胶原性关节炎

2024-10-30

胶原性关节炎(精选10篇)

胶原性关节炎 篇1

类风湿性关节炎 (rheumatoid arthritis, RA) 是一类严重危害人类身体健康的常见自身免疫性疾病, 以关节滑膜炎及对称性、破坏性的关节病变为主要特征。由于RA的发病机制过于复杂, 其发病机制至今尚未明确。完全弗氏佐剂诱导的佐剂性关节炎 (adjuvantarthritis, AA) 是目前最为经典、最为常用的RA实验模型, 常用于RA发病机制的研究[1,2]。

近年来, 大量的文献资料显示, 羊软骨Ⅱ型胶原蛋白 (CⅡ) 不但在RA和骨肿瘤的病理研究方面扮演着重要角色[3,4], 而且在治疗RA中也有着广阔的应用前景[5,6,7,8]。国内外均有通过口服CⅡ诱导免疫耐受治疗RA动物模型的研究报道[9,10], 但对羊源CⅡ的预防和治疗效果研究报道较少。本试验采用弗氏完全佐剂制作AA小鼠动物模型, 然后以预防和治疗两种方案灌胃给予羊软骨CⅡ, 测定致炎后小鼠血清中白细胞介素-1β (IL-1β) 、一氧化氮 (NO) 、超氧化物歧化酶 (SOD) 、丙二醛 (MDA) 含量及免疫器官胸腺、脾脏指数的变化, 旨在为CⅡ对小鼠佐剂性关节炎的抑制作用研究提供理论依据。

1 材料

KM系雄性小鼠 (合格证号为8010078) , 6周龄, 160只, 体重为20 g左右, 购自河北省试验动物中心;新鲜羊肋软骨, 购自保定市肉联厂。

一氧化氮检测试剂盒、丙二醛检测试剂盒和超氧化物歧化酶检测试剂盒, 均购自南京建成生物工程研究所;白细胞介素-1β检测试剂盒, 购自解放军总医院科技开发中心放免研究所。

2 方法

2.1 羊软骨CⅡ的制备

以新鲜羊肋软骨为原料, 按照参考文献[11]中的方法自行制备羊软骨CⅡ。

2.2 预试验

取100只体重为20 g左右的KM系雄性小鼠进行羊软骨CⅡ灌胃剂量的筛选试验。结果表明0.6 mL/d为最佳灌胃剂量, 采用该剂量进行正式试验。

2.3 正式试验

取60只KM系雄性小鼠随机分为4组, 即对照组 (A组) 、预防组 (B组) 、治疗组 (C组) 、模型组 (D组) , 每组设15个重复。每组除正常饲喂外, A组每天灌胃生理盐水, 在第31天于小鼠右后足跖部注射生理盐水0.1 mL;B组每天灌胃0.6 mL羊软骨CⅡ, 在第31天于小鼠右后足跖部注射弗氏完全佐剂0.1 mL诱导小鼠致炎;C组前30 d每天灌胃生理盐水, 在第31天再对小鼠以同样方法致炎 (同B组) , 致炎后每天灌胃0.6 mL羊软骨CⅡ;D组在第31天同法致炎, 全程每天灌胃生理盐水。

2.4 测定指标

血样的采集与处理:致炎后第24天摘除小鼠眼球放血, 用1.5 mL安瓿管接血, 直至血放尽为止, 取血前禁食12 h。采集的血液于 37 ℃放置30 min, 4 ℃过夜后3 000 r/min离心15 min, 分离血清, 于-20 ℃保存, 用于各指标的测定。

血清指标的测定:按照相应试剂盒的方法测定。

小鼠胸腺、脾脏指数的测定:致炎后第24天, 将各组小鼠脱颈椎处死, 称体重, 解剖, 取胸腺和脾脏, 在滤纸上浸干血液后称重, 用于计算胸腺指数和脾脏指数。计算公式:胸腺 (脾脏) 指数=胸腺 (脾脏) 重 (mg) /小鼠体重 (g) ×10。

2.5 数据分析

采用单因子四水平设计, 应用SPSS软件包的 One-Way ANOVA程序进行单因素试验的方差分析, 差异显著时用LSD检验法进行组间的多重比较。

3 结果与分析

3.1 灌胃羊软骨CⅡ对小鼠血清指标的影响

3.1.1 小鼠血清IL-1 β含量的测定 结果见图1。

注:与对照组比较, *表示差异显著 (P<0.05) , **表示差异极显著 (P<0.01) 。

由图1可以看出:模型组小鼠血清IL-1β含量极显著高于对照组 (P<0.01) ;预防组和治疗组小鼠血清IL-1β含量均低于模型组;与对照组相比, 预防组和治疗组均差异显著 (P<0.05) , 其中治疗组更明显。说明致炎可使小鼠血清中致炎因子IL-1β含量升高, 致炎前后口服羊软骨CⅡ均可抑制致炎小鼠血清IL-1β含量的升高, 且预防效果优于治疗效果。

3.1.2 小鼠血清NO含量的测定 结果见图2。

注:与对照组比较, **表示差异极显著 (P<0.01) ;与模型组比较, #表示差异显著 (P<0.05) 。

由图2可以看出:模型组小鼠血清NO含量极显著高于对照组 (P<0.01) ;预防组和治疗组小鼠血清NO含量均显著低于模型组 (P<0.05) ;预防组和治疗组间差异不显著 (P>0.05) 。说明弗氏完全佐剂诱导的小鼠佐剂性关节炎可使小鼠血清NO含量升高, 预防组和治疗组均可显著抑制致炎小鼠血清NO含量的升高。

3.1.3 小鼠血清MDA含量及SOD活性的测定 结果见图3、图4。

注:与对照组比较, *表示差异显著 (P<0.05) ;与模型组比较, #表示差异显著 (P<0.05) 。

注:与对照组比较, *表示差异显著 (P<0.05) ;与模型组比较, #表示差异显著 (P<0.05) ;与预防组比较, △表示差异显著 (P<0.05) 。

由图3、图4可知:模型组小鼠血清MDA含量显著高于对照组 (P<0.05) ;SOD活性显著低于对照组 (P<0.05) ;预防组和治疗组小鼠血清MDA含量均显著低于模型组 (P<0.05) , 且两组差异不显著 (P>0.05) 。预防组和治疗组SOD活性均显著高于模型组 (P<0.05) , 预防组效果显著优于治疗组 (P<0.05) 。说明通过致炎造模可以使小鼠血清MDA含量升高, 降低小鼠血清SOD活性;预防和治疗两种方案均可降低小鼠血清MDA含量及提高小鼠血清SOD活性, 且前者效果更佳。

3.2 灌胃羊软骨CⅡ对小鼠胸腺指数、脾脏指数的影响 (结果见表1)

注:与对照组比较, *表示差异显著 (P<0.05) ;与模型组比较, #表示差异显著 (P<0.05) 。

由表1可见:模型组小鼠的胸腺重和脾脏重与对照组相比有降低的趋势, 且其指数均低于对照组;预防组和治疗组小鼠胸腺重和脾脏重与模型组相比均有升高的趋势, 两组小鼠胸腺指数高于模型组, 且预防组和模型组相比差异显著 (P<0.05) ;预防组和治疗组小鼠脾脏指数显著高于模型组 (P<0.05) 。试验结果表明, 模型组与对照组相比小鼠胸腺及脾脏的生长均受到抑制, 而预防和治疗两种方案对小鼠胸腺及脾脏的恢复均有促进作用, 并且前者效果更好。说明灌胃羊软骨CⅡ可以明显促进免疫器官的生长, 进而增强机体免疫力。

4 讨论

IL-1β是一种由单核巨噬细胞产生的重要细胞因子和多肽调节因子, 主要在细胞免疫激活中发挥调节作用。据报道, IL-1β是RA发病机理中居中心地位的促炎症细胞因子, 在RA或实验性关节炎滑膜病变中起着重要的致病作用[12,13]。潘新[14]通过试验发现, 膝关节原发性骨性关节炎患者血清中IL-1水平明显高于正常对照组, 且血清中IL-1浓度和关节液内IL-1浓度呈高度正相关。本试验结果显示, 小鼠致炎后血清中IL-1β含量与对照组相比明显升高, 灌胃羊软骨CⅡ可抑制致炎小鼠血清IL-1β水平的升高, 且预防组比治疗组效果更佳, 说明血清IL-1β水平与炎症应答反应有关, 灌胃羊软骨CⅡ可以减轻佐剂性关节炎的炎症反应。

近年来研究表明, NO与机体特异性免疫反应、自身免疫密切相关。尤其引人注目的是, 在RA或动物实验性关节炎时, 体内NO的代谢产物NO2-/NO3- 浓度升高, 特别是关节液中有大量NO生成, 显示出NO与RA关系密切[15]。在本试验中, 模型组小鼠血清NO浓度明显高于对照组, 而预防组和治疗组小鼠血清中NO浓度均低于模型组, 且预防组效果更明显, 说明NO参与了免疫炎症反应, 灌胃羊软骨CⅡ可降低NO产生, 抑制炎症反应的进行。

骨性关节炎患者体内氧自由基含量增高, 关节内过量的氧自由基抑制软骨细胞增殖引起软骨细胞死亡, 抑制软骨基质蛋白多糖和胶原的合成, 加速软骨基质的降解, 导致软骨细胞损伤;相反减少关节液内自由基含量, 可减轻关节软骨损伤, 延缓疾病发展, 改善临床症状。在正常情况下, 由于体内存在自由基清除剂, 如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化酶及过氧化氢酶等, 体内自由基的产生与清除保持相对平衡。近年来的研究认为, 氧自由基损伤透明质酸, 使其发生解聚, 改变滑液黏度, 是RA的发病机制[16,17]。MDA是机体受自由基攻击后产生的脂质过氧化产物, SOD是超氧阴离子的清除剂, 测定MDA含量和SOD活性可间接反映体内氧自由基的高低。由本试验结果可知, 模型组小鼠血清MDA含量较对照组明显升高 (P<0.05) , SOD活性显著降低 (P<0.05) ;预防组和治疗组均能明显抑制MDA和SOD的变化趋势, 说明致炎可使关节内氧自由基生成增加, 灌胃羊软骨CⅡ可抑制氧自由基的生成。

动物免疫器官是免疫活性细胞发育、定居、增殖的场所。胸腺、脾脏都是机体的免疫器官, 胸腺的主要功能是产生T淋巴细胞和分泌胸腺素, 主要参与细胞免疫;脾脏中有丰富的淋巴细胞和巨噬细胞, 但B淋巴细胞比例较大, 因此与体液免疫关系更为密切。免疫器官重量与其功能及其中免疫细胞数量有关, 其器官指数可在一定程度上反映机体免疫功能的强弱。本试验结果显示, 小鼠致炎后胸腺、脾脏指数均较对照组降低, 而预防组和治疗组2个器官指数均高于模型组, 说明灌胃羊软骨CⅡ可促进胸腺、脾脏的发育, 提高小鼠的免疫功能。

胶原性关节炎 篇2

【关键词】 关节炎,类风湿;关节炎,胶原诱导性;磁共振成像;分子磁共振成像

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以关节及关节周围组织的非感染性炎症为主要表现的自身免疫性疾病。本病病情迁延,可出现关节软骨和骨破坏,最终导致关节畸形和功能丧失 [1]。有研究表明,RA疾病进展出现关节破坏多在发病后1年,甚至4个月内,该阶段之前的炎性改变是可逆的,因此该阶段是积极治疗、阻止关节破坏、避免关节畸形的关键时期。早期诊断、早期正规治疗对于RA的病情控制及预后改善至关重要,寻求一种早期诊断RA的敏感检查方法是各国学者研究的热点[2]。影像学检查是评估RA关节破坏的重要方法,常规X线片检查对早期RA的诊断作用有限[3];CT的分辨率明显优于常规X线片,对于早期RA的轻微骨质破坏有较高价值;而磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)对于软组织的分辨率优于CT,并可对RA滑膜炎症程度进行量化。早期RA 的MRI敏感性明显优于X线片,其能清晰显示关节正常结构及RA早期滑膜炎症改变,与病理改变有较好的相关性[4],有助于早期RA的诊断。

1 胶原诱导性关节炎模型的建立 Ⅱ型胶原诱导性关节炎(collagen induced arthritis,CIA)大鼠模型是已被公认的研究人类RA的经典模型,但国内外实验室尚未采取统一的造模方法[5-6];目前CIA模型在大鼠品系、性别、乳化方法、注射剂量、注射部位等方面都存在差异,并且造模成功率普遍较低,约为65.00%[7]。因此,构建发病率、稳定性及可重复性高的CIA大鼠模型仍需进一步探索。

