胶原诱导性关节炎（精选6篇）
胶原诱导性关节炎 篇1
类风湿性关节炎是以慢性、对称性、多滑膜关节炎和关节外病变为主要临床表现, 尚未明确病因的全身性炎症性自身免疫炎性疾病[1]。目前, 类风湿性关节炎的治疗以迅速缓解疼痛症状为主, 但其副作用较强, 有一定的局限性。我国传统中药具有毒副作用小等特点, 在类风湿性关节炎的治疗方面有广泛的应用前景。白藜芦醇 (RES) 是一种多酚类化合物, 其生物学功能主要有抗肿瘤、抗菌消炎、抗氧化、抗自由基等。目前针对RES的研究热点之一是其抗炎作用。本文研究RES对类风湿关节炎是否具有治疗作用, 初步探讨其作用机制。
1 材料与仪器
白藜芦醇 (纯度>80%, 湖南省洪江华光生物有限责任公司, 批号:20130205) ;BCA蛋白定量试剂盒 (Pierce公司) ;牛II型胶原、大鼠TNF-α、IL-6ELISA检测试剂盒 (Sigma公司) ;弗氏不完全佐剂 (美国Sigma公司) 。实验动物:健康雄性4月龄SD大鼠, 体重250~275g, , 由由江江西西中中医医药大学实验动物中心提供, 标准环境饲养, 许可证号SCXK (赣) 2012-0016。
2 方法
2.1 实验分组及给药方案
将SD大鼠随机分为6组:正常组, CIA模型组, RES低剂量组 (20mg·kg-1) 、中剂量组 (40mg·kg-1) 、高剂量组80mg·kg-1) 和阳性对照组 (布洛芬10mg·kg-1) 。各用药组于致炎后第21~35天灌胃给药, 每天1次, 正常组和CIA模型组灌胃给予等容量的0.5%羧甲基纤维素钠。
2.2 大鼠CIA模型制备与评价[3]
牛II胶原500μg溶于0.05mol·L-1醋酸0.2mL中, 与等体积弗氏完全佐剂混合充分, 注射至大鼠尾根部皮下。初次致敏后第21天, 再次大鼠尾根部皮下注射同体积试剂。每日观察关节皮下结节、红肿程度等情况。评价标准:4分:全部足爪肿胀;3分:踝关节以下的足爪肿胀;2分:足趾和趾关节有肿胀;1分:趾关节有红肿;0分:无红肿。
2.3 足爪容积测定及病理检查
足爪仪测定致炎前每只小鼠左后足容积, 自第21天起, 每4天测定1次相应足容积, 肿胀度= (Vt-Vn) /Vn×100%, Vn指模型前足容积, Vt指模型后足容积。第35天处死小鼠后, 剪取左踝关节制病例切片待查。
2.4 血清中炎性因子的检测
第1次免疫后35天麻醉大鼠, 眼底静脉丛取血, 分离取血清, 并按照ELISA试剂盒说明操作, 检测血清中IL-6、TNF-α水平。
2.5 统计学处理
运用SPSS13.0软件进行统计分析, 数据以表示, 组间比较采用t检验, P<0.05表示差异具有统计学意义。
3 结果
3.1 RES对大鼠多发性关节炎指数的影响
RES可剂量依赖性地抑制CIA大鼠继发性足肿胀, 其足爪肿胀度明显轻于模型组, 差异具有统计学意义 (0.05或) , 见表1。
3.2 病理切片观察
常规HE染色病理切片显微镜检发现:健康对照组滑膜关节结构完整, 关节软骨表面完整, 腔内无渗出液, 滑膜组织正常;CIA模型组大鼠镜下可见滑膜关节结构破坏, 关节间隙狭窄, 可见炎性细胞浸润, 并且伴有血管翳形成。CIA阳性对照组可见滑膜关节结构较完整, 关节间隙清晰。见图1。
(±s, n=6)
注:与模型组比较, *P<0.05, **P<0.01。
A:健康对照组;B:CIA模型组;C:CIA阳性药物组
3.3 RES对炎性因子表达的影响
经ELISA法检测, 相较于正常组, CIA模型组炎性因子IL-6、TNF-α的表达明显增加, 而RES给药组可呈剂量依赖性地抑制促炎因子的表达, 见表2。
(±s, n=6)
注:与正常组比较, *P<0.05, **P<0.01;与模型组比较, #P<0.05, ##P<0.01。
4 讨论
本研究观察了RES对各实验组大鼠体重的影响。经RES治疗35天后, 正常对照组、CIA模型组、CIA阳性对照组、及RES高、中、低剂量组大鼠平均体重比较发现:各实验组两两比较平均体重均无统计学差异 (P>0.05) , 表明RES对SD大鼠无明显毒副作用。此外, 已经出现关节炎症状的CIA大鼠使用RES处理35天, 其关节炎指数、足爪容积及滑膜组织病理评分与模型组比较明显下降, 与阳性对照药物布洛芬比较, 下降稍缓, 提示RES对CIA大鼠的关节炎有抑制作用, 其作用强度不及布洛芬。本研究首次通过实验动物模型显示RES对CIA大鼠的关节炎有抑制作用, 机制可能与其调节CIA大鼠异常免疫功能有关。
摘要：目的:研究白藜芦醇 (RES) 对大鼠胶原诱导性关节炎 (CIA) 的作用及其机制。方法:建立牛Ⅱ型胶原蛋白大鼠CIA模型, 测定大鼠足爪炎症肿胀度, HE染色对关节组织进行检查, ELISA法检测血清中炎症因子IL-6、TNF-α水平。结果:灌胃给予RES能减轻CIA大鼠的关节炎症状, 降低血清中IL-6、TNF-α水平, 且呈现剂量依赖性趋势 (P<0.05或P<0.01) ;HE检查发现RES可改善局部关节炎症状。结论:RES对CIA大鼠具有治疗作用, 该机制可能与其调节CIA大鼠异常免疫功能有关。
关键词：胶原性关节炎,白藜芦醇,炎症,免疫功能
参考文献
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胶原诱导性关节炎 篇2
【关键词】 胶原诱导性关节炎；关节炎，类风湿；热痹康汤；血管内皮生长因子；大鼠
Effect of Rebikang Tang（热痹康汤）on Vascular Endothelial Growth Factor in Rats with Collagen-induced Arthritis
PANG Xue-feng，LIU Sha-sha，LI Yu-ling，LIU Huan，MENG Yu-hua，YAO Ping，FENG Yu-qing，WU Yan-hong，TANG Li-ping，LEI Zong-shang，SHU Jian-long，WANG Si-chao，DU Yong-yi，LIN Ju
【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of Rebikang Tang（热痹康汤—a prescription of clearing away heat and toxic materials and anti-rheumatism）on vascular endothelial growth factor（VEGF）in rats with collagen-induced arthritis（CIA）.Methods：Sixty clean-grade female Wistar rats were randomly divided into a blank control group，a model control group，a methotrexate group，and low，medium and high-dose Rebikang Tang groups，10 rats in each group.Except the blank control group，the rats in the other groups were induced by the incomplete adjuvant combined with collagen typeⅡto establish CIA rat models.The model control group was given intragastric administration of physiological saline，the low，medium and high-dose Rebikang Tang groups were given corresponding dose of Rebikang Tang，the methotrexate group was given intragastric administration of methotrexate and the rats in the control group could drink water and eat food freely.The effects of different doses of Rebikang on joint swelling index and VEGF were observed.Results：The joint swelling indexes in each dose of Rebikang group and the methotrexate group were lower than that of the model group（P < 0.01），among which the effect in the medium-dose Rebikang group was equivalent to that of the methotrexate group（P > 0.05） and the effect in the high-dose Rebikang group was superior to that of the methotrexate group（P < 0.01）.The synovial VEGF levels in each Rebikang group and the methotrexate group were lower than that of the model control group
（P < 0.05），among which the effect of the high-dose Rebikang group is superior to the methotrexate（P < 0.05），
while the effects of the middle and low-dose Rebikang groups were equivalent to the methotrexate（P > 0.05）.Conclusion：The mechanism of Rebikang Tang in the treatment of rheumatoid arthritis can be achieved by inhibiting the generation of VEGF.
