I型胶原（精选4篇）
I型胶原 篇1
引言
胶原广泛存在于动物的皮肤、肌腱、骨骼和其他结缔组织中, 约占蛋白质总量的三分之一, 目前已经证实的胶原有27种, 但常以I型胶原为主[1,2]。由于I型胶原具有低免疫性、良好的生物相容性、生物可降解性等诸多特性, 在生物医学领域中有着广泛的应用[3,4,5]。但是, 鉴于I型胶原大分子在常规溶剂中的溶解度较低, 这又大大限制了其在生物制造中的应用[6]。
六氟异丙醇 (hexafluoroisopropanol, HFIP) 是一种重要的含氟精细化学品, 具有强极性, 易与水和许多有机试剂互溶, 耐热且允许紫外线通过的特点, 这些特性使HFIP成为许多物质体系理想的溶剂[7]。HFIP作为I型胶原的溶剂制备多种材料是近年来的研究热点之一。Matthews等人研究表明:以HFIP为溶剂静电纺胶原, 聚合物浓度和纤维直径成线性关系[8], 对在组织工程中作为支架材料有重要意义。Rho K S等人以HFIP为溶剂进行静电纺丝获得纳米胶原纤维, 在细胞试验中发现, 纳米胶原纤维作用与层粘连蛋白相似, 即为人角质层细胞的附着和增殖提供支架, 在动物试验中发现能加快创伤口在初期的愈合[9]。Shih Y R V等人以HFIP为溶剂进行静电纺丝获得纳米胶原纤维, 细胞试验表明:骨髓间充质干细胞的基因在该纤维上具有更高的表达活性, 而且纤维并不损坏它们的成骨分化能力, 这有望用于骨组织工程, 促进膜内骨的生成[10]。
然而, 对于采用HFIP溶解胶原大分子制备而成的膜, 是否仍保留有其独特的三股螺旋结构, 仍需要系统而全面的论证。本文着力于研究将I型胶原以不同质量浓度溶解在HFIP中, 检测PDC (prospective degeneration collagen, PDC) 的结构特征, 为HFIP是否适合作为I型胶原的良溶剂在生物制造中进行广泛的应用, 提供了理论支撑。
1 试验
1.1 试验材料和仪器
HFIP, 北京华威锐科科技有限公司。
真空冷冻干燥机Free Zone 6Liter, Labconco公司;
微型凝胶电泳仪Powerpac basic, 美国Bio-Rad公司;
紫外-可见分光光度计UV-3600、傅里叶变换红外光谱仪Nicolet i S10, 赛默飞世尔科技分子光谱部;
TG-207-F1型热失重分析仪, NETZSCH公司;
超灵敏差式扫描量热仪NanoZS, 英国Marlven公司;
德国X射线衍射仪, Philips公司;
原子力显微镜SPM-9600, 岛津技迩 (上海) 商贸有限公司。
1.2 样品的制备
(1) I型胶原的提取:参照本实验室I型胶原提取方法[11]。
(2) PDC样品的制备:以HFIP为溶剂, 配制质量浓度为3%、5%、7%的I型胶原溶液, 室温 (约20℃) 搅拌3d, 低温冷冻干燥后获得PDC样品, 分别记为a、b、c。
1.3 样品的表征
(1) 凝胶电泳法 (SDS-PAGE) 分析:采用7.5%分离胶及5%的浓缩胶, 进样体积20μL, 分离胶电压采用120V, 浓缩胶电压采用150V, 考马斯亮蓝R250染色。
(2) 紫外光谱法 (UV) 分析:将样品溶解于0.5mol/m L的醋酸溶液中, 溶解均匀的样品在紫外-可见光分光光度计200~400nm处, 进行紫外光谱扫描。
(3) 傅里叶红外光谱法 (FT-IR) 分析:室温 (20±1) ℃干燥条件下, 在研钵中放入少量样品, 再加入适量KBr, 研磨均匀, 压片, 放入样品池, 测试, 扫描波数为450~4 000cm-1, 分辨率为2cm-1, 每次扫描重复15次。
(4) 热重法 (TG) 分析:氮气气氛, 以10℃/min的升温速率从40℃加热到600℃, 测定样品热分解温度。
(5) 超灵敏查实扫描量热法 (US-DSC) 分析:0.5mol/m L的醋酸溶液作为参比液, 配制浓度为0.5mg/m L的样品溶液, 室温 (20±1) ℃条件下除气泡30min, 升温速率1℃/min, 检测范围25~60℃。
(6) X射线衍射法 (XRD) 分析:测定样品的XRD图谱, 试验参数为:Cu Kα, 40k V, 速度2°/min, λ=1.541×10-10m, 2θ范围5°~50°。
2 结果与讨论
2.1 SDS-PAGE凝胶电泳的测试
Lame 1:Mw Marker;Lame 2:I型胶原;Lame 3:a;Lame4:b;Lame 5:c;Lame 6:明胶, a、b、c分别代表质量浓度为3%、5%、7%的PDC样品
SDS-PAGE是测定蛋白质分子质量的常用方法之一, 根据肽链分子质量的大小可推测胶原的三股螺线结构的完整程度参考文献[12], 从SDS-PAGE凝胶电泳图可以看出, I型胶原有3条清晰的条带, 从上往下依次是β链 (245k Da左右) 、α1链 (125k Da) 、α2链 (115k Da) ;明胶的电泳分离带为连续带, 分布在90~135k Da之间, 在125k Da处颜色稍深;PDC样品a、b和c条带基本相同, 有2条条带, 在125k Da处的条带颜色较深, 在245k Da处的条带较窄, 不是很明显。众所周知, I型胶原是由3条链形成的三股螺旋结构, 分子质量较大;明胶是胶原高温变性后的产物, 三股螺旋结构遭到破坏, 破坏程度不一, 所以组成复杂, 可能部分α链仍然存在, 因此在图1中第6泳道125k Da处颜色稍深。电泳结果表明, 经HFIP溶解后的I型胶原可能其三股螺旋结构遭到部分破坏。
2.2 UV测试
a、b、c分别代表质量浓度为3%、5%、7%的PDC样品, 图3-图7同