李艳等[8]研究认为,CIA大鼠模型的造模成功率与胶原给药剂量有关,与性别因素无关。发病率与胶原给药剂量成正相关,200 μg发病率为50.00%,300 μg为83.30%,而400 μg的胶原蛋白注射量能够达到最高的100%发病率。200~400 μg

胶原给药剂量是安全的。为了避免弗氏完全佐剂对实验的干扰,造成佐剂性关节炎(adjuvant arthritis,AA),建议选择弗氏不完全佐剂建立模型。另外,为了提高成模率,降低实验费用,许多研究者选用了相对经济且制剂纯度较高的鸡Ⅱ型胶原蛋白进行胶原乳剂制备。

模型评价多为一般观察、足容积测定、关节炎评分、血清抗CⅡ抗体与TNF-α浓度测定及病理观察的联合评价。CIA病理改变自首次免疫后3~4周

为急性期,为滑膜炎症增生期;免疫10 d后关节内只有纤维沉积物,而滑膜细胞未见明显改变;12 d

后肉眼可见踝关节肿胀,光镜下滑膜细胞增多,层数增加到3~7层,并向软骨鼓面爬行,滑膜下有纤维沉积;19 d后为急性期的第2期,滑膜由6~10 μm

增厚至200~250 μm,血管翳形成,并可见大量单核细胞、巨噬细胞等浸润,在微血管周围形成微脓肿,可见单核细胞侵入软骨连接处的软组织。7~8周为慢性期,逐渐出现软骨及软骨下骨破坏[9-10,17]。此过程动态模拟了RA的不同病变进程。

2 磁共振成像

急性期、慢性期CIA模型及正常对照大鼠在麻醉后,俯卧固定于扫描床使大鼠双膝关节呈屈曲位,经尾静脉注射钆喷替酸葡甲胺(Gd-DPTA)

0.2 mmol·kg-1,5 min内增强造影,注射前后以1.5或3.0 T核磁扫描仪行膝关节磁共振扫描。扫描参数:快速自旋回波序列T1增强压脂像(TSE-FS-T1WI),重复时间(repetition time,TR)= 300 ms,回波时间(echo time,TE)= 14 ms;快速自旋回波序列T2增强压脂像(TSE-FS-T2WI),TR = 1 700 ms,

TE = 103 ms,回波链长15,扫描方向为矢状位,层厚2 mm,矩阵256×154,视野42 mm×56 mm。第2次扫描结束后处死大鼠,取下双膝关节滑膜,质量分数10.00%中性甲醛溶液固定,常规固定、脱色、透明、包埋、制成蜡块、切片,行常规苏木素-伊红(HE)染色,病理学观察。

正常滑膜在MRI各序列中均不显示,而CIA模型急性期滑膜逐渐增厚,在MRI上表现为关节边缘软组织信号影,其中T1加权像(T1 weighted image,T1WI)上显示为低到中等信号,T2WI上表现为中等到高等信号,T2压脂像上则表现为滑膜厚度大于正常,显示信号强于正常,注入增强剂后,T1WI上病灶出现强化。临床研究显示,T2压脂像和T1增强压脂像在轴位切面能较好显示滑膜炎症信号的强度与滑膜厚度,增强MRI能反应滑膜增生和炎性血管翳,准确显示滑膜炎[11],并且增强后动态MRI还可区分RA的活动性与非活动性。

扫描序列一般包括自旋回波序列(SE)T1WI冠状面,快速自旋回波序列(TSE)T2WI冠状面及轴面扫描,应用抑脂技术。注射造影剂Gd-DTPA后行SE-T1WI冠状面及轴面扫描,应用抑脂技术。崔延安等[12]采用结合T1加权成像的三维脂肪抑制扰相梯度回波序列(FS-3D-FLASH)和结合T2加权成像的三维脂肪抑制快速进动成像序列(FS-3D-FISP),因为FS-3D-FLASH在滑膜增生或/和血管翳形成时多呈低信号改变,而FS-3D-FISP呈中高信号改变,早期RA由于滑膜增生及血管翳生成,血流灌注增加,注射钆对比剂后,增厚的滑膜在FS-3D-FLASH增强序列上明显呈高信号改变,明确显示滑膜增厚的部位和范围。

钆喷替酸葡甲胺(Gd-DPTA)是常用的快速增强造影剂,能够缩短被引入组织的 T1弛豫时间,增强组织的T1WI信号,对T2弛豫时间的影响较小,因其敏感性和特异性较高,已经广泛应用于临床与实验研究。王艳艳等[4]运用Gd-DPTA作为CIA大鼠关节炎早期病变的造影剂,比较MRI与普通X线片、病理组织检查的检出率,证实MRI对早期滑膜炎、滑膜增生、血管翳等病理学的诊断生成方面有明显的优势。但临床研究也证明其仍有一定的漏检率,并且大鼠关节和组成骨过小,炎症早期滑膜增生不明显,1.5 T的MRI分辨率偏低也是造成漏检的原因之一。

3 分子磁共振成像

随着分子生物学和医学影像学的发展,产生了通过无损害实时成像技术及目标靶向标记的分子显影相结合的交叉学科——分子影像学。分子MRI是在活体内组织水平、细胞及亚细胞水平,通过MRI成像技术对体内及特定探针结合的分子进行成像,并对特定分子进行分析研究。分子MRI已经应用于肿瘤、心血管及神经系统等的临床和实验研究[13],而在风湿疾病的应用研究相对较少。

目前常采用巨噬细胞、细胞黏附分子、基质金属蛋白酶等作为标记物,与某些造影剂进行特异性结合,从而提高检出率,并进行特征性描述。MRI常规造影剂为钆类顺磁性螯合物(如Gd-DPTA),其结构非常稳定,难以与生物大分子螯合,不能作为生物分子标记物的载体应用于MRI分子影像学研究[14]。新型分子MRI造影剂成为分子影像学研究热点。

超顺磁性氧化铁纳米颗粒(ultrasmall superparamagnetic iron oxide,USPIO)近年来受到较多关注,是一种能被巨噬细胞摄取的细胞特异性MR对比剂,它的粒径小,穿透力强,可以明显缩短T1、T2弛豫时间,从而提高信噪比多;另外,其纳米颗粒表面易于修饰,可以与特定物质连接,甚至携带治疗性物质,因此其应用前景较好。现主要应用于动脉粥样硬化、实体器官移植排斥反应、细菌软组织感染等多种炎性疾病的研究,但应用于RA相关文献报道不多。

巨噬细胞在RA滑膜炎及关节破坏中发挥重要作用[15],大量存在于炎症滑膜和软骨-血管翳连接处,活化后具有广泛的促炎和组织破坏能力。特异性对比剂USPIO被巨噬细胞吞噬后,在局部造成不均匀磁场,可缩短T2弛豫时间,使T2WI和T2*WI信号降低[16],运用高分辨率核磁成像扫描仪,或许从细胞分子水平上显示RA滑膜炎症,为RA的早期诊断提供新思路。

顾娟芳等[17]对CIA大鼠模型早、中、晚期行静脉注射USPIO,注射前及24 h后分别在7.0 T动物磁共振扫描仪上行膝关节T1WI、T2WI和T2*WI序列扫描,随后取膝关节滑膜制成病理组织切片,行HE染色、普鲁士蓝染色及CD68免疫组织化学染色。结果提示,USPIO增强T2WI和T2*WI序列上,CIA模型早、中、晚期均可见到滑膜组织的负增强效应,且病理组织学证实由巨噬细胞吞噬铁颗粒引起。

由于USPIO既能被骨关节、脑等组织的巨噬细胞摄取,还能被网状内皮系统(如肝、脾、淋巴结)中的巨噬细胞吞噬[16],不可避免的存在很高的假阳性率。而且进入体内的SPIO迅速为巨噬细胞吞噬或经肝清除,因而影响其与靶分子的结合效率,用于细胞标记时,SPIO也可能抑制标记细胞的增殖和分化,甚至导致细胞的死亡。

细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule,ICAM-1)是滑膜内皮细胞的主要表达成分,有助于募集淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞等至炎性关节,并且在活化的中性粒细胞与在滑膜衬里下层的纤维样滑膜细胞和巨噬细胞样滑膜细胞相互作用中占重要角色。另外,由于ICAM-1免疫组化的结果在RA不同阶段是不同的,因此,ICAM-1可以作为特异性靶向分子成像的目标分子。

Lee S-II等[18]尝试用ICAM-1抗体与Gd-DPTA螯合物作为CIA模型MRI的造影剂。实验选取Gd-DPTA作为非靶向造影剂,Gd-DPTA-抗-ICAM-1作为靶向造影剂,Gd-DPTA-IgG作为控制造影剂,以无关节炎小鼠、早期CIA模型(造模28 d后)小鼠、慢性CIA模型(造模56 d后)小鼠为实验对象,动态观察各造影剂经小鼠尾静脉注射时,注射后

10 min、30 min、80 min、2 h及24 h的MRI。

实验结果显示,以Gd-DPTA-抗-ICAM-1为造影剂的CIA模型MRI上,T1像信号显示逐渐增强,并且持续时间达24 h,而Gd-DPTA增强T1像的时间仅维持了数分钟;动态磁共振显示,结合了与Gd-DPTA-抗-ICAM-1相同量Gd的Gd-DPTA-IgG,增强信号也只持续了30~60 min。低于Gd-DPTA 1/10剂量Gd的Gd-DPTA-抗-ICAM-1,就可以显示更加明显的T1增强信号。另外,由Gd-DPTA-抗-ICAM-1在MRI上显示的增强信号只在CIA模型早期炎症组出现,而在慢性破坏期则未出现增强信号。提示Gd-DPTA-抗-ICAM-1与表达于CIA模型炎性滑膜上的ICAM-1特异性结合,能够在分子MRI上显示特异性的图像,或许可以作为早期诊断RA及区分RA不同阶段的无创性新方法。

4 小 结

2010年ACR/EULAR发表了新的RA分类标准,以强调RA的早期诊断、早期治疗,但在临床中发现RA患者早期即可出现 MRI 异常,且与临床表现并不平行[19]。MRI可以显示临床没有表现的关节炎处的滑膜增生[20],在临床活动性指标好转的患者中仍可提示部分患者骨侵蚀的进展[21]。MRI作为一种敏感而又可靠的手段,可以早期发现滑膜炎、骨髓水肿及骨侵蚀等病变,为RA的早期诊断和治疗提供信息。所以,MRI对于RA早期诊断有一定的价值,其与分子生物学结合形成的分子MRI技术将对RA的研究起到推动作用。

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胶原性关节炎 篇3

1 材料与仪器

白藜芦醇 (纯度>80%, 湖南省洪江华光生物有限责任公司, 批号:20130205) ;BCA蛋白定量试剂盒 (Pierce公司) ;牛II型胶原、大鼠TNF-α、IL-6ELISA检测试剂盒 (Sigma公司) ;弗氏不完全佐剂 (美国Sigma公司) 。实验动物:健康雄性4月龄SD大鼠, 体重250~275g, , 由由江江西西中中医医药大学实验动物中心提供, 标准环境饲养, 许可证号SCXK (赣) 2012-0016。

2 方法

2.1 实验分组及给药方案

将SD大鼠随机分为6组:正常组, CIA模型组, RES低剂量组 (20mg·kg-1) 、中剂量组 (40mg·kg-1) 、高剂量组80mg·kg-1) 和阳性对照组 (布洛芬10mg·kg-1) 。各用药组于致炎后第21~35天灌胃给药, 每天1次, 正常组和CIA模型组灌胃给予等容量的0.5%羧甲基纤维素钠。

2.2 大鼠CIA模型制备与评价[3]

牛II胶原500μg溶于0.05mol·L-1醋酸0.2mL中, 与等体积弗氏完全佐剂混合充分, 注射至大鼠尾根部皮下。初次致敏后第21天, 再次大鼠尾根部皮下注射同体积试剂。每日观察关节皮下结节、红肿程度等情况。评价标准:4分:全部足爪肿胀;3分:踝关节以下的足爪肿胀;2分:足趾和趾关节有肿胀;1分:趾关节有红肿;0分:无红肿。

2.3 足爪容积测定及病理检查

足爪仪测定致炎前每只小鼠左后足容积, 自第21天起, 每4天测定1次相应足容积, 肿胀度= (Vt-Vn) /Vn×100%, Vn指模型前足容积, Vt指模型后足容积。第35天处死小鼠后, 剪取左踝关节制病例切片待查。

