效价跟踪（通用7篇）
效价跟踪 篇1
近年来, 随着人们生活水平的提高, 优质肉鸡的市场需求量越来越大, 家禽养殖从业者为适应市场需求, 创造出了种养结合、充分利用空间和自然条件的果园养鸡、林下养鸡、竹山养鸡模式。为了指导、总结在自然环境下规模放养鸡群的生物安全, 2013年在龙岩市新罗区白砂镇选择了一户4 000羽饲养规模的林下放牧鸡群, 进行重组禽流感病毒灭活疫苗 (H5N1亚型、Re-6株) 的免疫效价跟踪测定。
1鸡场基本情况
该养殖户从事养鸡多年, 具有一定的管理经验和诊病用药知识, 存养规模4 000羽。该场建在山坡树林下, 与村庄和主要交通道路较远, 自然隔离条件较好, 但林中常年均有野鸟, 近三年生产经营正常。该场的免疫程序为:1日龄接种马立克氏病疫苗、11日龄接种法氏囊病疫苗、18日龄接种新-支二联苗、23日龄进行法氏囊病疫苗二免、27日龄接种禽流感疫苗、33日龄进行新-支二联苗二免、65日龄肌注新城疫Ⅰ系疫苗、75日龄肌注禽霍乱疫苗、95日龄进行禽流感疫苗二免。
2疫苗来源
疫苗为政府统一采购的哈尔滨维科生物技术开发公司生产的重组禽流感病毒灭活疫苗 (H5N1亚型、Re-6株) , 生产批号:2012048, 生产日期:20121114, 有效期12个月。其他疫苗为业主从市场采购。
3检测方法
随机抽取鸡只采血, 待检血样经当天离心后立即用血凝与血凝抑制试验方法检测。检测试剂为哈尔滨维科生物技术开发公司生产, 生产批号:2012002, 生产日期:20120605, 有效期24个月。红细胞采自自备的未接种任何疫苗的公鸡, 现配现用。
4结果与分析
放养鸡群禽流感免疫效价测定结果见表1。
1) 1日龄血样检测结果:免疫效价≥1:16的有12份, 占60.0%, 表明该批鸡的母源抗体水平较低。
2) 14日龄和32日龄的检测结果:免疫效价≥1:16的分别占检测样品的27.5%和6.0%, 表明该批鸡处于高度风险状态。
3) 47日龄检测结果:免疫效价≥1:16的占94.0%, 表明该批鸡已经获得理想的免疫保护效价。62日龄、77日龄、92日龄的检测结果免疫效价≥1:16的占比分别为98.0%、94.0%、90.0%, 表明该批鸡保持高滴度的免疫抗体效价。
4) 110日龄的检测结果:免疫效价≥1:16占比为86.0%, 表明禽流感二免2周后仍没有提高免疫效价。
5) 125日龄和143日龄的检测结果:免疫效价≥1:16的占比均为94.0%, 表明禽流感二免使得抗体免疫效价维持在较高和均衡的水平。
5结论与建议
1) 该次免疫效价跟踪检测的结论是: (1) 规模化林下放养鸡群在1月龄左右接种重组禽流感病毒灭活疫苗 (H5N1亚型、Re-6株) , 经20 d后能获得较高的免疫效价, 约4周时达最高值, 之后以每2周4个百分点的速率下降。 (2) 禽流感二免加强免疫后不能在2周内使免疫效价提高, 但在1个月后能重新获得较高的免疫效价, 并保持比较均衡的状态。 (3) 在母源抗体较低的情况下, 1月龄左右接种禽流感疫苗, 在产生有效免疫抗体前有比较长时间的感染野毒风险 (约1个月) 。
2) 该次免疫效价跟踪检测的1日龄血样偏少, 是由于采血样需剪断鸡颈部、畜主考虑经济效益所致。免疫程序也是畜主自行制定。该批次鸡于150日龄后销售, 约10 d售完。
3) 建议畜主以禽苗的母源抗体水平来确定禽流感的首免时间。鉴于目前广大家禽饲养者的条件所限, 每批苗种进行母源抗体检测不现实, 建议种禽场和动物防疫主管部门应制定禽苗中禽流感母源抗体水平强制检测制度, 以便真正使禽流感的强制免疫制度达到预期效果。
青霉素酶抗体的制备及效价检测 篇2
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
青霉素酶, 中国兽医药品监察所产品;牛血清白蛋白, 美国SIGMA公司产品;弗氏佐剂, 美国GIBCO品牌;羊抗鼠酶标二抗, 河南华美生物工程有限公司产品;550型酶标仪, 美国BIO-RAD公司产品;高速匀浆机, 美国BECKMAN公司产品。6周龄BALB/C小鼠购自郑州大学医学院。
1.2 小鼠免疫
用青霉素酶免疫6周龄BALB/C小鼠, 每组3只, 背部皮下分点注射。首次免疫加等体积的弗氏完全佐剂进行乳化[10 m L青霉素酶+90 m L磷酸盐缓冲液 (PBS) +100 m L佐剂], 间隔20 d进行第2次免疫, 二免改用弗氏不完全佐剂进行乳化, 第3次免疫后10 d对小鼠断尾采血, 分离血清。
1.3 青霉素酶抗体的检测
将青霉素酶包被酶标板 (10 m L青霉素酶溶解于10 m L碳酸盐包被液) , 37℃温箱内培养2 h, 然后用磷酸盐缓冲液洗3次, 每次3 min, 于吸水纸上拍干;用含0.1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液封闭, 37℃温箱内孵育1 h, 然后洗涤 (方法同上) ;将1∶100的血清进行倍比稀释, 同时设阴性对照 (小鼠的阴性血清) 和空白对照 (磷酸盐缓冲液) , 37℃温箱内培养30 min, 然后洗涤;加入1∶1 000的酶标二抗 (GAMIgG-HRP) , 37℃温箱内培养30 min;然后加底物液显色, 10 min后中止反应, 用酶标仪测OD450值。阴性对照OD值为N, 阳性OD值为P, 以P/N≥2.1且OD>0.2判为阳性。
2 结果与分析
间接酶联免疫吸附试验 (间接ELISA) 测定效价, 结果见表1。以P/N≥2.1且OD>0.2判为阳性, 结果3只小鼠的效价均达到1∶3 200。表明小鼠血清中产生了青霉素酶的抗体。
3 讨论
效价跟踪 篇3
1 材料与方法
1.1 研究对象
来自2010年1月至2011年6月来我院妇科门诊就诊的O型孕妇共计248人, 年龄24～38岁, 孕期为12～38周, 其中配偶A型116人, B型102人, AB型23人, 孕妇Rh D阴性7人, 配偶Rh D阳性。
