增殖, 增加了功能性成骨细胞的数量。但其对骨代谢的调还可能存在其他机制, 还有待于进一步研究。

参考文献

[1] Garnero P, Elisabeth SR, Delmas PD.Low serum IGF-1 and occurrence of osteoporotic fracturs in postmenopausal women[J].Lancet, 2000, 355:898-899.

[2]Goad DL, Rubin J, Wang H, et al.Enhanced expression of vascularendothelial growth factor in human SaO2osteoblast like cells andmurine osteoblasts induced by insulin-like growth factor 1[J].En-docrinology, 2003, 137 (6) :2262.

[3]McCarthy TL, Centrella M, Canalis E.Regulatory effects of insulin-like growth factors I andⅡon bone collagen synthesis in rat cal-varial cultures[J].Endocrinology, 1989, 124:301-309.

[4]Thomas T, Gori F, Spelsberg TC, et al.Response of bipotential humanmarrowstromal cells toinsulin-like growthfactors:Effect on bind-ing protein production, proliferation, and commit ment to osteo-blasts and adipocytes[J].Endocrinology, 1999, 140:5036-5044.

Ⅰ型胶原提取中的若干技术问题 篇5

胶原是在提取、分离时,随着方法和条件不同,可以产生胶原、明胶和胶原蛋白三种产物。胶原的三股螺旋结构没有改变,保留了其生物活性,形成的膜具有较好的柔韧性、弹性和强度,在模拟生理条件下能再形成纤维,能明显激活细胞的生长,胶原不溶于冷水和热水,不能被蛋白酶利用[6];明胶是胶原在酸、碱、酶或高温作用下的变性产物,明胶的三股螺旋结构已被破坏[7],因此生物活性较低,相对分子质量分布较宽,从几万到十万,明胶能成冻、成膜,但明胶膜性脆,强度比胶原膜差;胶原蛋白是多肽混合物,三股螺旋结构基本松开,成为三条自由的肽链,相对分子质量为几千到几万,相对分子质量分布很宽,生物活性很低,能溶于冷水,能被蛋白酶利用,但不能成膜[6]。其中,三者最为显著的差异是天然胶原能促进细胞粘附和生长;而明胶和水解胶原蛋白则不具有促进细胞生长的能力。

1 Ⅰ型胶原提取的工艺方法选择

根据胶原的溶解特性,将其制备方法大致分为两类:一是通过溶解掉组织中可溶解的胶原和非胶原的成分,得到胶原纤维;二是分离和提纯可溶的胶原分子。一般地,前一种方法所需时间过长,但能保留组织中的大部分胶原,较适合工业化大规模生产;后一种方法对原材料要求较高,较适合实验室少量制备[4],以供研究。目前胶原的提取方法主要有酸法、碱法、盐法、酶法、结合法等。表1列举了酸法、碱法、盐法、酶法及结合法的特点。

从表1来看,不论是酸法、碱法、盐法还是酶法,都存在着一些不足,如果采用结合法提取胶原,将会弥补使用单一方法的缺陷,且提取的胶原纯度高,胶原三股螺旋保持得较好,品质良好。另外,也不乏其它一些提取胶原的方法。金勇等以新鲜猪皮为原料, 首先经萃取、沉淀、冰醋酸溶解精制纯化后再中和提取胶原的方法,得到纯度较高的胶原且三股螺旋保持得较好[8]。胡二坤等将直接用水提法提取的胶原蛋白同经酶预处理再利用水抽提法提取的胶原对比,发现后者的提取率将会大大提高[9]。

2 Ⅰ型胶原提取过程的控制

2.1 pH值的控制

叶易春等对不同pH值条件下提取猪皮胶原做了一些分析。冻干皮块经预处理、酸处理及离心等操作,通过SDS-PAGE电泳测分子量,结果发现:在醋酸强度为pH值2.0~2.5时,提取的胶原分子质量比较大且分布窄;在醋酸强度为pH值1.0~1.5时,提取的胶原分子质量也较大且分布窄。说明低温时,醋酸用量加大强度增强,仍不能水解胶原的肽链。pH值在3以上,由于酸作用及水解作用太弱,几乎没有胶原溶出;pH值低于2,则醋酸用量增大,生产成本也随之增高。故pH值为2.0~2.5较合适,既节约成本,又最大程度地提取胶原[10]。王晨等人在较小范围内(pH值1.5~2.0)研究了酶解pH值对鸡骨胶原蛋白提取的影响,以进一步确定最适pH值。发现pH值先是增加,当达到1.7时可以得到骨胶原的最大提取率16.7%,之后又开始下降,原因可能是酶活性的下降导致原料水解度降低引起,从而确定了提取骨胶原蛋白的最适pH值为1.7[11]。实验中选用0.5mol/L乙酸或柠檬酸,加入相应钠盐调节作为提取缓冲体系,既可保证提取过程pH值的控制,同时还可增强体系离子的强度并降低料液黏度,利于分离[10]。因此,pH值的控制不仅要考虑到最适反应条件、胶原得率,还要权衡经济成本等问题。