2.4 血清中炎性因子的检测

第1次免疫后35天麻醉大鼠, 眼底静脉丛取血, 分离取血清, 并按照ELISA试剂盒说明操作, 检测血清中IL-6、TNF-α水平。

2.5 统计学处理

运用SPSS13.0软件进行统计分析, 数据以表示, 组间比较采用t检验, P<0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 RES对大鼠多发性关节炎指数的影响

RES可剂量依赖性地抑制CIA大鼠继发性足肿胀, 其足爪肿胀度明显轻于模型组, 差异具有统计学意义 (0.05或) , 见表1。

3.2 病理切片观察

常规HE染色病理切片显微镜检发现:健康对照组滑膜关节结构完整, 关节软骨表面完整, 腔内无渗出液, 滑膜组织正常;CIA模型组大鼠镜下可见滑膜关节结构破坏, 关节间隙狭窄, 可见炎性细胞浸润, 并且伴有血管翳形成。CIA阳性对照组可见滑膜关节结构较完整, 关节间隙清晰。见图1。

(±s, n=6)

注:与模型组比较, *P<0.05, **P<0.01。

A:健康对照组;B:CIA模型组;C:CIA阳性药物组

3.3 RES对炎性因子表达的影响

经ELISA法检测, 相较于正常组, CIA模型组炎性因子IL-6、TNF-α的表达明显增加, 而RES给药组可呈剂量依赖性地抑制促炎因子的表达, 见表2。

(±s, n=6)

注:与正常组比较, *P<0.05, **P<0.01;与模型组比较, #P<0.05, ##P<0.01。

4 讨论

本研究观察了RES对各实验组大鼠体重的影响。经RES治疗35天后, 正常对照组、CIA模型组、CIA阳性对照组、及RES高、中、低剂量组大鼠平均体重比较发现:各实验组两两比较平均体重均无统计学差异 (P>0.05) , 表明RES对SD大鼠无明显毒副作用。此外, 已经出现关节炎症状的CIA大鼠使用RES处理35天, 其关节炎指数、足爪容积及滑膜组织病理评分与模型组比较明显下降, 与阳性对照药物布洛芬比较, 下降稍缓, 提示RES对CIA大鼠的关节炎有抑制作用, 其作用强度不及布洛芬。本研究首次通过实验动物模型显示RES对CIA大鼠的关节炎有抑制作用, 机制可能与其调节CIA大鼠异常免疫功能有关。

摘要:目的:研究白藜芦醇 (RES) 对大鼠胶原诱导性关节炎 (CIA) 的作用及其机制。方法:建立牛Ⅱ型胶原蛋白大鼠CIA模型, 测定大鼠足爪炎症肿胀度, HE染色对关节组织进行检查, ELISA法检测血清中炎症因子IL-6、TNF-α水平。结果:灌胃给予RES能减轻CIA大鼠的关节炎症状, 降低血清中IL-6、TNF-α水平, 且呈现剂量依赖性趋势 (P<0.05或P<0.01) ;HE检查发现RES可改善局部关节炎症状。结论:RES对CIA大鼠具有治疗作用, 该机制可能与其调节CIA大鼠异常免疫功能有关。

关键词:胶原性关节炎,白藜芦醇,炎症,免疫功能

参考文献

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胶原性关节炎 篇4

【关键词】 关节炎,胶原诱导性;痹痛康丸;白细胞介素-1β;白细胞介素-6;实验研究;大鼠

Effect of Bitongkang Pill on Interleukin-1β and Interleukin-6 in the Collagen-Induced Arthritis Rats

Yan Mei-feng,Jiang Nan,Xu Ming-zhi,Lü Xin-liang

【ABSTRACT】Objective:To investigate the impact of Bitongkang Pill on the ankle joint synovium IL-1β and IL-6 of collagen-induced arthritis (CIA) rats,exploring its therapeutic mechanism.Methods:After establishing the CIA rat models with type II collagen and complete Freund's adjuvant,60 Wistar rats were randomly divided into 6 groups:the control group,the model group,the three bitongkang pill groups [with low,medium and high dose—0.3,3,30 g (kg·d) -1] and the methotrexate group [1.2 mg (kg·w) -1].Drugs of the above groups were dissolved in physiological saline (2 mL) and the rats were continuously given drugs by intragastric administration one time per day for four weeks.Rats of the control group and the model group were given normal physiological saline,2 mL for each.After 8 weeks,the rats were sacrificed to observe the pathological changes of the right ankle joint synovium and the expression changes of the IL-1β,IL-6 proteins in synovium.Results:The pathological changes of synovial tissue of every treatment group but the group with the low-dose bitongkang pill was relieved,and the IL-1β,IL-6 protein expressions were lower than that of the model group (P < 0.05).Conclusion:Bitongkang pill can effectively relieve the synovitis of CIA rats and prevent bone destruction or joint reconstruction,having immunomodulatory effect.

【Key words】 arthritis,collagen-induced;bitongkang pill;interleukin-1β;interleukin-6;experimental study;rats

類风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是以对称性多关节炎为主要临床表现的异质性、系统性自身免疫性疾病,主要病理改变为关节滑膜炎症、渗液、细胞增殖、血管翳形成,软骨及骨组织破坏,导致关节破坏和功能障碍。临床和实验研究已证实痹痛康丸有抗炎、镇痛和免疫调节作用,并能有效控制RA病情进展[1,3-5]。本实验旨在研究痹痛康丸对胶原诱导性关节炎(Collagen-induced Arthritis,CIA)大鼠踝关节滑膜中白细胞介素–1β(IL–1β)、白细胞介素–6(IL–6)蛋白表达量的影响,进一步探讨其治疗RA的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 清洁级Wistar大鼠60只,由内蒙古大学动物试验中心提供,动物许可证号:SCXK(蒙)2002-0001,雌雄各半,体质量(190±10) g,

分笼饲养。

1.2 实验药品、试剂及仪器 痹痛康丸由武警内蒙古总队医院制剂室提供([2003]武制FP030001),甲氨蝶呤(MTX)(国药准字H31020644)。牛Ⅱ型胶原蛋白(c7806-10 mg,SIGMA公司生产,批号1000638705),弗氏完全佐剂(F5881-10 mL,SIGMA公司生产),鼠抗人IL-1β单克隆抗体(批号DZE90065,购于北京博奥森公司),鼠抗人IL-6免疫组化单克隆抗体(批号DZE90066,购于北京博奥森公司)。FR-988生物显微图像分析仪(上海复日科技有限公司制造),电子分析天平TB-2002 DENVER(北京赛多利斯仪器系统有限公司生产),切片机 LEICA RM 2016(上海企伟实业有限公司生产)。

2 方 法

2.1 CIA大鼠模型的建立[1] 将牛Ⅱ型胶原蛋白溶解于0.1 mol·L-1醋酸中,制成2 mg·mL-1溶液,将溶液与弗氏完全佐剂按1∶1比例制成乳剂。在各组大鼠尾根部、右足足垫皮下各注射1个部位,每只每次0.1 mL;3周后采用同样方法再次进行免疫注射,每只每次0.2 mL [1,3,5-6]。4周后模型造成。根据关节红肿程度进行关节炎指数(Arthritic Index,AI)[2]的评定。关节积分评定每周2次,全身病变按5级评分法评价,4个肢体的病变程度累计积分,计算AI。积分越高,表示关节症状越重。每只大鼠最高16分,造模的大鼠AI≥4分认为造模成功。4周后再通过苏木精-伊红(Hematoxylineosin staining,HE)染色观察大鼠右踝关节滑膜病理改变,根据AI及病理改变情况确定CIA模型大鼠造模成功。本实验造模60只大鼠全部成功,成功率达到100%。

2.2 实验分组 60只大鼠随机分为空白对照组,模型组,痹痛康丸低、中、高剂量组,MTX组,每组10只,雌雄各5只。

2.3 给药方法 空白对照组与模型组:无药物干预,第5周开始灌服生理盐水,每只2 mL,每日1次,连续给药4周。痹痛康丸低、中、高剂量组和MTX组均在第5周开始给药,每日1次。痹痛康丸低剂量组灌服0.3 g·kg-1·d-1,中剂量组为

3 g·kg-1·d-1(约为临床人体用量的10倍),高剂量组为30 g·kg-1·d-1,MTX组每周1.2 mg·kg-1(约为人体用量每周10 mg)。以上各组药物溶解于2 mL生理盐水中,各组连续给药4周。其中MTX组每周灌服MTX溶液1次,其余6 d自由饮食。人与大鼠剂量转换按如下公式:D=D'×R/ R'×(W'/W)1/3。

D,D'分别是两种动物的每公斤体质量给药剂量;R,R'分别是两种动物的体质量系数,大鼠和人的值分别为90和100;W,W'分别是两种动物的体质量。

2.4 IL-1β、IL-6蛋白表达量检测方法 给药4周后,采取大鼠心脏血每只约2 mL,处死大鼠,将血液静置30 min后离心 10 min,分离血清;大鼠处死后,取右踝关节组织固定、包埋。组织切片制作采用HE染色,IL-1β、IL-6蛋白表达检测采用免疫组化SP法。在IL-1β、IL-6表达检测过程中,每个染色流程均有对照作为质量控制标准,阳性对照采用阳性组织切片,阴性对照用PBS缓冲液代替一抗。每张免疫组化切片置于低倍镜(×100)下随机选取5个视野,采用Smartscape图像分析系统分析所有图像,采用平均灰度值反映IL-1β、IL-6蛋白在组织中的表达强弱。

2.5 统计学方法 采用SPSS13.0软件进行统计分析,实验数据用表示,组间比较采用单因素方差分析进行统计处理,检验水准α=0.05,以P<0.05

为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 各组大鼠踝关节病理改变 从大鼠踝关节病理切片中可见,模型组滑膜组织出现大量炎性细胞浸润,滑膜细胞变圆,滑膜增厚,并有明显骨破坏和小血管增生。各用药组除痹痛康丸低剂量组外均较模型组病理改变有不同程度的减轻,痹痛康丸低剂量组滑膜组织与模型组比较未见明显变化。痹痛康丸中、高剂量组大鼠踝关节滑膜细胞形态逐渐恢复正常,滑膜厚度趋于正常,小血管增生较模型组和痹痛康丸低剂量组明显减少,未见明显骨破坏。

3.2 各组大鼠踝关节滑膜IL-1β、IL-6蛋白表达量的变化 阴性对照切片上踝关节滑膜组织未见IL-1β、IL-6蛋白阳性表达,其他各组切片可见IL-1β、IL-6蛋白免疫反应阳性的棕黄色颗粒,定位于细胞质。与空白对照组比较,模型组大鼠踝关节IL-1β、IL-6蛋白表达显著降低(P<0.05),痹痛康丸中、高剂量组、MTX组IL-1β、IL-6蛋白表达与模型组相比显著升高

(P<0.05),痹痛康丸低剂量组大鼠滑膜IL-1β、IL-6蛋白表达与模型组比较,差异无统计学意义

(P>0.05),痹痛康丸中、高剂量组大鼠踝关节IL-1β蛋白表达与MTX组比较,差异无统计学意义

(P>0.05)。痹痛康丸中剂量组大鼠踝关节IL-6蛋白表达与MTX组比较,差异无统计学意义(P>0.05),

痹痛康丸高剂量组大鼠踝关节IL-6蛋白表达低于痹痛康丸中剂量组、MTX组,差异有统计学意义(P<0.05),

见表1。

4 讨 论

RA属中医学“痹证”“历节”等范畴。因患者先天不足、正气虚弱,风、寒、湿、热等外邪侵袭,致机体气血、肝肾亏虚,痰浊瘀血阻络,临床以关节、肌肉、筋骨疼痛、肿胀、麻木,关节屈伸不利、甚至关节僵硬畸形为主要表现。痹痛康丸方中鹿角霜、熟地黄等益肾填精以固其本,制附子、桂枝等温经散寒、通经止痛,羌独活、蜈蚣、乌梢蛇、地龙等祛风胜湿、搜风活血,薏苡仁、防己利湿消肿,黄芪益气,赤芍活血,白芍、生地黄养阴缓急并防桂附等辛热之药燥血。上述诸药配合攻不伤正,补不碍邪,处方平稳,适合RA患者长期服用。前期实验[1,6]表明,痹痛康丸能明显改善CIA大鼠症状,减轻大鼠胸腺和脾脏重量,减轻或抑制关节滑膜炎症,具有减轻或消除关节肿胀的作用;可使大鼠血清CD4+、CD8+比值降低,并可抑制大鼠踝关节滑膜内皮细胞生长因子、转化生长因子的表达,提示痹痛康丸能有效抑制滑膜中新生血管的形成。CIA为非感染性炎症,病理变化为增生性滑膜炎、关节软骨破坏等,MTX 可使体外培养滑膜细胞中IL-1诱导产生COX-2减少,但对COX-1、