nlc202309080929
【Keywords】 collagen-induced arthritis；arthritis，rheumatoid；Rebikang Tang（热痹康汤）；vascular endothelial
growth factor；rats
类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种主要侵犯外周关节的慢性自身免疫性疾病。不经规范治疗的晚期RA患者会出现关节畸形和功能丧失[1]，血管内皮生长因子（VEGF）在RA的发病、发展中起到重要的作用。本研究通过给予CIA大鼠灌服清热解毒抗风湿方药——热痹康汤，探讨其对CIA大鼠滑膜VEGF的影响。
1 实验材料
1.1 实验动物 清洁级雌性Wistar大鼠60只，体质量（110±10）g，购于广西中医药大学实验动物中心。动物合格证号：桂医动字第11005号。饲养在空气流通、温度约22～25 ℃、湿度适中（不低于40%）的安静动物房内。
1.2 实验试剂 牛Ⅱ型胶原蛋白、弗氏不完全佐剂（美国Chondrex公司）；检测VEGF所需试剂盒（南京建成生物工程研究所）。
1.3 实验药物 本院新药研发中心负责制备提供本实验研究所用的热痹康汤提取物，将热痹康汤（原药）提取制成含有活性部位的浸膏（由本院新药研发中心负责制作）。造模时按比例加入乙醇和生理盐水溶解配制成质量分数为2×10-7 g·L-1的溶液供大鼠造模。甲氨蝶呤片购自上海医药（集团）有限公司信谊制药总厂。
2 方 法
2.1 分组与造模 将60只清洁级Wistar雌性大鼠放置于鼠笼中进行适应性喂养，观察7 d无异常后随机分为模型对照组，甲氨蝶呤组，热痹康汤低、中、高剂量组，每组10只。除空白对照组外，其余各组大鼠按步骤分别进行造模（方法参照文献[2]）：实验时于无菌条件下，在冰面上将牛Ⅱ型胶原蛋白充分溶解于冰醋酸中，接着加入相同体积的弗氏不完全佐剂，随后一起注入医用三通管内，用注射器互相推吸以充分混合乳化，制成油包水状的CⅡ乳剂，完成后把它放置于4 ℃的冰箱进行保存。进行造模时，分别将CⅡ乳剂分多点注射于Wistar大鼠的背部和尾部皮内。注射后观察大鼠14 d，无异常后再次注射CⅡ乳剂（所用方法和药物剂量同前所述）进行免疫。
2.2 给药治疗 按70 kg人体质量与200 g大鼠换算系数为0.018，甲氨蝶呤组大鼠按甲氨蝶呤药液
2.7 mg·kg-1进行灌胃，每周1次；热痹康汤高剂量组大鼠给予31.25 g·（100 g）-1·d-1的热痹康汤提取物进行灌胃，中剂量组大鼠给予15 g·（100 g）-1·d-1
的热痹康汤提取物进行灌胃，低剂量组大鼠给予
7.5 g·（100 g）-1·d-1的热痹康汤提取物进行灌胃，每日分2次灌服；模型对照组大鼠给予生理盐水
2 mL·（100 g）-1灌服，每日1次。空白对照组大鼠不限制饮水，自由进食。
2.3 关节肿胀指数评分 治疗前及治疗后第1，2，4周分别做好各组大鼠关节肿胀指数的观察并详细记录。评分4分及以上即为造模成功（评分标准参考文献[3]进行拟定：其中表现为包括踝关节在内的全部关节肿胀者评为4分，选取造模成功的大鼠进行下一阶段实验）。
2.4 滑膜VEGF的检测 除空白对照组外，其余各组大鼠均按计划给药。4周后所有大鼠均采用水合氯醛腹腔注射进行麻醉，麻醉完全后于无菌条件下在膝关节处快速剥离滑膜组织，放置于-20 ℃冰箱保存备测。采用免疫组化法测定滑膜中的VEGF含量，项目检测步骤及方法严格按试剂盒说明书进行。
2.5 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料以表示，2组间疗效比较采用t检验，各组间的疗效比较采用方差分析。以
P < 0.05为差异有统计学意义。
3 结 果
3.1 各组大鼠治疗前后关节肿胀指数比较 与模型对照组比较，各治疗组大鼠关节肿胀指数治疗
2周后均有降低，其中热痹康汤高、中剂量组及甲氨蝶呤组与模型对照组比较，差异有统计学意义
（P < 0.01）。各治疗组大鼠关节肿胀指数治疗
4周后与模型对照组比较，差异有统计学意义
（P < 0.01），其中热痹康汤中剂量组作用与甲氨蝶呤组相当（P > 0.05），热痹康汤高剂量组作用优于甲氨蝶呤组（P < 0.01）。见表1。
3.2 各组大鼠治疗前后滑膜VEGF变化比较
各组大鼠滑膜VEGF水平明显高于空白对照组（P < 0.01）；各给药组大鼠治疗4周后的滑膜VEGF水平与模型对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。热痹康汤中、低剂量组与甲氨蝶呤组疗效相当，差异无统计学意义（P > 0.05）；
热痹康汤高剂量组与甲氨蝶呤组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。
表2 各组大鼠治疗前后滑膜VEGF变化比较
组别动物数（只）VEGF（%）
空白对照组104.52±0.46
模型对照组10 29.75±3.131）
甲氨蝶呤组10 23.25±1.751）2）
热痹康汤低剂量组10 22.62±1.821）2）
热痹康汤中剂量组10 21.84±1.711）2）
热痹康汤高剂量组10 17.61±1.671）2）3）
注 与空白对照组比较，1）P < 0.01；与模型对照组比较，2）P < 0.05；与甲氨蝶呤组比较，3）P < 0.05
4 讨 论
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RA的发病和病情进展过程中，血管翳的形成会导致关节的破坏、畸形以及功能障碍，而血管翳形成的重要环节之一就是血管新生。VEGF在RA的发病、发展中起到非常重要的作用。有一项研究将RA患者与健康人群及退行性骨关节炎患者进行对比，结果发现，RA患者血清中VEGF水平明显升高，并且发现其与炎性指标、类风湿因子以及病情的严重程度呈正相关，笔者认为可以把VEGF作为判断RA病情是否活动的一个指标[4-5]。有实验研究证实，经向RA关节腔内注射VEGF抗体或其受体拮抗剂进行治疗，可以减轻RA的症状以及明显抑制滑膜血管翳的形成[6]。近年来多方面的研究结果已经表明，通过抑制VEGF的表达这一途径治疗RA的研究已逐渐成为新的热点和方向之一。
