纤维胶原蛋白

纤维胶原蛋白（精选8篇）

纤维胶原蛋白 篇1

摘要：将有机膦FP作为交联剂,采用胶原蛋白改性超细纤维合成革基布,通过蒸馏水、丙酮溶液和稀碱溶液对改性产物进行洗涤,采用恒重法定量分析胶原蛋白对基布的作用方式,根据SEM、AFM、DSC和接触角检测结果,综合考察胶原蛋白对基布的作用机理。结果表明:改性体系pH值为4.0和7.0时,胶原蛋白对超细纤维合成革基布的作用方式均主要是共价键的结合方式,其次是物理吸附沉积方式,最后有少量胶原蛋白以氢键和电价键方式进行结合,且改性体系的pH对其作用方式影响较小。通过对比未改性基布与改性基布洗涤前后的表面形貌、表面粗糙程度、热稳定性能以及润湿性,发现洗涤对改性基布的卫生性能有一定的影响,但洗涤后基布的卫生性能较未改性基布仍有明显改善。

关键词：胶原蛋白,超细纤维合成革基布,作用方式

前言

超细纤维合成革是以聚酰胺超细纤维和高性能聚氨酯复合而成的高档合成革,其外观和性能与天然皮革相似,物理机械性能甚至优于天然皮革,但聚酰胺超细纤维含有的活性基团少[1,2,3],使得水汽在纤维与外界之间不能有效地传递和吸收,基布染色主要依靠染料自身的沉积作用物理结合使纤维上色,所以超细纤维合成革的卫生性能和染色性能较差[4,5,6,7,8]。胶原蛋白分子是由三螺旋链组成的,分子上除了含有侧链羧基之外,还含有侧链氨基和主链氨基等,故其溶液能够显示出两性聚合物的性能,生物相容性、亲水性以及降解性能良好[9,10,11]。

将废弃皮革屑中提取的明胶进行酶水解,将得到的胶原蛋白接枝到硫酸处理后的超细纤维合成革基布上,可以增加基布的活性基团,改善其卫生性能和染色性能,同时实现废弃皮革屑的资源化利用。对超细纤维合成革基布进行化学交联改性,胶原蛋白会以共价键交联、物理沉积吸附、氢键以及电价键等不同的方式结合到基布上[12],进而改善基布的相关性能。

本研究采用有机膦FP交联胶原蛋白改性超细纤维合成革基布,通过洗涤试验对胶原蛋白与基布的作用方式进行定量分析,并结合相关的仪器检测结果综合探讨其作用机理。

1 试验部分

1.1 试验试剂及仪器

明胶、碱性蛋白酶、超细纤维合成革基布、有机膦FP等见参考文献[13];

水杨醛,AR,国药集团化学试剂有限公司;

吡啶、丙酮,AR,天津市科密欧化学试剂有限公司;

碳酸钠,AR,福晨化学试剂厂;

其它常规试剂(略)。

不锈钢控温试验转鼓、电子天平等见参考文献[13];

其它常规仪器设备(略)。

1.2 试验方法

1.2.1 胶原蛋白的制备

胶原蛋白的制备方法及相关检测表征见参考文献[13]。

1.2.2 胶原蛋白对超细纤维合成革基布的交联改性

采用浓硫酸预处理超细纤维合成革基布后,对其进行胶原蛋白改性,改性方法为有机膦FP先与基布进行充分的交联反应,再加入胶原蛋白进行改性,水洗、晾干,有机膦FP和胶原蛋白的用量根据预处理基布表面的氨基含量和胶原蛋白的氨基含量来确定。本研究采用的改性方法参见文献[13]。

预处理条件:液比5 000%,温度50℃,时间4h,硫酸用量15%;

改性条件:液比3 000%,温度35℃,时间5h,胶原蛋白用量18%,有机膦FP用量9%。

本研究分别控制改性体系pH值为4.0和7.0,对基布进行胶原蛋白改性,然后充分洗涤改性产物,并探讨其作用机理。

1.2.3 洗涤试验

在选定的改性工艺条件下,采用胶原蛋白改性超细纤维合成革基布得到改性基布试样,然后将其分为大致相同的3块,依次编号为1#、2#、3#。1#为改性基布的空白对照;2#首先经过蒸馏水洗涤3次,20min/次,洗涤后试样记为2#1,再通过丙酮溶液(丙酮:水=1:1)对试样2#1洗涤3次,20min/次,洗涤后试样记为2#2,最后采用稀碱溶液(0.5%Na2CO3溶液)对试样2#2洗涤3次,20min/次,洗涤完成后试样记为2#3;3#选用自来水作为介质进行空白处理,作为2#的机械作用对比试样,然后测定试样1#、2#1、2#2、2#3、3#和未改性基布试样0#的透水汽性和吸水性[14],并计算洗涤后改性基布相关性能的降低率。其计算公式如下:

其中:w—洗涤前后改性基布性能的降低率;

W—洗涤前改性基布的性能;

V—洗涤后改性基布的性能。

1.3 检测与表征

(1)取未改性基布试样和改性基布洗涤前后的试样,将其置于冰箱内冷冻24h,取出后立即切取薄片置于载玻片上,然后对其进行喷金,借助日本TM-1000型扫描电子显微镜观察基布试样的表面形貌。

(2)将未改性基布试样和改性基布洗涤前后的试样置于100℃的真空干燥箱中烘至恒重,借助日本SPI3800N/SPA400型原子力显微镜,对其表面粗糙程度进行观察。

(3)运用差示扫描量热法使样品处于程序控制温度下,在氮气保护条件下,以10℃/min的升温速率、20mL/min的流量,于30～500℃范围内借助德国STA 409PG型综合热分析仪,对试样进行检测分析,观察试样和参比物之间热流差随温度的变化,对比未改性基布试样及改性基布洗涤前后试样DSC曲线的不同。

(4)将未改性基布试样和改性基布洗涤前后的试样置于100℃的真空干燥箱中烘至恒重,剪取小样贴于载玻片上,用玻璃棒反复碾滚至相对平整,然后借助德国OCA 20型接触角测定仪,对基布试样的润湿性能进行检测。

2 结果与讨论

2.1 基布试样的透水汽性和吸水性

通过有机膦FP交联胶原蛋白对超细纤维合成革基布进行改性,其相互作用主要是指有机膦FP中的羟甲基和胶原蛋白的氨基形成共价交联的过程,如图1所示[13],胶原蛋白的氨基是羟甲基的主要交联点。有机膦盐具有较强的还原性,氧化易变成三羟甲基氧化膦,故真正起到交联作用的是三羟甲基氧化膦。体系pH对羟甲基与氨基的反应有一定的影响[15],通过前期工艺条件优化的研究发现:有机膦FP交联的最佳pH值为5.5,当pH<5.5时,交联程度随着pH的升高而逐渐增加,当pH>5.5时,其交联程度不再变化明显。因此,本研究分别选用改性体系pH值为4.0和7.0时所得的改性产物,对其进行相同的洗涤处理,分析胶原蛋白与基布氨基的结合方式,进而探讨胶原蛋白对基布的作用机理。

聚酰胺超细纤维合成革基布中含有大量的酰胺基(—CO—NH—)和部分的端羧基(—COOH)和端胺基(一NH2),采用有机膦FP交联胶原蛋白改性基布后,通过蒸馏水洗涤可以除去与基布酰胺基以物理吸附形式结合的胶原蛋白,通过丙酮溶液洗涤,可以除去与基布酰胺基以氢键形式结合的胶原蛋白,通过稀碱溶液洗涤,可以除去与基布酰胺基以电价键形式结合的胶原蛋白,所有洗涤后剩余的结合量,即为与酰胺基以共价键形式结合的胶原蛋白[16,17,18]。

表1、表2分别为改性体系pH值为4.0和7.0时,未改性基布、改性基布、改性基布蒸馏水洗涤、丙酮溶液洗涤和稀碱溶液洗涤以及空白试样的透水汽性和吸水性。由表1可见,体系pH值为4.0时,胶原蛋白改性基布分别经过蒸馏水、丙酮溶液和稀碱溶液洗涤后,透水汽性依次降低了14.36%、3.54%和5.63%,吸水性分别降低了6.95%、2.42%和5.44%;改性基布依次通过蒸馏水、丙酮溶液及稀碱溶液洗涤后,基布的透水汽性和吸水性均有所降低,但明显高于未改性基布,且与3#试样相比较,可以发现机械作用对其性能的影响并不明显。

由表2可见:体系pH值为7.0时,改性基布经过蒸馏水、丙酮溶液和稀碱溶液洗涤后,透水汽性分别降低了13.01%、3.81%和5.16%,吸水性分别降低了7.99%、2.37%和4.73%。改性基布经过所有洗涤后,其透水汽性和吸水性均有所降低,但仍明显高于未改性基布的性能,而导致该洗涤基布性能提高的原因,就是基布上以共价键形式结合了胶原蛋白,这就说明胶原蛋白改性对超细纤维合成革基布的卫生性能,有持久的改善作用。