1.2 试剂与仪器
0.8%ABO反定型红细胞悬液和抗人球微柱凝胶卡 (均长春博讯生物技术有限责任公司生产) 批号:20091209、20101103;0.2mol/L 2-巯基乙醇 (2ME) (上海血液生物医药责任有限公司) ;TO-3A型血型血清学用离心机和FYQ免疫微柱孵育器 (长春博研科学生物仪器有限责任公司) ;电热恒温水箱 (天津市泰斯特仪器有限公司) 。
1.3 试验方法
1.3.1 标本预处理
取200µL孕妇血清标本和200µL 0.2mol/L 2-巯基乙醇应用液充分混匀, 试管加塞盖置37℃水浴60min, 充分裂解血清中IgM类抗体, 吸经2-ME处理的血清用生理盐水做倍比稀释, 稀释度分别为1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512, 留待进行平行试验。
1.3.2 MGI
取微柱凝胶试剂卡做好标记在微孔内各加入50µL与孕妇配偶相同血型的0.8%标准红细胞悬液, 再依次加入上述处理的稀释度为1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512的血清50µL, 置专用孵育器内37℃孵育15min, 再放入专用离心机离心5min (900转/分, 2min;1500转/分, 3min) , 结果判定以出现1+号凝集的最高稀释度的倒数为抗体效价。
2 结果
结果判定以出现1+号凝集的最高稀释度的倒数为IgG抗-A (B) 和抗-D的价效, IgG抗-A (B) 价效≥64为异常, 抗-D检出者为阳性, 未检出者为阴性。
在所检测的241例O型血孕妇中, 配偶血型组合 (O-A) 、 (O-B) 、 (O-AB) 的例数116、102和23, 抗体效价≥64有81例, 异常检出例占总数的33.6% (81/241) 其中IgG抗-A测定有139, 例效价≥64有36例, 异常检出占总抗-A的14.9% (36/241) , IgG抗-B测定有125例, 例效价≥64有45例18.67% (45/241) 。结果见表1。其中19例gG抗-A (B) 效价≥64, O型血孕妇所生新生儿作HDN血清学检查, 结果见表2。
注:与IgG抗-A (B) 效价为64比较, *P<0.01
3 讨论
新生儿溶血病 (HDN) 是指母婴血型不合引起的同族免疫性溶血。有报道说ABO溶血病占新生儿溶血的85.3%, Rh溶血病占14.6%, MN溶血病占0.1%。ABO血型不合中约1/5发病, RhD血型不合者约1/20发病。本病主要是母婴间血型不合而产生同族血型免疫反应的遗传性疾病。其次是RH系统, 胎儿由父母新方面遗传来的显性抗原恰为母亲所缺少, 此抗原侵入母体, 产生免疫抗体, 通过胎盘绒毛膜进入胎儿血循环与胎儿红细胞凝集、使之破坏而出现溶血, 引起贫血、水肿、脾肿大和生后短时间内出现进行性重度黄疸, 甚至发生胆红素脑病。常导致胎儿早期流产或新生儿贫血, 甚至造成新生儿死亡等严重后果。已知的可发生新生儿溶血病的20多个血型系统200余个血型抗原中, 以ABO系统最为常见, 其次RH系统, 每个血型系统在遗传上都是独立的, 并按孟德尔法则遗传。引起新生儿溶血病以的ABO系统为最多, 次为Rh系统, ABO血型系统引起防新生儿溶血病的比例比RH系统多[1]。检测母亲血清中是否存在IgG性质抗-A (B) 抗体及效价, 就可对ABO系统HDN发生进行预测, ABO溶血病通常以母亲为O型, 子女为A型或B型的发病率为高[2], 所以IgG-A (B) 水平的测定对胎儿溶血症状的减轻, 新生儿HDN发病率的降低有着非常重要的意义。对待妊娠约20周的、ABO血型不合的孕妇, 特别是存在原因不明的流产、早产、死胎等情况的, 需要动态监测血型抗体效价, 若母亲的IgG-A (B) ≥128, 结果很可能是婴儿已经受害, 若IgG-A (B) ≥512, 几乎98.1%发病[3]。表2结果表明新生儿HCN发病率与母体内的IgG血型效价呈正相关[4]。此时就需要格外重视, 并积极采取措施降低孕妇体内Ig G水平。
HDN的发病率随着母体内的IgG类血型抗体水平增高而增大, 所以对母体IgG-A (B) 和抗-D效价进行有效的检测, 可避免免疫性溶血的发生, 有利于早期诊断和治疗。我院采用微柱凝胶免疫试剂卡检测IgG血型抗体效价孕妇进行产前干预治疗, 可明显降低HDN的发病率。
摘要：目的 探讨对孕妇血清中IgG类血型抗体效价与新生儿溶血病 (HDN) 之间的关系, 对孕妇血清中血型抗体效价的检测, 了解IgG抗-A (B) 和抗-D水平在孕妇中的分布情况, 为预防及治疗HDN提供重要的试验依据。方法 采用微柱凝胶技术分别分别对241例O型血孕妇和7例RhD阴性血孕妇血清gG抗-A (B) 和抗D水平做出检测。结果 在所检测的241例O型血孕妇中, 配偶血型组合 (O-A) (、O-B) 、 (O-AB) 的例数116、102、和23, 其中IgG抗-A测定有139, 抗体效价≥64有36例, 异常检出例占总数的14.9% (36/241) , IgG抗-B测定有125例, 效价≥64有45例, 异常检出例占总数的18.6% (45/241) 。其中19例gG抗-A (B) 效价≥64, O型血孕妇所生新生儿中, 有4例患HDN, 阳性率占21.1%, 7例gG抗-A (B) RhD阴性血孕妇血清中1例检出gG抗-D抗体, 抗体检出率占14.3%。结论 HDN的发病率随着母体内的IgG类血型抗体水平增高而增大。
关键词：微柱凝胶技术,血型IgG抗体效价,新生儿溶血病
参考文献
[1]刘达庄.免疫血液学[M].上海:上海科学技术出版社, 1981:76-77.