RA属中医学“痹病”范畴，多为机体虚弱，御邪能力低下，风寒湿热之邪入侵，痹阻于内，气血运行不畅，筋脉瘀阻而成。热痹康汤是课题负责人根据上述理论认识，结合多年临床经验总结出的经验方，由秦艽、防风、桂枝、威灵仙、制川乌、地龙、桑枝、葛根、忍冬藤、青风藤、黄柏、苍术组成，具有清热解毒、利湿除痹止痛功效，治疗RA效果较好，能明显改善湿热型患者的晨僵、关节疼痛、关节压痛、关节肿胀及关节功能，降低患者血液中明显升高的C-反应蛋白、类风湿因子、红细胞沉降率以及免疫球蛋白等实验室指标，毒副作用较少，患者耐受程度较好[7]。已完成的动物实验研究表明，热痹康汤能降低胶原诱导性关节炎大鼠血清中升高的白细胞介素-2、白细胞介素-1β、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α及基质金属蛋白酶-3的水平[8-12]，提示热痹康汤能通过影响这些在RA的发病过程中起重要作用的促炎因子而达到治疗的作用。
本实验结果表明，热痹康汤可以通过抑制VEGF的产生，抑制血管翳的形成以及滑膜增殖，减轻炎症而起到治疗RA的作用，为进一步研究热痹康汤的作用机制提供了实验依据。
（下转第24页）
（上接第14页）
5 参考文献
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收稿日期：2016-09-13；修回日期：2016-10-25
胶原诱导性关节炎 篇3
1 材料与方法
1.1 实验动物与试剂
健康Wistar大鼠60只, 雌雄各30只;昆明山海棠;地塞米松;牛Ⅱ型胶原;不完全弗氏佐剂。
1.2 实验方法
1.2.1 动物的分组、标记、造模
10只大鼠设为空白组 (A组) 不予任何处理。50只大鼠造模后随机分为5组, 每组10只, 分别为模型组 (B组) , 地塞米松治疗组 (C组) , 以及THH高 (D组) 、中 (E组) 、低 (F组) 剂量治疗组。每组均给予10%水合氯醛进行腹腔注射, 麻醉后在大鼠尾根部皮肤分5处皮内注射乳化胶原共0.5 m L, 每处注射0.1 m L。首次免疫第14天后相同方法等量加强免疫一次。
1.2.2 给药
首次免疫第28天后开始药物治疗。A组不予任何处理。而B、C、D、E、F各组则按照每100克大鼠体重0.2 m L的剂量分别灌注蒸馏水, 0.04 mg/m L地塞米松灌注液, 200 mg/m L、150 mg/m L和100 mg/m L的高中低三个剂量的THH灌注液, 灌胃1次/d, 连续30 d。
1.2.3 标本制作
所有大鼠于给药第30天后处死, 取大鼠踝关节于4%多聚甲醛中固定12 h, 然后放入10%乙二胺四乙酸中脱钙。脱水包埋切片, 行HE染色。
1.2.4 病理学评分
方法参照Tsubaki等[4]于2005年提出的病理学评分。
1.3 统计学处理
采用SPSS 16.0软件对所得数据进行统计分析;计量资料用 (±s) 表示, 多组间均数的比较应用单因素方差分析, 以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠踝关节病理学改变
各组大鼠踝关节病理学改变。
2.1 A组
滑膜由1~2层滑膜细胞组成, 镜下未见炎症细胞浸润及血管增生, 软骨表面光滑, 未见骨破坏, 关节结构完整。
2.2 B组
滑膜细胞增生明显, 形成10~15层滑膜层, 并伴有血管翳形成。滑膜组织增生并呈绒毛状伸入关节腔内, 关节腔内有大量炎症细胞浸润, 关节表面透明软骨与骨组织发生破坏, 局部纤维化并相互粘连, 关节结构被破坏。
2.3 C组
该组在所有治疗组中的效果最佳, 滑膜细胞层数基本处于正常水平, 血管翳和炎症也基本消失, 偶见造模阶段引起的少许骨组织破坏。
2.4 D组
该组对于模型有一定的抗炎作用, 但与C组和E组相比, 治疗效果稍显逊色。镜下少见血管增生和炎症细胞浸润, 滑膜细胞层数相比空白组稍有增加, 达到5~6层, 少见软骨与骨组织破坏。
2.5 E组
该组在所有THH治疗组中效果最好, 镜下只见2~3层滑膜细胞, 很少见到炎症细胞和血管增生, 基本没有发生软骨与骨组织破坏。
2.6 F组
镜下仍然可见数层滑膜细胞增生组织, 有少许炎症细胞浸润同时伴有血管增生, 关节骨组织破坏明显, 相对于其他治疗组治疗效果不太理想, 具体病理学评分见表1。
分
*与A组比较, P<0.05;△与B组比较, P<0.05
3 讨论
RA是一种病因未明的慢性全身性自身免疫性疾病, 以对称性、多关节滑膜炎和关节外病变为主要临床表现, 主要累及手、腕、足等小关节, 反复发作, 呈对称分布[5]。传统治疗RA的药物主要包括激素类和非甾体类抗炎药等药物, 但长时间服用这些药物会带来类似骨髓抑制等一些较为严重的毒副反应[6], 这也是许多患者无法坚持服药治疗的主要原因。因此临床上治疗RA的药物虽然很多, 但至今尚没有一种特效的治疗方法, 所以目前对于RA的治疗依然只能以减轻患者疼痛、降低病理损害和减缓关节畸形为治疗的主要目标。
昆明山海棠是一种与雷公藤同属的传统中草药, 与雷公藤相比, 昆明山海棠具有毒性更小、安全范围更大的优点, 目前在临床上主要用于治疗RA等多种自身免疫性疾病, 效果显著[7,8]。胶原诱导性关节炎以多发性关节炎性改变并伴有关节损害为特征, 是国内外较为理想的类风湿关节炎动物模型之一, 大鼠则因饲养容易, 实验成本低廉而成为首选[9]。此种大鼠模型的病理特征甚至包括某些临床表现都非常接近于人类RA[10], 因此本实验采用了这种动物模型。
实验结果显示, 在所有治疗组中地塞米松的治疗效果最好, 这也是肯定了这一经典药物治疗RA的有效性。同时在THH高中低三个不同剂量治疗组中, 中剂量的治疗效果最好, 这就提示在临床用药时应该注意人体用药剂量的把握。总之从HE染色结果可以看出, 模型建立成功, 镜下出现关节滑膜细胞增生、炎症细胞浸润、血管增生和软骨及骨质破坏等病理改变, 所有THH治疗组与模型组比较差异均有统计学意义 (P<0.05) , 说明昆明山海棠对于大鼠模型的治疗是有效的, 这也验证了THH在临床上对于治疗RA的积极作用。