综合表1和表2的分析可知:改性基布首先经过蒸馏水洗涤后,其透水汽性和吸水性下降较为明显,再经过丙酮溶液和稀碱溶液洗涤,也均会使其性能有所下降,但并不明显,而且洗涤后基布的透水汽性和吸水性较未改性基布仍能够明显改善。这就说明胶原蛋白改性聚酰胺超细纤维合成革基布,主要是以共价键交联方式结合的,其次是以物理吸附沉积的方式结合的,最后还有少量胶原蛋白是以氢键和电价键的方式结合的,而且改性体系的pH值对胶原蛋白与基布的作用方式影响不明显。

2.2 基布试样的SEM对比

图2(a)、(b)和(c)为未改性基布、改性基布及洗涤基布放大1 000倍的SEM对比图。由图可见,未改性基布的纤维束编织较紧密,胶原蛋白改性后基布的纤维束分散程度明显增大,而经过各种方式洗涤后,基布的纤维束松散程度略有所降低,但仍明显高于未改性基布。因为改性后胶原蛋白可以通过共价交联渗透于基布内部纤维上,填充于纤维束之间,进而使得基布纤维变得明显松散,促进水汽在纤维与外界之间的吸收与传递;而蒸馏水洗涤、丙酮溶液洗涤和稀碱溶液洗涤,依次除去了物理沉积吸附、氢键和电价键结合的胶原蛋白,使得填充于基布纤维上的胶原蛋白有所减少,基布的松散程度也会适当降低。可见,胶原蛋白能够通过共价交联接枝到超细纤维合成革基布上,且其改性对基布卫生性能的改善作用具有持久性。

2.3 基布试样的AFM对比

图3(a)、(b)和(c)分别为未改性基布、改性基布及洗涤基布的AFM对比图。AFM三维等高图可以反映纤维表面形貌高度特征,根据其高度数据可以直接评价纤维表面的粗糙程度[19]。由图可见,未改性基布表面高低不平整,相对平均粗糙度Ra为22.70nm;胶原蛋白改性基布表面变得较为平整,相对平均粗糙度明显降低,Ra为6.612nm;而洗涤后基布上交联的胶原蛋白有所减少,使其表面变得有些粗糙,Ra增加为8.248nm。因为硫酸水解会腐蚀基布,使其表面的平均粗糙度较大;改性基布表面纤维结合了大量分布均匀的胶原蛋白,使其能够填充于纤维之间,进而降低其表面粗糙度;而洗涤过程能够除去基布上填充吸附的胶原蛋白,使得基布表面粗糙度相对变大,但仍然明显低于未改性基布表面的粗糙度。由此可见,胶原蛋白分子能够共价交联于基布上,进而使得其表面能够相对平整。

2.4 基布试样的DSC曲线

图4 (a)、(b)和(c)分别为未改性基布、改性基布及洗涤基布的DSC检测图。由图可见,未改性基布的DSC曲线峰值为221.2℃和408.7℃,改性基布结合了大量的胶原蛋白,使其热稳定性能有所降低,其DSC曲线峰值变为220.0℃和406.8℃,而洗涤基布上只有以共价键交联的胶原蛋白,对基布热稳定性能的影响减小,其DSC曲线峰值为220.3℃和407.1℃。因为胶原蛋白具有与基布不同的热稳定性能,将其加入到基布上会影响基布本身的热稳定性能;而洗涤可以除去基布上结合的部分胶原蛋白,使得改性对基布的影响适当减小。通过对比改性前后基布试样DSC曲线峰值对应的温度,可以发现胶原蛋白改性基布的DSC曲线峰值对应的温度略有降低,这就说明胶原蛋白与基布的相互作用力较弱,交联改性作用会使基布的热分解温度略有降低,其热稳定性能变差,而洗涤后基布的热稳定性能会有所上升,但仍然略低于未改性基布的热稳定性能。

2.5 基布试样的接触角检测

图5(a)、(b)和(c)分别为未改性基布、改性基布及洗涤基布的接触角测试图。接触角是指在气、液、固三相交点处所作的气-液界面的切线,穿过液体与固-液交界线之间的夹角,是润湿程度的量度。当夹角小于90°时,固体表面就是亲水性的,即液体较易润湿固体,其角越小,表示固体的润湿性越好。由图可见,未改性基布的接触角较大,其夹角达101.6°,润湿性较差;改性基布的接触角明显减小,夹角只有43.7°,基布的润湿性明显改善;而洗涤基布的接触角略有增加,但仍明显小于未改性基布的接触角。因为交联改性可以在基布上引入胶原蛋白所含的羧基和氨基等亲水基团,改变了基布的表面张力,使其润湿性提高;而洗涤除去了部分胶原蛋白,使接枝到基布上的活性基团变少,其接触角也略有增加。这就表明胶原蛋白改性,可以明显改善超细纤维合成革基布的润湿性,且其改善作用是持久有效的。

3 结论

(1)采用有机膦FP作为交联剂,对超细纤维合成革基布进行胶原蛋白改性,可以明显改善基布的透水汽性和吸水性,且其改善作用具有持久性。

(2)通过蒸馏水、丙酮溶液和稀碱溶液的洗涤试验表明:胶原蛋白改性超细纤维合成革基布主要是以共价键交联方式结合的,其次是以物理吸附沉积方式结合的,只有少量胶原蛋白是以氢键和电价键方式结合的。

(3)通过对比基布的SEM、AFM、DSC和接触角检测结果可知,采用FP交联胶原蛋白改性超细纤维合成革基布,可以持久地增大基布纤维束的松散程度、降低基布表面的平均粗糙程度和基布的热稳定性能,提高基布的润湿性,这也说明了胶原蛋白与超细纤维合成革基布,确实发生了共价交联作用。

纤维胶原蛋白 篇2

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纤维胶原蛋白 篇3

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小鼠胚胎成纤维细胞 (NIH3T3) 购于中国典型培养物保藏中心;DMEM培养基购于Hyclone公司;新鲜特等优质胎牛血清 (FBS) 购自杭州四季青公司;重组ADAMTS-1 购自Abcam公司;RNA提取试剂盒购于康为世纪;逆转录试剂盒、c DNA合成试剂盒购于Fermants公司;Ⅰ型胶原蛋白抗体由广州威佳科技有限公司提供试用装;TGF-β 单克隆抗体及HRP- 标记的羊抗兔二抗购自康为世纪;BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIPA裂解液、PMSF购于碧云天生物技术研究所。

1.2 实验方法

1.2.1 NIH3T3的体外培养和分组

NIH3T3用含10%胎牛血清的DMEM在5%二氧化碳 (CO2) 、37℃下恒温培养, 0.25%胰蛋白酶消化、传代;将细胞均匀接种在6孔板上, 待细胞亚融合后改用无血清的DMEM培养液同步化饥饿12 h, 依实验要求共分正常对照组、低浓度组 (1 nmol) 、中浓度组 (10 nmol) 和高浓度组 (20 nmol) 4组, 每组10个样本。刺激24 h后检测COL1、TGF-β1水平, 实验重复3次。

1.2.2 RT-PCR

各组采用试剂盒法提取总RNA, 每10 cm2加入1 mL Buffer RLT, 裂解, 室温下5min;以每1 mL Buffer RLT加入200μL氯仿摇匀, 室温下2 min, 4℃离心12 000 r/min 10 min;取上清液移至新EP管, 加入等体积的70%乙醇;将液体移入装有收集管的吸附柱中, 4℃离心12 000 r/min, 20s;加入700μL Buffer RW1, 4℃离心12 000 r/min, 20s;加入500μL Buffer RW2, 4℃离心12 000r/min, 2 min, 吸附柱室温晾干, 置去酶离心管中, 加入30μL RNase-Free water, 4℃离心12 000 r/min, 1 min, 收集RNA溶液。用核酸蛋白分析仪鉴定RNA纯度和量, 所用RNA的OD260/OD280均在1.8~2.0之间, 表示样品为纯RNA。获得的RNA按逆转录试剂盒说明书进行操作, 加入总RNA 5μL、Primer oligo1μL、DEPC处理的水6μL、5×buffer 4μL、Ribolock Rnase inhibitor 1μL、10 mmol dNTP mix 2μL、M-Mu LV 1μL, 70℃5 min, 42℃60 min, 70℃5 min, 合成cDNA。产物置于-70℃保存, 以备PCR扩增。引物均由上海生物工程技术有限公司合成。总反应体系为20μL。目的基因COL1上游引物:5'-GACAGACTGGCAACCTCAAGAA-3', 下游引物:5'-GGATGGAGGGAGTTTACACGAA-3', 产物长度273 bp。反应条件:94℃预变性2 min, 94℃变性20 s, 56.8℃退火1min, 72℃延长30 s, 循环30次, 最后72℃延伸10min。目的基因TGF-β1上游引物:5'-GACCGCAACAACGCAATCTATG-3', 下游引物:5'-TATTCCGTCTCCTTGGTTCAGC-3', 产物长度300 bp。反应条件:94℃预变性3 min, 94℃变性30 s, 54℃退火30 s, 72℃延长1 min, 循环30次, 最后72℃延伸5 min。内参β-actin上游引物:5'-TGTCCCTGTATGCCTCTGGT-3', 下游引物:5'-GGTCTTTACGGATGTCAACG-3', 产物长度459 bp。在相同的条件下同管扩增β-actin。扩增结束后, 各组PCR产物取5μL进行琼脂糖凝胶电泳, EB染色, Alpha Imager 3400凝胶成像分析系统成像, Photoshop CS5软件测定各组吸光灰度值, 计算目的/内参灰度比值。