COX-2的mRNA表达无直接影响;抑制RA患者滑膜组织中中性粒细胞的趋化性,使炎症关节处的COX進一步降低,而且MTX可抑制前炎症因子TNF的表达[7],因此,MTX对CIA有治疗作用。

在RA滑膜增生與关节破坏的过程中,IL-1β是其中起着重要作用的细胞因子,关节组织中主要由滑膜细胞软骨细胞分泌、由巨噬/单核细胞产生,在RA炎症反应和组织损伤中发挥重要作用。在RA致病过程中,IL-1β可促使细胞表面分子在成骨细胞或骨衬里细胞中的表达,正是表面分子的表达促使了以上变化的发生。IL-1常由局部免疫复合物与游离胶原等分解产物刺激产生,进而促使滑膜和软骨细胞生成基质金属蛋白酶,导致滑膜炎和软骨基质成分的降解破坏,此过程反复继而形成恶性循环[8-9]。此外,IL-1β可通过与成骨细胞部分受体结合,增加核因子-κβ受体激活因子配体的表达,刺激大量炎性因子IL-6和IL-8分泌产生,这两个因子与RA血管翳的生成以及关节软骨侵蚀密切相关。大量动物实验及文献报道证实,细胞因子网络失衡紊乱导致RA关节破坏和滑膜炎症,IL-1β和TNF-α在RA发病机制过程中起关键作用,IL-1β可刺激基质金属蛋白酶(Matrixmetalloproteinases,MMPs)产生,同时抑制胶原和糖蛋白合成,这说明了IL-1β有加重骨损伤的作用,且有研究显示TNF-α有类似作用,但作用不及IL-1β强烈[8]。IL-6是一种多效的细胞因子,曾被称为B细胞分化生长因子,能刺激B细胞成熟,促进RF和其他自身抗体的产生。在炎性细胞因子网络和免疫调节网络具有关键性且多样的作用。IL-6可强力诱导产生急性期反应蛋白(如C-反应蛋白)诱导B细胞分化为能分泌IgG型抗体的浆细胞,介导前列腺素类因子的生成,促进IL-1、肿瘤坏死因子(TNF)和类风湿因子的分泌[10]。IL-6不仅是重要的致炎细胞因子,且参与骨关节重建过程中的细胞间相互作用。在RA发病过程中,IL-6可以通过提高成骨细胞和滑膜细胞中细胞核因子κB活化因子配体的释放,促进破骨细胞生成因子的表达。体外实验证明,IL-6既能激活B细胞促进自身抗体产生,又能通过诱导IL-2的产生和IL-2R的表达而活化T细胞,并可与IL-2结合,促使T细胞和胸腺细胞分化为细胞毒性T细胞,其分泌的炎性CK如IL-1β、TNF-α、IL-6和RA的滑膜炎高度相关[10-11] 。

在RA发病进程中,IL-6与TGF-β共存在并发挥协同作用,诱导大量Th17细胞形成。由Th17分泌的强致炎性细胞因子IL-17与TNF-α协同诱导IL-6高表达,诱导破骨细胞和FLS分泌MMPs,激活破骨细胞降解结缔组织,加剧骨侵蚀[11-12]。本实验研究结果表明,IL-1β、IL-6在模型组大鼠踝关节中的表达明显高于痹痛康丸中、高剂量组,且痹痛康丸中、高剂量组大鼠踝关节IL-1β表达与MTX组比较无差异,说明痹痛康丸能有效降低关节组织对IL-1β的分泌。痹痛康丸高剂量组IL-6表达量低于MTX组,说明痹痛康丸还能有效降低关节组织对IL-6的分泌。

本研究发现,痹痛康丸具有降低CIA大鼠关节组织对IL-1β、IL-6的分泌,抑制CIA大鼠滑膜炎症、血管翳生成,延缓骨破坏的作用。相信随着痹痛康丸对RA治疗作用的深入研究,能为RA的有效防治开辟新的途径。

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胶原性关节炎 篇5

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

健康Wistar大鼠60只, 雌雄各30只;昆明山海棠;地塞米松;牛Ⅱ型胶原;不完全弗氏佐剂。

1.2 实验方法

1.2.1 动物的分组、标记、造模

10只大鼠设为空白组 (A组) 不予任何处理。50只大鼠造模后随机分为5组, 每组10只, 分别为模型组 (B组) , 地塞米松治疗组 (C组) , 以及THH高 (D组) 、中 (E组) 、低 (F组) 剂量治疗组。每组均给予10%水合氯醛进行腹腔注射, 麻醉后在大鼠尾根部皮肤分5处皮内注射乳化胶原共0.5 m L, 每处注射0.1 m L。首次免疫第14天后相同方法等量加强免疫一次。

1.2.2 给药

首次免疫第28天后开始药物治疗。A组不予任何处理。而B、C、D、E、F各组则按照每100克大鼠体重0.2 m L的剂量分别灌注蒸馏水, 0.04 mg/m L地塞米松灌注液, 200 mg/m L、150 mg/m L和100 mg/m L的高中低三个剂量的THH灌注液, 灌胃1次/d, 连续30 d。

1.2.3 标本制作

所有大鼠于给药第30天后处死, 取大鼠踝关节于4%多聚甲醛中固定12 h, 然后放入10%乙二胺四乙酸中脱钙。脱水包埋切片, 行HE染色。

1.2.4 病理学评分

方法参照Tsubaki等[4]于2005年提出的病理学评分。

1.3 统计学处理

采用SPSS 16.0软件对所得数据进行统计分析;计量资料用 (±s) 表示, 多组间均数的比较应用单因素方差分析, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠踝关节病理学改变

各组大鼠踝关节病理学改变。

2.1 A组

滑膜由1~2层滑膜细胞组成, 镜下未见炎症细胞浸润及血管增生, 软骨表面光滑, 未见骨破坏, 关节结构完整。

2.2 B组

滑膜细胞增生明显, 形成10~15层滑膜层, 并伴有血管翳形成。滑膜组织增生并呈绒毛状伸入关节腔内, 关节腔内有大量炎症细胞浸润, 关节表面透明软骨与骨组织发生破坏, 局部纤维化并相互粘连, 关节结构被破坏。

2.3 C组

该组在所有治疗组中的效果最佳, 滑膜细胞层数基本处于正常水平, 血管翳和炎症也基本消失, 偶见造模阶段引起的少许骨组织破坏。

2.4 D组

该组对于模型有一定的抗炎作用, 但与C组和E组相比, 治疗效果稍显逊色。镜下少见血管增生和炎症细胞浸润, 滑膜细胞层数相比空白组稍有增加, 达到5~6层, 少见软骨与骨组织破坏。

2.5 E组

该组在所有THH治疗组中效果最好, 镜下只见2~3层滑膜细胞, 很少见到炎症细胞和血管增生, 基本没有发生软骨与骨组织破坏。

2.6 F组

镜下仍然可见数层滑膜细胞增生组织, 有少许炎症细胞浸润同时伴有血管增生, 关节骨组织破坏明显, 相对于其他治疗组治疗效果不太理想, 具体病理学评分见表1。

*与A组比较, P<0.05;△与B组比较, P<0.05

3 讨论

RA是一种病因未明的慢性全身性自身免疫性疾病, 以对称性、多关节滑膜炎和关节外病变为主要临床表现, 主要累及手、腕、足等小关节, 反复发作, 呈对称分布[5]。传统治疗RA的药物主要包括激素类和非甾体类抗炎药等药物, 但长时间服用这些药物会带来类似骨髓抑制等一些较为严重的毒副反应[6], 这也是许多患者无法坚持服药治疗的主要原因。因此临床上治疗RA的药物虽然很多, 但至今尚没有一种特效的治疗方法, 所以目前对于RA的治疗依然只能以减轻患者疼痛、降低病理损害和减缓关节畸形为治疗的主要目标。

昆明山海棠是一种与雷公藤同属的传统中草药, 与雷公藤相比, 昆明山海棠具有毒性更小、安全范围更大的优点, 目前在临床上主要用于治疗RA等多种自身免疫性疾病, 效果显著[7,8]。胶原诱导性关节炎以多发性关节炎性改变并伴有关节损害为特征, 是国内外较为理想的类风湿关节炎动物模型之一, 大鼠则因饲养容易, 实验成本低廉而成为首选[9]。此种大鼠模型的病理特征甚至包括某些临床表现都非常接近于人类RA[10], 因此本实验采用了这种动物模型。

实验结果显示, 在所有治疗组中地塞米松的治疗效果最好, 这也是肯定了这一经典药物治疗RA的有效性。同时在THH高中低三个不同剂量治疗组中, 中剂量的治疗效果最好, 这就提示在临床用药时应该注意人体用药剂量的把握。总之从HE染色结果可以看出, 模型建立成功, 镜下出现关节滑膜细胞增生、炎症细胞浸润、血管增生和软骨及骨质破坏等病理改变, 所有THH治疗组与模型组比较差异均有统计学意义 (P<0.05) , 说明昆明山海棠对于大鼠模型的治疗是有效的, 这也验证了THH在临床上对于治疗RA的积极作用。

摘要:目的:探讨昆明山海棠 (tripterygium hypoglaucum hutch, THH) 对胶原诱导性关节炎 (collagen induced arthritis, CIA) 大鼠模型关节病理评分的影响。方法:60只Wistar大鼠 (雌雄各30只) , 将其随机分为6组:空白组、模型组、地塞米松治疗组以及THH高、中、低剂量治疗组, 连续给药30 d, 观察大鼠关节病理的改变。结果:给药30 d后, HE染色显示模型组产生多层滑膜细胞, 大量炎症细胞和血管翳生成;在3个THH治疗组中中剂量的治疗效果最好, 镜下只见2~3层滑膜细胞, 少见炎症细胞。结论:HE染色结果显示THH对CIA模型有积极的治疗作用。

关键词:昆明山海棠,胶原性诱导关节炎,类风湿性关节炎

参考文献

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胶原性关节炎 篇6

1 材料与方法

1.1 实验动物

6~8 周龄雌性BALB/c小鼠30 只,SPF级,购于武汉大学动物实验中心(合格证号:No.42000500006615),饲养于武汉大学人民医院动物房。

1.2 主要试剂及仪器

鸡Ⅱ型胶原(CⅡ)、完全弗氏佐剂(CFA)、冰醋酸购于Sigma公司,重组小鼠Gal-9 和抗小鼠Tim-3 单抗(Tim-3 m Ab)购于Pepro Tech公司,白介素(IL)-10和转化生长因子-β(TGF-β)酶联免疫吸附法试剂盒购于R&D公司,PCR仪购于北京东胜公司。

1.3 小鼠CIA造模及分组

将鸡Ⅱ型胶原(CII)加入0.1 mol/L冰醋酸,冰浴中搅拌溶解, 配成2 mg/m L溶液,4℃冰箱过夜后,将CⅡ溶液与完全福氏佐剂(CFA)按1∶1 等体积混合制成乳化剂;取CⅡ乳化剂50 μL,于小鼠背部及尾根部多点皮下注射,1 周后按上述方法、 相同剂量加强免疫1 次;初次免疫后第6 天,即加强免疫的前1 天,按照尾静脉输注不同药物进行分组: ①激活组(n=10): 尾静脉输注含Gal-9 (5 μg/m L) 的PBS 100 μL;②阻断组(n=10):尾静脉输注含Tim-3 m Ab(10 μg/m L)的PBS 100 μL;③对照组(n=10):尾静脉输注PBS100 μL。

1.4 关节炎指数(arthritic index,AI)

采用0~4 级评分法[10],0 分:无红肿;1 分:趾关节轻度肿胀;2 分:趾关节及足跖肿胀;3 分:踝关节以下足爪肿胀;4 分:包括踝关节在内全部足爪肿胀。AI为4 只足爪的累计评分,数值越高,代表关节炎越严重,初次免疫后每周记录1 次,共记录4 次。