紫外光谱法对于辨别有机化合物中发色基团和助色基团的位置、种类及其数目有其独特的优点, 胶原由于含有芳香族氨基酸, 因此可以在近紫外区检测到吸收峰。从图2所示的紫外吸收光谱可以看出, I型胶原、PDC样品a、b和c的最大波长吸收都在231nm处, 明胶的最大吸收在233nm, 与蛋白质的特有吸收峰相符;I型胶原和明胶在280nm处还有一个小的吸收峰, 而a、b和c没有, I型胶原中的酪氨酸和苯丙氨酸在300nm内是敏感的发色基团, 通常认为在280nm处的吸收峰是它们各自吸收峰叠加造成的[13], 明胶有吸收峰的主要原因是明胶是胶原高温变性的产物, 其中所含的酪氨酸和苯丙氨酸在肽链中并没有遭到破坏。而造成PDC样品a、b和c没有吸收峰的可能原因是HFIP与I型胶原作用, 影响了酪氨酸和苯丙氨酸对紫外光的吸收。
2.3 FT-IR测试
红外光谱图吸收峰的位置和强度可以反映I型胶原的结构、基团和一定的局部结构[14]。图3中, 3 410cm-1的酰胺A带与N—H伸缩振动有关, I型胶原、PDC样品a、b、c和明胶在酰胺A带波数差别不大, 但是吸收峰逐渐变宽, 这表明a、b和c肽链的氢键作用被削弱, PDC样品的无序结构增加[15]。1 640~1 660cm-1处的酰胺I带是N—H弯曲振动, 图3可知, I型胶原、PDC样品a、b、c和明胶都有强烈的吸收峰, I型胶原在1 659cm-1处有强吸收峰, PDC样品a、b和c在酰胺I带吸收峰的位置向低波数移动分别为1 648、1 647、1 650cm-1处, 明胶的吸收峰在1 652cm-1, PDC样品a、b和c与明胶接近, 说明PDC样品的氢键作用减弱。
由于I型胶原的甘氨酸以及特征氨基酸羟脯氨酸和脯氨酸含量高, 且形成独特的序列 (Gly-Pro-Hyp) n, 使得I型胶原在1 200~1 400cm-1具有其他蛋白没有的红外光谱特征, 由C—N伸缩和N—H弯曲引起的酰胺III带出现在1 200~1 360cm-1谱带有中强吸收峰, I型胶原的吸收峰在1246cm-1处, PDC样品a、b、c和明胶的吸收峰依次在1 246、1 247、1 247、1248cm-1向高波数移动大约1个波数。
FT-IR结果表明:PDC样品的无序结构增加, 分子间氢键减少, 氢键作用减弱, 与Bing Dong[16]等人报道的HFIP的2个三氟甲基有助于打破疏水作用的联系, 并且HFIP中温和的酸性二级醇羟基有助于打断I型胶原的氢键一致。
2.4 TG测试
图4和图5分别是I型胶原、PDC样品a、b、c和明胶的TG/DTG曲线, 对相同类型的胶原而言, 大分子间的束缚力、链的空间几何效应、分子的螺旋结构等, 是影响TG的重要因素[17]。从图4中可以看出:各个样品在热处理过程中经过了3次失重, 100℃之前, 是样品中吸附水或其他小分子物质的释出引起的;200~500℃是样品热解过程肽键发生断裂, 胶原被降解为多肽和氨基酸, 最后氨基残基被破坏, 脱水, 脱氮;500℃后的失重则更复杂, 主要是热解产物碳化引起的。从表1中可以看出:样品大部分失重是在200~500℃期间, PDC样品的a、c、和b失重比率略小于I型胶原, 残留量要多于I型胶原;明胶失重率为61%, 剩余量为27%, 各个样品之间差别不大。
图5为DTG曲线的峰值, 即样品失重速率最快, 一般认为, 此温度对应分解反应的分解温度, 从曲线中可以看出:I型胶原分解温度最高, 明胶次之, PDC样品a、b、c依次减小, 这说明HFIP和I型胶原发生了作用, 改变I型胶原的构象和聚集状态, 使得PDC样品的结构变得不稳定, 从而降低了I型胶原的热分解, 降低了材料的热稳定性。
注:a、b、c分别代表质量浓度为3%、5%、7%的PDC样品。
2.5 US-DSC测试
US-DSC可以精确测量液体样品在温度变化或某一恒定温度过程中的热量信息, 胶原的热变性温度是反映其三股螺线结构的重要指标之一, 当胶原的热变性温度发生变化时, 即可认为其结构发生一定的改变。如图6所示, I型胶原、PDC样品a、b、c和明胶溶解在0.5mol/L醋酸溶液的US-DSC曲线。I型胶原在升温过程中有2个吸收峰, 第1个小的吸收峰约为33℃处, 第2个主吸收峰约为42℃处, 通常认为此为I型胶原的热变性温度Ts, 对应I型胶原由三螺旋结构转化为无规卷曲[18]。测试结果表明:US-DSC能灵敏地检测到胶原在升温过程中蛋白构象的转变, 明胶因为没有规整的三股螺旋结构则没有吸收峰出现, PDC样品a、b和c只有一个吸收峰, 随着I型胶原浓度的升高, 吸收峰依次为33、33.3、32.7℃远远小于I型胶原的主吸收峰。据报道氟代醇中—OH的个数及位置对胶原分子有不同的影响, 异丙醇仅在C2上含有一个—OH, 能降低胶原热变性温度[19], 与HFIP的结构相似即仅在C2上有一个—OH, 因此, HFIP降低了I型胶原分子的热变性温度, PDC样品a、b和c结构发生改变, 但是与明胶不同, PDC仍有多条链聚集的结构存在, 与SDS-PAGE试验结果一致。
2.6 XRD测试
X射线衍射图谱能有效地区分物质的晶体结构和无定形结构。图7为胶原、明胶、PDC样品a、b、和c的XRD图。I型胶原为低结晶性分子, 在5°~50°有3个衍射峰, 第1个峰在7.5°处, 代表I型胶原分子间横向重组装, 第2个峰在21°处, 代表I型胶原的无定形分散, 第3个峰在32°处, 代表I型胶原典型的三股螺旋结构, 是判断I型胶原构象完整性的重要依据[20]。从图7可以看出:I型胶原的3个衍射峰较为明显, 明胶只有第2个峰, PDC样品a、b、和c有第一和第2个峰, 没有第3个峰, 并且衍射峰强度比I型胶原的略弱, 说明HFIP与I型胶原作用, 破坏了I型胶原的三股螺旋结构, 导致其无定形区面积增大, 结晶度下降, 与FT-IR检测结果一致。
3 结论