摘要：目的:探讨昆明山海棠 (tripterygium hypoglaucum hutch, THH) 对胶原诱导性关节炎 (collagen induced arthritis, CIA) 大鼠模型关节病理评分的影响。方法:60只Wistar大鼠 (雌雄各30只) , 将其随机分为6组:空白组、模型组、地塞米松治疗组以及THH高、中、低剂量治疗组, 连续给药30 d, 观察大鼠关节病理的改变。结果:给药30 d后, HE染色显示模型组产生多层滑膜细胞, 大量炎症细胞和血管翳生成;在3个THH治疗组中中剂量的治疗效果最好, 镜下只见2~3层滑膜细胞, 少见炎症细胞。结论:HE染色结果显示THH对CIA模型有积极的治疗作用。
关键词：昆明山海棠,胶原性诱导关节炎,类风湿性关节炎
参考文献
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胶原诱导性关节炎 篇4
NF-κB/P65、NF-κB/P50和IκBα蛋白活性明显高于空白对照组（P < 0.05或P < 0.01）。结论：CIA模型大鼠滑膜细胞NF-κB活性蛋白增高，IL-17呈高表达，可能与炎症相关。
【关键词】 关节炎，类风湿；胶原诱导性关节炎；滑膜细胞；血清；NF-κB；IL-17；大鼠
类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种原因不明的自身免疫性疾病，其确切的发病机制尚不清楚。核转录因子-κB（nuclear factor kappa B，
NF-κB）是一种广泛存在于真核细胞的核转录因子，NF-κB作为信号转导的枢纽，在肿瘤、哮喘及RA的发生发展中起重要作用[1-3]。NF-κB参与炎症、免疫反应、细胞凋亡及细胞周期控制与分化，并在RA发病中起关键作用。白细胞介素-17（interleukin-17，IL-17）是一种促炎症细胞因子，能诱导活化T细胞和刺激成纤维细胞、巨噬细胞等产生多种促炎介质，抑制软骨细胞合成基质，增强破骨细胞活性，最终导致骨侵蚀，IL-17与其他细胞因子如白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等相互
作用，导致RA病变进展[4]。本实验通过建立Ⅱ型胶原诱导性关节炎（collagen-induced arthritis，
CIA）大鼠模型，观察CIA模型大鼠关节滑膜细胞NF-κB蛋白活性及血清IL-17的水平，探讨NF-κB、
IL-17与CIA模型大鼠关节炎症的关系。
1 实验材料
1.1 实验动物 健康清洁级雌性Wistar大鼠24只，
6周龄，体质量（200±20）g，购于重庆滕鑫生物技术有限公司[动物许可证号SCXK（渝）20070006]，遵守实验动物福利伦理原则。
1.2 主要试剂 牛Ⅱ型胶原（美国Sigma公司，C7806）；不完全弗氏佐剂（美国Sigma公司，F5881）；兔抗大鼠NF-κB P65多克隆抗体（美国millipore公司，NG1861049）；兔抗大鼠NF-KB（p105/p50）单克隆抗体（美国Epitomics公司）；兔抗大鼠IκBα单克隆抗体（美国Epitomics公司）；IL-17 ELISA试剂盒（美国ADL公司，RT110371）。
1.3 主要仪器 LD25-2自动平衡离心机（北京医用离心机厂）；YLS-7B大鼠足趾容积测量仪（淮北正华生物仪器设备有限公司，校零误差≤±5 μL）；
高速分散均质匀浆机（A200-12G）；台式高速离心机（TGL-16M型）；低温冰箱（型号-86-
120WA），电泳仪（DYY-7C型）；紫外分光光度计（日本岛津）；凝胶成像分析系统（美国GE Healthcare公司）；电泳仪（江苏常州无线电元件四厂）；LY70倒置显微镜（日本Olypmpus公司）；酶联免疫检测仪（上海同舸工贸有限公司，DG5033A）；洗板机（130011，AT-828）。
2 方 法
2.1 动物模型制备及分组 将24只Wistar大鼠随机分为空白对照组和模型对照组，每组12只，模型对照组大鼠按照文献[5]建立CIA模型。将牛Ⅱ型胶原10 mg溶于5 mL成质量分数为0.1 mol·L-1
的醋酸溶液中，配制成质量分数为2 mg·mL-1的胶原溶液，使之充分混匀，置于4 ℃冰箱过夜。再与等体积弗氏完全佐剂在冰浴中充分乳化，配制成1 mg·mL-1的胶原乳剂。于大鼠尾根部皮下多点注射胶原乳剂0.5 mL，第7天再同法予胶原乳剂0.3 mL加强免疫。空白对照组在实验过程中不做任何处理。两组大鼠自由摄食、饮水，温度控制在18～22 ℃，湿度控制在65%～80%。
2.2 关节炎指数（AI） 致炎第7天按AI评分标准[6]评价关节炎程度，无关节红肿记0分，趾关节红肿记1分，趾关节和足跖肿胀记2分，踝关节以下的足爪肿胀记3分，踝关节在内的全部足爪肿胀记4分。每个关节最高分为4分，4个关节累计积分即为每只大鼠的AI。分别计算各组大鼠造模前及造模后7，14，21，28 d时的AI。28 d后断头处死大鼠取血，离心取上清，剥离双侧后膝关节滑膜用于实验指标检测。
2.3 足趾容积 造模第1天用大鼠足趾容积测量仪测量每组大鼠前后足趾容积，分别于第14，21，28天测量足趾容积，并做好记录。
2.4 关节滑膜病理切片 取双侧后膝关节滑膜及软骨，于质量分数4%多聚甲醛液固定，常规脱钙、脱水，石蜡包埋，切片后HE染色，在光学显微镜下观察关节滑膜及周围组织的病理变化。
2.5 血清IL-17检测 采用ELISA法，按照ELISA试剂盒说明书进行操作，先加入标准品和待测样品，设置阴性对照；37 ℃ 反应30 min温育，后洗板5次；加入酶标试剂，37 ℃ 反应，洗板5次；加入显色液A、B，37 ℃显色10 min，加入终止液，上酶标检测OD值（吸光度），重复3次，取平均值。
2.6 NF-κB检测 采用Western blot法，将关节滑膜组织低温匀浆后加蛋白裂解液，置冰上40 min，于4 ℃置12 000 r·min-1离心机离心10 min，取上清。以BSA为标准，用Bradford 法对上清进行蛋白定量。取20 μg蛋白样品，质量分数10% SDS-PAGE电泳，100 V转移1 h至硝酸纤维素薄膜，放入封闭液中37 ℃封闭1 h；一抗4 ℃过夜。用不含抗体TBS-T液孵育作为阴性对照。反复洗膜后，将膜与碱性磷酸酶（AP） 标记的抗IgG抗体孵育，室温轻摇1 h；洗膜后，用Western blot印迹观察，用图像分析测定各带吸光度（A）值作定量分析。NF-κB检测过程中，匀浆液中需加蛋白保护剂。
