抗生素效价测定(精选7篇)
抗生素效价测定 篇1
管碟法是国内外常用的抗生素微生物检定法,其原理根据抗生素在一定浓度范围内对数剂量与抑菌圈直径呈线性关系,比较标准品与供试品两者对接种的特定试验菌的固体培养基内呈球面形扩散,形成含一定浓度抗生素球形区,抑制了试验菌的繁殖而呈现透明的抑菌圈大小,计算出供试品的效价。在试验过程中影响的因素较多, 任何一个环节操作不当或疏忽就会造成结果的很大误差,甚至导致试验的失败,笔者根据多年的工作经验和实践,对以下关键的影响因素进行了试验研究,并提出控制方法。
1 实验室的环境影响因素
1.1 实验室的环境因素
抗生素效价测定室分衣帽间、缓冲间、无菌室, 缓冲间、衣帽间、无菌操作室都要有紫外灯。每次试验前后必须开灯消毒杀菌30min以上,无菌室分百级区和万级区,在这两个区中的操作台都要水平、洁净、无菌,每做完一组试验都用75%的酒精消毒杀菌, 不得让抗生素和培养基残留在操作台上。下一次试验前必须用75%的酒精擦拭, 保持台面的清洁无菌,定期用清洁剂擦拭地面并熏蒸消毒, 定期进行菌落检查,总数要低于3个,方能进行试验。
1.2 操作人员的消毒也要彻底
出入操作间均需用0.1%新洁尔灭浸泡双手,进衣帽间把衣帽鞋更换,在做试验前双手必须用75%的酒精消毒,衣帽鞋每做完一批样品要消毒一次。
1.3 实验器具的选择和清洗
实验器具的选择也是关键的,要选择底平整,无气泡的,双碟清洗要干净,如清洗不干净,会影响到测定的效果,会使数据造成误差。钢管应选择两端平坦,光滑,管壁厚薄和质量均匀一致的同一批产品,内壁,外壁都要清洁,清洗,不干净重量就不相符,圈就不圆。两端不平坦,抗生素溶液就会漏出,破坏均匀扩散现象,导致整组试验失败。移液管、容量瓶必经过检定,尽量减少误差。
2 试验菌的准备及影响
要及时做好实验菌的传代和保存工作,以前的常用方法是将冻干菌种复苏后,采用斜面低温保藏法,一般1~3月转种一次,传到第7代后平板分离一次,挑选典型的单个菌落扩大培养,继续使用。但时间用长了就出现抑菌圈变小,不清晰。通过查找有关资料, 并进行了反复试验,改进了菌种的传代和保藏,就是将冻干菌种复苏后,挑取单个纯种菌落的第2代菌种用适宜的方法保藏数支,同时挑取纯菌落转接斜面菌种为工作用菌种,到第5代为止,再取保藏用的第2代菌种转种工作用菌种至第5代。如此循环用完保藏的第2代为止,同时保藏的第2代菌种要6个月转一次至第4代为止。这样能保证试验菌种的使用质量,使抑菌圈更清晰均匀度更好,有效的控制了可信限率和抑菌圈大小。菌液的复苏也是关键问题, 如果掌握不好会导致整个试验失败,要掌握好复苏的时间,过短它没醒,过长它又休眠了。
3 培养基对效价测定的影响探讨及改进
培养基中原料的质量对抑菌圈边缘清晰度及试验结果的精确度影响很大。培养基有干粉培养基和自配培养基两种。我们实验室为了保证试验的成功和试验数据的准确, 所用培养基都是从中国兽药监察所购干粉培养基,按比例加水配制后高压灭菌使用,使用前需测定和调节pH值,使pH值符合要求。
4 标准品和供试品的称量
称样量的计算公式 (W为需标准品或供试品的重量;C为标准品或供试品溶液的浓度;V为容量瓶的毫升数;P为估计效价, 要精密称量, 称多了要按比例补加液体使其达到准确配制的溶液浓度。提高准确度, 以防出现边缘数据。标准品的称量一般不低于20mg, 样品称量不低于50mg。
5 标准品和供试品的稀释