[2]达庄.免疫血液学[M].上海:上海科学技术出版社, 2002:128-131.
[3]孙悦玲, 施选性, 金春子, 等.O型流产妇女再孕与IgG抗体效价的关系[J].中国优生与遗传杂志, 2005, 13 (10) :68-69.
效价跟踪 篇4
关键词：新生儿溶血病,母婴血型不合,ABO血型,RhD血型,抗体效价
新生儿溶血病(hemolytic disease of newborn,HDN)是由于母婴血型不合,母体血液中含有针对胎儿或新生儿红细胞抗原免疫性抗体(IgG类),并通过胎盘绒毛膜进入胎儿血液循环,致敏胎儿而发生同种免疫引发溶血。在人类已经发现的血型系统中,ABO-HDN是以母婴ABO系统血型不合引起的,发病率最高,约占HDN总发病率的85.3%,病死率约为1.4%[1],其次为Rh血型系统,其他血型系统HDN较少见[2]。笔者将从2008年起对云浮市级医院就诊的ABO/RhD血型不合的孕妇血清进行IgG-A或IgG-B、抗-D效价测定,分析HDN与孕妇妊娠次数及年龄之间的关系,分析抗体效价与发生HDN的关联性,以便于对高危孕妇进行早期干预,有效预防HDN的发生或减少对胎儿的危害,对优生优育、提高胎儿生存质量具有重要意义[3]。
1 对象与方法
1.1 检测对象
选择云浮市市级医院门诊及住院孕妇,在妊娠早期10～16周选择孕妇ABO血型为O型,丈夫为A型或B型;孕妇为A型,丈夫为B型或AB型;孕妇为B型,丈夫为A型或AB型;共计380例。Rh血型系统孕妇为RhD阴性者8例。其中ABO血型系统孕妇1次妊娠者238例(62.63%),多次妊娠(2次及2次以上,包括有流产史)者142例(37.36%),孕妇年龄在21～40岁之间,其中分21～30岁年龄段(适龄产妇)和31～40岁年龄段(高龄产妇)两组。
1.2 试剂和仪器
ABO血型抗-A、抗-B及抗-D血型定型试剂(由长春博德生物技术有限责任公司提供);IgM-D筛选试剂(由上海血液生物医药有限责任公司提供);抗球蛋白试剂和2-巯基乙醇(2-Me,由上海血液生物医药有限责任公司提供);凝聚胺试剂盒(由长春博德生物技术有限责任公司提供);微柱凝胶检测卡(由长春博迅生物技术有限责任公司提供);ABO标准试剂红细胞由本站血型参比试验室自制;CCBY免疫微柱孵育器(由长春博迅生物技术有限责任公司提供);KA-2200离心机(日本KUBOT生产),OLYMPUS-CX21型生物显微镜(日本OLYMPUS生产)。
1.3 检测方法
1.3.1 输血规程
夫妇ABO/RhD血型检测严格按照《中国输血技术操作规程(血站部分)》执行。
1.3.2 微柱凝集法孕妇血清红细胞不规则抗体筛选及鉴定[4]
分别在3个微柱孔下标记Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,在反应池中分别加10μL5%相应筛检红细胞,再分别各加40μL待检血清,置微柱凝胶专用孵育器孵育(37℃,10 min);取出后置专用微柱凝胶离心机离心。观察结果:红细胞全部沉于微柱底部者为阴性,全部或部分红细胞滞留于微柱凝胶孔中者为阳性。如红细胞不规则抗体筛选阳性需进一步进行抗体鉴定,操作方法同上。自身抗体阳性的待检血样采用微柱凝胶自身抗体分型卡(AHG/IgG/C3d)进行抗体分型,操作方法同上。
1.3.3 IgG-A或IgG-B及抗-D抗体效价检测
参考具体文献[5]执行。
1.4 统计学处理
采用SAS 8.1统计软件进行统计学分析,计数资料采用χ2检验,P<0.05或<0.01均表示有统计学意义。
2 结果
2.1 孕妇血清IgG-A或IgG-B抗体效价测定
共检测380例ABO血型不合孕妇血清中的IgG-A或IgG-B抗体效价,其中孕妇为O型367例(96.7%),A型7例(1.8%),B型6例(1.5%)。在380例孕妇中检出IgG-A或IgG-B抗体效价≥1∶64者204例(53.6%),其中1次妊娠且年龄在21～30岁者94例(39.5%),多次妊娠且年龄在31～40岁者110例(77.4%),多次妊娠者IgG-A或IgG-B抗体效价≥1∶64者明显多于1次妊娠者(P<0.01);在31～40岁年龄段的孕妇IgG-A或IgG-B抗体效价≥1:64者明显多于21～30岁年龄段的孕妇(P<0.01),结果见表1、2。
注:两组比较,χ2=11.543,P<0.01
2.2 Rh系统抗-D效价检测
在8例RhD阴性孕妇中检出抗-D者5例(62.5%),抗-D效价≥l∶32者1例(12.5%),抗-D效价≥l∶64者2例(25.0%),抗-D效价≥l∶128者2例(25.0%)。
3 讨论
产前IgG型血型抗体的检测作为预防HDN的早期检查已备受重视。妊娠期间母婴的血液循环为各自独立的系统,血液有形成分一般是不相通的。但在妊娠期间难免有少许绒毛破损,可能会发生极少胎儿血液进入母体血液循环。当一次进入母体的血液达到1 ml以上时,就能致敏孕妇产生抗体。一旦致敏,再次妊娠时如果极少量的带有相应抗原的胎儿血液进入母体,回忆反应就会导致孕妇体内抗体迅速升高。5%～10%的孕妇在妊娠2个月时,在血液中可以找到胎儿红细胞;有10%～20%的胎儿红细胞进入母体量在0.1～30 ml。母婴血液互相渗透,会发生同种免疫应答,产生IgG类抗体,该类抗体可以自由通过胎膜屏障,进入到胎儿血液循环致敏胎儿红细胞,导致胎儿红细胞发生血管外溶血,引起胎儿或出生后HDN。而ABO、RhD血型系统引起的HDN最为常见。当孕妇血清中IgG-A或IgG-B抗体效价≥1∶64或RhD阴性孕妇血液中产生针对胎儿RhD抗原的抗-D抗体时,胎儿有可能发生HDN。