2.7 统计学方法 采用SPSS 16.0软件进行统计分析。计量资料以表示，两组间比较采用t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
3 结 果
3.1 两组一般情况 实验中，12只模型大鼠造模成功10只。模型对照组大鼠于免疫后第14天左右开始出现不同程度的关节红肿；随着免疫时间进
展，模型对照组大鼠关节肿胀程度逐渐加重，运动量明显减少，出现直立困难，活动障碍，毛发晦暗无泽，食欲减少，体质量减轻，至第28天关节肿胀程度达到高峰。见图1。
3.2 两组血清IL-17比较 ELISA结果显示，空白对照组IL-17为（19.54±5.76）ng·mL-1，模型对照组为（36.71±9.12）ng·mL-1，模型对照组大鼠血清IL-17表达高于空白对照组（P < 0.01）。
3.3 两组大鼠关节滑膜NF-κB/P65、NF-κB/P50、IκBα灰度值比较 免疫蛋白印迹结果分析显示，与空白对照组比较，模型对照组大鼠关节滑膜细胞NF-κB/P65、NF-κB/P50、IκBα灰度值明显升高
（P < 0.05或P < 0.01）。说明模型大鼠关节滑膜细胞NF-κB/P65、NF-κB/P50、IκBα的蛋白活性呈高表达。见表1。
表1 两组大鼠关节滑膜NF-κB/P65、NF-κB/P50、IκBα灰度值比较 组别动物数
（只）NF-κB/P65NF-κB/P50IκBα
空白对照组12 3.42±1.75 3.43±1.524.83±1.20
模型对照组10 6.45±2.671） 6.37±1.892）6.70±2.252）
注 与空白对照组比较，1）P < 0.05，2）P < 0.01
3.4 两组AI评分结果比较 模型对照组大鼠致炎后2周开始出现不同程度的关节红肿，4周后肿胀达高峰，部分关节变形。见表2。
3.5 两组各时间点足趾关节容积变化比较 随着免疫时间的延长，模型对照组大鼠足趾关节肿胀逐渐加重，足趾容积增加。见表3。
3.6 两组关节滑膜形态学变化比较 病理染色结果显示，空白对照组大鼠膝关节滑膜未见明显的血管扩张、增生及炎细胞浸润。模型对照组滑膜组织可见血管增生、滑膜增厚、炎细胞浸润、水肿，软组织增生。见图2。
4 讨 论
RA是一种多细胞因子参与的侵蚀性滑膜炎为特征的自身免疫性疾病，NF-κB信号通路在细胞因子的激活过程中起着“开关”作用。在静息状态下，NF-κB多以异源二聚体存在，并与抑制物IκB结合成三聚体以无活性方式存在于细胞质中。NF-κB的活化与调节是一个复杂而精细的过程。生理状态下NF-κB活化受到机体内在机制调控，参与多种生命过程。在哺乳动物细胞中最常见的是NF-κB p65与p50结合形成p65/p50二聚体，在静息状态下，胞浆中NF-κB与抑制蛋白IκB结合形成复合体，覆盖NF-κB核定位信号，使NF-κB锚定于胞质中，不能发挥基因转录调控作用。IκB亚基IκBα与NF-κB二聚体上的两个核定位序列中的一个结合，使非活性状态的NF-κB-IκBα进入细胞核。同时，IκBα蛋白氨基末端的出核信号（nuclear-export
signal，NES）使NF-κB-IκBα复合物移出胞核，NF-κB-IκBα复合物在核内与核外处于动态平衡中[7]。IκBα启动子上有一个NF-κB反应元件，对刺激比较敏感，能够快速被降解与再合成[8]；当细胞受到TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17等外源性刺激，IκB被降解，NF-κB异二聚体移位到胞核内，与DNA上的κB基序列相结合从而发挥转录调控作用。NF-κB参与炎症、免疫反应、细胞凋亡及细胞周期控制与分化，并在RA发病中起关键作用。RA滑膜细胞中TNF-α和IL-1β等通过一系列级联反应激活IKK激酶复合体。IκB在IKK激酶复合体作用下被降解，释放NF-κB，从而调控各种炎症介质基因（如TNF-α与IL-1β）的表达。炎症因子与活化的NF-κB形成正相调控循环，两者构成的正反馈机制使RA关节滑膜炎症反应和骨质破坏得以维持与进展[9-10]。研究表明，NF-κB在CIA大鼠滑膜组织中表达升高，且主要于细胞核中表达[11]。NF-κB的调控与活化在RA的病理变化中占有重要地位。本研究结果表明，NF-κB的活性在CIA大鼠关节致炎后明显增高，表明NF-κB参与CIA炎症的调控。
IL-17是一种前炎性促炎症细胞因子，主要由Thl7细胞产生，具有强大的募集和激活嗜中性粒细胞能力，能诱导活化T细胞和刺激成纤维细胞、巨噬细胞和上皮细胞产生多种促炎介质IL-1、IL-6、TNF-α、一氧化氮合酶2、IL-8、单核细胞趋化蛋白-1、生长调节因子等多种细胞因子，抑制软骨细胞合成基质，增强破骨细胞活性，最终导致骨侵蚀。IL-17主要通过其受体（IL-17R）特异性结合，发挥促炎症反应、免疫应答等多种功能。在RA的发病过程中，IL-17与其他细胞因子如IL-1、TNF-α等相互作用，导致RA病变进展[4]。本研究结果显示，CIA模型大鼠血清IL-17明显高于空白对照组，NF-κB的活性在CIA大鼠关节致炎后明显增高，其血清IL-17的表达升高，说明两者可能在RA的发生、发展中相互作用、相互调节，IκBα亦呈升高趋势。研究结果的可靠性尚需进一步验证。
5 参考文献
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胶原诱导性关节炎 篇5
关键词：金雀异黄素,滑膜微血管密度,基质金属蛋白酶
风湿性关节炎(RA)的主要病理特点是在炎性环境中受各种炎性细胞因子如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)和血管内皮生长因子(VEGF)的刺激,关节成纤维样滑膜细胞(FLS)显著增殖和微血管新生[1,2],并进一步产生基质金属蛋白酶(MMPs)、蛋白溶解酶类及前列腺素等物质,破坏关节软骨及骨结构,从而导致关节畸形及功能障碍[3]。如能在发病早期及时进行有效的干预,则对RA的病情控制具有重要意义。笔者前期工作发现,金雀异黄素(Gen)能够调节RA成纤维样滑膜细胞凋亡蛋白的表达,抑制其增殖,并能降低Ⅱ型胶原诱导型关节炎(CIA)大鼠成纤维样滑膜细胞分泌IL-1β、TNF-α等炎性细胞因子[4,5,6]。本研究应用体内实验进一步观察Gen对CIA大鼠发病的预防作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物