I型胶原经HFIP溶解后, FT-IR和XRD结果表明:HFIP的2个氟甲基和醇羟基打断了I型胶原2条链的Gly和Hyp之间的氢键, 它的三股螺旋结构遭到破坏, 无序结构增加;US-DSC、SDS-PAGE和UV结果表明:I型胶原的三股螺旋结构虽然遭到破坏, 但是还有多链聚集的结构存在, 与明胶结构不同;TG和US-DSC结果表明:HFIP的酸性二级醇降低了I型胶原的热变性温度, 并且热稳定性也下降。因此, HFIP可能不适合作为I型胶原的良溶剂, 在生物制造中广泛的应用。
Ⅰ型胶原提取中的若干技术问题 篇2
胶原是在提取、分离时,随着方法和条件不同,可以产生胶原、明胶和胶原蛋白三种产物。胶原的三股螺旋结构没有改变,保留了其生物活性,形成的膜具有较好的柔韧性、弹性和强度,在模拟生理条件下能再形成纤维,能明显激活细胞的生长,胶原不溶于冷水和热水,不能被蛋白酶利用[6];明胶是胶原在酸、碱、酶或高温作用下的变性产物,明胶的三股螺旋结构已被破坏[7],因此生物活性较低,相对分子质量分布较宽,从几万到十万,明胶能成冻、成膜,但明胶膜性脆,强度比胶原膜差;胶原蛋白是多肽混合物,三股螺旋结构基本松开,成为三条自由的肽链,相对分子质量为几千到几万,相对分子质量分布很宽,生物活性很低,能溶于冷水,能被蛋白酶利用,但不能成膜[6]。其中,三者最为显著的差异是天然胶原能促进细胞粘附和生长;而明胶和水解胶原蛋白则不具有促进细胞生长的能力。
1 Ⅰ型胶原提取的工艺方法选择
根据胶原的溶解特性,将其制备方法大致分为两类:一是通过溶解掉组织中可溶解的胶原和非胶原的成分,得到胶原纤维;二是分离和提纯可溶的胶原分子。一般地,前一种方法所需时间过长,但能保留组织中的大部分胶原,较适合工业化大规模生产;后一种方法对原材料要求较高,较适合实验室少量制备[4],以供研究。目前胶原的提取方法主要有酸法、碱法、盐法、酶法、结合法等。表1列举了酸法、碱法、盐法、酶法及结合法的特点。
从表1来看,不论是酸法、碱法、盐法还是酶法,都存在着一些不足,如果采用结合法提取胶原,将会弥补使用单一方法的缺陷,且提取的胶原纯度高,胶原三股螺旋保持得较好,品质良好。另外,也不乏其它一些提取胶原的方法。金勇等以新鲜猪皮为原料, 首先经萃取、沉淀、冰醋酸溶解精制纯化后再中和提取胶原的方法,得到纯度较高的胶原且三股螺旋保持得较好[8]。胡二坤等将直接用水提法提取的胶原蛋白同经酶预处理再利用水抽提法提取的胶原对比,发现后者的提取率将会大大提高[9]。
2 Ⅰ型胶原提取过程的控制
2.1 pH值的控制
叶易春等对不同pH值条件下提取猪皮胶原做了一些分析。冻干皮块经预处理、酸处理及离心等操作,通过SDS-PAGE电泳测分子量,结果发现:在醋酸强度为pH值2.0~2.5时,提取的胶原分子质量比较大且分布窄;在醋酸强度为pH值1.0~1.5时,提取的胶原分子质量也较大且分布窄。说明低温时,醋酸用量加大强度增强,仍不能水解胶原的肽链。pH值在3以上,由于酸作用及水解作用太弱,几乎没有胶原溶出;pH值低于2,则醋酸用量增大,生产成本也随之增高。故pH值为2.0~2.5较合适,既节约成本,又最大程度地提取胶原[10]。王晨等人在较小范围内(pH值1.5~2.0)研究了酶解pH值对鸡骨胶原蛋白提取的影响,以进一步确定最适pH值。发现pH值先是增加,当达到1.7时可以得到骨胶原的最大提取率16.7%,之后又开始下降,原因可能是酶活性的下降导致原料水解度降低引起,从而确定了提取骨胶原蛋白的最适pH值为1.7[11]。实验中选用0.5mol/L乙酸或柠檬酸,加入相应钠盐调节作为提取缓冲体系,既可保证提取过程pH值的控制,同时还可增强体系离子的强度并降低料液黏度,利于分离[10]。因此,pH值的控制不仅要考虑到最适反应条件、胶原得率,还要权衡经济成本等问题。
2.2 温度的控制
提取温度是提取过程中最难控制的因素,对提取的胶原质量也有很大影响。 叶易春[10]等在不同温度条件下醋酸和胃蛋白酶提取猪皮胶原蛋白,最后通过SDS-PAGE电泳实验,得出温度对分子质量及分布的影响较大的结论。当温度低时,提取的胶原分子质量大且分布窄;当温度较高时,提取的胶原分子质量分布宽并且呈弥散分布。分析得知,由于酶是作用于胶原的特定点,水解时是特定点打断;而醋酸在高温时,随机作用于胶原的肽链,水解时是随机点打断的。因此为了得到高分子质量且分布窄的高附加值胶原蛋白,提取过程中要严格控制其温度。猪皮胶原蛋白容易受热变性,所以实验温度最好控制在低于10℃(一般为4℃)条件下进行。王晨等[11]在pH值为1.7及时间90min,利用胃蛋白酶,研究了不同酶解温度对提取鸡骨胶原蛋白的影响。在35~37℃范围内提高温度,有利于骨胶原蛋白的提取,继续升高温度,由于酶的活性降低而导致提取率的下降,确定37℃为提取鸡骨胶原蛋白最佳酶解温度,此时骨胶原的提取率最大。沈菊泉等[12]将不同温度及时间提取出来的牛皮胶原蛋白样品做了SDS-PAGE电泳,结合胶原蛋白纯度和蛋白沉淀做了一些分析。32℃比37℃下得到的蛋白沉淀少,但提取产物纯度比较高,α(α1和α2)、β链保持完整,且可见γ链;综合考虑提取周期和生产成本,32℃比其它条件都较合适。张文熊等[13]发现牛皮胶原提取中,温度升高虽有利于使更多酶能量达到反应活化能,加快酶解反应速度而提高产率,但随着温度升高,酶变性将逐渐抵消反应速度加快程度,反而使产率降低。故而提取Ⅰ型胶原时,在胶原的不变性条件下适当提高温度是可以的,而且不同原料提取胶原,其所需温度有所不同。
2.3 酶的控制