1.5 酶联免疫吸附试验(ELISA)法测抗炎因子

初次免疫后第28 天对每只小鼠眼眶取血0.8~1.0 m L , 全血37℃ 恒温箱静置1 h , 放入离心管,2000 r/min离心15 min, 吸取上清, 按照ELISA试剂盒说明测IL-10 和TGF-β 浓度。

1.6 PCR测Th17和Treg标志性蛋白ROR-γt、Fox P3

1.6.1引物

由Pub Med基因库获取全基因序列,由北京擎科新业公司设计并合成。ROR-γt m RNA上游引物:5'-CATTCAGTATGTGGTGGAGTTTGC-3',下游引物:5'-GACTA GGACGACTTCCATTGCTC-3',扩增片段为109 bp;Fox P3 m RNA上游引物:5'-GTACAC-CC AGGAAAGACAGCAAC-3',下游引物:5'-CTC-GAAGACCTTCTCACAACCA-3',扩增片段为104 bp;以持家基因β-actin为内参,上游引物:5'-CAC-GATGGAGGGGCCGGACTCATC-3',下游引物:5'-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3',扩增片段为240 bp。

1.6.2 RT-PCR

造模后第28天颈椎脱臼法处死小鼠,取左前足踝关节滑膜,Trizol法提取组织总RNA,以Gene Copoeia公司逆转录试剂盒合成c DNA;PCR扩增后取5μL产物加入1μL DNA上样缓冲液,2%琼脂糖凝胶电泳检测样品,每份样品行3次重复检测,Quantity One 4.62图像分析软件行光密度值测定,ROR-γt和Fox P3的表达量以目的片段与内参β-actin的相对比值表示。

1.7 统计学方法

采用统计软件SPSS 19.0 对数据进行分析, 正态分布计量资料以均数±标准差(±s)表示,多组间比较采用方差分析,两两比较采用LSD-t检验。 计数资料以率表示,采用 χ2检验。 以P < 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AI情况

三组小鼠初次免疫后, 四只足爪均出现轻度肿胀,局限于趾间关节,药物干预及加强免疫后,激活组肿胀加重不明显,阻断组关节肿胀最严重,出现强直畸形,对照组介于二者之间。 初次免疫后第28 天,即加强免疫后第21 天,激活组、阻断组、对照组AI值分别为(7.12±1.53)、(13.82±2.12)、(10.88±1.84)分,差异有高度统计学意义(P < 0.01)。 见图1。

与对照组比较,**P<0.01

2.2 抗炎因子情况

ELISA检测小鼠血清IL-10 和TGF-β 浓度,激活组IL-10、TGF-β 分别为(12.88±2.23)、(27.61±4.52)ng/L,阻断组为(4.26±1.79)、(12.35±2.42)ng/L, 对照组为(7.49±1.70)、(21.33±2.07)ng/L,激活组浓度均明显高于对照组,阻断组均明显低于对照组,差异有高度统计学意义(P < 0.01)。 见图2。

与对照组比较,**P<0.01;IL-10:白介素-10;TGF-β:转化生长因子-β

2.3 Th17 和Treg标志物情况

2.3.1 PCR

RT-PCR扩增ROR-γt和Fox P3的电泳结果显示,无引物二聚体,无非特异扩增,测序后结果与基因库相比较,确定为所需目的基因。见图3。

2.3.2 PCR光密度值测定

三组小鼠滑膜组织ROR-γt m RNA的相对表达量:激活组为(0.265±0.074),阻断组为(0.972±0.143),对照组为(0.536±0.125),激活组较对照组降低(P<0.01),阻断组较对照组增高(P<0.01);Fox P3 m RNA相对表达量:激活组为(1.203±0.228),阻断组为(0.135±0.026),对照组为(0.419±0.102),激活组较对照组增高(P < 0.01),阻断组较对照组降低(P < 0.01)。 见表1。

a:激活组;b:阻断组;c:对照组

注:与对照组比较,**P < 0.01

3 讨论

RA是以多关节受累为主要表现的自身免疫病,滑膜组织分泌大量细胞因子,募集免疫细胞[11]; 各种炎症因子与细胞互相激活,导致RA不断进展,迁延不愈[12]。幼稚T细胞(naive T cell,Tn)受到诱导后分化为Th1、Th2 和Th17,其中Th17 在介导自身免疫性炎症的过程中发挥重要作用[13]。研究发现,Th17 主要分泌IL-17,起到募集炎症细胞的作用,而ROR-γt是Th17的特异性标志物,在自身免疫疾病中均发现IL-17 和ROR-γt表达量升高,与Th17 活动增强有关[12,13]。 Treg由Tn分化而来,是负性免疫调节细胞,具有抗炎和抑制自身免疫功能,Fox P3 是其特异性标志物[14]。 由此可见,Th17 与Treg是调控自身免疫反应的两种关键细胞,Th17/Treg平衡对于维持免疫稳态意义重大。

Tim-3 为近年新发现的受体分子,主要表达于Th1、Th17、Treg等细胞,具有调控细胞增殖、分化及凋亡的作用[4,15]。 在诸多自身免疫病的动物模型中,当Tim-3与其天然配体Gal-9 结合后,激活的Gal-9/Tim-3 通路可诱导免疫耐受,缓解炎性反应[5,6,7,8,15]。 作为公认理想的RA动物模型,小鼠CIA成功模拟了RA的病理生理特点和免疫学微环境[16],为探讨Gal-9/Tim-3 通路对RA的影响提供必需条件。 本实验发现,阻断组小鼠关节病变较对照组严重, 而激活组较对照组减轻,证明阻断Gal-9/Tim-3 通路会加重CIA炎症,激活该通路则可有效遏制关节炎进展。 有文献报道,Gal-9/Tim-3 通路使抗炎因子IL-10 和TGF-β 表达增加,拮抗炎症介质作用, 减轻组织病变[9,17]; 本实验以ELISA法测三组小鼠血清IL-10 和TGF-β 浓度, 证实了该结论。 关于抗炎介质表达增加的途径,很可能是活化的Tim-3 分子多途径诱导Th17 凋亡, 激活Treg,触发了强大的免疫耐受效应[14,18]。 本实验中,激活组滑膜组织ROR-γt表达下降,Fox P3 表达上升,而阻断组ROR-γt上升,Fox P3 下降, 说明激活Gal-9/Tim-3 通路确实能恢复Th17/Treg平衡, 重建免疫稳态。 总之,本实验发现激活Gal-9/Tim-3 通路对CIA具有缓解作用, 并证实其机制很可能是通过恢复Th17/Treg平衡,上调抗炎因子表达,从而实现自身免疫耐受,这为人类RA的治疗提供了新的靶点。

摘要:目的 探讨激活或阻断Gal-9/Tim-3信号通路对小鼠胶原诱导性关节炎的影响及其机制。方法 6~8周龄雌性BALB/c小鼠30只,建立Ⅱ型胶原诱导性关节炎模型,造模后第7天加强免疫。于加强免疫前1 d随机分为激活组、阻断组、对照组,每组10只,分别经尾静脉输注半乳糖凝集素-9(Gal-9)、阻断剂Tim-3单抗、PBS。造模后28d观察三组小鼠踝关节变形程度,记录关节炎指数,ELISA法检测血清抗炎因子白介素-10(IL-10)、转化生长因子β(TGF-β)水平,RT-PCR检测踝关节滑膜组织辅助性T细胞(Th17)、调节性T细胞(Treg)标志性蛋白ROR-γt、Fox P3表达量。结果 加强免疫后,三组小鼠出现不同程度关节变形,造模后第28天关节炎指数:激活组为(7.12±1.53)分、阻断组为(13.82±2.12)分、对照组为(10.88±1.84)分,差异有高度统计学意义(P<0.01);血清IL-10、TGF-β水平:激活组[(12.88±2.23)、(27.61±4.52)ng/L]明显高于对照组[(7.49±1.70)、(21.33±2.07)ng/L](P<0.01),阻断组[(4.26±1.79)、(12.35±2.42)ng/L]明显低于对照组(P<0.01);RT-PCR结果显示:ROR-γt m RNA在滑膜组织的表达情况激活组明显低于对照组(P<0.01),阻断组明显高于对照组(P<0.01);Fox P3 m RNA表达情况激活组明显高于对照组(P<0.01),阻断组明显低于对照组(P<0.01)。结论 激活Gal-9/Tim-3通路可缓解小鼠胶原诱导性关节炎,阻断该通路则加重炎性反应,作用机制可能与该通路抑制Th17,活化Treg有关。

胶原性关节炎 篇7

1 材料与方法

1.1 研究对象与实验分组 实验于1999年6月至2001年2月在南方医科大学完成。取8个月龄新西兰兔24只,雄性,体重(2.5±0.2) kg。随机抽签法分为对照组、骨形态发生蛋白组(bone morphogentic protein,BMP)和诱导型一氧化氮合酶抑制剂S-甲基异硫脲(S-methylisothiourea,SMT)组,每组8只。动物由南方医科大学提供。

动物模型和标本处理:8月龄新西兰兔24只,随机分为对照组、BMP组和SMT各8只。在右侧股骨髁间关节面上作直径4.5 mm、深达髓腔的全层缺损。a)对照组:软骨缺损不充填任何物质;b)BMP组:缺损用BMP纤维蛋白凝胶复合物充填;c)SMT组:缺损应用胶原复合BMP充填,术后按5 mg·kg-1·12 h-1皮下注射SMT。术后1年各组处死动物,制作石蜡切片用于检测。

1.2 苦味酸-天狼猩红染色显示胶原分布:石蜡切片,0.1%的天狼猩红饱和苦味酸溶液(0.1 g天狼猩红溶于100 mL苦味酸溶液)染60 min,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,封片。偏振光显微镜下观察。

1.3 软骨Ⅰ、Ⅱ型胶原图像分析 在40倍视野下,每张切片上选择10个纵向视野,以正常软骨Ⅰ、Ⅱ型胶原色度为参照。利用Leica-Q500MC图像分析仪,在交互式操作方式下进行测试,获得关于胶原的体视学定量指标。将获得的体视学参数值按体视学原理和计算公式求得每例标本的形态学定量参数值,得到各型胶原含量。软骨厚度图像分析:利用Leica-Q500MC图像分析仪,100倍视野下测量修复组织表面Ⅱ型胶原显示的厚度来间接测量软骨厚度。

1.4 统计学分析 SPSS 8.0软件包完成统计处理,数值均以undefined表示,Paired-samples T test作均数的显著性检验。

2 结 果

2.1 偏振光显微镜下观察

在偏振光显微镜下,Ⅰ型胶原表现为较强的双折光,紧密排列,为黄色或红色的纤维。Ⅱ型胶原显示弱的双折光,呈现绿色混合颜色的疏松纤维。术后1年,对照组修复组织内基本未见绿色纤维,以致密粗大黄色纤维为主,与软骨下骨结构也有明显差别;术后1年,BMP组基本以黄色和红色纤维为主,中间夹杂很少量绿色弱折光纤维;术后1年,SMT组仍可见大量绿色弱折光纤维,但局部有异位骨化。

2.2 软骨修复组织Ⅰ/Ⅱ胶原分布图像分析结果

经图像分析,SMT组术后1年Ⅰ型胶原占65.9%,Ⅱ型胶原30.7%。分别与对照组Ⅰ型胶原(94.6%)、BMP组Ⅰ型胶原(88.5%),对照组Ⅱ型胶原(4.5%)、BMP组的Ⅱ型胶原(10.8%)相比,差异有显著性意义(P<0.05)(见表1)。

2.3 软骨厚度的测量

经图像分析,1年后SMT组软骨厚度(1.85±0.56) mm明显高于BMP组(0.67±0.31) mm及对照组(0.24±0.10) mm,其差异有显著性意义(P<0.05)(见表1)。

3 讨 论

NO作为体内重要的信号传导分子,已证实在骨关节炎发病和转归方面有重要作用。我们以前的研究也提示iNOS抑制剂SMT能提高软骨修复组织的质量[1,2],但由于技术的原因,均未能对软骨修复组织内胶原变化,特别是Ⅰ型和Ⅱ型胶原作定量分析,以阐明修复组织胶原的变化规律,从而提高修复组织质量。天狼猩红是阴离子强酸染料,易与胶原纤维中的碱性基团反应。胶原纤维在偏振光下有正的单轴双折光属性,与天狼猩红结合可增强双折射,提高分辨率[3]。Junqueira等[4]最早将苦味酸-天狼猩红染色法应用于组织切片的胶原检测,国内也曾用于纤维表达等方面的研究[5,6]。