选用南京医科大学实验动物中心提供的雌性SD大鼠(清洁级),4周龄,体重为(120±20)g,动物许可证号:SCXK(苏)2007-0001。
1.2 实验材料
鸡Ⅱ型胶原、完全弗氏佐剂、二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司;DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司;Gen纯品(纯度≥99%)购于上海融禾医药科技发展有限公司;IL-1、TNF-α、VEGF、MMP-1、MMP-2、MMP-9抗体,辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗购于美国CST公司;其余试剂均为进口分装或市售分析纯。
1.3 药物的配制
参照文献[4]配制Ⅱ型胶原乳剂及Gen混悬液。
1.4 实验方法
1.4.1 动物模型的建立
1.4.1. 1 实验动物分组及处理
24只大鼠随机分成三组:空白对照组、模型对照组及Gen预防用药组,每组8只大鼠。Gen预防用药组大鼠在造模前1周开始每天胃内灌注Gen混悬液1 m L。空白对照组以及模型对照组大鼠每天灌注等量羧甲基纤维素钠。
1.4.1. 2 造模
模型对照组和Gen预防用药组大鼠左后足趾皮下注射0.1 m LⅡ型胶原乳剂,并于3周后在尾根部进行多点加强注射,空白对照组注射等量的注射用水。
1.4.2 动物模型的评价
关节炎指数(AI)评分及关节肿胀度测定,参照文献[4]。
1.4.3 免疫组化检测
在给药4周后处死所有大鼠,常规病理学及免疫组化法检测滑膜炎症及血管新生,参照文献[7]用Mouse Anti-CD31标记滑膜微血管,进行滑膜微血管密度(MVD)测定。
1.4.4 免疫印迹(Western blot)法检测
造模4周后处死大鼠,心脏采血5 m L,分离血清,参照文献[8]检测Gen预防性用药后CIA大鼠血清炎性因子(IL-1β、TNF-α)、血管新生相关调节因子(VEGF、MMP-1、MMP-2、MMP-9)表达的变化。每个实验样本重复3次。
1.5 统计学方法
采用SPSS 10.0统计学软件进行数据分析,计量资料数据用均数±标准差(±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠造模后一般情况
造模组大鼠造模后当天后肢注射部位开始出现肢体肿胀,随后发现对侧和前肢关节也出现了肿胀,以后肢关节肿胀更为明显,部分大鼠关节表面皮肤充血且有关节活动障碍。造模组大鼠与空白对照组大鼠相比,精神萎靡,进食减少,运动迟缓,体重增长减慢,毛发缺少光泽。
2.2 三组大鼠关节炎指数比较
AI评分结果显示,空白对照组大鼠无关节炎性反应,从造模后1周开始,模型对照组的AI评分均明显高于空白对照组(P<0.05);从第3周开始Gen预防用药组AI评分低于模型对照组(P<0.05),见图1。分析足肢肿胀程度结果发现,CIA大鼠关节肿胀于造模后开始增加,模型对照组于第3周达到高峰,Gen预防用药组于第2周达到高峰,以后逐渐降低。见图2。
与空白对照组比较,·P<0.05;与模型对照组比较,*P<0.05
2.3 各组大鼠血清中IL-1β、TNF-α表达比较
模型对照组大鼠IL-1β、TNF-α的表达均明显高于正常对照组(P<0.05),Gen预防用药组IL-1β、TNF-α的表达均明显低于模型对照组(P<0.05),但仍高于空白对照组大鼠(P<0.05)。见图3。
与空白对照组比较,*P<0.05;与模型对照组比较,·P<0.05
2.4 各组大鼠血清中VEGF表达比较
研究发现,与空白对照组相比,模型对照组大鼠VEGF表达明显升高(P<0.05),Gen能明显抑制CIA大鼠血清中VEGF表达(P<0.05),但仍高于空白对照组。见图4。
与空白对照组比较,*P<0.05;与模型对照组比较,·P<0.05
2.5 各组大鼠关节滑膜免疫组化结果及MVD比较
采用Mouse Anti-CD31标记关节滑膜组织中的内皮细胞,计数大鼠关节滑膜组织中单位密度的微血管数(图5~6)。统计结果显示,模型对照组大鼠关节滑膜中的微血管数目明显多于空白对照组(P<0.05);Gen预防用药组大鼠的关节滑膜微血管数目仍高于空白对照组,但明显低于模型对照组(P<0.05)。
与空白对照组比较,*P<0.05;与模型对照组比较,▲P<0.05
2.6 各组大鼠血清中MMP-1、MMP-2、MMP-9表达比较
研究发现,与空白对照组相比,模型对照组大鼠MMP-1、MMP-2、MMP-9的表达均明显升高(P<0.05);而Gen预防用药组大鼠血清中MMP-1、MMP-2、MMP-9的表达水平明显低于模型对照组,但仍高于空白对照组(P<0.05)。见图7。
3 讨论
Gen是大豆中生物活性最强的异黄酮之一,现已证实Gen可用于预防和治疗多种疾病[9,10,11,12]。TNF-α、IL-1β是RA发生的重要炎性细胞因子。TNF-α和IL-1β相互协同下促进RA关节滑膜组织增生;诱导关节成纤维样滑膜细胞和软骨细胞产生胶原酶和前列腺素E2;增加血管内皮细胞黏附分子表达,促使血管生成;影响糖蛋白的代谢,抑制骨形成,最终导致关节结构破坏[13]。本研究发现,模型对照组大鼠与空白对照组相比,其血清中IL-1β、TNF-α的表达明显增高(P<0.05);预防性给予Gen干预后,IL-1β、TNF-α表达明显降低,但并未恢复到正常水平,提示Gen能够通过部分调节CIA大鼠体内炎症因子的表达而预防RA的发病。