2.2 温度的控制

提取温度是提取过程中最难控制的因素,对提取的胶原质量也有很大影响。 叶易春[10]等在不同温度条件下醋酸和胃蛋白酶提取猪皮胶原蛋白,最后通过SDS-PAGE电泳实验,得出温度对分子质量及分布的影响较大的结论。当温度低时,提取的胶原分子质量大且分布窄;当温度较高时,提取的胶原分子质量分布宽并且呈弥散分布。分析得知,由于酶是作用于胶原的特定点,水解时是特定点打断;而醋酸在高温时,随机作用于胶原的肽链,水解时是随机点打断的。因此为了得到高分子质量且分布窄的高附加值胶原蛋白,提取过程中要严格控制其温度。猪皮胶原蛋白容易受热变性,所以实验温度最好控制在低于10℃(一般为4℃)条件下进行。王晨等[11]在pH值为1.7及时间90min,利用胃蛋白酶,研究了不同酶解温度对提取鸡骨胶原蛋白的影响。在35~37℃范围内提高温度,有利于骨胶原蛋白的提取,继续升高温度,由于酶的活性降低而导致提取率的下降,确定37℃为提取鸡骨胶原蛋白最佳酶解温度,此时骨胶原的提取率最大。沈菊泉等[12]将不同温度及时间提取出来的牛皮胶原蛋白样品做了SDS-PAGE电泳,结合胶原蛋白纯度和蛋白沉淀做了一些分析。32℃比37℃下得到的蛋白沉淀少,但提取产物纯度比较高,α(α1和α2)、β链保持完整,且可见γ链;综合考虑提取周期和生产成本,32℃比其它条件都较合适。张文熊等[13]发现牛皮胶原提取中,温度升高虽有利于使更多酶能量达到反应活化能,加快酶解反应速度而提高产率,但随着温度升高,酶变性将逐渐抵消反应速度加快程度,反而使产率降低。故而提取Ⅰ型胶原时,在胶原的不变性条件下适当提高温度是可以的,而且不同原料提取胶原,其所需温度有所不同。

2.3 酶的控制

用来提取动物组织中的胶原蛋白酶有胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰酶等。施辉阳等[14]对这三种酶的作用效果进行了对比试验,通过胶原提取率的比较,得出胃蛋白酶(41.5%)优于木瓜蛋白酶(12.3%)和胰酶(18.0%)。胡胜等[15]对酶法提皮胶原也做了一些研究,选取酶要考虑其对胶原作用的强弱及其价格,作用太弱,则无法得到较高皮胶原溶解率;酶纯度直接影响酶的价格,一般考虑用已完全工业化的酶,使用过程中对酶进行初步纯化即可。另外还得考虑酶对胶原的作用位点,这将直接影响最后水解产物分子量的分布。酶的用量会影响其水解作用,对酶水解反应到达平衡时间也有直接影响,但用量过多并不能显著提高水解反应程度,实际应考虑生产成本和工艺特点[16]。林海等[17]实验证明胃蛋白酶作为一种十分有效的提取猪皮胶原的酶制剂,在特定操作条件下,其水解速率降为最大水解速率一半所需时间为(2.59±0.19)h。用一阶指数衰减方程表征了胃蛋白酶水解速率的衰减过程,得出水解绞碎冻干猪皮的胃蛋白酶用量为2%时较为理想,水解作用时间为6~7h,既能保证较高的水解产率,又能较好地控制生产周期。

2.4 其它条件的控制

提取胶原蛋白过程中,除了要注意pH值、酶和温度的影响,还有其它一些工艺条件控制也不容忽视。例如酸法提取的介质、料液比、提取时间、盐析和透析过程及产物得率和纯度等因素。沈菊泉等[12]在相同时间和温度条件下采用0.5mol/L乙酸、柠檬酸作为酸提介质,比较得出料液比(S/L)1∶10~1∶30范围内采用乙酸-乙酸钠作为提取介质胶原提取率要高于柠檬酸-柠檬酸钠。还考察了料液比为1∶20~1∶40的条件下对牛皮胶原提取的影响,结果表明25℃下,料液比1∶30时胶原蛋白的提取率最高,虽然提取时间长有利于提高胶原蛋白的提取率,但考虑到提取周期太长,生产设备投资大,故确立最佳料液比的同时,还要进一步考察可否控制其它条件来缩短提取时间。用水量对酶水解也有一定影响,文献表明[16],原料加水少,水解度低,蛋白质提取率低,加水多有助于水解反应进行,增加蛋白质提取率。但用水过多使产物浓度降低,浓缩时能耗增大。罗发兴等[18]用柠檬酸、醋酸和盐酸以及胃蛋白酶提取猪皮胶原,探讨了三种酸溶液在不同时间、不同酶用量条件下对猪皮胶原蛋白溶出率的影响。三种酸液协同酶消化作用于猪皮胶原蛋白,通过比较分析得出,柠檬酸提取猪皮胶原蛋白的作用效果最好,醋酸次之,盐酸较差。