既往研究虽然采用了多种方法促进软骨修复,许多报告均能在早期获得缺损区透明软骨的生成。但是这些修复组织无论是在生物学结构和形态方面,还是生物力学方面,均与正常软骨不同。而且这些修复软骨组织较差的功能及耐用性,随后导致退行性退变,被纤维组织代替[7,8]。Ⅱ型胶原是软骨组织最主要的成分,可作为软骨的表型标记,决定了关节软骨特性,是评价软骨修复质量的标志之一。既往采用免疫组化技术不仅抗体来源不易,价格昂贵,操作费时,而且只能在不同切片上观察胶原的分布情况。而苦味酸-天狼猩红染色法可以在一张切片上同时显示出各种胶原的分布及其相互的关系,有利于观察软骨修复过程中各种胶原变化的规律。随着计算机分析技术的成熟,根据不同的颜色和灰度定量分析胶原分布成为可能。我们首次采用苦味酸-天狼猩红染色法并与病理体视学方法结合,检测软骨修复组织中Ⅰ型和Ⅱ型胶原的分布,以观察一氧化氮合酶抑制剂SMT对软骨表型维持的影响。但天狼猩红染色对于区分Ⅱ型和Ⅲ型胶原尚不理想,我们采用正常软骨的Ⅱ型胶原为基准来校正软骨修复组织中Ⅱ型胶原,以此区分Ⅲ型胶原。同时,软骨修复中Ⅲ型胶原的表达较少。图像分析结果显示,SMT组软骨修复组织在术后1年Ⅰ型胶原明显少于BMP组和对照组,Ⅱ型胶原多于BMP组和对照组。

本实验结果提示,SMT的应用对维持软骨修复组织的表型方面具有积极作用。但软骨的修复组织与正常软骨相比仍然有一定差距,尤其是异位骨化及接合处的退变。但苦味酸-天狼猩红染色法无疑是一种观察软骨修复组织中胶原类型、分布、含量及变化较理想的方法。

参考文献

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[2]孙炜,王吉兴,金大地,等.一氧化氮合酶抑制剂长期作用对兔关节软骨缺损修复的影响[J].中华医学杂志,2002,82(1):23-26.

[3]周明芳,程天民,冯正直.抑郁对大鼠创面愈合过程中胶原含量的影响[J].第三军医大学学报,2008,30(13):1293-1295.

[4]Junqueira LC,Cossermlli W,Brentani R.Differential staining of collagens of type,and by Sirius Red and polarization microscopy[J].Arch HistolJpn,1978,41(3):267-274.

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胶原性关节炎 篇8

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要试剂

1.1.1实验动物与分组

健康清洁级Wistar雄性大鼠60只,体重(120±15)g,由南京医科大学动物实验中心提供。实验过程中对动物的处置遵循中华人民共和国科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》。动物在实验前适应性喂养1周,每笼3只,动物房温度在23~25℃,湿度在40%~60%,12 h明暗交替。采用完全随机法,随机取16只分为正常组,anti-IL-22-对照组,其余大鼠采用Ⅱ型胶原和弗氏不完全佐剂制备RA模型,将造模成功的16只大鼠随机分为RA组,anti-IL-22-RA组。

1.1.2主要试剂

DMEM培养基及胎牛血清(FetalBovine Serum,FBS)购自Gibco公司,ELISA试剂盒(R&D公司),流式抗体CD4PECy5、IFN-γFITC、IL-17PE及IL-22APC(BD公司),IL-22、U6、GAPDH及STAT3引物购自上海吉玛生物技术有限公司,Trizol(Invotrogen公司),Real-time PCR试剂盒(ROCHE公司),anti IL-22封闭抗体、抗IL-22抗体及抗STAT3抗体(Abcam公司),抗β-actin抗体(Santa Cruz公司),羊抗兔二抗(Santa Cruz公司),CCK-8购自上海博谷生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1动物模型制备

取适量Ⅱ型胶原溶于0.1 mol/L的乙酸溶液中,使其最终浓度为2 mg/ml,放置于4℃冰箱中摇晃过夜,次日与等量的弗氏不完全佐剂于冰上充分乳化,达到油包水状态则为乳化完全。于大鼠左后跖底部注射0.2 ml/只的乳剂,7 d之后在尾根追0.2 ml/只,进而诱发类风湿性关节炎模型[5]。模型成功的标准为大鼠食量减少,毛色略黄无光泽,行动迟缓,体重减轻,足爪红肿,足垫增厚,不能负重,甚至出现跛行。

1.2.2大鼠滑膜R AFLS细胞培养

引颈处死大鼠,无菌条件下取滑膜组织,采用HBSS液反复漂洗组织块3次后剪成约1~2 mm3小块。组织块贴壁培养,待滑膜FLS长出后,胰蛋白酶消化细胞传代培养。采用生长状态良好的第3~5代细胞进行实验。

1.2.3流式细胞术检测大鼠全血中Th22细胞

取新鲜采集的大鼠肝素抗凝的外周血5 ml,制备成单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),将PBMC分别用PBS缓冲液洗1遍并重悬于100μl PBS缓冲液中,加入CD4-PECY5(0.2 mg/ml)、IL-17-PE(0.2 mg/ml)和IL-22-APC(0.25 mg/ml)抗体,4度避光孵育30 min,PBS洗2遍以及,上机检测(BD FACS Calubur),Th22细胞表现为CD4+IL-17-IL-22+细胞群。

1.2.4 R eal-time PCR检测IL-22 m R N A表达水平

新鲜采集的大鼠外周血2 ml,静置6 h后,离心取上清,依照产品说明书,以U6作为内参,检测IL-22 mR NA的表达水平。IL-22引物:正向5'-CGATTGGGGAACTGGACCTG-3',反向5'-GGACGTTAGCTTCTCACTTT-3'。

1.2.5 ELISA检测IL-22蛋白表达水平

取新鲜采集的大鼠外周血2 ml,静置6 h后,离心提取上清液,依照产品说明书,ELISA试剂检测IL-22蛋白表达水平。

1.2.6 CCK-8实验检测R AFLS细胞增殖

将对数生长期的RAFLS细胞以50%的融合率接种至96孔板,每组设置3个复孔,同时设置不含细胞的空白培养基作为对照组,37℃,5%二氧化碳CO2,95%湿度下培养24 h后,分别在培养孔加入10μL CCK-8溶液;孵育2 h,酶标仪检测450 nm的吸光值,每孔实测光密度(optical density,OD)值需减去空白对照组OD值,取3复孔平均值,记录OD值。

1.2.7 R eal-time PCR检测STAT3 m R N A表达水平

将培养至对数生长期的大鼠RAFLS细胞,用Trizol提取各组总RNA,反转录为cD NA,依照产品说明书,以U6作为内参,检测STAT3 mR NA的表达水平。Stat3引物:正向5'-GGAGGAGGCATTCGGAAAGTA-3',反向5'-CTGCAGGTCGTTGGTGTCAC-3'。

1.2.8 Western blot检测STAT3蛋白表达水平

大鼠RAFLS细胞培养至对数生长期,按照蛋白抽提步骤,提取总蛋白;采用BCA法测定总蛋白浓度,经SDS-PAGE电泳后转移到NC膜上,5%脱脂奶粉室温封闭1.5 h,TBST洗涤后,分别加入1∶1 000抗STAT3抗体、1∶500抗β-actin抗体,4℃孵育过夜,TBST洗涤后加入1∶5 000辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗,37℃孵育1 h,再用TBST洗涤,化学发光并曝光成像。Weastern blot检测以β-actin条带作为内参,STAT3条带与其比较,观察STAT3蛋白表达变化。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0 统计软件进行数据分析, 计量资料用均数±标准差( ±s) 表示,两组间差异比较用Student’s t检验,P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 流式细胞术检测大鼠全血中Th22 细胞

Th22 细胞在RA大鼠全血中表达显著高于正常大鼠,差异有统计学意义( P <0.01) ,见图1。

2.2 检测血清中IL-22 m RNA和蛋白表达水平

IL- 22 m RNA细胞在RA大鼠血清中表达显著高于正常大鼠,具有统计学意义( P <0.01) ;蛋白水平表达同样显著高于正常大鼠,具有统计学意义( P <0.01) 。 此外,与RA组比较,IL- 22 的中和抗体后能够显著抑制RA小鼠体内IL- 22 的蛋白水平。 同时注射IL- 22 的中和抗体亦减低RA小鼠的IL- 22m RNA水平, 可能是体内注射IL- 22 中和抗体后可以通过影响其他一系列的复杂机制来调节的IL- 22的m RNA表达情况。 见图2。

2.3 RAFLS细胞增殖实验

RA大鼠注射IL- 22 封闭抗体后,与未注射封闭抗体的RA大鼠比较,RAFLS细胞的增殖能力明显下降,差异有统计学意义( P <0.01) ,见图3。

2.4 Real-time PCR检测STAT3 m RNA表达水平

RA大鼠注射IL- 22 封闭抗体后,与未注射封闭抗体的RA大鼠比较,STAT3 m RNA的表达明显下降,差异有统计学意义( P <0.01) ,见图4。

2.5 Western blot检测STAT3 蛋白表达水平

RA大鼠注射IL- 22 封闭抗体后,与未注射封闭抗体的RA大鼠比较,STAT3 蛋白表达显著下降( 见图5) ,差异有统计学意义( P <0.01) 。

3 讨论

类风湿性关节炎( RA) 是以对称性多关节滑膜炎症为主的慢性自身免疫性疾病,能引起软骨破坏,关节间隙变窄,晚期可出现关节畸形,致残率很高。除了关节炎症的表现外,RA还可能出现广泛的全身性病变,如发热、乏力、体重下降、心包炎、胸膜炎及周围神经病变等[6]。 RA在全球都有发病,发病率平均为1%,我国的发病率为1.3%~1.4%,如果不及时诊治,70%的患者2 年后可能发生不同程度的残疾,平均寿命缩短10~15 年。 目前,RA的治疗以主要是以甲氨蝶呤为基础的早期联合用药, 但这只能缓解RA的症状,不能从根本上治愈疾病,且长期使用副作用较大。 近年来,临床上应用以TNF- α 为靶向的生物治疗,但效果一般,且价格昂贵[7]。 RA发病机制尚未明确, 故深入研究RA的发病机制对RA治疗至关重要。

Th22 细胞是新近发现的一类独立于Th1、Th2和Th17 细胞的CD4+T淋巴细胞亚群, 以高水平分泌IL- 22 为特点, 是一个终末分化且独立稳定的谱系[8,9],其功能主要通过IL- 22 来实现。 Th22 细胞参与了炎症反应、 自身免疫性疾病、 肿瘤等的发生发展,在机体免疫调节、宿主防御及组织修复中发挥重要作用。 有研究表明,在RA患者的外周血中,IL- 22高表达[10]。 本研究运用胶原诱导的大鼠关节炎模型发现,RA大鼠模型全血中Th22 细胞的表达明显高与正常大鼠, 血清IL- 22 基因和蛋白水平的表达同样明显高于正常大鼠,说明在Th22 和IL- 22 参与了RA大鼠的发病。 RA发病机制中FLS起关键作用。增生的FLS释放细胞因子和趋化因子, 如IL- 6、IL- 8、IL- 15 及基质细胞起源因子SDF- 1 等,这些小分子进一步促进了滑膜中白细胞由血管内向滑膜的迁入、活化。 FLS增强了针对关节软骨降解生成特异抗原的免疫应答, 促进了SDF- 1 和其他内皮细胞生长因子,包括成纤维细胞生长因子介导的血管再生[11]。 当RA大鼠体内IL- 22 被封闭抗体中和后,RAFLS细胞的增殖显著降低, 说明Th22 和IL- 22 通过影响RAFLS细胞增殖,参与RA的发病。JAK2- Stat3 信号分子是调控细胞增殖分化重要的细胞内信号通路,JAK2 作为上游激酶, 其活化后可以募集胞质中无活性的Stat3 分子,使其酪氨酸磷酸化而形成有活性的二聚体, 进而转移入细胞核, 结合DNA,导致特定靶基因的开启[12,13]。 当RA大鼠体内IL- 22 被封闭抗体中和后,RAFLS细胞中STAT3 不管基因水平还是蛋白水平, 表达都是降低的, 提示Th22 和IL- 22 通过STAT3 信号途径, 影响RAFLS细胞增殖。 这与Lerman等人的研究是一致的[14]。