血管新生失去控制是RA滑膜增生以及关节软骨侵蚀的主要因素。研究表明,VEGF能促进新生血管的生成[14]。Yi等[15]研究证实,RA患者血清、关节滑膜组织和滑膜液中VEGF含量与疾病活动度具有相关性。RA病程中VEGF可诱导关节滑膜毛细血管内皮细胞增殖和迁移,引起关节滑膜血管新生及血管翳形成,并能通过增加毛细血管的通透性而促进炎性物质的渗出。新生血管形成的过程中首先是毛细血管内皮下基底膜被MMPs等物质降解,提示MMP-1、MMP-2、MMP-9在促进RA关节滑膜血管新生的过程中发挥重要作用[16,17,18]。关节滑液及滑膜组织中过量表达的MMP-1、MMP-2、MMP-9可通过降解关节软骨成分直接参与RA关节软骨基质的分解,最终导致骨结构破坏[19]。Sbardella等[20]研究表明,测定血清中MMPs含量可以间接反映关节滑液中MMPs的变化情况。本实验结果显示:Gen预防用药组大鼠滑膜组织中的MVD明显多于空白对照组(P<0.05),但与模型对照组比明显减少(P<0.05);Gen预防性干预后,可以明显抑制CIA大鼠血清中VEGF表达(P<0.05);且CIA大鼠血清中MMP-1、MMP-2、MMP-9表达水平明显减低(P<0.05)。这表明Gen可以通过下调CIA大鼠体内的VEGF、MMP-1、MMP-2、MMP-9的表达抑制关节滑膜血管新生,并可直接阻止关节软骨及骨的破坏以达到防止RA的发病的目的。
与空白对照组比较,*P<0.05;与模型对照组比较,·P<0.05
胶原诱导性关节炎 篇6
1 材料与方法
1.1 实验动物与主要试剂
1.1.1实验动物与分组
健康清洁级Wistar雄性大鼠60只,体重(120±15)g,由南京医科大学动物实验中心提供。实验过程中对动物的处置遵循中华人民共和国科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》。动物在实验前适应性喂养1周,每笼3只,动物房温度在23~25℃,湿度在40%~60%,12 h明暗交替。采用完全随机法,随机取16只分为正常组,anti-IL-22-对照组,其余大鼠采用Ⅱ型胶原和弗氏不完全佐剂制备RA模型,将造模成功的16只大鼠随机分为RA组,anti-IL-22-RA组。
1.1.2主要试剂
DMEM培养基及胎牛血清(FetalBovine Serum,FBS)购自Gibco公司,ELISA试剂盒(R&D公司),流式抗体CD4PECy5、IFN-γFITC、IL-17PE及IL-22APC(BD公司),IL-22、U6、GAPDH及STAT3引物购自上海吉玛生物技术有限公司,Trizol(Invotrogen公司),Real-time PCR试剂盒(ROCHE公司),anti IL-22封闭抗体、抗IL-22抗体及抗STAT3抗体(Abcam公司),抗β-actin抗体(Santa Cruz公司),羊抗兔二抗(Santa Cruz公司),CCK-8购自上海博谷生物科技有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1动物模型制备
取适量Ⅱ型胶原溶于0.1 mol/L的乙酸溶液中,使其最终浓度为2 mg/ml,放置于4℃冰箱中摇晃过夜,次日与等量的弗氏不完全佐剂于冰上充分乳化,达到油包水状态则为乳化完全。于大鼠左后跖底部注射0.2 ml/只的乳剂,7 d之后在尾根追0.2 ml/只,进而诱发类风湿性关节炎模型[5]。模型成功的标准为大鼠食量减少,毛色略黄无光泽,行动迟缓,体重减轻,足爪红肿,足垫增厚,不能负重,甚至出现跛行。
1.2.2大鼠滑膜R AFLS细胞培养
引颈处死大鼠,无菌条件下取滑膜组织,采用HBSS液反复漂洗组织块3次后剪成约1~2 mm3小块。组织块贴壁培养,待滑膜FLS长出后,胰蛋白酶消化细胞传代培养。采用生长状态良好的第3~5代细胞进行实验。
1.2.3流式细胞术检测大鼠全血中Th22细胞
取新鲜采集的大鼠肝素抗凝的外周血5 ml,制备成单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),将PBMC分别用PBS缓冲液洗1遍并重悬于100μl PBS缓冲液中,加入CD4-PECY5(0.2 mg/ml)、IL-17-PE(0.2 mg/ml)和IL-22-APC(0.25 mg/ml)抗体,4度避光孵育30 min,PBS洗2遍以及,上机检测(BD FACS Calubur),Th22细胞表现为CD4+IL-17-IL-22+细胞群。
1.2.4 R eal-time PCR检测IL-22 m R N A表达水平
新鲜采集的大鼠外周血2 ml,静置6 h后,离心取上清,依照产品说明书,以U6作为内参,检测IL-22 mR NA的表达水平。IL-22引物:正向5'-CGATTGGGGAACTGGACCTG-3',反向5'-GGACGTTAGCTTCTCACTTT-3'。
1.2.5 ELISA检测IL-22蛋白表达水平
取新鲜采集的大鼠外周血2 ml,静置6 h后,离心提取上清液,依照产品说明书,ELISA试剂检测IL-22蛋白表达水平。
1.2.6 CCK-8实验检测R AFLS细胞增殖
将对数生长期的RAFLS细胞以50%的融合率接种至96孔板,每组设置3个复孔,同时设置不含细胞的空白培养基作为对照组,37℃,5%二氧化碳CO2,95%湿度下培养24 h后,分别在培养孔加入10μL CCK-8溶液;孵育2 h,酶标仪检测450 nm的吸光值,每孔实测光密度(optical density,OD)值需减去空白对照组OD值,取3复孔平均值,记录OD值。
1.2.7 R eal-time PCR检测STAT3 m R N A表达水平
将培养至对数生长期的大鼠RAFLS细胞,用Trizol提取各组总RNA,反转录为cD NA,依照产品说明书,以U6作为内参,检测STAT3 mR NA的表达水平。Stat3引物:正向5'-GGAGGAGGCATTCGGAAAGTA-3',反向5'-CTGCAGGTCGTTGGTGTCAC-3'。
1.2.8 Western blot检测STAT3蛋白表达水平
大鼠RAFLS细胞培养至对数生长期,按照蛋白抽提步骤,提取总蛋白;采用BCA法测定总蛋白浓度,经SDS-PAGE电泳后转移到NC膜上,5%脱脂奶粉室温封闭1.5 h,TBST洗涤后,分别加入1∶1 000抗STAT3抗体、1∶500抗β-actin抗体,4℃孵育过夜,TBST洗涤后加入1∶5 000辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗,37℃孵育1 h,再用TBST洗涤,化学发光并曝光成像。Weastern blot检测以β-actin条带作为内参,STAT3条带与其比较,观察STAT3蛋白表达变化。