3 提高Ⅰ型胶原产率的方法

付强等通过采用两步法[19]对牛皮进行预处理,发现在较短时间内可以除尽皮上的毛,进而将大部分纤维间质除去,并适当地分散胶原纤维,使天然胶原的提取率得到明显的提高。因为皮胶原纤维分散得越好,天然胶原提取时蛋白酶就越容易与底物作用,从而天然胶原溶解量越多,提取率就越高。在提取动物骨胶原蛋白时,需对原料进行脱钙、脱脂预处理,否则骨胶原很难溶出。王晨[11]等利用不同脱钙剂和脱脂剂对鸡骨粉进行预处理,然后用胃蛋白酶酶解提取胶原。与未经脱钙脱脂处理提取的骨胶原对比,胶原的提取率明显地增加了,甚至未脱脂的样品不能形成絮状蛋白质沉淀,难以提取。不同酸的选取也对产率有一定关系,罗发兴等[18]考察了盐酸、醋酸及柠檬酸提取猪皮胶原对胶原蛋白溶出率的影响,其中柠檬酸的溶出率最高。总的说来,酸法盐法的产率都不高。文献表明[9],通过酶法预处理有利于疏松猪皮的表层结构,除去非纤维蛋白中的球状蛋白,促使内容物的溶出,软化胶原蛋白的皮层,可以大大提高胶原蛋白的提取率。周文常等[20]在提取猪皮胶原前,先将猪皮经自制CO2超临界处理器预处理纯化,再经胃蛋白酶消化、离心、盐析等操作,制得的胶原比未经自制CO2超临界处理器预处理提取的胶原纯度高很多。总之,要提高Ⅰ型胶原的产率,需要针对各工艺方法,综合考虑其反应条件,以最大程度提取胶原。譬如利用酶提取胶原的过程中,在它的最适反应温度、最适pH值和最适酶活力条件下进行提取会得到较高的胶原提取率。提取时间取决于原料是否充分反应,如果时间过短,反应不完全,造成原料损失同时提取率低;如果时间过长,造成水解过度,胶原进一步水解成明胶之类的小分子化合物,得不到目标产物胶原。

4 结束语

胶原所具有的生物性能决定了它在医药、化妆品、保健食品等行业中的重要地位[21,22,23,24],胶原的提取也越来越受到重视。由于胶原不溶于水,要想将它从生物组织中分离并提取是一件非常困难的事。加之在提取过程中存在着需要很好地保持胶原的三股螺旋结构,不致因过度处理而使胶原进一步分解为明胶而丧失胶原所具备的机械强度的难题,使得胶原的提取研究进展缓慢。

Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白 篇6

Ⅰ型胶原蛋白是皮肤、骨骼、肌腱的结构蛋白, 是一种多领域广泛使用的生物材料, 诸如手术缝合线、化妆品、伤口愈合和皮革制造。如此广泛的应用, 更加强了对胶原耐生物降解和耐热稳定性机理研究的必要性, 这些研究也将对胶原在工业和生物技术上的应用产生深远的影响。纤维素是一种已经广泛应用的天然聚合物。大量的纤维素衍生物通过化学方法改性得到。高氯酸氧化纤维素在温和的水性条件下制备, 它的特征是, 吡喃葡萄糖环苷键特异性裂解于C2-C3位上, 使每个单元得到两个醛基。因此, DAC是一种含有醛基的开链聚合物。如果在氧化过程中没有其它键断裂, 它的相对分子质量将与氧化前的纤维素相当。

胶原是一种具有突出特征的蛋白质, 每个胶原分子由三条肽链 (两条α1链, 一条α2链) , 缠绕在一起形成长约30μm直径150nm的右旋三股螺旋卷曲结构。胶原分子组成具有良好强度和稳定性的微纤维。分子链内、链间氢键和水参与的氢键共同成就了胶原结构的稳定性。胶原蛋白会受到微生物的侵蚀和降解。因此, 以胶原蛋白为基础发展的应用材料, 都要使他们抗微生物降解。胶原的热稳定性和关于胶原变性温度的各种影响因素已经得到广泛研究。众所周知, 胶原可以用各种交联剂 (如植物多酚、金属离子和醛) 发生交联, 使其耐酶降解性能及热稳定性都得到提升。近年来, 环境友好型的交联化学品呼声越来越高。六价铬、甲醛和戊二醛都是致癌的。改性多糖可生物降解, 在毒理学上是可接受的。DAC是由纤维素改性得到的生物高分子, 由于它能够使胶原稳定且来源丰富、价格低廉、生态环保受到了人们的关注。胶原对化学药品和酶的稳定性以及其湿热稳定性的高低由很多因素所决定。此次研究, 将DAC作为一种交联剂与鼠尾肌腱纤维的Ⅰ型胶原作用, 研究其交联效应及Ⅰ型胶原的湿热稳定性和耐胶原酶解能力。这是模型研究, 其展示的经过DAC处理的Ⅰ型胶原的热稳定性和耐酶解能力, 也适用于其他来源的胶原, 这些胶原更易用于生物加工。