1.2.3 Western blotting

按实验分组条件处理后, 收集细胞, 用预冷PBS洗涤3次, 加入细胞蛋白裂解液100μL, 冰浴裂解30min, 4℃离心20000r/min, 15 min, 收集上清液。BCA蛋白定量法测定蛋白含量。波长490 nm处紫外分光光度计测吸光度, 以﹝ (样本孔OD值-对照孔OD值) ×1893.021-42.306﹞×10-3计算各样本蛋白含量。测得蛋白含量最低的样品加20μL, 再根据蛋白量相等原则计算出其他样品上样量, 用去离子水将总体积补足至20μL, 移至EP管中, 加入适量体积的5×上样缓冲液, 100℃变性5~10min, 然后进行10%SDS-PAGE电泳, PVDF膜转印2 h, 行Western blotting检测。以5%脱脂奶粉封闭2 h, 分别加入一抗 (1︰100, 1︰750) 4℃过夜, 孵育二抗 (1∶1 000) 1 h, 采用ECL显色法显色;凝胶成像系统扫描分析, Photoshop CS 5.0软件测定各组灰度值, 以COL1/APDH、TGF-β1/GAPDH显影条带灰度值的比值表示COL1、TGF-β1的相对蛋白含量。实验重复3次。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0 软件进行统计学分析, 所有实验数据以均数±标准差 (±s) 表示, 组间比较用单因素方差分析, P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ADAMTS-1 对Ⅰ型胶原蛋白的影响

RT-PCR及Western blotting结果显示, 加入ADAMTS-1 刺激后COL1 m RNA水平及蛋白水平均降低, 并且随着ADAMTS-1 浓度升高, 成纤维细胞中COL1 m RNA水平、蛋白水平也逐渐降低, 见图1。

2.2 ADAMTS-1 对TGF-β 的影响

RT-PCR及Western blotting结果显示, 加入ADAMTS-1 刺激后TGF-β m RNA水平及蛋白水平均降低, 并且随着ADAMTS-1 浓度升高, 成纤维细胞中TGF-β m RNA水平、蛋白水平也逐渐降低, 见图2。

A:COL1的RT-PCR结果以及关于COL1与β-actin灰度比的统计条图;B:COL1的Western blotting结果以及关于COL1与GAPDH灰度比的统计条图。1) 与对照组比较, P<0.05;2) 与低浓度组比较, P<0.05;3) 与中浓度比较, P<0.05

A：TGF-β 的 RT-PCR 结果以及关于 TGF-β 与 β-actin 灰度比的统计条图；B：TGF-β 的 Western blotting 结果以及关于 TGF-β与 GAPDH 灰度比的统计条图。1）与对照组比较，P <0.05；2）与低浓度组比较，P <0.05；3）与中浓度比较，P <0.05

3 讨论

近20 余年来, 肺纤维化的发病率和死亡率在世界各地均呈上升趋势, 国外报道, IPF的发病率约为14~43 人/10 万, 确诊后中位生存期3~5 年, 严重危害人类健康[4]。该病的形成机制复杂, 尚不完全清楚, 临床上缺乏有效的治疗手段。历来应用皮质类固醇和环磷酰胺、硫唑嘌呤等免疫抑制剂及秋水仙碱等抗纤维化制剂治疗, 但疗效欠佳。因此, 研究该病的发病机制, 阐明其病理生理过程, 寻找有效的治疗药物和靶点成为目前国内外学者研究的热点。以往都致力于致肺纤维化因子的研究, 很少对拮抗纤维化的因子进行探讨。

ADAMTS-1 意为含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶, 是继基质金属蛋白酶MMP后新发现的一类Zn2+依赖的分泌型金属蛋白酶, 是ADAMTS家族的第一个成员, 1997 年由KUNO等人[5]在小鼠结肠癌基因差异显示和筛选中发现并命名, 在哺乳动物组织中广泛表达, 可由巨噬细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞等多种细胞合成和分泌。与多种疾病有关, 如肿瘤浸润[6]、动脉粥样硬化[7]、椎间盘退变[8]、哮喘[9]、关节炎[10]等。郭春艳[11]通过动物实验发现ADAMTS-1 与心肌纤维化密切相关, 本课题组肖兴洲等人[3]也发现在肺纤维化大鼠肺部组织中ADAMTS-1 的表达降低, 推测ADAMTS-1具有抗纤维化作用。

从本实验检测各组COL1 m RNA及蛋白表达的结果来看, 对照组COL1 的表达较各ADAMTS-1 浓度组高, 并且ADAMTS-1 浓度越高, COL1 表达越低。该结果说明ADAMTS-1 可以降低成纤维细胞内Ⅰ型胶原蛋白的表达。

细胞外基质包括Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、纤连蛋白和蛋白多糖。肺纤维化是各种致纤维化因素和抗纤维化因素之间的平衡被打破, 细胞外基质积聚, 最后疤痕组织形成的结果。所以, ADAMTS-1 通过降低Ⅰ型胶原蛋白可能具有一定的抗纤维化作用。

纤维化的重要调节因子包括:细胞因子 (IL-13、IL-21 和TGF-β1) 、趋化因子 (MCP-1 和MIP-1β) 、血管生成因子 (VEGF) 、生长因子 (PDGF) 、过氧化物酶体增殖物激活受体 (PPARs) 、急性期蛋白 (SAP) 、半胱氨酸蛋白酶、肾素- 血管紧张素- 固酮系统 (血管紧张素Ⅱ) 。在众多调节因子中, TGF-β1是公认的最重要的调控因子, 是诱导器官纤维化的总开关。在组织损伤或炎症时, TGF-β1促进成纤维细胞分化成肌成纤维细胞, 肌成纤维细胞表达 α- 平滑肌肌动蛋白 (α-SMA) 、钙调蛋白和细胞外基质, 促使细胞外基质过度积聚, 疤痕形成, 导致纤维化。本实验检测TGF-β1m RNA及蛋白的表达发现, 各ADAMTS-1 浓度组TGF-β1的表达较对照组低, 并且ADAMTS-1 浓度越高, TGF-β1的表达越低。证明ADAMTS-1 能够降低成纤维细胞内TGF-β1的表达。ADAMTS-1 降低Ⅰ型胶原蛋白, 下调TGF-β1可能是其潜在机制。

TGF-β1可由各种细胞合成, 以转化生长因子-转化生长因子结合蛋白复合体的形式分泌。在纤维蛋白溶酶、活性氧、血小板反应素-1 和酸性物质蛋白水解作用下, TGF-β1与转化生长因子结合蛋白 (LTBP) 分离, 具有活性, 与相应的受体识别结合, 激活下游的信号通路, 发挥其功能[12]。目前, 下游部分分子途径已经被确认, 包括Smad途径、PI3K/Akt途径和MAPK途径[13]。ADAMTS-1 是否下调或者抑制TGF-β1的下游信号通路, 下调或者抑制TGF-β1的哪条下游信号通路, 目前并不明确, 还有待进一步实验研究。探索拮抗纤维化的因子在纤维化过程中的变化规律并进行外源性的干预, 可能为寻求拮抗纤维化的方法开辟新的思路。

摘要：目的 探讨含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶 (ADAMTS-1) 对小鼠肺成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白 (COL1) 表达的影响及可能的机制。方法 应用细胞培养技术进行小鼠肺成纤维细胞培养, 利用ADAMTS-1为刺激因子, 将培养的细胞分为空白组、低、中、高浓度组, 应用逆转录-多聚酶链反应技术 (RT-PCR) 观察COL1 mRNA、转化生长因子β1 (TGF-β1) mRNA在各组中的表达情况;采用蛋白质印迹法 (Western blotting) 观察各组细胞COL1、TGF-β1的变化。结果 与空白组相比, 低浓度组、中浓度组、高浓度组的COL1、TGF-β1表达水平下降, 其中高浓度组表达水平最低 (P<0.05) 。结论 ADAMTS-1能降低COL1的表达, 抑制TGF-β1是其抗纤维化作用的可能潜在机制。

纤维胶原蛋白 篇4

本研究旨在构建COL1A1 C端甘氨酸重复序列基因(氨基酸1 000~1 189)的真核表达载体,转染CHO细胞进行表达,并检测其与鼠成纤维细胞表面Endo180是否能够相互作用,为深入研究COL1A1基因的生物学功能提供了依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

p APtag-4质粒、prcol1α1质粒、E.coli GH2感受态、中国仓鼠卵巢细胞(二氢叶酸缺陷型,dhfr-/-)、鼠胚胎成纤维细胞(Rat-1)由Gene Hunter公司提供。

1.1.2 试剂

DL5000 DNA marker、限制性内切酶、r Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶购于Takara公司;胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自OMEGA公司;引物合成和DNA测序由TSINGKE公司完成;Fu GENE 6购自Roche公司;兔抗人AP多克隆抗体购自Gene Hunter公司;HRP标记的羊抗兔Ig G二抗购自Southern Biotch公司;Reagent A(含氯化镁、二乙醇胺、BSA和对硝基苯磷酸酯)购自Gene Hunter公司;Reagent S(氯化硝基四氮唑兰)购自Sigma公司;胎牛血清购自Bovogen公司。其他试剂和耗材均购自国内生物公司。