临床通常以IgG-A或IgG-B抗体效价≥1∶64作为阳性指标,当IgG-A或IgG-B抗体效价≥1∶128时,新生儿发生HDN的几率增大,IgG-A或IgG-B抗体效价≥1∶512时,新生儿几乎100%的受害,因此,临床上要采取早期预防措施[6]。对孕妇为O型或RhD阴性,丈夫为A、B、AB型或RhD阳性者,在妊娠6个月时进行IgG抗体效价检测,凡抗体效价在1∶64以上即开始进行治疗,有效地预防了宫内发育迟缓,减少了流产或死胎的发生。但是有必要了解妊娠次数与年龄因素与发生HDN的风险关系,本次研究表明,多次妊娠的孕妇其产生IgG-A或IgG-B抗体效价≥1∶64者明显多于1次妊娠者,且年龄在31～40岁年龄段的孕妇其产生IgG-A或IgG-B抗体效价≥1∶64者明显多于21～30岁年龄段者,说明多次妊娠者及高龄产妇发生ABO-HDN的几率较高,应当对这些特征的孕妇定期进行IgG-A或IgG-B抗体效价检查,对IgG-A或IgG-B效价≥1∶64者早期采取有效的预防措施及产后的治疗措施。
由于我国汉族人群RhD阴性率为0.4%[7],因此Rh血型系统抗原引起的HDN相对ABO较少,但病情程度严重。Rh血型不合引起的HDN一般不发生于第一胎[6]。但多次妊娠,血型抗体产生的几率会增加,胎儿患病可能性也增大。本研究在8例RhD阴性孕妇血清中检出抗-D 5例(62.5%),4名孕妇有2次以上妊娠史,1名有输血史,因此产前RhD的常规检测是十分必要的,对首次妊娠检测出抗-D的孕妇应在产后72h内预防性注射免疫球蛋白,防止在下次妊娠时发生HDN。目前对HDN的预防,主要依赖于孕妇产前ABO/RhD血型鉴定及其抗体效价检测的血型血清学指标,因此,夫妇血型不合的孕妇产前抗体效价普查的意义显得格外重要。为围产期HDN的监测、预防、治疗提供了可靠依据,发现异常及时进行妊娠期干预治疗,可以有效地预防和减少HDN的发生率[9],对优生优育工作及提高人口素质有重要意义。
参考文献
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[4]李勇,杨贵贞.人类红细胞血型学实用理论与实验技术[M].北京:北京科学技术出版社,1999:139-157.
[5]田兆嵩.临床输血质量管理指南:技术性规程示例[M].北京:科学出版社,2011:255-257.
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[7]李雪英,张国平,韩惠云,等.焦作市无偿献血者ABO及Rh血型分布调查[J].临床和实验医学杂志,2006,5(10):1555.
效价跟踪 篇5
链霉素(streptomycin, SM)是常用的氨基糖苷类抗生素,在治疗家畜感染性疾病中发挥了重要的作用,还可用于农作物细菌性病害的防治。《中国药典》(2010版 二部)规定链霉素的效价采用抗生素微生物检定法进行测定[1],其中最常用的是管碟法,即利用链霉素对敏感指示菌枯草芽胞杆菌的抑菌圈直径大小来描述其生物活性高低。由于管碟法具有准确、直观、重复性好等优点,目前已广泛用于链霉素成品含量[2]及生物样品中链霉素残留量[3]的检测。但该法操作繁琐,耗时长,不能及时提供效价检测数据,因此不适用于发酵过程的监控。由于链霉素在碱性溶液中,其链霉糖结构经重排使环扩大形成麦芽酚,麦芽酚与硫酸铁铵溶液形成紫红色配位化合物,此配位化合物在520 nm处存在最大吸收,因此,有研究采用分光光度法来检测成品中硫酸链霉素的含量[4,5],对于发酵液中的链霉素的含量,由于受多种干扰物质的影响,则无法采用此方法。本研究利用盐酸羟胺法使发酵液中链霉素失活,并以此液作为对照来排除发酵液颜色对吸光度的干扰,成功地将分光光度法用于发酵液中链霉素效价的检测,该方法简便、快速、准确,适用于发酵生产中间过程的监测、菌种选育等。
1材料与方法
1.1仪器
UV—752型紫外可见分光光度计,上海佑科仪器仪表有限公司;METTLERAE240型电子天平,梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司;HH—4型数显恒温水浴锅,国华电器有限公司;TGL—10TA型高速冷冻离心机,上海安亭科学仪器厂。
1.2药品与试剂
链霉素标准品,购于中国药品生物制品检定所,批号 0308-200012,效价731 u/mg;1%硫酸铁铵溶液(称取硫酸铁铵·12H2O 1.8 g,置于100 mL容量瓶中,加入5%硫酸溶液溶解并定容至刻度,摇匀);草酸;盐酸羟胺;氢氧化钠。所用药品均为分析纯。
1.3链霉素发酵液
灰色链霉菌(Streptomyces griseus),中国工业微生物菌种保藏管理中心提供。采用葡萄糖、黄豆饼粉、硫酸铵、玉米浆、磷酸氢二钾、碳酸钙培养基(pH 7.5),接种量6%,160 r/min摇瓶振荡培养7 d,0～96 h温度为30 ℃,96～168 h温度为28 ℃。
1.4溶液的配制
1.4.1 链霉素标准贮备溶液
精确称取链霉素标准品,精确至0.1 mg,用水溶解并稀释成含链霉素1.4 mg/mL的溶液,0～4 ℃保存备用。
1.4.2 链霉素标准工作溶液
精确量取链霉素标准贮备溶液,用水稀释成含链霉素质量浓度为1.4、1.2、1.0、0.8、0.6、0.4和0.2 mg/mL的标准工作溶液,各浓度对应效价分别为1 023.4、877.2、731、584.8、438.6、292.4、146.2 u/mL。
1.4.3 供试品溶液的制备
吸取15 mL稀释一定倍数的发酵液于离心管中,用草酸将发酵液酸化至pH=3左右,75 ℃水浴10 min,既可使与菌丝体结合的链霉素释放出来,又可使蛋白质沉淀,再冷却至室温,于7 000 r/min 离心10 min,上清液即为供试品溶液。