2 实验材料和方法

2.1 实验材料

Ⅰ型胶原酶购于Sigma化学公司, 使用前根据Keller和Mandl的方法, 先用Sephadex G-200进行凝胶过滤提纯。实验所用化学品均为分析纯, 购于印度SRL化学公司。

2.2 实验方法

2.2.1 Ⅰ型胶原的制备

鼠尾取自6个月大的雄性白鼠, 在-20℃的条件下冰冻。由于它纯度高, 具有可利用的残留赖氨酸和胶原含量高, 是一种研究交联剂的理想材料。从冰冻器中取出鼠尾解冻, 取出肌腱。在4℃下, 用0.9%的NaCl溶液洗涤取出的胶原, 去除粘性可溶性蛋白。鼠尾肌腱用去离子水充分洗涤后, 储存于-20℃的条件下, 当作胶原纤维使用。根据Chandrakasan等描述得方法分离出酸溶鼠尾肌腱Ⅰ型胶原溶液, 步骤包括用醋酸提取和用NaCl盐析。使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 测定所制备胶原的纯度。根据Woessner的方法, 通过测定羟脯氨酸的含量来确定溶液中的胶原含量。

2.2.2 DAC的制备

根据早期报道的改性方法制备DAC。纤维素 (约100 g) 用5mol/L的盐酸水解 (10 h, 85℃) , 水解后的纤维素悬浮于去离子水中, 然后在冰水浴中冷却。在磁力搅拌器搅拌下向样品中加入120g高碘酸钠。反应过程中溶液pH值保持为4, 温度为35℃, 在避光条件下反应48 h后便得到含量99%的DAC。产物用叔丁醇 (样品∶溶剂为1∶3) 离心分离萃取。用碘量法测定上层清液中的碘。产物在同体积的叔丁醇中重新悬浮分散, 然后多次离心分离直至所有含碘化合物被分离除去。将产物在30℃下干燥。用碘量法来测量未消耗的高碘酸盐, 从而确定样品的氧化程度;双醛含量用早期报道的方法测定。DAC溶解度低, 因此, 试验中所使用的DAC均经过了高压蒸汽处理 (将10%的DAC悬浮于蒸馏水中, 在120℃, 15磅压力下处理2 h) 。

2.2.3 交联胶原的制备

鼠尾肌腱纤维用4℃的双重蒸馏水充分水洗, 放到1%的DAC溶液中, 在24℃, pH8的条件下反应24 h。交联后的胶原样品充分水洗后放置24 h后, 进行湿热稳定性、DSC和耐胶原酶解试验。

2.2.4 DAC的表征

用含折光指数检测器的凝胶色谱 (Jasco MX 2080-31) 测定DAC的相对平均相对分子质量。凝胶色谱分析用8μm材料填充的水性凝胶-OH柱 (内径7.5mm, 柱长300 mm) , 去离子水作为流动相, 流速为1 mL/min。用示差折光检测器检测控制溶液的洗脱情况。凝胶色谱柱用相对分子质量为580、5900、6300、504000、1112000 Da的多聚糖标准品校正。样品装柱之前先用薄膜过滤器 (0.45μm) 过滤。每次装样品20μL (质量浓度约为0.1%) 。

2.2.4. 1 水解程度。

将50 mL高压蒸汽处理过的DAC溶液离心10 min。用蒸馏水洗涤沉淀物两次, 然后在空气中干燥 (30℃) 24 h。分别计算高压蒸汽处理与未高压蒸汽处理样品的水分含量。通过高压蒸汽处理前后DAC的质量变化来确定水解程度。

2.2.5 交联胶原的表征

2.2.5.1 交联率

DAC稳定胶原的交联率, 用三硝基苯磺酸 (TNBS) 检测胶原中的ε-氨基来确定, 即用TNBS测定交联前后赖氨酸的有效含量来得到交联率。交联与未交联胶原溶液中赖氨酸上未反应的ε-氨基基团与TNBS反应会形成一种可溶性配合物。在60℃的去离子水中, 将1 mL 4% (w/v) 的碳酸氢钠溶液与1 mL刚配制的0.5% (v/v) 的TNBS溶液加入到1 mL酸溶胶原溶液 (浓度为5 mg/mL) 与1 mL各种浓度 (0%～2%) 的DAC (在pH值7及4℃下储存24 h) 中混合加热4 h。取1 mL此混合溶液在40℃下与3 mL 6 M的HCl反应1.5 h, 稀释后在334nm处测量吸光度。天然胶原溶液也在相同参数条件下用TNBS处理。所有的实验都做三个平行样。交联率用式 (1) 计算。

2.2.5. 2 热稳定性

2.2.5.2.1 湿热收缩

DAC处理后胶原纤维的湿热稳定性用微收缩测试仪测定。胶原纤维长度收缩到原始长度的1/3时的温度, 计为胶原的收缩温度。当在水浴条件下测定时, 收缩温度也被视称为湿热稳定性。切下一小块纤维用水润湿, 置于带槽显微镜的载玻片上。将载玻片翻面置于上方安装有显微镜的加热装置上。一边加热一边观察, 升温的速率为2℃/min。