要采用容量瓶稀释, 稀释步骤不得超过3步,每步的取样量要根据药品的标示量来计算但不得低于2m L。吸取溶液的吸管要作3次冲洗(用稀释液冲),吸取溶液后,要用滤纸把吸管外壁多余液体擦去,再从起始刻度开始垂直放液,一定要把液体放完。标准品与供试品所用溶剂要相同,使用同一瓶缓冲液用同一支吸管, 吸取相同的体积,同时进行稀释,使测定条件尽量一致。尽量减少各种误差,将操作误差降低到最低限度。
6 双碟制备对测定效价的影响探讨
6.1 底层培养基的制备
用干粉培养按比例调配好后放到电炉上加热煮沸, 一定要注意, 不要让液体流出, 待完全溶化后放到高压灭菌锅中高压灭菌30min后放到55~60℃的水溶锅中备用,温度不可太高,也不可太低,太低培养基会出现结块,甚至不能使用。做好后在每个碟中注入20mL培养基,使其铺满整个双碟,不能有气泡,若有要用吸管戳破。6.2菌层的制备菌层制备时要掌握好温度,温度过高会杀死细菌,过低培养基会出现结块,一般细菌控制在48~50℃,芽孢菌控制在60℃。当培养基中加入菌悬液后要尽快注入到底层培养基上,用吸管吸取菌层放在底层培养基的双碟的中间部位,在迅速转动双碟,使菌层培养基均匀推布并铺满整个底层,铺好后应平放,如果不平整,加入钢管中的抗生素溶液会从钢管下端流出,出现破圈,导致整组试验失败。
6.3 菌悬液的加量
菌悬液是取工作用菌种营养琼脂斜面物,用灭菌水洗下制备而成,新制备的菌悬液在做试验前要先试圈,使抑菌圈的直径在18~22mm内菌悬液的量要根据保存的时间长短来定,新配制的加量少,到中后期量要增加,因为菌株会随时间的延长而衰亡,生长周期不一样,对抗生素的敏感度减小,导致抑菌圈变大,模糊,甚至无圈都有可能,因此,菌悬液在使用一段时间后就要增大用量,一般3个月的菌悬液最好用。所以抑菌圈的大小就用菌悬液的量来调整,菌圈大就减少加量,菌圈小就增加量。
6.4 钢管放置
钢管放置要用钢管自动放置器, 这样放置出来的钢管距离均匀,如果距离不均匀, 会导致菌圈相离太远,或太近测量时会造成误差, 在抑菌圈自动测定仪上甚至测不出。
6.5 抗生素的滴加
滴加抗生素可以用胶头滴管滴加或定量加样器滴,在滴加之前必须用滴加液洗3次。笔者一般是用胶头滴管滴加(用胶头滴管滴加要操作熟练),滴加前要检查滴管内是否有气泡或滴管开口端有液体残留,继续滴加容易造成气泡破裂,使溶液溅在菌层培养基上造成破圈,有残留液体会造成量不准确。滴加的量不能多,多了就要溢出,加少了量不够, 菌圈的直径达不到18~22mm,所以每个钢管内加到平满管口即。在滴加时不要离管口太高,太高会溅出,太低会碰到钢管。滴加的时间不能过长, 因为溶液的扩散时间不同会给测量结果造成误差。
7 培养的时间温度对效价的影响
把做好的双碟水平放置在35~37℃的恒温培养箱中, 培养12~18h, 根据需要可以延长1~2h,主要抑菌圈清晰就可以测量,双碟要放在恒温箱的中间比较好,温度均匀有利于细菌生长。
8 抑菌圈测定仪测量的影响
笔者用抑菌圈测定仪测量。如果不注意调整抑菌圈清晰度后就测量,会给测量造成很大误差,抑菌圈清晰测出的准确。圈不清晰测出的结果不准确。所以尽量使用仪器测量以减小人为因素引起的试验误差。
9 讨论
本文对管碟法测定抗生素进行试验探讨,对管碟法测定抗生素有直观, 准确, 灵敏度高, 便于操作的优点。笔者认为虽然影响因素较多, 但只要认真熟练的操作就能消除影响, 使测量结果更准确,提高测量结果的精密度和准确性。