用来提取动物组织中的胶原蛋白酶有胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰酶等。施辉阳等[14]对这三种酶的作用效果进行了对比试验,通过胶原提取率的比较,得出胃蛋白酶(41.5%)优于木瓜蛋白酶(12.3%)和胰酶(18.0%)。胡胜等[15]对酶法提皮胶原也做了一些研究,选取酶要考虑其对胶原作用的强弱及其价格,作用太弱,则无法得到较高皮胶原溶解率;酶纯度直接影响酶的价格,一般考虑用已完全工业化的酶,使用过程中对酶进行初步纯化即可。另外还得考虑酶对胶原的作用位点,这将直接影响最后水解产物分子量的分布。酶的用量会影响其水解作用,对酶水解反应到达平衡时间也有直接影响,但用量过多并不能显著提高水解反应程度,实际应考虑生产成本和工艺特点[16]。林海等[17]实验证明胃蛋白酶作为一种十分有效的提取猪皮胶原的酶制剂,在特定操作条件下,其水解速率降为最大水解速率一半所需时间为(2.59±0.19)h。用一阶指数衰减方程表征了胃蛋白酶水解速率的衰减过程,得出水解绞碎冻干猪皮的胃蛋白酶用量为2%时较为理想,水解作用时间为6~7h,既能保证较高的水解产率,又能较好地控制生产周期。
2.4 其它条件的控制
提取胶原蛋白过程中,除了要注意pH值、酶和温度的影响,还有其它一些工艺条件控制也不容忽视。例如酸法提取的介质、料液比、提取时间、盐析和透析过程及产物得率和纯度等因素。沈菊泉等[12]在相同时间和温度条件下采用0.5mol/L乙酸、柠檬酸作为酸提介质,比较得出料液比(S/L)1∶10~1∶30范围内采用乙酸-乙酸钠作为提取介质胶原提取率要高于柠檬酸-柠檬酸钠。还考察了料液比为1∶20~1∶40的条件下对牛皮胶原提取的影响,结果表明25℃下,料液比1∶30时胶原蛋白的提取率最高,虽然提取时间长有利于提高胶原蛋白的提取率,但考虑到提取周期太长,生产设备投资大,故确立最佳料液比的同时,还要进一步考察可否控制其它条件来缩短提取时间。用水量对酶水解也有一定影响,文献表明[16],原料加水少,水解度低,蛋白质提取率低,加水多有助于水解反应进行,增加蛋白质提取率。但用水过多使产物浓度降低,浓缩时能耗增大。罗发兴等[18]用柠檬酸、醋酸和盐酸以及胃蛋白酶提取猪皮胶原,探讨了三种酸溶液在不同时间、不同酶用量条件下对猪皮胶原蛋白溶出率的影响。三种酸液协同酶消化作用于猪皮胶原蛋白,通过比较分析得出,柠檬酸提取猪皮胶原蛋白的作用效果最好,醋酸次之,盐酸较差。
3 提高Ⅰ型胶原产率的方法
付强等通过采用两步法[19]对牛皮进行预处理,发现在较短时间内可以除尽皮上的毛,进而将大部分纤维间质除去,并适当地分散胶原纤维,使天然胶原的提取率得到明显的提高。因为皮胶原纤维分散得越好,天然胶原提取时蛋白酶就越容易与底物作用,从而天然胶原溶解量越多,提取率就越高。在提取动物骨胶原蛋白时,需对原料进行脱钙、脱脂预处理,否则骨胶原很难溶出。王晨[11]等利用不同脱钙剂和脱脂剂对鸡骨粉进行预处理,然后用胃蛋白酶酶解提取胶原。与未经脱钙脱脂处理提取的骨胶原对比,胶原的提取率明显地增加了,甚至未脱脂的样品不能形成絮状蛋白质沉淀,难以提取。不同酸的选取也对产率有一定关系,罗发兴等[18]考察了盐酸、醋酸及柠檬酸提取猪皮胶原对胶原蛋白溶出率的影响,其中柠檬酸的溶出率最高。总的说来,酸法盐法的产率都不高。文献表明[9],通过酶法预处理有利于疏松猪皮的表层结构,除去非纤维蛋白中的球状蛋白,促使内容物的溶出,软化胶原蛋白的皮层,可以大大提高胶原蛋白的提取率。周文常等[20]在提取猪皮胶原前,先将猪皮经自制CO2超临界处理器预处理纯化,再经胃蛋白酶消化、离心、盐析等操作,制得的胶原比未经自制CO2超临界处理器预处理提取的胶原纯度高很多。总之,要提高Ⅰ型胶原的产率,需要针对各工艺方法,综合考虑其反应条件,以最大程度提取胶原。譬如利用酶提取胶原的过程中,在它的最适反应温度、最适pH值和最适酶活力条件下进行提取会得到较高的胶原提取率。提取时间取决于原料是否充分反应,如果时间过短,反应不完全,造成原料损失同时提取率低;如果时间过长,造成水解过度,胶原进一步水解成明胶之类的小分子化合物,得不到目标产物胶原。
4 结束语
胶原所具有的生物性能决定了它在医药、化妆品、保健食品等行业中的重要地位[21,22,23,24],胶原的提取也越来越受到重视。由于胶原不溶于水,要想将它从生物组织中分离并提取是一件非常困难的事。加之在提取过程中存在着需要很好地保持胶原的三股螺旋结构,不致因过度处理而使胶原进一步分解为明胶而丧失胶原所具备的机械强度的难题,使得胶原的提取研究进展缓慢。
I型胶原 篇3
Ⅳ型胶原作为构成细胞外基质中基底膜的主要成分之一[1],参与构成人体组织支架。Ⅳ型胶原浓度与肝纤维化程度密切相关。当富含血管基底膜成分的组织或器官发生病变时,也将出现Ⅳ 型胶原及其降解片段的明显异常及水平上升,如肾病、糖尿病等[2,3]。大量研究表明,癌症患者体内的Ⅳ型胶原参与肿瘤细胞的粘附、迁徙、增殖等过程,与肿瘤生物学特性密切相关[4,5]。基底膜是肿瘤细胞浸润转移的第一层天然屏障,肿瘤组织内基底膜破坏促使了肿瘤细胞的扩散、侵犯周围正常组织引起远处转移[6—8]。细胞侵袭和转移是胃恶性肿瘤的一个重要标志,是决定预后的关键因素[9—13]。
Ohlund D等在胰腺癌患者体液 Ⅳ 型胶原研究中指出,Ⅳ型胶原水平的升高可能是由于肿瘤细胞破坏基底膜及肿瘤细胞合成分泌的Ⅳ型胶原释放入体液形成的结果[14]。吴畏等采用免疫组化法对30例Dukes B、C期大肠癌患者的癌组织和正常组织进行IV型胶原检测及相关性分析,在正常大肠组织中见于腺管上皮和血管壁周围的基底膜具有连续性环形结构,而大肠癌中大部分癌巢的周边无正常组织那种环绕基底膜形成的环状结构,表现为偶然的灶性中断,明显的不连续,染色浅淡或缺失,IV型胶原在大肠癌组织中的表达明显降低[15]。
本文通过检测胃液以及血清中Ⅳ型胶原含量, 测定Ⅳ型胶原含量在胃癌组织中的表达变化,并进一步探讨Ⅳ型胶原的水平变化在胃癌诊断中的意义,尝试将患者Ⅳ型胶原的含量和水平作为反应胃癌生长和转移状况的标志物之一。