2.2.5.2.2 差式扫描量热法 (DSC) 。

经过DAC处理的胶原和未经处理的胶原的热稳定性用差示扫描量热仪Netzsch DSC 200 PC进行分析。所有的测试都在氮气保护的情况下进行。用铟作标准对温度进行校正。加热速率控制在5℃/min。研究两种胶原在收缩过程中与相转变相关的的峰值变性温度 (TD) 、焓变 (ΔH) 、收缩速率 (ko) 以及活化能 (Ea) 。

2.2.5.3 耐胶原酶作用

用细菌性胶原酶降解两种胶原, 然后通过计算释放到溶液中的羟脯氨酸进行分析。胶原酶处理过程在pH值7.2的0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液和0.04 mol/L CaCl2缓冲液中进行 (胶原∶酶比为50∶1) 。通过检测从不溶胶原释放出的可溶性羟脯氨酸来确定两种胶原的裂解情况。羟脯氨酸的含量 (%) 用Woessner法测定。此测定方法是将羟脯氨酸氧化为吡咯-2-羧酸, 而吡咯-2-羧酸与对二甲氨基苯甲醛形成的络合物在557 nm处呈现最大吸光度。胶原降解率计算公式见式 (2) 。

3 结果与讨论

用99%的高碘酸氧化纤维素得到含92%双醛和3%可溶物的DAC。高碘酸特定地裂解多糖上邻近的乙二醇结构, 形成双醛衍生物。这个反应常用来阐明多糖的结构。高碘酸突出的优点是它的氧化具有特定性。通过控制所用高碘酸的量就能很容易地控制氧化程度, 可使氧化程度在0%～100%范围内, 从而调节DAC醛衍生物的含量。在给定条件下, 一个α-乙醇基团消耗一分子的高碘酸, 反应的速率主要由α-乙醇基的空间位置来决定。尽管氧化反应在水溶液中进行, DAC在多相分散体系 (叔丁醇∶水比为3∶1) 中也会沉淀出来。氧化后的DAC在水中的溶解度很低。DAC突出的特点是, 即使氧化完全也不溶于水或一般溶剂。DAC的不溶性归因于其未反应的羟基与醛基之间半缩醛的形成。但是, DAC在120℃、15磅压力下高温蒸汽处理后具有明显的可溶性, 水解程度可以达到54.6%, 冷却至室温也不会产生明显的沉淀, 稳定性可以一直保持。由于水是化学品材料转移进胶原内部的主要介质, 因此交联剂的水溶性很重要。

3.1 DAC的相对分子质量分布

pH值4.5时高温蒸汽处理10%的DAC会得到4种低聚物, 其中最重要的一种组分含量约为52%, 相对分子质量为790 Da (见表1) 。蒸汽处理时的高温高压条件会使DAC水解。通过计算高压蒸汽处理前后DAC质量的减少情况, 计算出水解程度为54.6%。早期的报告也显示, 在热机械应力作用下纤维素的相对分子质量会降低。由于双醛基团的存在, 高碘酸氧化纤维素在碱性条件下很容易降解。通过凝胶色谱证实在pH 8时, 高压蒸汽处理DAC会进一步水解。在此种情况下, 得到的主要组分含量为81%, 相对分子质量为580 (见表1) 。

3.2 DAC与胶原交联

Bowes和Cater曾经报道, 胶原中的氨基能够与双醛发生交联。单醛与胶原的氨基发生Mannich反应, 最可能生成亚甲基和希夫碱类化合物。甲醛不能与相邻胶原肽链上的氨基进行有效交联。要形成有效交联, 用作交联剂的分子应当含有双官能团, 以使两个多肽链间产生反应。因此, 双醛是一种很好的胶原交联剂。乙二醛能与精氨酸基团反应, 是一种效果突出的交联剂。戊二醛是另一种常用作交联的双醛化合物, 它主要与蛋白质的赖氨酸基团发生反应。据文献报道, 能与戊二醛发生交联的典型双分子模型主要有, N-烷基-1, 4-二氢吡啶 (在pH>7) 和2, 6-二取代的四氢吡喃以及2, 6-二芳基氨基四氢吡喃。因此, DAC交联就是胶原中赖氨酸和羟赖氨酸的氨基及精氨酸的侧基与DAC反应 (见图1) 。在低pH条件下氨基一般带阳电荷, 因此醛基与蛋白质反应的最佳pH一般要求高于蛋白质的等电点 (IEP) 。胶原的等电点是6.7, pH高于这个值胶原带负电, 其氨基就可以与醛基发生反应。早期的研究表明, pH为8是醛基与胶原反应的可行条件。pH越高交联后的胶原收缩温度越高。在pH为4.5和6时, 收缩温度分别为64℃和71℃, 而pH为8时, 收缩温度为80℃ (见表2) 。由表2也可以看出, 在pH为8时用DAC处理后胶原的耐胶原酶稳定性提高了93%。随着pH的升高, 氨基酸 (如精氨酸和赖氨酸) 侧链基团中未带电荷的氨基 (NH2) 含量也会升高, 由于醛基可以与胶原蛋白的氨基反应产生共价交联, 这也有利于DAC通过醛基基团固定于胶原上。如表1所示, 在pH值8的条件下高温蒸汽处理的DAC相对分子质量更低。在这个pH条件下, 各组分的相对分子质量也越低, 其渗透于扩散效果就越好, 也就越易与胶原反应。