1.1.3 仪器

PCR仪(Bio-Rad);电泳仪(北京JUNYI电泳仪公司);冷冻离心机(Eppendorf公司);凝胶成像系统(Bio-Rad公司);CO2恒温培养箱(Thermo Fisher公司)。

1.1.4 培养基

胎牛血清购自Hyclone公司;DMEM高糖培养基和IMDM培养基均购自Hyclone公司。

1.2 方法

1.2.1 COL1A1 C端甘氨酸重复序列基因的获取

根据NCBI数据库中鼠COL1A1的c DNA序列设计一对用于扩增COL1A1 C端甘氨酸重复序列基因(氨基酸1 000~1 189)的引物,上游引物P1:5'-GTAGATCTGGACGTGAGGGG-3',下划线为BglⅡ酶切位点,下游引物P2:5'-GGTCTAGATTT-GAAGCTGAAGTCG-3',下划线为XbaⅠ酶切位点。以含有COL1A1的c DNA全长的质粒prcol1α1为模板,以P1、P2为上下游引物,用r Taq DNA聚合酶进行PCR扩增目的基因。PCR扩增条件为:94℃、5 min;94℃、30 s,58℃、1 min,72℃、1 min,循环数30;72℃、5 min。PCR产物经过2%琼脂糖凝胶电泳后割胶回收。

1.2.2 真核表达质粒p AP-Gly的构建和鉴定

用BglⅡ和XbaⅠ双酶切甘氨酸重复序列基因和真核表达载体p AP-tag4,将酶切后的p AP-tag4和甘氨酸重复序列分别进行割胶回收。将纯化的p AP-tag4和甘氨酸重复序列基因(1∶10)经T4DNA连接酶16℃连接过夜,并转化E.coli GH2感受态,使用含有氨苄和四环素双抗的固体LB培养板挑取单菌落培养,提取质粒,然后进行PCR鉴定、双酶切鉴定以及送到TSINGKE公司基因测序鉴定,得到测序完全正确的p AP-Gly重组质粒(图1)。

1.2.3 重组质粒转染CHO细胞

将生长状态良好的CHO(dhfr-/-)细胞经胰酶消化后用血球计数板计数,以每孔5×104细胞密度铺到六孔板中,培养时加入1×次黄嘌呤与胸腺嘧啶(HT)至IMDM培养基中,放入5%CO2孵箱中37℃培养24 h。当CHO(dhfr-/-)细胞长到50%~70%汇合度时,按照Roche公司提供的Fu GENE 6操作说明书进行转染,阴性对照为转染空质粒p AP-tag4的CHO(dhfr-/-)细胞,空白对照为无转染的CHO(dhfr-/-)细胞。转染72 h后进行蛋白水平鉴定。

1.2.4 AP活性测定检测AP-Gly蛋白在细胞中的表达

转染72 h后,收集六孔板中细胞培养基,5 000r/min离心5 min,取上清检测培养基中的AP活性。具体AP活性测定方法如下:取50μL含有AP-Gly蛋白的细胞培养基(以50μL IMDM培养基作为负对照),然后加入等体积AP反应底物2×Reagent A,立即放入37℃水浴锅并计时,待溶液变成黄色后,用100μL 0.5 mol/L Na OH终止反应,然后加入800μL双蒸水,利用酶标仪读取溶液OD405。根据公式54×OD405/(T·V)计算AP活性,其中T为水浴时间(min),V为样品体积(μL),AP活性单位是U/m L。

1.2.5 Western Blot鉴定AP-Gly蛋白的表达

将上述检测到有AP活性的AP或AP-Gly细胞培养基用PBS均调至相同AP活性,分别用加巯基乙醇和不加巯基乙醇两种蛋白上样缓冲液处理,沸水煮5 min,蛋白经过8%SDS-PAGE分离并且转PVDF膜。使用5%脱脂奶粉室温封闭1h,加入兔抗人AP多克隆抗体(1∶2 000)室温孵育2 h或4℃孵育过夜,TBST洗膜3次,加入羊抗兔Ig G二抗(1∶5 000)室温孵育1 h,TBST洗膜3次。加入ECL显影液,在凝胶成像仪(Bio-Rad)上拍照。

1.2.6 Rat-1细胞原位染色

取出Rat-1细胞六孔板培养皿并且弃掉培养基,用预冷的1 m L的HBHA(5 mmol/L KCl,0.44mmol/L KH2PO4,0.49 mmol/L Mg Cl2·6H2O,136mmol/L Na Cl,0.4 mmol/L Na H2PO4,5%BSA)清洗细胞1次,每孔中分别加入1U/m L的AP或AP-Gly细胞培养基,于4℃避光孵育90min,弃掉上述细胞培养基,用1 m L HBHA溶液在10 min内清洗细胞至少5次,每孔加入500μL固定液(60%acetone,3%formaldehyde,20 mmol/L HEPES p H7.5),固定细胞30 s,迅速弃掉固定液,加入1 m L HS溶液(1.6 mmol/L Na Cl,20 mmol/L HEPES p H 7.5)清洗细胞2次,加入1 m L HS溶液,将培养皿放在65℃水浴锅20 min(去除内源AP),然后弃掉HS溶液,每孔加入500μL AP显色底物Reagent S,于37℃孵箱显色2 h,直到在显微镜下观察到实验组细胞染成蓝紫色,而负对照组没有出现染色情况。

1.2.7 Rat-1细胞定量染色

取出Rat-1细胞六孔板培养皿并且弃掉培养基,用预冷的1 m L的HBHA清洗细胞1次,然后每孔中分别加入1 U/m L的AP或AP-Gly细胞培养基,于4℃避光孵育90 min,弃掉上述细胞培养基,加入200μL细胞裂解液(10 mmol/L Tris-HCl p H8.0,1%Triton×100)放置5 min后,将细胞刮下来,收集细胞液到1.5 m L离心管中,于4℃离心机最大转速离心2 min,收集上清,BCA法测定上清中Rat-1细胞全蛋白浓度,与此同时,将剩余上清于65℃孵育20 min(去除内源AP),最后按照上述AP活性测定方法测定各实验组上清中AP活性。

1.2.8 Rat-1细胞全蛋白的提取

取出Rat-1细胞培养皿并且弃掉培养基,用5m L预冷的PBS清洗细胞1次,再加入1 m L预冷PBS,将细胞刮下来,收集细胞液到1.5 m L离心管中,用4℃离心机2 000 r/min离心2 min,弃上清,然后在离心管中加入200μL预冷的细胞裂解液(10mmol/L HEPES,p H 8.0,10 mmol/L KCl,0.1 mmol/L EDTA,0.1 mmol/L EGTA,1 mmol/L PMSF,1mmol/L DTT,0.3%NP40),于4℃裂解细胞30min,4℃离心机最大转速离心10 min,收集上清。用BCA方法测定全蛋白浓度。

1.2.9 AP-Gly与Rat-1全蛋白的配体受体亲和印迹实验

将Rat-1全蛋白分别用加巯基乙醇和不加巯基乙醇的两种蛋白上样缓冲液处理,沸水煮5 min,上述蛋白经过8%SDS-PAGE分离并且转PVDF膜后,用5%脱脂奶粉封闭1 h后,TBST洗膜3次,分别用等AP活性的AP、AP-Gly、AP-Coll细胞培养基孵育,室温孵育2 h或者4℃摇过夜,TBST洗膜3次,往膜上滴加入AP反应底物Reagent S,直到出现蓝紫色目的条带,用双蒸水反复冲洗PVDF膜终止反应,在凝胶成像仪上拍照。

1.2.1 0 统计学分析

每次实验均独立重复3次,数据以平均数±标准误差(mean±SEM)表示,使用Graph Pad Prism5.0统计学软件进行单因素方差分析,组间两两比较采用t检验分析并作图,当P<0.05时具有统计学意义,*P<0.05,**P<0.01。

2 结果与分析

2.1 COL1A1 C端甘氨酸重复序列基因的PCR扩增

利用合成的引物以含COL1A1 c DNA全长的prcol1α1质粒为模板进行PCR扩增C端甘氨酸重复序列全长,利用2%琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物在500 bp~750 bp之间可见约570 bp的特异性单一条带,基因大小与预期相符合(图2)。

Note:M:DNA marker DL5000;1:C-terminal glycine repeats gene.

2.2 重组质粒p AP-Gly的PCR鉴定

将C端甘氨酸重复序列基因扩增产物与p AP-tag4载体连接,转化E.coli GH2感受态,进行菌液PCR鉴定。2%琼脂糖凝胶电泳结果可见约500 bp~750 bp处存在C端甘氨酸重复序列的的基因片段,说明重组质粒中含有C端甘氨酸重复序列基因(图3)。

Note:M:DNA marker DL5000;1-16:Electrophoretic profile of PCRproduct of p AP-Gly.

2.3 重组质粒p AP-Gly的双酶切鉴定

重组质粒用限制性内切酶BglⅡ和XbaⅠ双酶切后进行2%琼脂糖凝胶电泳分析,结果可见约5 500 bp的空质粒p AP-tag4片段和约570 bp的C端甘氨酸重复序列基因的目的片段,显示重组质粒构建成功(图4)。对上述鉴定正确的质粒进行测序并且在NCBI上进行BLAST比对,编码框完全正确,将测序正确的克隆命名为p AP-Gly。

Note:M:DNA marker;1:p AP-Gly with endonuclease.