摘要:管碟法测定抗生素效价需要从每个环节严格控制才能得到与真值更为接近的结果。笔者根据实验操作中积累的工作经验, 对管碟法测定抗生素效价过程中的多种影响因素进行归纳及改进, 有利于实验的顺利进行, 也有利于提高实验结果的准确性。
关键词:抗生素效价测定,管碟法,影响因素,控制方法
抗生素效价测定 篇2
1 实验方法与结果
1.1 标准曲线制备
1.1.1 中间浓度的选择:
根据量反应平行线原理设计, 通过检测抗生素对微生物的抑制作用, 在抗生素项下规定的剂量与反应线性范围内选择一个中间浓度C0=13.5 U/m L。
1.1.2 标准溶液浓度的确定:
依照标准品说明书的规定, 临用对照药典规定稀释, 各剂量按等比级数稀释。剂量间的距离为1∶0.85, 算出中间剂量邻近的高低2个浓度, C0+1及C0-1, 再分别计算各剂量的浓度, 各种浓度Cm (m1~m8) 分别为7.0、8.5、9.8、11.5、16.0、18.8、22.0、25.5 U/m L。
1.1.3 标准土霉素溶液的制备:
精密称取土霉素标准品, 用灭菌水制成1000 U/m L, 精密吸取20 m L至200 m L量瓶中, 加磷酸缓冲液 (p H7.8) 稀释成100 U/m L。再分别精密吸取3.5、7.0、8.5、9.8、11.5、16.0、18.8、22.0、25.5 m L至100 m L容量瓶中, 用p H6.0的磷酸盐缓冲液稀释至刻度, 制成中间浓度为13.5 U/m L及Cm (m1~m8) 各种浓度的标准溶液。
1.1.4 标准曲线的制定:
取试验用直径约90 mm、高16~17 mm的培养皿24只, 分为8组每组3只, 每组各培养皿内间隔的3枚不锈钢小管内分别滴满标准品, Cm1~8, 即8.4……21.0 U/m L溶液;另3枚不锈钢小管内均滴满标准品的中间浓度C0即13.5 U/m L溶液。在36℃培养14~16 h后, 用游标卡尺逐一测量每个培养皿3个浓度的抑菌圈直径。分别求得每组3个培养皿中间浓度C0所致的抑菌直径平均值y0即C1~C8所致抑菌圈直径的平均值, ym (即Cm=1~8) 。令fx=ym-y0, 分别计算测得值, 则8组培养皿可得出f1~8的8个反应参数 (表1) 。以fm值为横坐标, 以相应的抗生素浓度对数为纵坐标, 在方格纸上标点, 将各点联结即成标准曲线 (图1) ;或经计算, 得出回归曲线直线方程式:Y=0.15663X+1.32985, 相关系数:r=0.99878。
1.2 供试品效价测定
1.2.1 供试品效价测定:
取标准品制备中间浓度的标准液, 并取供试品, 预估效价后, 精取10 m L, 加灭菌水制成每1 m L中约含1000 U的溶液, 摇匀, 静置, 精密量取上清液适量, 用p H6.0的磷酸盐缓冲液稀释到与标准品的中间浓度相同的供试液。取试验用放置6枚不锈钢小管的培养皿, 一般不小于3个, 在每一培养皿中, 间隔的3枚不锈钢小管中分别滴满中间浓度的标准液, 另3枚不锈钢小管中滴满供试液。在36℃培养14~16 h后, 用游标卡尺测量各抑菌圈的直径。分别求得标准液抑菌圈的直径。分别求得标准液抑菌圈直径平均值y。和供试液抑菌圈直径的平均值ym, 算出的差数 (fm) 。据此在标准曲线上读取供试液的浓度, 即可换算成供试品所含效价 (U/m L) , 也可以代入回归曲线直线方程式, 算出供试品的效价 (即含量) 。