综上所述,Th22 细胞作为一种以分泌细胞因子IL- 22 为特征的新型辅助性T细胞, 在RA大鼠模型中,通过IL- 22 影响STAT3 信号途径,从而影响RAFLS细胞的增殖,参与大鼠RA的发病。 这为RA的生物靶点治疗提供了理论参考依据。

摘要:目的 探讨胶原诱导的大鼠类风湿性关节炎(RA)模型中,Th22和白细胞介素-22(IL-22)的水平及其可能的机制。方法 构建胶原诱导的大鼠RA模型后,流式细胞术检测Th22细胞,Real-time PCR检测IL-22 m R N A表达水平,ELISA检测IL-22蛋白表达水平;用IL-22封闭抗体中和R A大鼠体内IL-22后,CCK-8实验检测R AFLS细胞增殖,R eal-time PCR检测IL-22和STAT3 m R N A表达水平,Western blot检测STAT3蛋白表达水平。结果 与对照组比较,RA大鼠全血中的Th22细胞和血清IL-22的表达显著增加(P<0.01);用IL-22封闭抗体中和R A大鼠体内IL-22后,与对照组比较,R A大鼠血清IL-22显著下降(P<0.01),R AFLS细胞增殖能力下降(P<0.01),R AFLS细胞中STAT3基因和蛋白水平的表达显著较少(P<0.01)。结论R A大鼠模型中,Th22细胞通过分泌过多的IL-22刺激STAT3信号途径,从而提升R AFLS细胞的增殖能力,参与大鼠RA的发病。

胶原性关节炎 篇9

【关键词】 关节炎,胶原诱导性;寒痹康汤;核转录因子-κB

Influence of Hanbikang Decoction on the Expression of NF-κB in Synovial Cells of Collagen-Induced Rats with Rheumatoid Arthritis

Pang Xue-feng,Wang Qian,Wu Yan-hong,Tang Li-ping,Huang Chan-juan,Peng Zhong-yi,Liu Huan,Long Chao-yang,Pan Yan,Li Yu-ling

【ABSTRACT】 Objective:To observe the effect of hanbikang decoction on the expression of NF-κB in synovial cells of collagen-induced rats with rheumatoid arthritis to probe the mechanism of it in the treatment of rheumatoid arthritis.Methods:Bovine collagen type II and freund's incomplete adjuvant were used to induce rat model with arthritis to observe the expression of NF-κB in synovial cells of collagen-induced rats with rheumatoid arthritis with methotrexate as the control group.Results:Hanbikang decoction could reduce the expression of NF-κB in synovial cells of collagen-induced rats with rheumatoid arthritis,with almost the same function as methotrexate.Conclusion:Hanbikang decoction could influence the expression of NF-κB in synovial cells of collagen-induced rats with rheumatoid arthritis,being one of the mechanisms in the treatment of rheumatoid arthritis.

【Key words】 arthritis,collagen-induced;hanbikang decoction;NF-κB

类风湿关节炎(rheumatiod arthritis,RA)主要是机体对自身滑膜发生免疫反应的疾病,在RA的病理机制中,核转录因子-κB(NF-κB)的异常活化与滑膜组织炎性增生及其对关节局部组织的侵蚀密切相关。本研究采用牛Ⅱ型胶原蛋白(CⅡ)和弗氏不完全佐剂诱导大鼠关节炎模型(CIA),观察寒痹康汤对滑膜细胞NF-κB表达的影响,探讨寒痹康汤治疗RA的机理。

1 实验材料

1.1 实验动物 60只Wistar大鼠,雌性,体质量(100±10) g,购于广西中医药大学实验动物中心。

1.2 实验试剂 牛II型胶原蛋白、弗氏不完全佐剂购于Chondrex(美国)公司;NF-κBp65兔抗体、SP-9000/9001/9002 HistosainTM-Plus Kits免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒及ABC复合物试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 实验药品 寒痹康汤(组方:秦艽、防风、黄芪、附子、麻黄、当归、淫羊藿、狗脊、青风藤)由广西中医药大学附属瑞康医院新药研发中心制备提供。甲氨蝶呤由上海医药(集团)有限公司信谊制药总厂生产(生产批号20070121)。

2 方 法

2.1 造模及分组 60只大鼠适应性喂养7 d后,从中随机取10只为正常对照组,其余大鼠参照文献资料[1]方法造模:在无菌条件下,用0.1 mol·L-1冰醋酸充分溶解牛II型胶原蛋白,浓度为4 mg·L-1,

置4 ℃冰箱过夜后,再与等体积弗氏不完全佐剂

(1 mg·mL-1)混合、震荡至充分乳化,制成CII乳剂,置4 ℃冰箱保存备用。实验时分别在每只大鼠颈、背部进行多点皮内注射0.25 mLCII乳剂致炎,14 d后再次按上述方法和剂量进行免疫。免疫成功后(评分4分以上)随机分为模型组、甲氨蝶呤组、寒痹康汤高剂量组、寒痹康汤中剂量组、寒痹康汤低剂量组5组,每组10只。

2.2 给 药 正常对照组自由饮食,模型组以生理盐水2 mL·(100g)-1灌胃,每日1次;甲氨蝶呤组灌服甲氨蝶呤药液2.7 mg·kg-1(为70 kg成人临床用药3倍),每只灌服约0.405 mg,每周灌服1次;寒痹康汤高、中、低剂量组,分别以寒痹康汤(含生药16 g·kg-1、8 g·kg-1、4 g·kg-1)

2 mL·(100g)-1,每日分2次进行灌胃。

2.3 检测项目

2.3.1 关节肿胀指数 参照文献资料[2]采用0~4级关节评分法进行评分。0分:无关节炎;1分:小趾关节轻度肿胀;2分:小趾关节和足跖肿胀;3分:踝关节以下的足爪肿胀;4分:包括踝关节在内全部关节肿胀。关节指数积分越高,关节症状越严重。评分4分以上为造模成功。

2.3.2 标本采集 正常对照组、模型组及各实验组大鼠灌胃治疗36 d后,腹腔内注射2%戊巴比妥钠注射液进行麻醉,逐层分离膝关节各层组织,采集滑膜组织,用甲醛固定,石蜡包埋切片,切片厚度5 μm。

2.3.3 NF-κB的检测 石蜡切片常规脱蜡至水。PBS冲洗3次,每次3 min。滴加3% H2O2去离子水,37 ℃温箱孵育10 min。蒸馏水冲洗,PBS浸泡5 min。滴加试剂A,37 ℃温箱孵育15 min,倾去,勿洗。滴加1∶200的NF-κB兔抗体,4℃孵育过夜。PBS冲洗3次,每次3 min,滴加试剂B,37 ℃温箱孵育15 min。PBS冲洗3次,每次3 min,

滴加试剂C,37℃温箱孵育15 min。PBS冲洗3次,每次3 min,DAB显色剂显色。自来水充分冲洗,脱水、透明、中性树胶封片。用图像分析仪进行图像分析,测定其平均灰度值。

2.4 统计学方法 采用SPSS15.0软件进行统计分析,计量资料用表示,组间差异采用方差分析及t检验,以P < 0.05 为差异有统计学意义。

3 结 果

实验结果显示,模型组大鼠关节滑膜的NF-KBp65的阳性染色强度明显高于正常对照组,差异有统计学意义(P < 0.05)。经过甲氨蝶呤、寒痹康汤治疗36 d后,各治疗组的NF-κBp65的表达均下调,接近于正常水平,与正常对照组比较,差异无统计学意义(P > 0.05)。寒痹康汤组与甲氨蝶呤组比较,疗效相当,差异无统计学意义

(P > 0.05),见表1。

表1 各组大鼠滑膜NF-κBp65表达的平均吸光度值比较 组别动物数(只)NF-κBp65表达

正常对照组10 92±8

模型组10 163±11)

甲氨蝶呤组10 90±72)

寒痹康汤低剂量组10 89±72)3)

寒痹康汤中剂量组10 85±62)3)

寒痹康汤高剂量组10 83±52)3)

注 与正常对照组比较,1)P < 0.05,2)P > 0.05;3)与甲氨蝶呤组比较,P > 0.05

4 讨 论

RA主要是机体对自身滑膜发生免疫反应的疾病,其病理改变主要为滑膜组织的增生、炎性细胞浸润、血管翳形成以及骨和软骨进行性不可逆性破坏,其中血管翳的形成为一重要的中间环节。滑膜巨噬细胞、淋巴细胞凋亡受抑制是RA滑膜增生的重要因素,TNF-α的作用在此过程至为关键,它通过与TNFR结合使NF-κB信号通路过度活化而启动抗凋亡信号,导致了多种抗凋亡分子的转录,进而抵抗由死亡受体或线粒体依赖途径引发的凋亡。

NF-κB是普遍存在的真核细胞转录因子,在机体免疫反应和细胞增殖等方面发挥中心调节作用。近年来的研究证明,许多疾病的发生和发展均与NF-κB过度激活有关。Yoshida S[3]等的研究表明NF-κB可能对血管形成具有核心的调节作用,并发现血管生成因子中TGF-β、TNF-α、IL-1α、IL-8等含有NF-κB的特异性结合位点,其表达受NF-κB的调控。Han等[4]的研究显示,在II型胶原诱导的大鼠关节炎,NF-κB的活化于免疫后20 d明显增高,在临床症状出现前1~2周,滑膜胶原酶MMP-13及备解素MMP-3基因的表达至第35天才逐步升高。还有研究表明,在大鼠的胶原性关节炎及佐剂性关节炎中均证明NF-κB的表达先于临床症状出现[5]。Benito等[6]采用免疫组织化学及凝胶电泳迁移率改变分析法(EMSA)对早期RA患者关节组织的配对研究显示,在软骨与血管翳交界部位(CPJ),NF-κB阳性细胞绝对值显著高于关节内其他非CPJ部位,提示NF-κB与血管翳生成、关节软骨侵蚀密切相关。因此,NF-κB已成为RA治疗颇有吸引力的靶点和研究热点。

寒痹康汤是笔者治疗活动期RA的经验方,具有补益肝肾、益气温经、祛风除湿止痛之功效。应用秦艽汤及寒痹康冲剂治疗不同证型的RA患者,能明显改善患者症状,并可明显下调RA患者升高的TNF-α及IL-1β的水平[7-8]。动物实验亦表明,寒痹康汤能改善大鼠关节肿胀指数,诱导实验性关节炎大鼠滑膜细胞凋亡[9]。

本研究表明,寒痹康汤能下调胶原诱导性关节炎大鼠滑膜细胞NF-κB的表达,作用与甲氨蝶呤相当,进一步阐明了寒痹康汤治疗RA的作用机理。

5 参考文献

[1]邓安梅,仲人前,陈孙孝,等.关节炎中B7:CD28/CTLA-4共刺激途径的实验研究[J].中国免疫学杂志,2000,16(8):412-414.

[2]Larson P,Kleinau S,Holmdahl R,et,al. Homologous Type II collagen induced arthritis in rats[J].Arthritis Rheum, 1990,33(5): 693-701.

[3]Yoshida S,Ono M,Shono T,et al.Involvement of interleukin-8 vaseular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor in tumor necrosis factor alpha-dependent angiogenensis[J].MoI Cell Biol,1997,17(7):4015-4023.

[4]Han Z,Boyle DL,Manning AM,et al.AP-1 and NF-kappaB regulation in rheumatoid arthritis and murine collagen-induced arthritis[J].Autoimmunity,1998,28(4):197-208.

[5]Tsao PW,Suzuki T,Totsuka R,et al.the effect of dexam ethasone on the expression of activated NF-kappaB in adjuvant arthritis[J].Clin Immunol Immunopathol,1997,83(2):173-178.

[6]Benito MJ,Murphy E,Murphy EP,et al.Increased synovial tissue NF-kappaB1 expression at sites adjacent to the cartilage-pannus junction in rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheum,2004,50(6):1781.

[7]庞学丰.秦艽汤加减治疗类风湿性关节炎疗效观察[J].广西中医药,2002,25(1):11-13.

[8]庞学丰,刘欢,高立珍,等.寒痹康冲剂对类风湿关节炎细胞因子的影响[J].时珍国医国药,2010,21(11):2777-2778.