2.4 Western Blot检测融合蛋白的表达

转染p AP-Gly重组质粒于CHO(dhfr-/-)细胞中,收集细胞培养基进行Western Blot检测。Western Blot结果中,重组质粒组可检测到约77k Da大小条带(可能是由于存在表达提前终止现象,故还有一条略小条带),空质粒组检测到67k Da条带(图5)。

注:1:AP(加巯基乙醇);2:AP(不加巯基乙醇);3:AP-Gly(加巯基乙醇);4:AP-Gly(不加巯基乙醇)。Note:1:AP(+β-Me);2:AP(-β-Me);3:AP-Gly(+β-Me);4:AP-Gly(-β-Me).

2.5 细胞原位染色检测AP-Gly与Rat-1细胞表面的相互作用

为了检测AP-Gly融合蛋白是否能够和Rat-1细胞表面结合,用1 U/m L AP-Gly的细胞培养基去孵育Rat-1细胞90 min(负对照为含AP蛋白的细胞培养基),最后加入AP反应底物Reagent S于37℃孵箱显色。细胞原位染色分析表明:AP-Gly与Rat-1细胞表面能够发生结合,催化AP底物Reagrnt S发生颜色反应,而负对照却没有颜色变化(图6)。

2.6 细胞定量染色分析AP-Gly与Rat-1细胞全蛋白的相互作用

为了进一步证实AP-Gly融合蛋白能够与Rat-1细胞相互作用,我们进行细胞定量染色分析,用1 U/m L AP-Gly的细胞培养基去孵育Rat-1细胞90 min(负对照为含AP蛋白的细胞培养基)。细胞定量染色结果表明:实验组在Rat-1全蛋白量基本一致的情况下(图7A),AP-Gly融合蛋白能够和Rat-1全蛋白结合,催化AP底物Reagent A发生颜色变化,因而在波长为405 nm下具有很强的吸光值,而AP蛋白不能够与Rat-1全蛋白结合,所以在405nm下基本没有吸光值(表1)。AP-Gly与Rat-1细胞全蛋白的结合和AP对照组具有极显著差异(*P<0.05,**P<0.01)(图7B)。

2.7 配体受体亲和印迹实验

之前我们实验室用AP标签亲和标记了COL1A1的C端区域(氨基酸1 000~1 453),融合蛋白命名为AP-Coll,且证实了AP-Coll能够和Rat-1细胞表面的Endo180结合[10]。通过配体受体亲和印迹实验,我们进一步探究AP-Gly融合蛋白是否同样和Rat-1细胞表面的Endo180结合。

注:A:两组Rat-1细胞全蛋白量基本相同;B:AP-Gly能够与Rat-1全蛋白结合,与AP组有极显著差异。Note:A:Normalization of whole cell extract of Rat-1 cells;B:Bound AP activity.

将加巯基乙醇和不加巯基乙醇处理过的Rat-1全蛋白经8%SDS-PAGE分离并转PVDF膜后,5%脱脂牛奶封闭过后,分别用含有等活性的AP、AP-Gly、AP-Coll蛋白的细胞培养基室温孵育2h或4℃过夜孵育后,TBST清洗3次,用AP底物Reagent S滴加在PVDF膜上显色。结果表明:AP-Gly实验组并没有出现蓝紫色条带,而AP-Coll实验组能够在150 k Da~250 k Da之间出现蓝紫色条带(Endo180大小为180 k Da),AP负对照组也没有出现蓝紫色条带(图8)。我们推测AP-Gly融合蛋白应该是和Rat-1细胞表面2种或2种以上的蛋白组成的复合物结合。

Note:M:protein marker;1:whole cell extract(+β-Me);2:whole cell extract(-β-Me).

3 讨论

细胞外基质的重塑对发育、稳态以及出生后组织重塑都有很重要的作用,同样与肿瘤发生、许多细胞增生疾病紧密相关。Ⅰ型胶原蛋白作为细胞外基质成分中的重要一员,一直备受科学家的关注。Ⅰ型胶原蛋白是由(α1)2α2组成的异源三聚体。前体Ⅰ型胶原蛋白是由N端肽、中间的(Gly-X-Y)n甘氨酸重复序列、C端肽三部分组成的三股螺旋结构。在前体Ⅰ型胶原蛋白分泌到细胞外后,特定的蛋白酶分别将N端肽和C端肽剪切,形成只有(Gly-X-Y)n甘氨酸重复序列的成熟Ⅰ型胶原蛋白。最近的研究表明,Ⅰ型胶原蛋白的N端肽能够作为诊断肺癌骨转移过程中的一个代谢指标,患者尿液中的N端肽比正常人高[11]。COL1A1C端肽中一个氨基酸的替换将会导致致死性的成骨生成缺陷以及许多骨骼疾病[12]。COL1A1基因中第2 317个碱基由G替换为T的新生错义突变,第773个氨基酸由Gly转换为Cys,导致了非常严重的并且威胁终生的成骨生成缺陷[13]。COL1A1基因不仅与成骨生成密切相关,并且在乳腺癌细胞和内皮细胞的定向迁移过程中也起着很重要的作用[14]。

Endo180是Ⅰ型胶原蛋白的一个极其重要的受体,它与Ⅰ型胶原蛋白的相互作用与胶原蛋白的内吞、降解以及细胞粘附、肿瘤迁移等均有密切的联系。Endo180的表达常见于成纤维细胞和内皮细胞中。前期研究中,笔者课题组证实了COL1A1基因C端区域(氨基酸1 000~1 453)能够和鼠胚胎成纤维细胞表面的Endo180受体结合,并且它们的结合与细胞粘附紧密相关。但是,仅仅COL1A1C端甘氨酸重复序列是否参与细胞粘附还有待进一步研究。

本实验成功获得了COL1A1 C端甘氨酸重复序列基因(氨基酸1 000~1 189),构建了C端甘氨酸重复序列基因的真核表达质粒p AP-Gly,并在CHO细胞中成功表达,Western Blot分析转染重组质粒的细胞培养基可以检测到与预期一致的77 k Da蛋白。细胞原位染色表明AP-Gly能够与鼠成纤维细胞结合。细胞定量染色实验表明,AP-Gly与鼠成纤维细胞表面结合能力很强,相对于AP有极显著差异(**P<0.01)。配体受体亲和印迹实验表明,AP-Gly并不是和成纤维细胞表面的Endo180结合,也不能和成纤维细胞全蛋白中的任何一种单一蛋白结合,我们推测与其结合的受体蛋白很有可能是2种或2种以上的蛋白组成的复合物。

纤维胶原蛋白 篇5

1. 仪器及实验材料和试剂

1.1 仪器

UV300紫外-可见分光光度计以及工作站 (美国热电) ;SIMS50000个人型纯水器 (美国MILLIPORE) ;BP211D分析天平 (德国Sartorius) ;HWS26型电热恒温水浴锅 (上海一恒科技有限公司) ;ZH-2自动漩涡混合器 (天津药典标准仪器厂) ;5ml具塞纳氏比色管。

1.2 实验材料和试剂

硫酸铜 (Cu SO4·5H2O) (天津市化学试剂三厂分析纯) 、酒石酸钾钠 (C4H4O6KNa·4H2O) (中国·郑州派尼化学试剂厂分析纯) 、氢氧化钠 (Na OH) (中国医学科学院天津协和医学科技公司分析纯) ;胶原蛋白对照品由陕西巨子生物技术有限公司提供;胶原蛋白贴敷料由陕西巨子生物技术有限公司提供 (批号:20101011、20101113、20101215) 。

2. 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 双缩脲试剂的制备

称取1.50g硫酸铜 (Cu SO4·5H2O) 和6.0g酒石酸钾钠 (C4H4O6KNa·4H2O) , 用500m l纯化水溶解, 在搅拌下加入300ml10%Na OH溶液, 用纯化水稀释至1000ml, 摇匀, 即得。

2.1.2 空白溶液的制备

在5ml具塞纳氏比色管中加入1ml纯化水, 加双缩脲试剂至5ml, 用自动漩涡混合器充分摇匀后, 在37℃水浴下恒温放置30min, 作为空白溶液。

2.1.3 胶原蛋白系列标准溶液的制备

精密称取胶原蛋白适量, 用纯化水做溶剂稀释成每1ml含10mg的胶原蛋白标准储备溶液。分别精密量取标准储备液2ml、4ml、6ml、8ml、10ml、15ml、20ml加入100ml容量瓶中, 纯化水定容, 配制成0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/m l、1.0mg/m l、1.5mg/m l、2.0mg/m l的胶原蛋白标准系列溶液备用。分别精密吸取上述标准溶液各1ml, 移入5ml具塞纳氏比色管中, 加双缩脲试剂至5ml, 用自动漩涡混合器充分摇匀后, 在37℃水浴下恒温放置30min。

2.1.4 供试品溶液的制备

取胶原蛋白贴敷料, 挤压贴膜, 汇集挤出液于25ml烧杯中, 精密吸取挤出液5ml至10ml量瓶中, 加纯化水稀释至刻度, 摇匀。精密量取1ml, 移入5ml具塞纳氏比色管中, 加双缩脲试剂至5ml, 用自动漩涡混合器充分摇匀后, 在37℃水浴下恒温放置30min。