1.2.2 供试品效价的试验比较:
用标准曲线法测定土霉素片[2]批号分别为20101007、20111104、20120506、20121210, 并与抗生素微生物检定法 (二剂量法) 相比较, 结果如下 (表2) 。
1.3 重复性试验:
取土霉素片 (批号为20121210) , 按标准曲线法测定6份, 其平均值为98.6%, RSD为1.40%。
2 讨论
标准曲线法测定土霉素片抗生素效价, 选择标准品中间浓度为13.5 U/m L, 加菌液适量可现直径在15~18 cm的菌圈, 其抑菌圈较为清晰的边缘。用标准曲线法测定效价与二剂量法相比较, 结果没有显著差异, 实验过程虽然繁琐, 但结果准确, 重现性好。
摘要:目的 探讨用标准曲线法测定土霉素片的抗生素效价。方法 利用标准曲线法测定其效价, 与中国药典规定用抗生素微生物检定法二剂量法测定其效价进行比较。结果 标准曲线法测定其浓度在7.025.5 U/m L范围内菌圈清晰, 标准品菌圈直径与中心浓度菌圈的差与抗生素浓度对数线性关系良好 (r=0.99878) 。结论 本法与二剂量法比较, 结果无显著差异、准确, 重复性好。
关键词:标准曲线法,抗生素效价,土霉素片
参考文献
[1]国家药典委员会.中国药典 (二部) [M].2010年版.北京:中国医药科技出版社, 2010:附录93-95.
[2]国家药典委员会.卫生部药品标准, 抗生素药品第一册[S].1989:89.
抗生素效价测定 篇3
1 资料与方法
1. 1 一般资料选择2013 年8 月~2014 年11 月来本院实施骨科手术的患者180 例, 排除糖尿病、肾功能不全、感染病者。随机分成A、B、C、D、E、F共六组, 每组30 例。A组中男18 例, 女12 例, 年龄19~67 岁, 平均年龄 (36.7±10.9) 岁;B组中男16 例, 女14 例, 年龄21~66 岁, 平均年龄 (37.1±10.4) 岁;C组中男17 例, 女13 例, 年龄22~69 岁, 平均年龄 (36.3±10.1) 岁;D组中男16 例, 女14 例, 年龄18~64 岁, 平均年龄 (37.7±10.3) 岁;E组中男17 例, 女13 例, 年龄20~69岁, 平均年龄 (37.3±10.6) 岁;F组中男18 例, 女12 例, 年龄22~68 岁, 平均年龄 (36.5±10.7) 岁。六组患者性别、年龄等一般资料比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。
1. 2 治疗方法A组患者使用头孢呋辛进行治疗, 给患者静脉注射1.5 g头孢呋辛, 2 次/d ;B组患者使用头孢他啶进行治疗, 给患者2 次/d, 静脉注射, 头孢他啶1~2 g/ 次;C组患者使用磺苄西林钠进行治疗, 同样2 次/d静脉注射磺苄西林钠, 2~4 g/ 次;D组患者使用阿奇霉素进行治疗, 给患者第1天顿服0.5 g, 第2~5 天顿服0.25 g ;E组患者使用克林霉素进行治疗, 给患者静脉注射克林霉素, 0.6~1.2 g/ 次, 2 次/d ;F组使用左氟沙星进行治疗, 给患者静脉每次注射左氟沙星0.2~0.4 g, 2 次/d。
1. 3 观察指标观察使用不同抗生素的六组患者的治疗总有效率及药物成本效果。