胶原性关节炎 篇10

体表创伤敷料对于创伤治疗的重要性和意义不言而喻,这也驱使各国的研究者开发各种新型材料。目前,对于体表创伤的愈合理论,普遍接受的是1962年由Winter提出的湿性愈面修复材料的要求而被广泛关注,成为研究热点,并有部分成果用于临床应用且取得良好效果[2,3]。合理论[1]。根据湿性愈合理论的要求,体表创伤敷料应该具有理想的物理机械性能、适当的保湿性能和一定的生物降解性能,这也为体表创伤敷料提出了较为关键和具体的要求。正因如此,水凝胶由于具有符合理想创

然而,以聚乙烯醇(PVA)为原料制备得到的水凝胶,由于表面缺乏细胞识别位点,细胞相容性较差,因此很难单独作为组织工程支架应用。胶原是一种具有优异生物相容性和低抗原性的天然高分子材料,可以介导细胞间的传导和相互作用,将其用于体表创伤敷料,能够支持很多不同组织的生长。因此,以PVA和胶原为原料制备复合型天然高分子水凝胶成为一种新的发展方向。除此之外,水凝胶还可作为药物缓释或控释的载体,减少用药并提高疗效。有研究者就以PVA、N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)与丙烯酸(AAc)等为原料,制备具有温敏性的水凝胶薄膜材料[4,5,6,7,8]。

文章拟以P(NIPAM-co-AAc)、PVA和胶原为主要原料,制备具有环境敏感性的功能性高分子水凝胶。利用PVA构建具有良好物理机械性能的高分子网络结构,辅以胶原蛋白改善材料的生物相容性。在此基础上,以分子设计的思路合成相转变温度在人体生理温度附近的PNIPAM基共聚物,并以此作为温度敏感控件,构建具有智能环境响应能力的高分子水凝胶材料。主要结构特征如图1所示。

1 试验部分

1.1 主要试验材料与仪器设备

胶原按实验室已建立的方法自制及纯化[9];

聚乙烯醇(PVA),分析纯,平均聚合度1 700±50,醇解度99%,成都科龙化工有限公司;

1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),分析纯,上海延长生化试剂有限公司;

P(NIPAM-co-AAc),实验室自制;

其它化学试剂均为市售分析纯试剂,如未特殊说明均为直接使用,使用前未经任何提纯或附加操作。

精密增力电动搅拌器,JJ-1,江苏金宇环宇科学仪器厂;

真空冷冻干燥机,Freeze 6,Labconco;

万能拉力机,AI-7000S,台湾GoTech。

1.2 试验内容与方法

1.2.1 PVA-P (NIPAM-co-AAc)-Col水凝胶的制备与响应曲面设计

(1)PVA的改性及改性PVA溶液的配制

为了获得含羧基的聚乙烯醇材料,本试验选择丁二酸酐与聚乙烯醇进行反应。改性后得到的产物标记为改性PVA(sPVA)[10]。

取适量密封保存备用的sPVA,加入适量蒸馏水使其浓度达到18%左右,于60℃搅拌溶胀约2h后,升温至90℃,继续搅拌至完全溶解成均匀溶液,再按照18%的sPVA浓度补加蒸馏水至预定重量,搅拌均匀后自然冷却至室温,静置脱泡备用。

(2)P(NIPAM-co-AAc)聚合物的制备及溶液的配制

以APS和TEMED为氧化还原体系,分别作为反应的引发剂和加速剂,以BIS作为交联剂,采取无皂乳液聚合法合成P(NIPAM-co-AAc)共聚物。取纯化后冷藏保存的AAc,用约0.5mol/L NaOH溶液溶解并调pH值至4.0,使AAc单体浓度为10%。准确称取BIS和APS,用蒸馏水配制成浓度约为1%的交联剂溶液和10%的引发剂溶液,冷藏保存。准确称取已纯化的NIPAM单体,按NIPAM与AAc单体摩尔比9:1加入AAc单体溶液和0.15%BIS交联剂溶液,加入蒸馏水使混合后总重为50g,搅拌溶解成澄清均匀溶液后加入加速剂TEMED,再将混合溶液倒入恒压加样漏斗。准确称取0.08%的APS溶液,加入蒸馏水至总重为50g,转入三颈瓶中通氮气驱氧约30min后置于70℃水浴中,搅拌状态下将已转入恒压加样漏斗的单体混合溶液缓慢滴加到三颈瓶中,单体溶液滴加总时间为2h,加完后继续搅拌反应2h,整个反应过程始终保持通氮气驱氧。反应完成后将三颈瓶移出水浴,搅拌状态下冷却至室温,将冷却后的反应液转移入截留分子质量为10 000的透析带中,用蒸馏水透析,最后将纯化的产物冷冻干燥,得到白色粉末状共聚物,标记为P(NIPAM-co-AAc)聚合物[4,5,6,7,8]。经检测,该共聚物的低临界相转变温度(LCST)在人体生理温度(37℃)附近。

取适量密封保存备用的P(NI-PAM-co-AAc)共聚物粉末,加入适量蒸馏水使其浓度为5.0%,室温下搅拌溶解成澄清均匀溶液,静置脱泡后备用。

(3)胶原溶液的配制

取适量密封保存备用的胶原海绵,准确称量后加入0.1M HAC配制成浓度为1.0%的胶原溶液,置于冰箱中4℃条件下充分搅拌溶解,静置脱泡备用。

(4)水凝胶的制备与响应曲面设计

在前期的研究基础上,对响应曲面设计进行了修正。选择三因素Box-Behnken方法进行设计,主要考察PVA的浓度(CPVA)、P(NIPAM-coAAc)共聚物与PVA的比例(NA/PVA)、以及反复冻融循环次数(FTC)对水凝胶性能的影响。响应曲面设计的因素与水平如表1所示,利用Minitab软件生成试验方案如表2所示。

取适量上述配制的sPVA溶液,按照表2中规定的P(NIPAM-coAAc)共聚物与PVA的比例(质量比)加入P(NIPAM-co-AAc)共聚物溶液,室温条件下搅拌混匀后加入NHS,溶解后再加入EDC,充分搅拌反应液约30min后加入胶原固含量为PVA重量10%的胶原溶液,连续搅拌反应约5h;其中NHS和EDC的用量为0.03mmol/g(以混合总质量计);反应完成后,将上述反应液静置过夜,充分脱泡后将10g反应液倒入直径为90mm的培养皿中,置于-20℃冰箱中冷冻10~12h,然后再将冷冻的样品置于室温条件下融解7~8h,该冷冻-融解过程称为一次冻融循环,按照表2中规定的次数完成各组样品的冻融循环后,将水凝胶样品置于蒸馏水中充分浸泡,以除去未完全反应的单体。最终将制备得到的部分水凝胶冷冻干燥,密封保存用于各项表征检测,部分水凝胶直接用于力学性能以及含水量的测试。响应曲面设计方案中的各编号样品均制备3个以上平行样,每个响应值检测重复3次,检测结果以均值±标准偏差的形式表示,且当P值小于0.05时认为具有统计学意义。

1.2.2 PVA-P (NIPAM-co-AAc)-Col水凝胶的验证试验

采用响应曲面设计进行PVA-P(NIPAM-co-AAc)-Col水凝胶的制备与分析以后,拟对其结果的准确性和可靠性进行验证和探讨。选择不同于响应曲面中的试验参数,按照相同流程和方法重新制备PVA-P(NI-PAM-co-AAc)-Col水凝胶并进行相同项目的检测表征。同时,利用响应曲面设计得出的结果进行理论计算,比较实际检测结果与理论计算结果之间的差异,以对试验结果进行验证。验证试验的编号以及主要参数列于表3。

1.3 PVA-P (NIPAM-co-AAc)-Col水凝胶的表征

(1)水凝胶的力学性能检测

使用电子拉力机进行抗张强度和断裂伸长率的测定,同时计算材料的杨氏模量,与材料的抗张强度、断裂伸长率一并分析。

(2)水凝胶的含水量测定

水凝胶试样的含水量(WC)可以通过样品干燥前后的质量差计算得到。

其中,W1为干燥恒重前水凝胶试样的质量,W2为干燥恒重后水凝胶试样的质量。

(3)水凝胶的溶胀率测定

将密封保存备用的水凝胶剪成合适大小的小块,准确称重后分别浸泡于含有蒸馏水和生理盐水的15mL离心管中,于25℃水浴中静置24h以上;用湿润的滤纸吸取吸水后的水凝胶试样的表面水,准确称重,根据水凝胶试样浸泡吸水前后的质量差值计算其平衡溶胀率。

其中,Qe是吸水溶胀平衡的溶胀率,W0是水凝胶冻干试样的质量,We是水凝胶吸水平衡后的质量。

(4)水凝胶的透水汽性测定

采用医药行业标准《YY/T0471.2-2004接触性创面敷料试验方法第2部分透气膜敷料水蒸气透过率》中规定的方法进行干态透水汽性和湿态透水汽性的检测。在测定PVA-P(NIPAM-co-AAc)-Col水凝胶的湿态透水汽性时,分别在35℃和39℃条件下进行测定,以分析水凝胶材料是否表现出应有的温敏性质。

2 结果与讨论

2.1 PVA-P(NIPAM-co-AAc)-Col水凝胶的响应曲面分析

2.1.1 水凝胶的抗张强度分析

根据抗张强度的响应值,选择完全二次方程分析并绘制了水凝胶抗张强度的响应曲面,如图2所示。

在可进行分析的几种模型中,完全二次模型可以很好地拟合PVA-F(NIPAM-co-AAc)-Col水凝胶的抗张强度。从抗张强度的响应曲面图上可以看出:原料中PVA的浓度对结果具有明显影响。从CPVA与其它2个因素的响应曲面图上可以清楚的看到,在水凝胶冻融次数和温敏共聚物使用量保持不变的情况下,水凝胶的抗张强度几乎随着PVA的浓度直线上升。其原因在于PVA是以碳碳单键为基础构成主链骨架的大分子材料,在受到拉力作用时,PVA主链能够表现出很强的抗张作用;同时,经与温敏共聚物和交联剂改性以后,PVA长链分子与其它2种大分子共价交联并在水凝胶中互相缠绕成空间网状结构。因此,水凝胶中PVA含量的高低直接决定了其抗张强度的大小。

相对而言,冻融次数和温敏共聚物比例对抗张强度的影响就要小很多。从图2中可以看出,在固定水凝胶中PVA浓度的情况下,增加冻融次数和减小温敏共聚物的加入比例都能较小程度地增加水凝胶抗张强度。这与其他研究人员得出的结论基本一致[11]。原因在于,增加冻融次数可以加强PVA的结晶程度,更加有序的高分子排列结构具有更好的应变耐受能力;而在水凝胶中胶原与PVA的比例与交联剂用量都是固定的,所以减少加入温敏共聚物的量可以一定程度上减小在水凝胶中的占位作用,减小对PVA结晶的影响,从而提高抗张强度。

进一步运用Minitab软件对试验结果进行多元回归拟合,得到关于抗张强度的完全二次回归模型拟合方程,如式3和式4所示。在进行验证试验时,给定了试验参数以后,就可以采用式3对响应值进行计算预测,而利用式4中各项的系数大小可以对比因素的线性关系、平方关系和交互关系对响应值的影响程度。由公式4中的编码方程可以看出,对水凝胶抗张强度影响最大的因素是平方项,其次为FTC2和NA/PVA2,线性项中CPVA的影响再大一些,其它线性项以及交互项的影响都较小且比较接近。

(A=CPVA;B=NA/PVA;C=FTC;后同)

式3 PVA-P(NIPAM-co-AAc)-Col水凝胶抗张强度的完全二次拟合未编码方程

式4 PVA-P(NIPAM-co-AAc)-Col水凝胶抗张强度的完全二次拟合编码方程

2.1.2 水凝胶的断裂伸长率分析

根据PVA-P (NIPAM-coAAc)-Col水凝胶的断裂伸长率检测结果绘制响应曲面图,如图3所示。观察发现,在3个因素的两两交互作用响应曲面中,CPVA对水凝胶的断裂伸长率的影响还是比较明显的。与CPVA对水凝胶抗张强度的影响规律有所不同的是,PVA浓度对断裂伸长率的影响不完全是正面的,即断裂伸长率随着PVA浓度的增加出现极小值。水凝胶的断裂伸长率主要受到水凝胶中高分子的分子质量及分布、分子长链的结晶和交联缠绕程度等因素的影响,网络结构越强硬,则在受力拉伸时越容易应力集中而断裂。在制备不同PVA-P(NIPAM-co-AAc)-Col水凝胶试样时,各种原料的分子质量基本是保持不变的,主要的区别在于制备工艺。因此,水凝胶中高分子长链的结晶和交联是决定性因素。水凝胶断裂伸长率出现极小值的原因就在于水凝胶中高分子结晶和化学交联很高,使高分子网络结构的柔韧性降低。从式6可以发现,平方项的影响最大。

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