1.5测定方法
1.5.1 标准曲线制作
分别吸取各浓度链霉素标准工作溶液5 mL于试管中,空白试管中加入5 mL水和1滴4%盐酸羟胺,分别向各管中加入2 mol/L NaOH溶液1 mL,摇匀后置于85 ℃水浴中15 min,冷却至室温,再加入1%硫酸铁铵2 mL,摇匀,静置10 min,于520 nm波长下测定吸光度。以链霉素效价为纵坐标,吸光值为横坐标作线性回归,求出回归方程。
1.5.2 供试品溶液效价的测定
分别吸取5 mL供试品溶液置于两支试管中,向其中一支试管中加入4%盐酸羟胺1滴作为空白对照,按1.5.1方法测定其在520 nm波长下的吸光度,将所测得的吸光值代入回归方程,计算供试品效价,再根据稀释倍数,即可求出发酵液的效价。
1.6回收率试验
吸取2.5 mL已知效价的供试品溶液置于5支试管中,分别向各管中加入效价为82、156、338、454和520 u/mL的链霉素标准工作溶液2.5 mL,空白试管中加入2.5 mL供试品溶液、2.5 mL水和1滴4%盐酸羟胺,混匀,按1.5.1和1.5.2的方法检测并计算混合液效价,再根据供试品溶液的已知效价值,求出加入的链霉素标准品效价测量值,计算回收率。
1.7稳定性试验
取一定量发酵168 h的灰色链霉菌发酵液,适当稀释后立刻按1.4.3的方法制备供试品溶液,在室温、无日光照射下放置,分别于放置后的0、6、12、18和24 h按1.5.1和1.5.2的方法检测并计算供试品溶液的效价。
1.8重复性试验
分别吸取5 mL供试品溶液置于6支试管中,向其中的一支试管中加入1滴4%盐酸羟胺作为空白对照,按1.5.1和1.5.2的方法检测并计算供试品溶液的效价。
2结果
2.1标准曲线的绘制
利用链霉素的专属反应——麦芽酚反应,用硫酸铁铵溶液作为显色剂,采用分光光度法测定不同浓度链霉素标准品溶液在520 nm 处的吸光度,结果如表1所示。
以吸光值为横坐标,链霉素效价为纵坐标做线性回归,结果见图1。
线性回归结果表明,链霉素效价在146.2～1 023.4 u/mL,吸光值与效价呈良好的线性关系。回归方程为y=1 444.188x-7.523,相关系数r2=0.999 1。
2.2回收率
通过回收率试验,测量发酵液及链霉素标准品混合液经麦芽酚反应和硫酸铁铵显色后在520 nm处的吸光度,计算混合液的效价,并进一步求出链霉素标准品的效价,结果见表2。
由表2可见,分光光度法测定发酵液中链霉素的平均回收率99.16%。
2.3稳定性
将制备好的供试品溶液于室温、无日光照射下放置,分别在0、6、12、18、24 h后采用分光光度法测定链霉素效价,结果见表3。
由表3可见,供试品溶液的链霉素效价在24 h内基本无变化,RSD为0.52%,表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.4重复性
测量5份供试品溶液的效价,RSD为0.64%(n=5),表明该法重现性较好。
2.5分光光度法与管碟法测定链霉素效价的结果比较
随机取4份供试品溶液分别用分光光度法和管碟法检测链霉素的效价,结果见表4。
由表4可知,用2种方法测定的链霉素效价结果基本一致,二者相对偏差均在5%以内,实验结果可靠。
3讨论与结论
分光光度法是检测抗生素效价的一种主要方法,它是根据抗生素的特征性光吸收值或与显色剂反应后的特征性光吸收值来进行检测的,由于具有简便、快捷、准确等优点已普遍用于纯品抗生素的分析[5]。对于发酵液中抗生素效价的检测,由于受多种有色物质的干扰,使光吸收受到影响,从而限制了分光光度法的应用[6]。以链霉素失活的发酵液作为对照,解决了发酵液颜色对检测结果的影响,通过回收率、稳定性、重复性等试验,得出以下结论。
(1)用分光光度法测定链霉素生产发酵液的生物效价,结果可靠,重现性好,操作步骤简单,检测周期短,从样品制备到检测结束的整个过程在90 min内即可完成。
(2)随机抽取4份链霉素发酵液,同时用分光光度法和管碟法检测发酵液的链霉素效价,结果显示:分光光度法与管碟法的结果基本一致,可见,分光光度法在实际工作中可行。与管碟法相比,分光光度法操作步骤简单、耗时短,更适合于发酵生产中间过程的监测和菌种选育等。
(3)分光光度法检测发酵液中链霉素效价的操作要点是,发酵液在检测前必须先进行酸化处理,以使与菌丝体结合的链霉素释放出来。另外,发酵液的颜色是影响吸光度的重要因素,制约了分光光度法的应用,利用盐酸羟胺与链霉素反应生成链霉污,从而使链霉素失活的特性,在发酵液中加入一滴4%盐酸羟胺作为空白对照,即可排除发酵液颜色对测定结果的影响。
摘要：建立使用分光光度法测定发酵液中链霉素效价的方法。发酵液经草酸预处理后,利用链霉素的专属反应——麦芽酚反应,用硫酸铁铵溶液作为显色剂,于520nm波长下测定吸光度。检测过程中以链霉素失活的发酵液作为对照,成功排除了发酵液颜色对吸光度的干扰。结果表明:链霉素效价在146.2～1023.4u/mL范围内,吸光值与效价呈良好的线性关系,r=0.9991,平均回收率为99.16%(RSD=0.94%,n=5)。该法简便、准确、回收率高,可快速测定发酵液中链霉素效价。
关键词：链霉素,分光光度法,发酵液
参考文献
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效价跟踪 篇6
抗生素效价测量系统是对抗生素药物药效进行测量的系统,测量时在菌液中加入一定剂量药品,37℃恒温条件下,在6h或更长时间内测量并记录菌液浊度变化,根据药典中一剂量标准曲线法、二剂量法或三剂量法[1,2]对药物效价进行测量[3,4]。