1. 4 疗效判定标准[3]显效:在手术后患者的伤口达到甲级愈合, 且没有出现感染;有效:患者手术后伤口达到乙级愈合, 且没有出现感染;无效:患者手术后伤口达到丙级愈合, 或者患者伤口出现感染。总有效率= 显效率+ 有效率。
1. 5 统计学方法采用SPSS18.0 统计学软件对数据进行分析。计量资料以均数 ± 标准差 ( ±s) 表示, 采用t检验;计数资料以率 (%) 表示, 采用 χ2检验。P<0.05 表示差异有统计学意义。
2 结果
2. 1 各组治疗效果比较A、B、C、D组患者的治疗总有效率明显高于E、F组, 差异具有统计学意义 (P<0.05) 。见表1。
注:分别与E、F组相比, aP<0.05
2. 2 药物成本效果对比A、B、C、D、E、F组药物成本分别为92.5、167.5、265.8、145.5、 88.4、91.2 元, 成本/ 效果分别为0.96、1.79、2.75、1.51、1.11、1.24, A组的成本效果比明显低于B、C、D、E、F组, 差异具有统计学意义 (P<0.05) 。
3 讨论
随着近些年交通事故的增多导致骨科手术的患者也大大增加。在骨科手术前后需要使用抗生素以防止发生感染。而有时医生为了提高杀菌效果, 常常会使用两三种抗生素联合使用, 导致菌群失调, 出现耐药菌株[4]。所以, 现在越来越多的业界人士认为必须合理使用抗生素, 避免使患者产生不良反应, 浪费资源。
所以本文主要研究骨科中的不同抗生素的治疗效果及价格比, 选择最佳的抗生素。通过本研究发现头孢呋辛、头孢他啶、磺苄西林钠、阿奇霉素、克林霉素、左氟沙星六种抗生素的治疗总有效率分别为96.67%、93.33%、96.67%、96.67%、80.00%、73.33%, 头孢呋辛、头孢他啶、磺苄西林钠、阿奇霉素的治疗总有效率明显高于克林霉素和左氟沙星, 差异具有统计学意义 (P<0.05) 。药效与成本比发现头孢呋辛的效果成本明显低于其他五种药物, 差异具有统计学意义 (P<0.05) 。
综上所述, 在骨科手术中使用头孢呋辛进行治疗的效果较好, 并且费用较便宜, 既能有效的提高治疗效果, 防止感染, 又能减轻患者的经济负担, 值得在骨科治疗中推广及运用。
摘要:目的 对比不同抗生素在骨科感染预防中的药物效果及价格。方法 180例实施骨科手术的患者, 随机分成A、B、C、D、E、F六组, 每组30例。A组使用头孢呋辛, B组使用头孢他啶, C组使用磺苄西林钠, D组使用阿奇霉素, E组使用克林霉素, F组使用左氟沙星, 对比这六组患者的治疗效果及用药的成本。结果 A、B、C、D组患者的治疗总有效率明显高于E、F组, 差异具有统计学意义 (P<0.05) ;A组药物的成本/效果明显低于B、C、D、E、F组, 差异具有统计学意义 (P<0.05) 。结论 采用头孢呋辛治疗预防骨科感染效果较好并且成本较低, 性价比最高, 值得临床推广使用。
关键词:抗生素,预防,骨科感染,药物效果及价格
参考文献
[1]滕凤卿.几种不同抗生素在骨科感染预防中的药物效价比较.临床合理用药杂志, 2014, 7 (31) :22-23.
[2]朱敏.不同抗生素在骨科感染预防中的药物效价比较.医药前沿, 2012, 2 (15) :286-287.
[3]李伟, 胡腾辉, 李迎辉, 等.不同抗生素在骨科感染预防中的药物效价比较.海峡药学, 2013, 25 (5) :284-285.