3.3 DAC的交联率

用TNBS测定DAC对胶原的交联能力。各种浓度的DAC交联对胶原稳定性的影响, 见表2。可以看出, 通过与胶原的氨基形成交联, 交联率随DAC的浓度的增大而增强。根据早期的报道, 天然胶原中每1000个氨基酸残基分子含33 mol氨基基团。浓度为0.2%的DAC交联度可达到36%而浓度为0.6%时, 交联度可达到52%。随DAC中醛基基团的增加, 胶原中赖氨酸的氨基减少, 胶原受DAC交联的程度提高, 稳定性提高。但是, 浓度为0.6%及以上时DAC的交联率明显提高, 会引起分子链内及链间的交联 (见图1) 。然而, 当DAC浓度为1%时, 能与胶原氨基交联的醛基达到最大值, 因此, 大于1%时交联率为一个恒定值。高pH值与高DAC浓度有助于高的交联, 因有大量的醛基可与胶原的氨基反应。DAC与胶原之间强的交联能力归因于二者之间强的结合能力, DAC可与胶原形成共价与非共价相互作用。因此, DAC中醛基与胶原的氨基形成的共价交联以及羟基形成的氢键, 都提高了胶原的热稳定性和耐酶解稳定性。

3.4 DAC交联胶原的湿热稳定性

交联胶原的热稳定性是交联效果的表征。加热会使胶原纤维的结构网络收缩。提高胶原基质耐湿热能力是使其稳定的重要方面之一。胶原收缩至原始长度1/3时的温度为62℃, 也称作胶原的湿热收缩温度。在此温度下胶原基质出现明显收缩, 是由于蛋白质的稳定结构失去。交联会引起纤维脱水, 使胶原的协同单元尺寸发生变化, 分子结构变得紧实。胶原蛋白质具有较高的变性温度, 根本的原因在于其聚集态的长程相互作用。DAC交联胶原使湿热稳定性明显提高。由表2可以知, 随着DAC浓度和pH的提高, 胶原基质湿热稳定性也提高。因此, 通过与氨基形成共价交联和形成氢键, DAC交联的胶原中增加了长程有序的结构, 这有利于提高胶原纤维的湿热稳定性。

在pH8下用DAC交联胶原的热力学参数, 如变性温度 (TD) 、焓变 (ΔH) , 活化能 (Ea) 与反应速率常数 (ko) 见表3。用DSC测定出天然的和经DAC交联的鼠尾肌腱纤维的变性温度 (见图2) 与相应胶原湿热收缩温度有相同的趋势 (见表2) 。胶原纤维的湿热收缩温度在水浴条件下测定, DSC则是在无水条件下测定。由于实验条件的差异, 用DSC测定出的变性温度要略高于湿热收缩温度。湿热收缩温度测定的原理在于加热条件下螺旋结构会发生转变, 这取决于水合作用的程度。从表3可以看出, DAC交联后胶原的焓变也增加。焓变 (ΔH) 升高, 意味着发生了交联, 需要更多的能量使螺旋结构发生转变。也可以看出, 与天然胶原相比, 经过DAC交联后鼠尾肌腱胶原纤维的变性温度、焓变都明显升高。这可能是由于共价键的作用使分子间的交联数的明显增加。与天然纤维相比, 交联后鼠尾肌腱纤维发生相变时的活化能也会升高。要使DAC交联过的胶原熔融就需要更多的能量。反应速率常数 (ko) 取决于破坏分子间氢键所需的能量及其引起的分子内部结构无序程度。由于结构改变所需熵减少, 热稳定性的提高与交联度的提升相关。焓变与相变相关, 即意味着热力学过程与二级、三级和四级结构有关联, 这种复合焓变与胶原各个层次结构的有序程度都有关。总的来说, 基于加热变性过程中样品的焓变, DSC法是测定胶原稳定性时一个客观可靠的方法。DSC法也间接提供了DAC与胶原反应的信息, 即交联机理。