1材料和方法
1.1病例资料
收集安徽医科大学第四附属医院消化内科近2年来门诊以及住院患者共121例。其中共包含胃癌患者50例,男40例,女10例,年龄37 ~ 80( 62. 36 ± 11. 21) 岁; 胃癌前病变患者41例,包括萎缩性胃炎、 肠化、不典型增生,男20例,女21例,年龄34 ~ 74 ( 54. 24 ± 11. 71) 岁; 浅表性胃炎30例,为胃镜下轻度浅表性胃炎患者,其中男14例,女16例,年龄20 ~ 60( 34. 23 ± 7. 90 ) 岁。以上所有患者均经胃镜及活检病理确诊,所有患者入选病例就诊前均未接受过手术、化疗或放疗,所有患者都无并发其他器官的原发肿瘤。
1.2取材
所有121例患者禁食8 h以上进行胃镜检查, 胃镜下经活检孔抽取胃液5 ~ 10 m L,须在活检之前进行,均无胆汁、血液污染。胃液用1 mol/L Na OH将其p H调至7. 0 ~ 8. 0之间,同时收集患者空腹静脉血5 m L。所有标本经3 000 r/min离心10 min, 取上清液,置 - 80 ℃ 冰箱保存待测,活检组织标本置于10% 福尔马林溶液固定,石蜡包埋,组织切片。 全部癌组织及正常组织均经病理证实。
1.3试剂和方法
胃液、血清Ⅳ型胶原采用放射免疫法测定,试剂盒由北京北方生物技术研究所提供,125I标记。鼠抗人Ⅳ型胶原单克隆抗体及免疫组化染色试剂盒 ( 包含封闭用正常山羊血清工作液、生物素化二抗工作液、辣根过氧化物酶标记链酶卵白素工作液等) ,DAB显色剂均购于北京中杉金桥生物技术有限公司,所有操作均严格按说明书进行。
1.4Ⅳ型胶原结果判定
以胃腺体基底膜完整性百分比判断实验结果, 每例观察5个高倍视野( × 200) ,每视野计算棕黄色线性结构( 阳性染色) 占肿瘤与间质交界长度的百分比,取平均值。根据腺体基底膜呈连续性分布的百分比,Ⅳ型胶原的表达可分为连续性和不连续性: 连续性定义为≥90% 腺体的基底膜呈连续性分布; 不连续性定义为 < 90% 腺体的基底膜呈连续性分布。
1.5统计学处理方法
采用SPSS13. 0统计软件分析,计量资料采用± s表示,计数资料采用构成比表示。部分数据呈偏态分布,故对其数据进行对数转换采用方差分析, 率的比较采用 χ2检验。均以P < 0. 05考虑有统计学意义。
2结果与讨论
2.1胃液、血清Ⅳ型胶原含量
胃癌组胃液Ⅳ型胶原含量的中位含量是14. 81 μg /L ( 4. 24 ~ 204. 40 μg /L) ,平均含量是34. 04 μg /L,( n = 50) 。癌前病变组中位含量7. 7 μg /L ( 4. 33 ~ 66. 35 μg /L) ,平均含量是10. 15 μg /L, ( n = 41) 。浅表性胃 炎组中位 含量7. 64 μg /L ( 4. 39 ~ 37. 61 μg /L) ,平均含量 是9. 53 μg /L, ( n = 30) 。胃癌组胃液Ⅳ型胶原含量明显高于胃癌前病变组和浅表性胃炎组( P < 0. 05; P < 0. 01) 。胃癌前病变组与浅表性胃炎组比较差异较小,无统计学意义( P > 0. 05) 。
胃癌组血清Ⅳ型胶原含量的中位含量是55. 65 μg /L ( 40. 53 ~ 89. 32 μg /L) ,平均含量是57. 25 μg /L,( n = 50) 。胃癌前病变组中位含量52. 13 μg /L ( 42. 66 ~ 93. 53 μg /L) ,平均含量是52. 99 μg /L,( n = 41 ) 。浅表性胃炎组中位含量53. 03 μg /L ( 36. 44 ~ 72. 50 μg /L) ,平均含量是52. 97 μg /L,( n = 30) 。胃癌组血清中Ⅳ型胶原含量明显高于胃癌前病变组( P < 0. 05) ; 见表1。
注: 与胃癌组相比:*P < 0. 05;**P < 0. 01。
2.2Ⅳ型胶原在胃癌组织中的表达
Ⅳ型胶原表达于胃粘膜组织细胞质、基底膜以及细胞间质中,研究中被染成棕黄色,Ⅳ型胶原在正常胃组织中可见于腺管上皮和血管壁周围的基底膜,在基底膜形成较粗的连续性环形结构。在早期胃癌组织中,大部分癌巢周边没有类似于正常组织环绕基底膜所形成的环状结构,腺体及癌巢周围线状基底膜样结构受到不同程度的破坏而变薄、断裂、 缺损,呈现断线状、条索状、甚至碎片样表达,呈不连续性,如图1所示。
胃癌组、胃癌前病变组及浅表性胃炎组所观察到的连续性Ⅳ型胶原分别为11例( 11 /50) 、38例 ( 38 /41) 和30例 ( 30 /30) ,也即22% 、92. 68% 、 100% ,胃癌组Ⅳ型胶原连续率明显低于胃癌前病变组和浅表性胃炎组,( P < 0. 01) ,胃癌前病变组与浅表性胃炎组比较差异无统计学意义( P > 0. 05) ,如表2所示。可见,Ⅳ型胶原在胃癌组织中的表达具有较强的诊断意义,可用于胃癌的诊断与肿瘤生长的检测。
注: 与胃癌组相比:**P < 0. 01。
2.3讨论
在本实验中,通过对121例患者胃液、血清Ⅳ型胶原采用放射免疫法进行检测,经统计学方法研究表明,胃癌组胃液中Ⅳ型胶原含量明显高于胃癌前病变组和浅表性胃炎组。从组织染色可知,胃癌组中基底膜连续性环形结构已见明显异常。
经统计121例患者血清Ⅳ型胶原平均含量,胃癌组血清中Ⅳ型胶原高于胃癌前病变组,而胃癌前病变组及浅表性胃炎组水平无明显差异。胃癌组血清Ⅳ型胶原含量与浅表性胃炎组相比却无明显统计学意义,这与其他相关报道略有不同,鉴于本实验收集的病例有限,有待于扩大样本量进一步研究。