抗生素效价测定 篇4
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取我院2011年6月-2012年6月收治的骨科手术患者120例, 随机分为A、B、C、D、E、F 6组, 每组20例。A组男14例, 女6例;年龄20~65 (38.3±8.4) 岁。B组男13例, 女7例;年龄22~65 (38.5±8.5) 岁。C组男13例, 女7例;年龄21~65 (38.2±8.3) 岁。D组男12例, 女8例;年龄21~64 (38.4±8.4) 岁。E组男13例, 女7例;年龄20~63 (38.3±8.6) 岁。F组男12例, 女8例;年龄22~64 (38.2±8.5) 岁。6组患者性别、年龄等方面比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。
1.2 纳入及排除标准
所有患者经检查均未发现肾功能不全、糖尿病、感染病灶等, 严格遵照手术预防性应用抗菌药物判定标准用药。
1.3 方法
A组采取头孢呋辛治疗, 头孢呋辛1.5g静脉注射, 每天2次。B组采取头孢他啶治疗, 头孢他啶1~2g静脉注射, 每天2次。C组采取磺苄西林钠治疗, 磺苄西林钠2~4静脉注射, 每天2次。D组采取阿奇霉素治疗, 第1天0.5g顿服, 第2~5天0.25g顿服。E组采取克林霉素治疗, 克林霉素0.6~1.2g静脉注射, 每天2次。F组采取左氧氟沙星治疗, 左氧氟沙星0.2~0.4g静脉注射, 每天2次。
1.4 观察指标
观察6组不同抗生素的治疗效果及成本效果。
1.5 疗效评定标准
显效:术后伤口达甲级愈合, 未出现感染;有效:术后伤口达乙级愈合, 未出现感染;无效:术后伤口达丙级愈合, 或出现感染。总有效率= (显效+有效) /总例数×100%。
1.6 统计学方法
计数资料以率 (%) 表示, 组间比较采用χ2检验, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 治疗效果
A组、B组、C组、D组、E组、F组总有效率分别为95%、90%、95%、95%、75%、70%, A组、B组、C组、D组总有效率明显高于E组、F组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。见表1。
注:与E、F组比较, *P<0.05
2.2 成本效果
A组、B组、C组、D组、E组、F组成本/效果分别为0.97、1.84、2.76、1.51、1.20、1.30, A组成本/效果明显低于B组、C组、D组、E组、F组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。见表2。
注:与其他各组比较, *P<0.05
3 讨论
随着交通日益发达, 车祸发生也逐渐增多, 造成骨伤患者增多[2]。骨伤患者大部分非手术治疗难以收到满意的效果, 需手术治疗, 而手术治疗以复位后内固定为主。骨科医师常需采用大剂量的抗生素用于术前、术后, 以避免感染。而为提升杀菌效果, 两至三种广谱抗生素联合使用也较为常见, 常导致菌群失调, 耐药菌株出现等[3]。因此, 多数学者认为, 抗生素的给予应具有针对性及合理性, 大剂量及联合使用往往会带来更加严重的不良反应, 造成严重的医疗资源浪费[4]。因此将目前常在骨科应用的抗生素的药物效价比进行对照观察, 以期在最大化满足疗效的基础上降低治疗费用。
围术期抗生素使用一般为预防性质, 用于预防切口感染, 提高愈合质量, 一般骨科常用头孢呋辛、他唑巴坦、头孢哌酮、头孢噻肟、氧氟沙星、克林霉素、依替米星等作为预防感染用抗生素。本结果显示, 6种抗生素治疗分别的总有效率为95%、90%、95%、95%、75%、70%, 头孢呋辛、头孢哌酮、依替米星的总有效率显著高于头孢噻肟、氧氟沙星、克林霉素, 并且通过成本对比计算, 头孢呋辛成本较低, 成本效果比也明显高于其他抗生素, 因此, 头孢呋辛为骨科感染防治中效果较好且花费较低的药物, 并且临床使用较为安全, 因此推荐进行使用。
参考文献
[1] 朱敏.不同抗生素在骨科感染预防中的药物效价比较[J].医药前沿, 2012, 2 (15) :286-287.
[2] 李伟, 胡腾辉, 李迎辉, 等.不同抗生素在骨科感染预防中的药物效价比较[J].海峡药学, 2013, 25 (5) :284-285.
[3] 康文磊, 孙铁铮, 牛慧云, 等.抗生素骨水泥治疗骨科感染的利与弊[J].中华关节外科杂志 (电子版) , 2012, 6 (5) :782-784.