目前,北京潮声公司已经推出基于浊度法抗生素效价测量系统,该系统内置单色仪,采用旋转机构使样品室转动从而实现对每个样品浊度测量,系统一共有42 个测量单元,该系统为旋转机构,易产生重复性误差,且单色系统长时间工作易产生光强波动从而造成测量误差。
本文提出一种新的抗生素效价测量系统设计方法,特点是采用发光二极管做为光源,系统中没有活动部件,并且对光强波动进行校正。
1 系统总体结构
系统总体结构如图1 所示。系统包括4 个部分:恒温子系统、测量子系统(由35 个测量单元构成)、数据采集系统和计算机系统,其中恒温子系统是定制,温度恒温范围是37℃ ± 0.2℃。数据采集系统由数据采集卡实现数据采集,通过USB通讯将数据传输到计算机,由Labview编写计算机程序进行数据处理,同时显示结果。
1.1 测量单元基本结构
测量子系统是整个系统核心;该部分有35 个测量单元,每个单元结构完全一致,如图2 所示。
绿色发光二极管前面放置直径为2mm光阑,作为光束口径限制,发光二极管灯丝中心位置放在准直物镜(镜焦距为5mm)焦点上,产生平行光射入菌液,经过菌液吸收,出射平行光被汇聚透镜汇聚由硅光电池接收。
①光二极管;②光阑;③准直物镜;④样品池;⑤汇聚物镜;⑥硅光电池;⑦磁铁;⑧马达。
系统中所使用样品池为10mm×20mm×150mm样品池,高于且宽于标准10mm×10mm×50mm样品池,主要由于试样体积较大,传统样品池容量太小。
每个测量单元底部装有一个电机,电机上装有磁铁,在样品池内加入磁珠,当磁铁随电机转动时,磁珠在样品池内转动,从而带动液体转动,可以防止菌液中悬浊物固化在样品池内壁上影响测量。
1.2 发光二极管驱动电路设计
系统工作时,要在恒温37℃条件下连续工作6h或更长,因此光强稳定性异常重要,如果光强发生偏差,则必会造成很大测量误差。为保证发光强度稳定性,系统采用恒流源驱动发光二极管,因发光二极管发光强度与流经二极管电流近似成线性关系,只要保证电路中电流恒定,即可保证发光二极管光强稳定性。电路如图3 所示。
电源电压为+5V,电阻R1和R2阻值可以选择为5K欧姆,A电位为2.5V,根据虚短概念B点电位也为2.5V,C点电位也为2.5V,R3阻值为2.5K欧姆,三极管射级电流为1m A恒流,基极电流与射级电流相等,也为1m A,用来驱动发光二极管发光。R3可以改为电位器,可以根据实际情况改变R3阻值,从而改变发光二极管亮度。
1.3 系统光强稳定性实现
虽然采用恒流源驱动发光二极管,但是在长时间测量中还是会有光强漂移,导致测量结果误差,为克服这些误差,系统专门设置一个通道为参比通道(Reference tunnel,在本设计中采用是通道①,如图1 所示),在该通道样品池中只加入蒸馏水,不进行样品测量。在采集数据时,同时采集被测通道和参比通道信号,由于电路设计一致性,如果光强度有漂移,那么参比样品池与被测样品池应该是漂移幅度一致。
测量前,先记录下每个被测通道(共34 个)和参比通道最初光强(初值),在实际测量时采用公式(1)进行补偿:
式中R1是当前参比通道光强值,R0是参比通道光强初值,S0是被测样品通道光强实测值,S1是光强真实值。
因参比与实测漂移幅度一致,真实值S1可以按下式(2)求得。
此方法可保证系统在10h长时间测量时漂移为0.002 个吸光度,保证测量结果长时间稳定。
2 数据采集实现
数据采集由阿尔泰公司数据采集卡PCI-2318 实现,为采样速率100KSPS12 位数据采集卡,由于系统有35 个通道,因此,在采集卡前方放置一个多通道模拟开关,通过开关选择测量哪一个通道浊度。结构如图4 所示。参比信号为通道1,每次测量时,同时采集参比信号与被测信号,按公式(2)计算后得到结果。
3 系统标定实现
对于每一个被测单元,均需要对其进行定标。定标基本方法为,配置6 种不同吸光度菌液,分别为0.1 个、0.3 个、0.5 个、0.7 个、0.9 个、1.1 个吸光度[5,6],菌液吸光度值均由标准紫外可见分光光度计(TU1901)测定,将标准吸光度菌液放入每个被测通道中,得到实际测量结果,实测结果与标准结果用最小二乘法拟合,得到标准曲线,实际测量时,测得被测值带入公式中,可得到标准吸光度值[7,8,9]。
4 实验
我国药典规定,可以采用一剂量标准曲线法、二剂量法和三剂量法计算某种药品效价,本次实验中采用一剂量标准曲线法。配置5种不同浓度标准样品(分别为10%、20%,30%,40%,50%),这些标准样品每种浓度配置5份,5种不同浓度标准品共25份,分别以相同剂量加入菌液中,被测样品同样配置5份,整个实验需30个测量单元,在37℃恒温条件下连续6 h测量并记录浊度,每个5min记录浊度测量结果,具体测量过程如图5所示。
搅拌防止悬浊物质凝固在样品池池壁上影响光透射,停止搅拌后等待110s目的是搅拌后液体彻底稳定,防止液体中存在漩涡等影响浊度测量。浊度测量结束后等待140s,保证每个测量周期为5min(300s),共进行6 h测量(也可以根据需要进行其他时长测量,如10h),共72 次测量,保存每次测量结果以备未来查看。图6 为某几个通道测量数据显示。
测量完毕后以浊度值平均值和标准样品浓度负对数值进行拟合,得到标准曲线。将被测样品浊度值带入标准曲线即可得到其效价。以北京潮声公司效价测量仪为定标仪器,可以确定本系统效价测量准确度为3%。(实验中所有操作均由国内某省级药检所专业人员完成)
5 小结
本文采用方法基于发光二极管抗生素效价测量,该方法特点是没有活动部件,系统中所有元件均固定,免除移动部件可能带来测量误差,而且对光强波动进行校正,系统一共35 个测量单元,每个单元独立且功能完全一致,使用方便,可以推广。