2.2 线性关系考察

以空白溶液为参比, 依据紫外-可见分光光度法, 在540nm对7个浓度的胶原蛋白标准溶液测定吸光度。以对照品溶液吸光度为纵坐标 (y) , 对照品溶液浓度为横坐标 (x) , 绘制工作曲线, 计算回归方程。结果见表1, 标准曲线见图1。

2.3 精密度试验

取0.6mg/ml的对照品溶液, 重复测试6次, 测定吸光度, 结果RSD为2.3%, 表明仪器的精密度良好。

2.4 稳定性试验

取20101011批样品, 在0、2、4、8、24小时分别按供试品溶液制备方法制得供试品溶液, 测定吸光度。结果RSD为1.9%, 表明样品溶液在24小时内基本稳定。

2.5 重复性试验

取20101011批样品, 按供试品溶液制备方法制得供试品溶液, 平行6份, 测定胶原蛋白含量。结果RSD为2.8%, 表明该方法的重复性良好。

2.6 加样回收率试验

取20101011批样品5ml至10ml量瓶中, 加纯化水稀释至刻度, 摇匀, 再精密量取0.5ml, 移入5ml具塞纳氏比色管中, 平行6份, 分别加入浓度为1.0mg/ml胶原蛋白对照品溶液0.5ml, 加双缩脲试剂至5ml, 用自动漩涡混合器充分摇匀后, 在37℃水浴下恒温放置30min, 依据前文的方法测定, 计算回收率及其RSD。结果见表2。

3.样品测定

分别测定胶原蛋白贴敷料3批样品中胶原蛋白含量, 平行操作, 取平均值。结果见表3。

4.讨论

比色法测定胶原蛋白贴敷料中胶原蛋白含量的原理是:在强碱性溶液中, 蛋白质与Cu2+形成紫色络合物, 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比, 利用标准胶原蛋白溶液作对照, 采用比色法测定样品胶原蛋白质含量。试验结果表明该方法准确、快速, 实验仪器简单、操作方便, 测定数值重现性好, 可用于胶原蛋白贴敷料中胶原蛋白含量的控制。

参考文献

纤维胶原蛋白 篇6

目前,在陆生动物中,人们已经发现了二十多种胶原蛋白,占所有蛋白质总量的30%左右;而在水生动物中,人们却只发现少数几种胶原蛋白:Ⅰ型胶原,Ⅱ型胶原,Ⅴ型胶原、ⅩⅠ型胶原和ⅩⅧ型胶原。鱼皮中的胶原含量最高可占蛋白质总量的80%多,较鱼体的其它部位高许多 [1,2,3,4]。

水生动物中的胶原蛋白也呈明显的三肽周期结构,甘氨酸仍为三肽中的固定组成。但其脯氨酸与羟脯氨酸的量较陆生动物的量少得多[5]。在胶原蛋白的组成上,水生动物的胶原蛋白,尤其是鱼鳞中的胶原蛋白含硫元素的蛋氨酸含量要远远大于陆生动物中的胶原蛋白[6]。

本文利用木瓜蛋白酶来水解草鱼皮胶原蛋白,对影响水解过程的因素进行了讨论,确定了酶解的最佳工艺条件。

1 试剂及仪器

常规试剂均为分析纯,木瓜蛋白酶、Tris均为生化试剂;恒温水浴振荡摇床(上海康华生化仪器厂),离心机(Beckman),磁力加热搅拌器。

2 试验方法

2.1 草鱼皮基本组成成分测定

水分:直接干燥法测定;灰分:高温炉550℃灼烧法测定;脂肪:索氏脂肪抽提法测定;蛋白:凯氏定氮法测定;糖:苯酚硫酸法测定。

2.2 草鱼皮中胶原蛋白提取

2.2.1 预处理

新鲜草鱼皮洗干净切碎后,加入5%的NaCl溶液浸泡12h,以除去盐溶性蛋白及其它可溶性杂质。用去离子水洗干净后用2%洗涤剂浸泡4h,洗干净后再用Na2CO3溶液浸泡4h,反复操作3次后用去离子水洗干净[7]。

2.2.2 胶原蛋白提取条件的确定

选取料液比、酶解pH值、酶解时间以及酶用量4因素,按照L9(34)进行正交试验,见表1。

在预处理过的草鱼皮原料中加入一定比例的已调节好pH值的枸椽酸缓冲溶液,搅拌15min,混合均匀后,再加入一定比例的木瓜蛋白酶,在冰水浴中搅拌一定时间,用医用纱布过滤。

2.2.3 盐析

在滤液中直接加入NaCl固体至最终浓度达到20%,真空脱气后离心分离,得到胶原蛋白。

2.2.4 纯化

盐析后得到的胶原沉淀溶于0.5mol/L的醋酸溶液中,然后在磷酸缓冲液中透析。

2.2.5 胶原蛋白含量的测定(以羟脯氨酸含量计)

按照ISO3496:1994(E)方法,测定羟脯氨酸含量。胶原蛋白含量等于羟脯氨酸含量乘以系数11.1。

胶原纯度=11.1×m1/m2×100%

其中:m1—测定的羟脯氨酸质量(g)

m2—测定羟脯氨酸时称取的胶原质量(g)

胶原蛋白提取率=(胶原纯度×M1/M2)×100%

其中:M1—成品胶原的质量(g)

M2—新鲜鱼皮的质量(g)

2.2.6 氨基酸组成及含量测定

取一定量的胶原蛋白于水解管中,加入一定量6mol/L的浓盐酸,将水解管抽真空密封,于110~115℃水解。水解结束后,抽真空排酸,定容至0.5ml,利用日立835-50氨基酸自动分析仪测定各氨基酸的含量。进样量为50μl。

3 结果与讨论

3.1 草鱼皮的基本组成成分

草鱼皮的一般组成成分如表2所示。

通过表2可以看出,草鱼皮中蛋白含量比较高,大约在25%左右,相对于陆生动物皮来说,脂肪含量比较少,这意味着利用草鱼皮来提取胶原蛋白,所需的预处理比较简单,不需要复杂的除去油脂的前处理工序。

3.2 正交实验结果

对草鱼皮进行2.2.2的正交实验,结果及分析见表3所示。

木瓜蛋白酶水解草鱼皮正交试验表明,该工艺对胶原蛋白提取率影响最大的是提取时间,然后依次是料液比、pH值及酶用量。最佳组合为A3B3C2D3,即当酶与原料比为1∶50、pH值为6.0、时间为36h、料液比为1g/20ml时提取率最佳。

实验对筛选出的最佳提取工艺“酶与原料比为1∶50、pH值为6.0、时间为36h,料液比为1g/20ml”时进行验证实验,结果发现,草鱼皮胶原蛋白平均提取率为13.98%,验证结果表明,当酶与原料比为1∶50、pH值为6.0、时间为36h、料液比为1g/20ml时为最佳提取工艺。

3.3 胶原蛋白氨基酸组成分析

本实验测定了木瓜蛋白酶法提取的草鱼皮胶原蛋白的氨基酸组成及含量,结果见表4。从表4可以看出,通过木瓜蛋白酶提取的草鱼皮胶原蛋白的氨基酸组成中除了甘氨酸含量最多外,谷氨酸与脯氨酸含量也较多。

利用木瓜蛋白酶法提取的草鱼皮胶原蛋白的氨基酸含量总和为96.15。

4 结论

采用木瓜蛋白酶提取草鱼皮胶原蛋白的最佳处理条件为:酶与原料比为1∶50,pH值为6.0、时间为36h、料液比为1g/20ml时,平均提取率为13.98%。

草鱼皮胶原蛋白含量高,采用木瓜蛋白酶提取得到的草鱼皮胶原蛋白纯度较高,色泽为淡黄色,无异味。

摘要：采用木瓜蛋白酶从淡水草鱼鱼皮中提取胶原蛋白,通过正交实验对草鱼皮胶原蛋白提取工艺进行优化。结果表明,料液比为1g/20ml、酶与原料比为1∶50、在pH值为6.0、酶解36h时得到胶原蛋白提取率为13.98%。

关键词：草鱼皮,木瓜蛋白酶,胶原,提取工艺

参考文献

[1]Morvan-Dubois G,Haftek Z,Crozet C,Ganone R.and leguellet D.Strueture and spatio-temporal expression of thefull length DNAcompementaryto RNA coding forαz typeⅠcolagen of zebrafish.[T].Gene2004,294:56-65.

[2]Lele Z and Krone P H.Expression of genes encoding the collagen binding heat shock protein(Hsp47)and typeⅡcollagen in deveoping zebrafish embryos[T].1997,Mech.Dev.61:89-98.

[3]Touhata K,Tanaka H,YoKoyama Y,Sakaguchi M and Toyohara H.Structure of a full-ength CDNA clone for the pro-Ⅹ(Ⅴ/Ⅺ)collagen chain of red sea brean,Bioth.Biophys,Acta.1517:323-326(2001).

[4]Haftek Z,Morvan-Dubois G,Thisse B.Sequenee and embryonic expression of collagenⅩⅧ.Necl domain(endostatin)in the Zebrafish Gene.Exp.Pathol,2003,3:351-354.

[5]郭文宇,代敏,杨丽红,等.水生动物与陆生动物皮胶原特性及应用前景[J].中国皮革,2007,36(17):59-62.