与血清Ⅳ型胶原含量检测结果相比,在同样的检测条件和统计学标准下胃癌患者胃液Ⅳ型胶原含量明显高于胃癌前病变组、浅表性胃炎组。这充分说明对胃癌患者而言,胃液Ⅳ型胶原含量检测比血清含量检测更加敏感。通过对Ⅳ型胶原胃液含量及血清含量进行对比,结果显示胃癌组、胃癌前病变组及浅表性胃炎组中Ⅳ型胶原在胃液中含量均低于血清中含量,这表明Ⅳ型胶原释放入胃液中的含量低于入血清中的含量。
本实验通过免疫组化染色方法,发现Ⅳ型胶原表达于胃黏膜组织细胞质、基底膜以及细胞间质中。 胃癌组织基底膜上Ⅳ型胶原呈断裂、碎片状,呈不连续性。胃癌组、胃癌前病变组及浅表性胃炎组所观察到的连续 性 Ⅳ 型胶原分 别为22% 、92. 68% 、 100% ,胃癌组Ⅳ型胶原连续比率明显低于胃癌前病变组和浅表性胃炎组。IV型胶原的缺失或间断为肿瘤在组织内浸润生长提供了条件,在不同组织来源的肿瘤中,Ⅳ型胶原的缺失可能发挥相似的作用。 IV型胶原表达越少可能表示肿瘤恶性程度越高,侵袭力越强,预后愈差。因此,Ⅳ型胶原与肿瘤的侵袭和转移有一定关系,对肿瘤细胞的转移具有一定的指示作用。通过检测体液中Ⅳ型胶原含量,可以尽早发现有高复发风险及不良预后的恶性肿瘤,以便更早的针对这些肿瘤患者进行积极治疗。
3结论
细胞侵袭和转移是恶性肿瘤的重要标志,也是胃癌的重要特性。本研究通过放射免疫法和免疫组化法对121例研究对象血清、胃液Ⅳ型胶原含量及组织表达的检测,发现胃癌患者的胃液Ⅳ型胶原含量明显高于胃癌前病变患者和浅表性胃炎患者,胃癌患者的血清Ⅳ型胶原含量高于胃癌前病变患者。 同时,胃癌组织基底膜上Ⅳ型胶原呈断裂、碎片状, 不连续性表达十分明显。
I型胶原 篇4
Ⅰ型胶原蛋白是皮肤、骨骼、肌腱的结构蛋白, 是一种多领域广泛使用的生物材料, 诸如手术缝合线、化妆品、伤口愈合和皮革制造。如此广泛的应用, 更加强了对胶原耐生物降解和耐热稳定性机理研究的必要性, 这些研究也将对胶原在工业和生物技术上的应用产生深远的影响。纤维素是一种已经广泛应用的天然聚合物。大量的纤维素衍生物通过化学方法改性得到。高氯酸氧化纤维素在温和的水性条件下制备, 它的特征是, 吡喃葡萄糖环苷键特异性裂解于C2-C3位上, 使每个单元得到两个醛基。因此, DAC是一种含有醛基的开链聚合物。如果在氧化过程中没有其它键断裂, 它的相对分子质量将与氧化前的纤维素相当。
胶原是一种具有突出特征的蛋白质, 每个胶原分子由三条肽链 (两条α1链, 一条α2链) , 缠绕在一起形成长约30μm直径150nm的右旋三股螺旋卷曲结构。胶原分子组成具有良好强度和稳定性的微纤维。分子链内、链间氢键和水参与的氢键共同成就了胶原结构的稳定性。胶原蛋白会受到微生物的侵蚀和降解。因此, 以胶原蛋白为基础发展的应用材料, 都要使他们抗微生物降解。胶原的热稳定性和关于胶原变性温度的各种影响因素已经得到广泛研究。众所周知, 胶原可以用各种交联剂 (如植物多酚、金属离子和醛) 发生交联, 使其耐酶降解性能及热稳定性都得到提升。近年来, 环境友好型的交联化学品呼声越来越高。六价铬、甲醛和戊二醛都是致癌的。改性多糖可生物降解, 在毒理学上是可接受的。DAC是由纤维素改性得到的生物高分子, 由于它能够使胶原稳定且来源丰富、价格低廉、生态环保受到了人们的关注。胶原对化学药品和酶的稳定性以及其湿热稳定性的高低由很多因素所决定。此次研究, 将DAC作为一种交联剂与鼠尾肌腱纤维的Ⅰ型胶原作用, 研究其交联效应及Ⅰ型胶原的湿热稳定性和耐胶原酶解能力。这是模型研究, 其展示的经过DAC处理的Ⅰ型胶原的热稳定性和耐酶解能力, 也适用于其他来源的胶原, 这些胶原更易用于生物加工。
2 实验材料和方法
2.1 实验材料
Ⅰ型胶原酶购于Sigma化学公司, 使用前根据Keller和Mandl的方法, 先用Sephadex G-200进行凝胶过滤提纯。实验所用化学品均为分析纯, 购于印度SRL化学公司。
2.2 实验方法
2.2.1 Ⅰ型胶原的制备
鼠尾取自6个月大的雄性白鼠, 在-20℃的条件下冰冻。由于它纯度高, 具有可利用的残留赖氨酸和胶原含量高, 是一种研究交联剂的理想材料。从冰冻器中取出鼠尾解冻, 取出肌腱。在4℃下, 用0.9%的NaCl溶液洗涤取出的胶原, 去除粘性可溶性蛋白。鼠尾肌腱用去离子水充分洗涤后, 储存于-20℃的条件下, 当作胶原纤维使用。根据Chandrakasan等描述得方法分离出酸溶鼠尾肌腱Ⅰ型胶原溶液, 步骤包括用醋酸提取和用NaCl盐析。使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 测定所制备胶原的纯度。根据Woessner的方法, 通过测定羟脯氨酸的含量来确定溶液中的胶原含量。
2.2.2 DAC的制备
根据早期报道的改性方法制备DAC。纤维素 (约100 g) 用5mol/L的盐酸水解 (10 h, 85℃) , 水解后的纤维素悬浮于去离子水中, 然后在冰水浴中冷却。在磁力搅拌器搅拌下向样品中加入120g高碘酸钠。反应过程中溶液pH值保持为4, 温度为35℃, 在避光条件下反应48 h后便得到含量99%的DAC。产物用叔丁醇 (样品∶溶剂为1∶3) 离心分离萃取。用碘量法测定上层清液中的碘。产物在同体积的叔丁醇中重新悬浮分散, 然后多次离心分离直至所有含碘化合物被分离除去。将产物在30℃下干燥。用碘量法来测量未消耗的高碘酸盐, 从而确定样品的氧化程度;双醛含量用早期报道的方法测定。DAC溶解度低, 因此, 试验中所使用的DAC均经过了高压蒸汽处理 (将10%的DAC悬浮于蒸馏水中, 在120℃, 15磅压力下处理2 h) 。
2.2.3 交联胶原的制备
鼠尾肌腱纤维用4℃的双重蒸馏水充分水洗, 放到1%的DAC溶液中, 在24℃, pH8的条件下反应24 h。交联后的胶原样品充分水洗后放置24 h后, 进行湿热稳定性、DSC和耐胶原酶解试验。
2.2.4 DAC的表征