参考文献
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效价跟踪 篇7
花椒籽油中脂肪酸的主要成分是油酸、亚油酸和亚麻酸,其次是含量较低的软脂酸、硬脂酸和棕榈油酸,最后是微量组分十七碳烯酸,不含花生四烯酸[4],其中富含的 α - 亚麻酸是合成二十碳五烯酸( EPA) 和二十二碳六烯酸( DHA) 的前体物质,与大脑和视网膜的发育有关; 还可以增强机体免疫能力; 防治多种心脑血管疾病,并有抗炎、抗过敏、抗癌、抗衰老、抗抑郁及促进毛发生长等多种作用[5 -7]。用富含 α - 亚麻酸等化合物的花椒籽饲喂动物可以得到含n -3系多不饱和脂肪酸的肉制品和奶制品[8]。
花椒籽中油脂含量为27% ~ 31%,出油率为20% ~ 25% ,高于大豆、棉籽。除含丰富的油脂外,花椒籽脱脂后的饼粕中蛋白质含量在48% 以上,其氨基酸成分比较齐全[9 -10],且各种必需氨基酸的含量较高,与大豆相比,有些氨基酸含量较低,但可作为鸡、猪等畜禽的饲料与其他谷物混合使用。花椒籽油含有丰富的钙、镁、铁、锌及较高的锶、锰等机体必需的矿物质元素[6]。花椒籽中的香豆素使其具有芳香甜味,可增加雏鸡的适口性,使雏鸡的采食量提高[11]。花椒籽中含丰富的油脂、不饱和脂肪酸和蛋白质,是优质的能量饲料,可部分代替玉米,作为一种重要的原料添加到饲料中[12]。
谢红兵等[13 -14]研究发现: 适当添加花椒对肉鸡及肉雏鸡的生长、免疫等机能有促进作用; 花椒籽作为一种高能饲料添加原料,所含有的不饱和脂肪酸类,芳樟醇、柠檬烯等挥发油类,香豆素类,氨基酸及微量元素等多种物质与花椒化学成分相同[15]。本试验旨在通过研究花椒籽对肉雏鸡免疫器官指数及抗体生成的影响,为其生产应用提供数据支持。
1材料与方法
1. 1试验药品
花椒籽粉末,选自四川省汉源县,粉碎过40目筛; 盐酸小檗碱( 批号为20110205) ,购自石家庄正大鸿福牧业有限公司。
1. 2试验动物与分组
选择11日龄健康雄性青脚麻肉鸡( 以下简称肉鸡,由四川农业大学家禽育种场提供) 150只,随机分成空白对照组,药物对照组,试验Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组,每组设3个重复,每个重复10只鸡。空白对照组饲喂基础日粮; 药物对照组饲喂基础日粮+ 0. 2% 盐酸小檗碱; 试验Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组分别饲喂基础日粮+ 0. 5% 、1. 0% 、1. 5% 花椒籽粉,试验时间为42 d。基础日粮参照美国NRC( 1994年) 《家禽的营养需要量》配制,其组成及营养水平见表1。
注: 每千克维生素预混料含维生素A 54 000 000 IU,维生素B12 000 IU,维生素D310 800 000 IU,维生素B215 000 IU,维生素E 18 000 IU,维生素B67 000 IU,维生素K 35 000 IU,维生素B1230 mg, D - 泛酸钙25 000 IU,烟酸35 000 IU,叶酸500 mg,生物素500 mg; 每千克矿物质预混料含铜8. 0 mg,锌40 mg,锰60 mg,碘0. 35 g,硒0. 15 g。
1. 3饲养管理
试验鸡饲养于育雏舍内,自由采食、饮水,保持舍内空气新鲜,舍内温度在肉雏鸡7日龄为35 ℃左右, 以后每周下降2 ~3 ℃,直至常温。人工饲喂,最初几天,每隔4 h饲喂1次,每昼夜6次。以后随着日龄的增长逐渐减少,到第4周时每天饲喂4次。最初的1周雏鸡饮用温水,1周后饮用冷水。保证水的清洁和鸡舍内良好的环境卫生,并按照正常免疫流程进行免疫。免疫流程为: 5 d用新城疫疫苗+ 传染性支气管炎疫苗滴鼻点眼; 12 d用传染性法氏囊疫苗饮水并注射禽流感H5疫苗; 20 d再进行新城疫疫苗及传染性支气管炎疫苗滴鼻点眼。
1. 4样品采集
于1,14,28,42日龄每个重复中随机取3只雏鸡空腹称其体重,颈静脉放血处死,分离脾脏、胸腺、法氏囊并称重,计算免疫器官指数,计算公式: 免疫器官指数= 免疫器官重量( g) /动物体重( kg)[13]。
分别于1,14,28,42日龄每组随机抽取16只鸡, 经翅静脉采血,分离血清,进行血凝和血凝抑制试验, 测定其新城疫和禽流感H5抗体效价。
1. 5统计学分析
采用SPSS 17. 0软件中的ANOVA模块进行单因子方差分析和Duncan’s多重比较,以P <0. 05为显著水平,试验数据用平均数 ± 标准差表示。
2结果与分析
2. 1花椒籽对肉雏鸡免疫器官指数的影响( 结果见表2)
注: 同列数据肩标字母完全不同表示差异显著( P < 0. 05) ,含相同字母或无肩标表示差异不显著( P >0. 05) 。
由表2可知: 各组胸腺指数进行比较,1日龄时, 各组间差异不显著( P >0. 05) ; 14日龄时,试验Ⅱ组比空白对照组提高8. 79% ( P <0. 05) ; 28日龄时,各组间差异不显著( P >0. 05) ; 42日龄时,药物对照组和试验 Ⅱ 组分别比空白对照组提高11. 69%、 12. 95% ( P < 0. 05) 。各组法氏囊指数进行比较,1, 14日龄时,各组间差异不显著( P > 0. 05) ; 28日龄时,试验Ⅱ组比空白对照组提高13. 55%( P <0. 05) ; 42日龄时,试验 Ⅱ 组比空白对照组提高14. 04% ( P <0. 05) 。各组脾脏指数进行比较,1日龄时,各组间差异不显著( P >0. 05) ; 14日龄时,试验Ⅱ组比空白对照组提高15. 91% ( P < 0. 05) ; 28日龄时,试验 Ⅱ组与试验Ⅲ组分别比空白对照组提高18. 78% 、 20. 44% ( P < 0. 05) ; 42日龄时,药物对照组、试验Ⅱ组与试验Ⅲ组分别比空白对照组提高18. 75%、24. 48%、 16. 15% ( P < 0. 05) ,比试验Ⅰ组分别提高12. 87% 、 18. 32% 、10. 40% ( P < 0. 05) 。从以上结果可以看出, 花椒籽对肉鸡免疫器官有一定的促生长作用。