[6]王南平,郭鹏达.鱼鳞胶原蛋白的研制[J].水产科技情报,2004,31(6):263-264.

猪皮中胶原蛋白美容价值的分析 篇7

猪皮是由表皮、真皮层、皮下结蹄组织构成, 在真皮层含有大量的胶原蛋白纤维, 其含量可占干物质的99%。猪皮中蛋白质含量可高达33%, 其中胶原蛋白含量为87.8%。胶原蛋白是一种高分子蛋白质, 由18种氨基酸组成, 其中甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸含量比较高, 是由3条肽链拧成螺旋形的纤维状蛋白质, 胶原蛋白是人体内含量最丰富的蛋白质, 占全身总蛋白质的30%以上。主要存在于人体皮肤、骨骼、眼睛、牙齿、肌腱、内脏 (包括心、胃、肠、血管) 等部位。在人体皮肤中, 其可与水结合, 具有很好的保水保湿作用, 它与弹力纤维合力构成网状支撑体, 提供真皮层坚定有力的支撑, 能使皮肤保持结实而有弹性。其功能是维持皮肤和组织器官的形态和结构, 也是修复各损伤组织的重要原料物质。随着年龄的增长, 胶原蛋白逐渐变性、断裂, 含量减少, 皮肤组织被氧化、萎缩、塌陷, 肌肤就会出现干燥、皱纹、松弛无弹性并变薄等衰老现象。因此说人的皮肤老化的确与胶原蛋白流失有密切的关系。

中国有句俗语“吃什么, 补什么”, 因此常理认为, 吃了富含胶原蛋白的牛蹄筋、猪蹄、猪皮、鸡翅、鸡皮、鱼皮及软骨等就等于吃到了胶原蛋白, 因此每次外出赴宴, 都会有人指着那盘猪蹄或猪肘子殷勤地对同桌的女士说:“女士多吃点好, 能美容。”这种说法是否正确?本实验试图通过对猪皮和猪肉中蛋白质必需氨基酸种类与含量的分析比较, 揭示食用猪皮能否直接高效补充人体皮肤的胶原蛋白, 促使人们能够形成正确健康的膳食美容观念。

材料

超市购买的带皮的新鲜猪肉。

主要仪器设备

恒温水浴锅、烧杯、高速冷冻离心机、层析缸、电磁炉、分液漏斗、滤纸;

50 ml量筒、精确电子天平、5 ml移液管、华氏喷雾器、吹风机、微型毛细管

实验方法

原材料的预处理

鲜肉冷冻后, 用小刀将皮肉剥离, 剔除皮下脂肪组织 (一定要剔除干净, 否则会影响实验结果) , 分别称取猪皮、猪肉各50 g, 分别切成10㎜×10㎜的小块, 用35℃清水冲洗干净, 再用4-5倍40℃温水和脱脂液 (8%Na2CO2溶液) 洗一次, 10 min后滤去温水, 再重复一次, 最后用清水再洗2次。

蛋白质的盐提

将预处理好的皮肉分别放入烧杯中, 加入等量的等渗盐水, 放置于60℃的恒温水浴锅中, 水浴加热1.5 h, 加热时不停地搅拌, 便于均匀受热, 直到用手就很容易把皮条扯断, 然后过滤, 得到蛋白质的悬浮液。

蛋白质的提纯

将制备好的溶液中加入等量25%的饱和硫酸铵溶液, 60℃加热5 min, 冷却至室温, 离心15 min (3000 r/min) , 弃去上清液, 即得到胶原蛋白粗制品。

胶原蛋白的水解

用酸解法水解蛋白质。分别量取相同量的猪皮和猪肉胶原蛋白粗制品, 然后加入相同量的6 mol/L盐酸, 在100℃的水中水解大致20 h。

胶原蛋白水解产物必需氨基酸的分离鉴定

取层析滤纸 (22×18 cm) 一张, 在纸的一端距边缘2-3 cm处用铅笔画一条直线, 在此直线上每间隔2 cm做一个记号;用毛细管蘸取少量氨基酸标准液分别点在这8个位置上, 用吹风机吹干后再点一次样。等滤纸上的液体干后, 用线将滤纸缝成筒状, 纸的两边不能接触。将点好液体的滤纸垂直放在里面有20 ml层析液的密封的层次缸中, 千万避免划横线的部分与层析液接触, 同时避免与层析缸两侧接触, 待滤纸浸湿处高度差不多到了15-20 cm时就拿出滤纸, 用铅笔在浸湿处扩展剂到达的地方画一条线, 吹干后, 用喷雾器在干的滤纸上喷上准备好的显色液 (茚三酮正丁醇溶液) , 然后用热风吹5 min左右就能看出每个层析出的斑点。将原蛋白水解液分别稀释一倍, 用上述同样的方法进行纸层析, 选取效果清晰的层析图, 与8种标准必需氨基酸的层析图进行比较, 即可能鉴定出水解样液中氨基酸的种类。

氨基酸含量的测定

采用茚三酮显色法。茚三酮配成的溶液能跟氨基酸发生作用生成紫色的物质。紫颜色的深或者浅与每种氨基酸的含量多少是呈正比的关系。可以通过观察反应颜色的深浅来比较猪皮胶原蛋白和猪肉蛋白质中所含有必需氨基酸相对含量的多少。

结果与分析

猪皮与猪肉中必需氨基酸种类的比较与分析

猪皮中含有的必需氨基酸种类

由图1可知:猪皮中含有6种人体必需的氨基酸, 即赖氨酸 (Lys) , 苯丙氨酸: (Phe) , 蛋氨酸 (Met) , 苏氨酸 (Thr) , 亮氨酸 (Leu) , 缬氨酸 (Val) ,

没有色氨酸 (Trp) 和异亮氨酸 (Ile) , 通过参考文献得知:含有的异亮氨酸 (Ile) 只有0.67%, 所以图中几乎没有显示出来。试验结果表明:猪皮胶原蛋白不含必需色氨酸, 也就是说猪皮胶原蛋白实际上是一种不完全蛋白。

猪肉中含有的必需氨基酸种类

由图2可知:瘦猪肉蛋白质中含有8种人体必需的氨基酸, 即赖氨酸 (Lys) , 苯丙氨酸: (Phe) , 蛋氨酸 (Met) , 苏氨酸 (Thr) , 亮氨酸 (Leu) , 缬氨酸 (Val) , 色氨酸 (Trp) 和异亮氨酸 (Ile) 。实验结果表明:试验结果表明:猪肉胶原蛋白中含有8种必需氨基酸, 也就是说猪肉胶原蛋白是一种完全蛋白, 营养价值高。

讨论

由于猪皮胶原蛋白中含有的必需氨基酸的种类与含量均比猪肉中低, 并且猪皮胶原蛋白的食用率也没有猪肉蛋白质高, 所以食用猪皮并没有特殊的美容价值, 甚至还不如猪肉的美容价值高。并且胶原蛋白都是大分子的不完全蛋白质, 不能被人体直接吸收, 这些蛋白质经过人体的蛋白酶分解后变成了多肽、氨基酸, 再被人体吸收, 合成了新的蛋白质。所以大多数人认为的食用猪皮中胶原蛋白能更高效补充人体皮肤胶原蛋白这种观点是错误的。

真皮革和胶原纤维革的鉴别研究 篇8

鉴于天然革的卫生性能及价格, 胶原纤维革和人工革已被消费者的认可。随着仿真技术的迅速提高, 人们对革的种类判断出现困难。有文献[1,2,3]介绍, 可通过燃烧、氢氧化钠法和IR法等能准确鉴别出人工革和天然革, 但对鉴别出胶原纤维革和天然革一直存在着问题。真皮革是动物皮由纤维间质的去除和胶原纤维的松散直至后续材料的进入和结合成为革, 形成充满化工材料的交联网络, 使革的各方面性能都得到了较大的提高。经过制革加工, 皮胶原的三维网状构造虽被修饰, 但整体构型基本不变。再生革[4], 又名胶原纤维革, 是废革屑中所提取的革纤维通过黏胶材料粘结而成, 在此革内, 为了保证材料强度, 黏胶材料成为了连续相。真皮纤维革又称无纺革, 是废革纤维被磨具打碎成一定粒度大小后与微量粘合剂及水使之成浆, 浆料再经过金属筛网控去水分, 待干透后即得相互粘结在一起的纤维片材, 实现了革废弃物的综合利用。胶原纤维革制品和天然革制品在某些性能方面可以相媲美。用一些简单方法来鉴别他们, 如传统的手摸、眼观和灼烧法已不能把两者区分开来, 因此为了准确鉴别, 本文采用溶剂法、撕裂法、扫描电镜观察法和热重分析法等科学方法作为鉴别依据。

2 实验部分

2.1 材料、试剂及仪器

材料及试剂:再生革3块, 编号为1-3, 天然革1块, 编号4, 黏合剂 (丙烯酸树脂) 编号5, 某厂提供;四氢呋喃、丙酮、乙酸乙酯, 均为分析纯;10%氢氧化钠溶液, 自配;甘油水溶液 (甘油∶水=7∶3) , 自配;实验前所有样品均在恒温恒湿箱中放置48 h, 温度 (20±2) ℃, 湿度 (65±2) %