用含折光指数检测器的凝胶色谱 (Jasco MX 2080-31) 测定DAC的相对平均相对分子质量。凝胶色谱分析用8μm材料填充的水性凝胶-OH柱 (内径7.5mm, 柱长300 mm) , 去离子水作为流动相, 流速为1 mL/min。用示差折光检测器检测控制溶液的洗脱情况。凝胶色谱柱用相对分子质量为580、5900、6300、504000、1112000 Da的多聚糖标准品校正。样品装柱之前先用薄膜过滤器 (0.45μm) 过滤。每次装样品20μL (质量浓度约为0.1%) 。
2.2.4. 1 水解程度。
将50 mL高压蒸汽处理过的DAC溶液离心10 min。用蒸馏水洗涤沉淀物两次, 然后在空气中干燥 (30℃) 24 h。分别计算高压蒸汽处理与未高压蒸汽处理样品的水分含量。通过高压蒸汽处理前后DAC的质量变化来确定水解程度。
2.2.5 交联胶原的表征
2.2.5.1 交联率
DAC稳定胶原的交联率, 用三硝基苯磺酸 (TNBS) 检测胶原中的ε-氨基来确定, 即用TNBS测定交联前后赖氨酸的有效含量来得到交联率。交联与未交联胶原溶液中赖氨酸上未反应的ε-氨基基团与TNBS反应会形成一种可溶性配合物。在60℃的去离子水中, 将1 mL 4% (w/v) 的碳酸氢钠溶液与1 mL刚配制的0.5% (v/v) 的TNBS溶液加入到1 mL酸溶胶原溶液 (浓度为5 mg/mL) 与1 mL各种浓度 (0%～2%) 的DAC (在pH值7及4℃下储存24 h) 中混合加热4 h。取1 mL此混合溶液在40℃下与3 mL 6 M的HCl反应1.5 h, 稀释后在334nm处测量吸光度。天然胶原溶液也在相同参数条件下用TNBS处理。所有的实验都做三个平行样。交联率用式 (1) 计算。
2.2.5. 2 热稳定性
2.2.5.2.1 湿热收缩
DAC处理后胶原纤维的湿热稳定性用微收缩测试仪测定。胶原纤维长度收缩到原始长度的1/3时的温度, 计为胶原的收缩温度。当在水浴条件下测定时, 收缩温度也被视称为湿热稳定性。切下一小块纤维用水润湿, 置于带槽显微镜的载玻片上。将载玻片翻面置于上方安装有显微镜的加热装置上。一边加热一边观察, 升温的速率为2℃/min。
2.2.5.2.2 差式扫描量热法 (DSC) 。
经过DAC处理的胶原和未经处理的胶原的热稳定性用差示扫描量热仪Netzsch DSC 200 PC进行分析。所有的测试都在氮气保护的情况下进行。用铟作标准对温度进行校正。加热速率控制在5℃/min。研究两种胶原在收缩过程中与相转变相关的的峰值变性温度 (TD) 、焓变 (ΔH) 、收缩速率 (ko) 以及活化能 (Ea) 。
2.2.5.3 耐胶原酶作用
用细菌性胶原酶降解两种胶原, 然后通过计算释放到溶液中的羟脯氨酸进行分析。胶原酶处理过程在pH值7.2的0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液和0.04 mol/L CaCl2缓冲液中进行 (胶原∶酶比为50∶1) 。通过检测从不溶胶原释放出的可溶性羟脯氨酸来确定两种胶原的裂解情况。羟脯氨酸的含量 (%) 用Woessner法测定。此测定方法是将羟脯氨酸氧化为吡咯-2-羧酸, 而吡咯-2-羧酸与对二甲氨基苯甲醛形成的络合物在557 nm处呈现最大吸光度。胶原降解率计算公式见式 (2) 。
3 结果与讨论
用99%的高碘酸氧化纤维素得到含92%双醛和3%可溶物的DAC。高碘酸特定地裂解多糖上邻近的乙二醇结构, 形成双醛衍生物。这个反应常用来阐明多糖的结构。高碘酸突出的优点是它的氧化具有特定性。通过控制所用高碘酸的量就能很容易地控制氧化程度, 可使氧化程度在0%～100%范围内, 从而调节DAC醛衍生物的含量。在给定条件下, 一个α-乙醇基团消耗一分子的高碘酸, 反应的速率主要由α-乙醇基的空间位置来决定。尽管氧化反应在水溶液中进行, DAC在多相分散体系 (叔丁醇∶水比为3∶1) 中也会沉淀出来。氧化后的DAC在水中的溶解度很低。DAC突出的特点是, 即使氧化完全也不溶于水或一般溶剂。DAC的不溶性归因于其未反应的羟基与醛基之间半缩醛的形成。但是, DAC在120℃、15磅压力下高温蒸汽处理后具有明显的可溶性, 水解程度可以达到54.6%, 冷却至室温也不会产生明显的沉淀, 稳定性可以一直保持。由于水是化学品材料转移进胶原内部的主要介质, 因此交联剂的水溶性很重要。
3.1 DAC的相对分子质量分布
pH值4.5时高温蒸汽处理10%的DAC会得到4种低聚物, 其中最重要的一种组分含量约为52%, 相对分子质量为790 Da (见表1) 。蒸汽处理时的高温高压条件会使DAC水解。通过计算高压蒸汽处理前后DAC质量的减少情况, 计算出水解程度为54.6%。早期的报告也显示, 在热机械应力作用下纤维素的相对分子质量会降低。由于双醛基团的存在, 高碘酸氧化纤维素在碱性条件下很容易降解。通过凝胶色谱证实在pH 8时, 高压蒸汽处理DAC会进一步水解。在此种情况下, 得到的主要组分含量为81%, 相对分子质量为580 (见表1) 。
3.2 DAC与胶原交联