3.5 DAC交联胶原纤维的耐胶原酶分解能力

胶原的三股螺旋结构对酶降解 (胶原酶除外) 有抵抗作用。本文通过分析在胶原酶作用下胶原的水解速率, 来研究DAC交联胶原抗酶降解的能力。胶原酶优先裂解胶原分子非极性区-Gly-Pro-X-Gly-Pro-X-序列中的X-Gly键 (X是一种最常见的中性氨基酸) 。取自溶组织梭状芽孢杆菌的胶原酶能够在多个位点裂解胶原。用胶原酶降解天然胶原和经DAC交联鼠尾肌腱胶原纤维, 测定了它们不同时间的水解性 (利用羟脯氨酸的释放量检测) 。与天然纤维相比, DAC交联胶原纤维的降解率明显减少。培养反应96 h后, DAC交联鼠尾肌腱纤维降解率为7%, 而天然胶原降解率达99%。由表2知, 胶原耐胶原酶解的稳定性随着DAC的浓度和pH的升高而增强。DAC与胶原反应形成共价键和氢键。胶原与DAC反应保护了胶原中能被胶原酶识别的活性位点, 因而抗酶解稳定性提高。高压蒸汽处理后的DAC, 双醛分子变小, 更容易扩散渗透进入胶原内部与之反应。这就保障了经过蒸汽处理的DAC小分子与胶原有更好的反应性, 从而提高胶原的耐热与耐酶解稳定性。DAC交联胶原耐酶解稳定性的显著提高, 是由于DAC能够很好地与胶原反应, 形成共价键和氢键交联。

4 结论

Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白 篇7

关键词：一贯煎,肝纤维化,I型胶原

肝纤维化( hepatic fibrosis,HF) 是指以胶原纤维为主的细胞外基质( extracellular matrix,ECM) 在肝内大量沉积的病理过程[1]。与拮抗纤维化的西药相比,中药复方在对病人个体治疗方面具有一定优势。滋阴疏肝的时方一贯煎为临床常用治疗肝纤维化的方剂。本课题组前期实验研究表明[2],一贯煎汤剂能有效降低血清转氨酶含量,减轻肝脏炎症程度。本研究拟通过建立CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型,观察经一贯煎汤剂干预后,肝组织细胞外I型胶原沉积情况的变化,探讨一贯煎汤剂对降解细胞外I型胶原沉积是否有促进作用。

1材料与方法

1.1实验动物及试剂

选用健康Sprague-Dawley大鼠,雄性,体质量180 ~ 200 g,鼠龄8周,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,合格证号: SCXK ( 京) 2012-0001,共28只,饲养在首都医科大学实验动物科学部SPF级动物室。

一贯煎: 根据原方药物剂量和比例[3],选取北京同仁堂药店的标准中药材北沙参9 g、麦冬9 g、当归9 g、生地黄20 g、枸杞子12 g、川楝子4. 5 g,煎煮为汤剂。按照体表面积计算,大鼠每100 g体质量所需生药为0. 65 g,将一贯煎汤剂按照100 g大鼠灌胃1m L的体积配成相应浓缩液备用。

CCl4( 四氯化碳 分析纯专 用试剂,纯度 ≥ 99. 5% ,北京现代东方精细化学品有限公司,批号: 20060132) ,橄榄油 ( 阿果萨特级初榨橄榄油,最大酸度0. 4% ,批号: 14001952) ,秋水仙碱( 西双版纳版纳药业有限责任公司生产,批号: 120412) ,生理盐水( 石家庄四药有限公司,批号: 20729509) ,蛋白定量试剂盒( 北京蒂诺奥生物科技有限公司) ,一抗: Anti-Collagen I antibody ab34710( 美国abcam) 、 蛋白质印迹法二抗: Dylight 800-goat anti-rabbit Ig G ( 美国Earthox LLC) ,二抗: Polink-2 plus@ Polymer HRP Detection System( 北京中杉金桥生物技术有限公司,PV-9001) 。

1.2仪器设备

酶标仪( Bio-Rad,Model680,美国) 垂直电泳槽 ( Bio-Rad,美国) ,小型电泳仪( Bio-Rad,美国) ,Odyssey双色红外荧光成像系统 ( Li-Cor,美国) ,荧光显微镜( Nikon Eclipse 80i) ,恒温箱( Sanyo) 。

1.3造模

适应性饲养1周后,随机分为正常组,模型组, 西药组,中药组。除正常组外,其余3组大鼠腹腔注射50% CCl4橄榄油溶液( 0. 2 m L /100 g) ,每周2次,共2周; 随后腹腔注射0. 1 m L/100 g的CCl4橄榄油溶液,每周2次,共2周; 接着腹腔 注射0. 05 m L /100 g的CCl4橄榄油溶液,每周2次,共2周。正常组大鼠以同样方式等剂量腹腔注射橄榄油溶液。

1.4治疗

从第7周开始,停止腹腔注射,中药组予一贯煎浓缩液1 m L/100 g灌胃,西药组给予秋水仙碱灌胃,0. 25 mg /kg( 相当于成人用量的30倍)[4]。正常组和模型组予等量生理盐水灌胃。每天1次,连续4周。