2. 2花椒籽对肉雏鸡抗体效价的影响( 见表3、 表4)
lb
注: 同列数据肩标字母完全不同表示差异显著( P < 0. 05) ,含相同字母或无肩标表示差异不显著( P >0. 05) 。
由表3可知: 1,14日龄时,各组间差异不显著( P >0. 05) ; 28日龄时,药物对照组、试验Ⅱ组与试验 Ⅲ组分别比空白对照组提高9. 93% 、15. 03% 、 12. 16% ( P < 0. 05) ; 42日龄时,试验Ⅱ组比空白对照组提高8. 23%( P <0. 05) 。
lb
注: 同列数据肩标字母完全不同表示差异显著( P < 0. 05) ,含相同字母或无肩标表示差异不显著( P >0. 05) 。
由表4可知: 1日龄时,各组间差异不显著( P > 0. 05) ; 14日龄时,试验Ⅱ组比空白对照组提高14. 13% ( P <0.05) ; 28日龄时,试验Ⅱ组比空白对照组、试验Ⅰ 组显著提高11.20%、6.68%; 试验Ⅲ组比空白对照组、 试验Ⅰ组提高9.83%、5.37%( P <0. 05) ; 42日龄时,药物对照组、试验Ⅱ组、试验Ⅲ组分别比空白对照组提高6. 22% 、6. 85% 、5. 46% ( P < 0. 05) 。
3讨论
胸腺、法氏囊和脾脏是肉鸡最重要的免疫器官, 参与全身的细胞免疫和体液免疫。胸腺是细胞免疫的中枢器官,是畜禽的一级淋巴器官及血液中淋巴细胞的主要来源,法氏囊属淋巴样上皮结构,是禽类特有的免疫器官,是血清抗体生成系统的细胞成长和分化部位,法氏囊分化生成大量的浆细胞和各种特异性的细胞,转移到脾脏、盲肠、扁桃体及其他淋巴组织中,参与体液免疫反应,从而产生抗体提高机体免疫力。脾脏则是禽类最大的外周免疫器官,产生大量的淋巴细胞,参与全身的细胞免疫和体液免疫[16]。A. Rivas等[17]研究发现,胸腺、脾脏及法氏囊的器官指数可用于评价雏鸡的免疫状态,这些免疫器官的绝对重量和相对重量越大,则说明机体的细胞免疫和体液免疫机能越强。本试验结果表明,添加适量花椒籽可有效提高肉雏鸡的免疫器官指数,在一定程度上增加免疫器官重量,表现出对机体免疫功能的增强效果。
饲喂花椒籽后新城疫抗体效价在28,42日龄时差异显著( P < 0. 05) ,而禽流感H5抗体效价在14, 28,42日龄差异显著( P < 0. 05) ,说明添加适量花椒籽可提高新城疫及禽流感H5抗体效价水平,并延长其抗体效价值的高峰期,从而起到提高动物抗病力的作用。
花椒籽具有提高动物机体免疫机能的作用,其原因可能是: 首先,机体的免疫功能与自由基的关系非常密切,花椒籽所含的 α - 亚麻酸具有清除自由基的功能,从而增强肉鸡的免疫功能[18]。另外,花椒籽含有多种花椒挥发油有效成分,有助于降低肠道微生物所产毒素的浓度,通过增加溶菌酶含量及巨噬细胞吞噬活性来增强机体的免疫能力。研究显示,花椒中含有大量的活性物质,对炭疽杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等革兰阳性菌及大肠杆菌、变形杆菌、霍乱弧菌等革兰阴性菌均有不同程度的抑制作用,从而提高机体抗病力[19]。与此同时,花椒籽中含有丰富的蛋白质、维生素及微量元素,丰富的蛋白质资源对于免疫器官的发育和抗体生成有重要作用[20]。这些物质的摄入可以促进机体及免疫器官的发育,使抗体效价升高,效价值延长,从而增强动物机体免疫力。
摘要：为了研究花椒籽对肉鸡免疫器官指数和抗体生成的影响,试验选用1日龄健康肉鸡150只,随机分成空白对照组,药物对照组,试验Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组,每组设3个重复,每个重复10只鸡。空白对照组饲喂基础日粮;药物对照组饲喂基础日粮+0.2%盐酸小檗碱;试验Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组分别饲喂基础日粮+0.5%、1.0%、1.5%花椒籽粉,试验时间为42 d。分别在1,14,28,42日龄剖杀试验鸡,计算免疫器官指数,同时检测血清中鸡新城疫(ND)和禽流感H5抗体效价。结果表明:试验Ⅱ组鸡的胸腺、法氏囊和脾脏指数分别在14,42日龄、28,42日龄、14,28,42日龄与空白对照组比较差异显著(P<0.05),其中脾脏指数在42日龄时与试验Ⅰ组比较差异显著(P<0.05);药物对照组在42日龄时的胸腺指数与空白对照组比较差异显著(P<0.05),脾脏指数与空白对照组和试验Ⅰ组比较差异显著(P<0.05);试验Ⅲ组的脾脏指数在28日龄时与空白对照组比较差异显著(P<0.05),在42日龄时与空白对照组和试验Ⅰ组比较差异显著(P<0.05)。饲喂花椒籽后新城疫抗体效价在28,42日龄时差异显著(P<0.05),禽流感H5抗体效价在14,28,42日龄时差异显著(P<0.05)。说明在日粮中添加花椒籽粉可以显著提高肉鸡的免疫器官指数,并提高肉鸡的免疫抗体效价,增强动物机体的免疫机能。