1.3 统计学方法
采用SPSS 19.0 统计软件进行数据分析, 计量资料用均数±标准差( ±s) 表示,两组间差异比较用Student’s t检验,P <0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 流式细胞术检测大鼠全血中Th22 细胞
Th22 细胞在RA大鼠全血中表达显著高于正常大鼠,差异有统计学意义( P <0.01) ,见图1。
2.2 检测血清中IL-22 m RNA和蛋白表达水平
IL- 22 m RNA细胞在RA大鼠血清中表达显著高于正常大鼠,具有统计学意义( P <0.01) ;蛋白水平表达同样显著高于正常大鼠,具有统计学意义( P <0.01) 。 此外,与RA组比较,IL- 22 的中和抗体后能够显著抑制RA小鼠体内IL- 22 的蛋白水平。 同时注射IL- 22 的中和抗体亦减低RA小鼠的IL- 22m RNA水平, 可能是体内注射IL- 22 中和抗体后可以通过影响其他一系列的复杂机制来调节的IL- 22的m RNA表达情况。 见图2。
2.3 RAFLS细胞增殖实验
RA大鼠注射IL- 22 封闭抗体后,与未注射封闭抗体的RA大鼠比较,RAFLS细胞的增殖能力明显下降,差异有统计学意义( P <0.01) ,见图3。
2.4 Real-time PCR检测STAT3 m RNA表达水平
RA大鼠注射IL- 22 封闭抗体后,与未注射封闭抗体的RA大鼠比较,STAT3 m RNA的表达明显下降,差异有统计学意义( P <0.01) ,见图4。
2.5 Western blot检测STAT3 蛋白表达水平
RA大鼠注射IL- 22 封闭抗体后,与未注射封闭抗体的RA大鼠比较,STAT3 蛋白表达显著下降( 见图5) ,差异有统计学意义( P <0.01) 。
3 讨论
类风湿性关节炎( RA) 是以对称性多关节滑膜炎症为主的慢性自身免疫性疾病,能引起软骨破坏,关节间隙变窄,晚期可出现关节畸形,致残率很高。除了关节炎症的表现外,RA还可能出现广泛的全身性病变,如发热、乏力、体重下降、心包炎、胸膜炎及周围神经病变等[6]。 RA在全球都有发病,发病率平均为1%,我国的发病率为1.3%~1.4%,如果不及时诊治,70%的患者2 年后可能发生不同程度的残疾,平均寿命缩短10~15 年。 目前,RA的治疗以主要是以甲氨蝶呤为基础的早期联合用药, 但这只能缓解RA的症状,不能从根本上治愈疾病,且长期使用副作用较大。 近年来,临床上应用以TNF- α 为靶向的生物治疗,但效果一般,且价格昂贵[7]。 RA发病机制尚未明确, 故深入研究RA的发病机制对RA治疗至关重要。
Th22 细胞是新近发现的一类独立于Th1、Th2和Th17 细胞的CD4+T淋巴细胞亚群, 以高水平分泌IL- 22 为特点, 是一个终末分化且独立稳定的谱系[8,9],其功能主要通过IL- 22 来实现。 Th22 细胞参与了炎症反应、 自身免疫性疾病、 肿瘤等的发生发展,在机体免疫调节、宿主防御及组织修复中发挥重要作用。 有研究表明,在RA患者的外周血中,IL- 22高表达[10]。 本研究运用胶原诱导的大鼠关节炎模型发现,RA大鼠模型全血中Th22 细胞的表达明显高与正常大鼠, 血清IL- 22 基因和蛋白水平的表达同样明显高于正常大鼠,说明在Th22 和IL- 22 参与了RA大鼠的发病。 RA发病机制中FLS起关键作用。增生的FLS释放细胞因子和趋化因子, 如IL- 6、IL- 8、IL- 15 及基质细胞起源因子SDF- 1 等,这些小分子进一步促进了滑膜中白细胞由血管内向滑膜的迁入、活化。 FLS增强了针对关节软骨降解生成特异抗原的免疫应答, 促进了SDF- 1 和其他内皮细胞生长因子,包括成纤维细胞生长因子介导的血管再生[11]。 当RA大鼠体内IL- 22 被封闭抗体中和后,RAFLS细胞的增殖显著降低, 说明Th22 和IL- 22 通过影响RAFLS细胞增殖,参与RA的发病。JAK2- Stat3 信号分子是调控细胞增殖分化重要的细胞内信号通路,JAK2 作为上游激酶, 其活化后可以募集胞质中无活性的Stat3 分子,使其酪氨酸磷酸化而形成有活性的二聚体, 进而转移入细胞核, 结合DNA,导致特定靶基因的开启[12,13]。 当RA大鼠体内IL- 22 被封闭抗体中和后,RAFLS细胞中STAT3 不管基因水平还是蛋白水平, 表达都是降低的, 提示Th22 和IL- 22 通过STAT3 信号途径, 影响RAFLS细胞增殖。 这与Lerman等人的研究是一致的[14]。
综上所述,Th22 细胞作为一种以分泌细胞因子IL- 22 为特征的新型辅助性T细胞, 在RA大鼠模型中,通过IL- 22 影响STAT3 信号途径,从而影响RAFLS细胞的增殖,参与大鼠RA的发病。 这为RA的生物靶点治疗提供了理论参考依据。
摘要：目的 探讨胶原诱导的大鼠类风湿性关节炎(RA)模型中,Th22和白细胞介素-22(IL-22)的水平及其可能的机制。方法 构建胶原诱导的大鼠RA模型后,流式细胞术检测Th22细胞,Real-time PCR检测IL-22 m R N A表达水平,ELISA检测IL-22蛋白表达水平;用IL-22封闭抗体中和R A大鼠体内IL-22后,CCK-8实验检测R AFLS细胞增殖,R eal-time PCR检测IL-22和STAT3 m R N A表达水平,Western blot检测STAT3蛋白表达水平。结果 与对照组比较,RA大鼠全血中的Th22细胞和血清IL-22的表达显著增加(P<0.01);用IL-22封闭抗体中和R A大鼠体内IL-22后,与对照组比较,R A大鼠血清IL-22显著下降(P<0.01),R AFLS细胞增殖能力下降(P<0.01),R AFLS细胞中STAT3基因和蛋白水平的表达显著较少(P<0.01)。结论R A大鼠模型中,Th22细胞通过分泌过多的IL-22刺激STAT3信号途径,从而提升R AFLS细胞的增殖能力,参与大鼠RA的发病。