Bowes和Cater曾经报道, 胶原中的氨基能够与双醛发生交联。单醛与胶原的氨基发生Mannich反应, 最可能生成亚甲基和希夫碱类化合物。甲醛不能与相邻胶原肽链上的氨基进行有效交联。要形成有效交联, 用作交联剂的分子应当含有双官能团, 以使两个多肽链间产生反应。因此, 双醛是一种很好的胶原交联剂。乙二醛能与精氨酸基团反应, 是一种效果突出的交联剂。戊二醛是另一种常用作交联的双醛化合物, 它主要与蛋白质的赖氨酸基团发生反应。据文献报道, 能与戊二醛发生交联的典型双分子模型主要有, N-烷基-1, 4-二氢吡啶 (在pH>7) 和2, 6-二取代的四氢吡喃以及2, 6-二芳基氨基四氢吡喃。因此, DAC交联就是胶原中赖氨酸和羟赖氨酸的氨基及精氨酸的侧基与DAC反应 (见图1) 。在低pH条件下氨基一般带阳电荷, 因此醛基与蛋白质反应的最佳pH一般要求高于蛋白质的等电点 (IEP) 。胶原的等电点是6.7, pH高于这个值胶原带负电, 其氨基就可以与醛基发生反应。早期的研究表明, pH为8是醛基与胶原反应的可行条件。pH越高交联后的胶原收缩温度越高。在pH为4.5和6时, 收缩温度分别为64℃和71℃, 而pH为8时, 收缩温度为80℃ (见表2) 。由表2也可以看出, 在pH为8时用DAC处理后胶原的耐胶原酶稳定性提高了93%。随着pH的升高, 氨基酸 (如精氨酸和赖氨酸) 侧链基团中未带电荷的氨基 (NH2) 含量也会升高, 由于醛基可以与胶原蛋白的氨基反应产生共价交联, 这也有利于DAC通过醛基基团固定于胶原上。如表1所示, 在pH值8的条件下高温蒸汽处理的DAC相对分子质量更低。在这个pH条件下, 各组分的相对分子质量也越低, 其渗透于扩散效果就越好, 也就越易与胶原反应。
3.3 DAC的交联率
用TNBS测定DAC对胶原的交联能力。各种浓度的DAC交联对胶原稳定性的影响, 见表2。可以看出, 通过与胶原的氨基形成交联, 交联率随DAC的浓度的增大而增强。根据早期的报道, 天然胶原中每1000个氨基酸残基分子含33 mol氨基基团。浓度为0.2%的DAC交联度可达到36%而浓度为0.6%时, 交联度可达到52%。随DAC中醛基基团的增加, 胶原中赖氨酸的氨基减少, 胶原受DAC交联的程度提高, 稳定性提高。但是, 浓度为0.6%及以上时DAC的交联率明显提高, 会引起分子链内及链间的交联 (见图1) 。然而, 当DAC浓度为1%时, 能与胶原氨基交联的醛基达到最大值, 因此, 大于1%时交联率为一个恒定值。高pH值与高DAC浓度有助于高的交联, 因有大量的醛基可与胶原的氨基反应。DAC与胶原之间强的交联能力归因于二者之间强的结合能力, DAC可与胶原形成共价与非共价相互作用。因此, DAC中醛基与胶原的氨基形成的共价交联以及羟基形成的氢键, 都提高了胶原的热稳定性和耐酶解稳定性。
3.4 DAC交联胶原的湿热稳定性
交联胶原的热稳定性是交联效果的表征。加热会使胶原纤维的结构网络收缩。提高胶原基质耐湿热能力是使其稳定的重要方面之一。胶原收缩至原始长度1/3时的温度为62℃, 也称作胶原的湿热收缩温度。在此温度下胶原基质出现明显收缩, 是由于蛋白质的稳定结构失去。交联会引起纤维脱水, 使胶原的协同单元尺寸发生变化, 分子结构变得紧实。胶原蛋白质具有较高的变性温度, 根本的原因在于其聚集态的长程相互作用。DAC交联胶原使湿热稳定性明显提高。由表2可以知, 随着DAC浓度和pH的提高, 胶原基质湿热稳定性也提高。因此, 通过与氨基形成共价交联和形成氢键, DAC交联的胶原中增加了长程有序的结构, 这有利于提高胶原纤维的湿热稳定性。
在pH8下用DAC交联胶原的热力学参数, 如变性温度 (TD) 、焓变 (ΔH) , 活化能 (Ea) 与反应速率常数 (ko) 见表3。用DSC测定出天然的和经DAC交联的鼠尾肌腱纤维的变性温度 (见图2) 与相应胶原湿热收缩温度有相同的趋势 (见表2) 。胶原纤维的湿热收缩温度在水浴条件下测定, DSC则是在无水条件下测定。由于实验条件的差异, 用DSC测定出的变性温度要略高于湿热收缩温度。湿热收缩温度测定的原理在于加热条件下螺旋结构会发生转变, 这取决于水合作用的程度。从表3可以看出, DAC交联后胶原的焓变也增加。焓变 (ΔH) 升高, 意味着发生了交联, 需要更多的能量使螺旋结构发生转变。也可以看出, 与天然胶原相比, 经过DAC交联后鼠尾肌腱胶原纤维的变性温度、焓变都明显升高。这可能是由于共价键的作用使分子间的交联数的明显增加。与天然纤维相比, 交联后鼠尾肌腱纤维发生相变时的活化能也会升高。要使DAC交联过的胶原熔融就需要更多的能量。反应速率常数 (ko) 取决于破坏分子间氢键所需的能量及其引起的分子内部结构无序程度。由于结构改变所需熵减少, 热稳定性的提高与交联度的提升相关。焓变与相变相关, 即意味着热力学过程与二级、三级和四级结构有关联, 这种复合焓变与胶原各个层次结构的有序程度都有关。总的来说, 基于加热变性过程中样品的焓变, DSC法是测定胶原稳定性时一个客观可靠的方法。DSC法也间接提供了DAC与胶原反应的信息, 即交联机理。
3.5 DAC交联胶原纤维的耐胶原酶分解能力
胶原的三股螺旋结构对酶降解 (胶原酶除外) 有抵抗作用。本文通过分析在胶原酶作用下胶原的水解速率, 来研究DAC交联胶原抗酶降解的能力。胶原酶优先裂解胶原分子非极性区-Gly-Pro-X-Gly-Pro-X-序列中的X-Gly键 (X是一种最常见的中性氨基酸) 。取自溶组织梭状芽孢杆菌的胶原酶能够在多个位点裂解胶原。用胶原酶降解天然胶原和经DAC交联鼠尾肌腱胶原纤维, 测定了它们不同时间的水解性 (利用羟脯氨酸的释放量检测) 。与天然纤维相比, DAC交联胶原纤维的降解率明显减少。培养反应96 h后, DAC交联鼠尾肌腱纤维降解率为7%, 而天然胶原降解率达99%。由表2知, 胶原耐胶原酶解的稳定性随着DAC的浓度和pH的升高而增强。DAC与胶原反应形成共价键和氢键。胶原与DAC反应保护了胶原中能被胶原酶识别的活性位点, 因而抗酶解稳定性提高。高压蒸汽处理后的DAC, 双醛分子变小, 更容易扩散渗透进入胶原内部与之反应。这就保障了经过蒸汽处理的DAC小分子与胶原有更好的反应性, 从而提高胶原的耐热与耐酶解稳定性。DAC交联胶原耐酶解稳定性的显著提高, 是由于DAC能够很好地与胶原反应, 形成共价键和氢键交联。
4 结论