1.5采集及处理样品

治疗4周后,所有大鼠 以10% 水合氯醛 按0. 35 m L /100 g剂量腹腔注射麻醉。取肝左叶同一部分,常规脱水、石蜡包埋,4 μm连续切片。常规脱蜡至水,自来水洗5分钟,蒸馏水洗5分钟。抗原修复后,滴入适当一抗( 1∶ 800) ,37度孵育90分钟,磷酸盐缓冲液( p H 7. 2 ~ 7. 6) 洗3次,每次2分钟。 滴入适当二抗,37 ℃孵育20分钟,pbs洗3次,每次3分钟,室温显色。苏木素轻度复染,脱水,透明,封片,光镜观察。采用NIS-Elements BR 3. 2采集图像,进行积分光密度分析。每组随机选取3个样本, 取肝右叶50 ~ 100 g,剪碎匀浆后蛋白定量,5% 浓缩胶80 V电泳约30分钟,10% 分离胶120 V电泳至溴酚蓝到底。60 m A冰浴过夜转膜,封闭后一抗 ( 1∶ 10000 ) 室温摇床 孵育1小时,洗膜后二 抗 ( 1∶ 10000) 室温摇床孵育1小时,洗膜后扫描成像, 采用Imagej2x分析蛋白电泳灰度值。

1.6统计学处理

采用SPSS 19. 0进行统计处理,各组计量数据均以均数 ± 标准差(  ± s) 表示,采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD检验。以P < 0. 05视为差异具有统计学意义,P < 0. 01视为差异具有显著的统计学意义。采用Origin 8绘制统计图。

2结果

正常组大鼠肝组织仅在中央静脉及汇管区周围可见极少量I型胶原沉积。与正常组相比,模型组大鼠I型胶原蛋白表达增加,在肝组织中央静脉及汇管区周围、桥接结构中可见大量I型胶原沉积, 且散见于小叶各处。与模型组相比,西药组与中药组I型胶原表达减少,肝组织细胞外I型胶原沉积明显减少,在中央静脉及汇管区周围有部分I型胶原沉积。见图1、图2、表1。

A: 正常组; B: 模型组; C: 西药组; D: 中药组

A: 正常组; B: 模型组; C: 西药组; D: 中药组

注: 与正常组相比aP < 0. 05,bP < 0. 01; 与模型组相比,cP < 0. 01。

3讨论

一贯煎始载自清·魏玉璜所著《续名医类案》, 由生地黄、沙参、当归、枸杞、麦冬、川楝子组成,功擅滋阴疏肝,临床常用于治疗肝肾阴虚、肝郁气滞所致胁痛、口干、腰膝酸软等症状。根据HF的临床表现和病症特点,中医学可参考“胁痛”、“肝积”“臌胀”“黄疸”等病证范畴。其病因多为饮食失节、情志失常、劳伤虚损、感染虫毒等,致湿热邪毒内蕴, 伤阴耗气,痰凝血瘀,损伤肝络,发为此病[5]。因肝肾二脏母子相及,乙癸同源,故肝纤维化病变后期往往出现肝肾阴虚的证候[6,7]。一贯煎方中重用生地黄为君药,滋阴养血,补益肝肾; 以沙参、当归、枸杞、麦冬4药共为臣药,滋阴柔肝; 同时少佐川楝子疏肝泄热,诸药合用,既滋补肝肾之阴又疏理肝气, 使肝阴得养,肝气得舒。

包括蛋白多糖、胶原蛋白和黏连蛋白[8]在内的ECM代谢紊乱会导致肝脏结构和功能出现异常,其中I型胶原蛋白变化幅度最大[9],可作为肝脏内胶原代谢变化的参考。正常肝组织细胞外间质的I型胶原主要分布在汇管区和中央静脉周围,研究表明[10,11],I型胶原由激活的肝星状细胞( hepatic stellate cell,HSC) 合成及分泌,受基质金属蛋白酶( matrix metalloproteinases,MMPs) / 金属蛋白酶抑制因子 ( tissue inhibitor of matrix metalloproteinases ,TIMPs) 调节。本实验结果表明,模型大鼠肝组织I型胶原蛋白表达增加,在肝组织细胞外沉积增多,反映出CCl4诱导大鼠肝纤维化过程中出现I型胶原代谢紊乱,过度沉积。经一贯煎汤剂治疗后,肝组织内沉积的I型胶原明显减少。前期研究表明,I型胶原减少的原因考虑与调节肿瘤坏死因子-α( tumor necrosis factor-α,TNF-α) 信号通路凋亡细胞抑制剂( cellular inhibitors of apoptosis,c IAP1 ) 蛋白[12],促进骨髓间充质干细胞募集到肝脏[2],调节MMP-1 /TIMP1有关。目前抗肝纤维化的现代药物研究主要集中于逆转纤维化的多种靶点,包括MMPs/TIMPs、TGFβ 细胞因子、Toll样受体( Toll-like receptor,TLR) 4、 内源性大麻素( endogenous cannabinoids,EC) 及其受体、整合素 αV、微小RNA-29在内的多种潜在靶点, 大部分仍处于临床前研究阶段[13],应用一贯煎汤剂等中药复方拮抗肝纤维化的研究可为肝纤维化的治疗提供新的思路。