仪器:GT-7005型恒温恒湿箱, 台湾高铁仪器公司;BS110S型电子分析天平, 北京塞多理斯天平公司;XL-100 A型拉力试验机, 广州试验仪器厂;DZKW-4型恒温水浴锅, 北京中兴伟业仪器有限公司;SZX-ILLD200体视显微镜, 日本OLYMPUS公司, TG 209 F1 Libra热重分析仪, 德国耐驰热分析;BP210D精密电子天平, 君达仪器仪表有限公司;JSM-5900LV扫描电子显微镜 (SEM) , 日本电子 (JEOL) 。

2.2 实验过程

1) 断裂截面观察法

选取试验拉力机下撕裂的试样, 置于体视显微镜下观察横截面的断面情况, 观察试样断裂口情况以及层间纤维间隙存在情况。

2) 溶剂法

把所有试样分别裁剪成1 cm×2 cm相同大小的形状, 置于50 Ml试管中, 分别加入四氢呋喃、丙酮和乙酸乙酯10 Ml, 置于30℃恒温水浴锅中, 保温2 h, 观察试样的变化情况。

3) 撕裂法

采用实验拉力机, 根据行业标准QB/T3812.5—1999《皮革抗张强度和伸长率的测定》以及QB/T 3812.6—1984《皮革撕裂力的测定》, 对所有样品进行物理性能的测试, 并记录实验数据和收集撕裂、拉伸过的样品, 然后在体式显微镜下观察样品断裂口处情况, 以及断裂处周围试样的变化。

4) 热重分析法

采用TG 209 F1 Libra热重分析仪对以上四种试样进行热重分析, 在BP210D精密电子天平上分别称取2~5 mg的试样置于小坩埚中, 采用动态升温来进行加热, 升温速率为10℃/min, 从40℃升温至600℃, 时间t为55 min, 实验结束后观察热重分析曲线。

5) SEM法

待测样品进行喷金处理, 置于JSM-5900LV扫描电子显微镜下进行观察, 观察革内胶原纤维束的情况。

3 结果与讨论

3.1 断裂截面观察法

天然革横截面处露出较多细长的纤维绒头, 粒面层和网状层的交界处可以明显看出很多细小的空洞, 胶原纤维革横截面处虽也有很多纤维绒头, 但长度短, 粗细较均匀, 断面处可见组织结构紧密均匀, 不具组织间隙[5], 革面与涂层的交界处连接光滑, 无空洞。原因是由于天然革的鞣制过程中, 粒面层和网状层交界处存在大量的汗腺、脂腺、毛囊等在前期处理中被除去, 因此便造成了两层连接较弱, 为了防止皮面“起皱”, 后期处理中加入大量填充材料, 虽在某种程度上可以填充部分空洞, 但仍有部分空洞凸现出来, 因此在显微镜下仍可以明显看到层界面处有空洞, 而胶原纤维革的加工过程中, 纤维束被打断, 粘合剂渗入纤维间空隙, 布满整个纤维网络, 进行填充、“弥补”, 靠粘合剂粘合成一整体, 固化成型后又在成型的纤维板上喷涂涂饰剂, 因此横截面处空洞消失。

1-a:tetrahydrofuran 1-b:acetone 1-c:ethyl acetate

3.2 溶剂法

试样在四氢呋喃、丙酮和乙酸乙酯作用2 h下, 试样的变化情况见图1。

从图1可知, 1#和2#再生革在用溶剂处理下, 试样会发生不同程度的卷曲变形, 涂层起皱, 而3#再生革和天然革形态变化不大。原因是由于天然革的主体结构是由胶原纤维束间相互交联编织构成, 当用有机溶剂处理时, 胶原纤维对有机溶剂不“敏感”, 因而形态变化不大;再生革的加工过程中, 大量极性高分子粘合剂使短小的胶原纤维束通过氢键和分子间作用力等作用粘结起来, 当用溶剂处理时, 由于“极性相似相容原理”, 部分粘合剂会与有机溶剂发生溶合, 造成再生革发生不同程度的卷曲变形, 而3#再生革在溶剂处理下, 形态变化也不大, 主要是与其加工制作过程有关, 在摊网、除水过程中, 压力和温度都较高, 致使再生革板硬、延伸性小, 强度高, 粘合剂粘合纤维强度高, 可耐溶剂处理[6]。

3.3 撕裂法

所有试样在万用拉力机下进行撕裂强度、抗张强度和断裂伸长率的测试, 实验数据见表1。

由表1可知, 天然革纵横向的撕裂强度远远大于胶原纤维革, 天然革纵横向撕裂强度差的绝对值为17.11 N/mm, 再生革依次为0.86、0.11和6.60, 远远小于天然革之差;抗张强度方面, 胶原纤维革纵横向大小几乎相近, 天然革纵横向相差较大。原因是由于胶原纤维革在加工过程中, 胶原纤维束被磨具打碎成相同粒度后, 胶原纤维已无纵横向差别之分, 纤维编织角不存在或纤维间交联较少, 只有借助粘合剂的粘合作用, 使细小的胶原纤维束在一定温度和压力下, 固定成型, 而天然革的鞣制过程中胶原纤维束并没有受到机械作用的“打碎处理”, 纤维间松散好, 与鞣质的交联络合作用好, 纤维间编织角与纤维的走向有密切关系, 因此在受到拉力机作用下, 天然革的纵横向则表现出明显的不同。从断裂伸长率来看, 并不能明显区分出天然革和胶原纤维革, 原因是由于断裂伸长率和革身的延伸性以及涂层的延伸性有关, 用于粘合胶原纤维的粘合剂如果是热塑性树脂的话, 其延伸性明显比热固性树脂好, 综合考虑涂层延伸性的影响, 断裂伸长率不作为区分两者的依据之一。

3.4 热重分析法

经过热重分析处理, 样品的失重变化曲线见图2。

从图2可知, 真皮革和胶原纤维革的失重过程基本一致, 原因是由于胶原纤维革和天然革一样, 其主要组分都为胶原纤维, 因此失重过程几乎一致, 但从图TG-DTG曲线可以看出, 1#样品革在400℃附近有一个微小的拐点, 而4#革在400℃附近的曲线光滑, 原因是由于在1#革的合成过程中, 大量粘合剂粘结纤维, 使纤维固定成型, 革纤维间充满着大量粘合剂, 因此猜想此处为粘合剂的最大热解点, 通过5#纯粘合剂热失重曲线可以看出, 最大热解点刚好和此点吻合, 天然革胶原纤维间无外加粘合剂的存在, 纤维的耐热稳定性主要靠纤维间的立体交联网络, 在400℃附近并无拐点出现, 因此该点可作为再生革和天然革的鉴别依据。

3.5 SEM法

待测革样胶原纤维束在扫描电镜下的构型见图3。可以明显看出天然革和再生革的差别, 电镜图 (×50) 中发现天然革的胶原纤维束在皮内呈一定的编织角存在, 从粒面层到网状层, 胶原纤维束逐渐变粗壮, 束与束之间相互交联缠绕, 再生革中胶原纤维束分布杂乱无章, 呈“杂草”状分布, 不存在编织角, 且胶原间交联错综复杂, 无规律性。从电镜图 (×250) 中更可以看到胶原纤维束中细小纤维的分布状态, 天然革胶原纤维束内可以明显看到很多相互呈三股螺旋结构交联的原纤维, 而再生革中胶原纤维束和原纤维分布模糊, 交联缠绕混乱。因此从借助扫描电镜可以明显的区分开再生革和天然革。

4 结论

胶原纤维革也具有和天然革胶原纤维一样的成分, 因此在某些性能方面和天然革类似。文献[7]记载, 可以通过灼烧、表面和肉面观察、撕裂、热重分析法和IR法等等来辨别出人工革和含有胶原纤维的革, 而对于含有胶原纤维的革的类别的鉴别可选用以下方法。首先, 先用镊子从革的背面进行“刮毛”处理, 看刮出纤维的形态, 刮出的纤维大小粗细一样即为再生革, 刮出纤维长短、粗细不一的为天然革;四氢呋喃、丙酮和乙酸乙酯处理下, 胶原纤维革在溶剂中发生不同程度的收缩卷曲, 天然革变化不大;胶原纤维革撕裂和抗张强度大小纵横向间差异小, 撕裂强度远远小于天然革;TG-DTG热失重曲线可以看出胶原纤维革在400℃附近出现一拐点, 为高分子粘合剂的热解点, 而天然革则无此现象;扫描电镜下胶原纤维束的构型形态明显不同, 可更容易的区分开两种革。

参考文献

[1]陈绍华, 林伟, 傅俊渊.浅谈真皮与人造革的鉴别[J].广西轻工业, 2010, (1) :95-96.

[2]朱洪亮, 杨萌, 李伟, 等.人造革与合成革类别及常用指标的检测研究[J].皮革科学与工程, 2013, 23 (3) :21-25.

[3]胡子文, 徐进勇, 李绛, 等.ATR-FTIR法在皮革产品中的应用[J].化学研究与应用, 2008, 20 (2) :205-207.

[4]栾世方, 范浩军.制革废弃物的再生革处理技术[J].西部皮革, 2001, (8) :46-49.

[5]董林峰.真皮、合成革、再生革的鉴别[Z].内蒙古产品质量监督检验所, 2002, (2) :45-46.

[6]郭翔.再生革的制造方法[J].中国皮革, 1994, 23 (9) :46-47.