抗生素效价测定 篇5
本试验通过用兔病毒性出血症灭活疫苗、兔病毒性出血症灭活疫苗和兔病毒性出血症病毒强毒两种不同的免疫程序来免疫家兔,无菌分离血清,采用血凝及血凝抑制试验检测血清的抗体效价,从而筛选出制备高效价抗血清的合理免疫程序,为兔病毒性出血症高免血清的制备提供依据。
1 材料及方法
1.1 材料
1.1.1
兔病毒性出血症病毒毒种,由本校微生物教研室提供。
1.1.2试验动物
16只体重在1.5~2 kg未免疫过兔病毒性出血症疫苗的健康家兔,由眉山市东坡区某种兔场提供,笼养,自由采食。
1.1.3 疫苗
由齐鲁动物保健品有限公司生产,生产批号:071102。
1.1.4 1%红血球(人“O”型血红细胞)
由眉山市第一人民医院提供。
1.1.5 阳性、阴性血清
由本校微生物教研室提供。
1.1.6 硫柳汞
由本校微生物教研室提供。
1.2 方法
1.2.1 毒株复壮
取兔病毒性出血症病毒感染过的肝组织,乳钵研磨,用无菌生理盐水制成1∶10组织悬液后加入青霉素、链霉素各5000单位/mL,置37℃温箱中作用3 h,取4只非免疫家兔颈部皮下注射上述肝组织悬液1 mL/只,取48h内典型死亡家兔的肝组织,无菌检验后备用。1.2.2检测抗原的制备取上述肝组织,乳钵研磨,用无菌生理盐水制成1∶10病毒组织悬液,加入青霉素、链霉素各5 000单位/mL,置37℃温箱中作用3h,无菌检验后保存备用。
1.2.3 免疫方法
取非免疫家兔12只,随机分成3组,每组4只。按表1剂量和方法进行免疫。
1.2.4 血清分离
第3次免疫15 d后采取颈动脉放血,常温下静置,待血液完全凝固后置4℃冰箱中过夜析出血清,抽取血清至无菌瓶中备用。
1.2.5 血清保存
将上述血清按0.01%比例加入硫柳汞防腐,充分混匀后按3 mL/瓶分装到无菌青霉素瓶中,置-20℃冰柜中保存备用。
1.2.6 血清效价测定
采用血凝及血凝抑制试验检测血清效价,并根据文献所介绍的判定标准进行效价判断。其方法如下:
1.2.6. 1 血凝试验(HA)
方法如表2所示。
1.2.6. 2 血凝抑制试验(HI)
完成HA试验后,以4个HA单位的抗原(HA试验中出现完全凝集的抗原的最大稀释度为1个血凝单位,4个血凝单位即抗原最大稀释度为4)进行HI试验。方法如表3所示。
2 结果
2.1 RHDV的HA试验
经血凝试验测得兔病毒性出血症强毒的血凝效价为1∶1 280。
2.2 RHDV的HI试验
3次免疫后,经血凝抑制试验测得:兔病毒性出血症灭活疫苗免疫程序组的家兔抗血清的平均效价为7 log2,兔病毒性出血症灭活疫苗和兔病毒性出血症病毒强毒免疫程序组的家兔抗血清的平均效价为9 log2,而未免疫的家兔血清抗体的平均效价则为2 log2。
3 结论及讨论
3.1 本试验通过用兔病毒性出血症灭活疫苗、兔病毒性出血症灭活疫苗和兔病毒性出血症病毒强毒两种不同的免疫程序免疫非免疫家兔,采用血凝及血凝抑制试验检测血清的抗体效价。结果表明,经3次免疫后,兔病毒性出血症灭活疫苗免疫程序组的家兔抗血清的平均效价为7 log2,兔病毒性出血症灭活疫苗和兔病毒性出血症病毒强毒免疫程序组的家兔抗血清的平均效价为9 log2,未免疫的家兔血清抗体的平均效价则为2 log2。
3.2 从以上结果看,用RHD疫苗和兔病毒性出血症强毒免疫程序免疫的家兔,抗血清的平均效价比单用RHD灭活疫苗免疫的家兔抗血清的平均效价高。我们认为,在用疫苗免疫的基础上再通过兔病毒性出血症病毒强毒对家兔进行加强免疫,家兔相当于又感染了一次兔病毒性出血症病毒, 对兔的免疫系统是一种更强的刺激作用。因此, 采用疫苗和兔病毒性出血症病毒强毒所制备的抗血清的抗体效价比单用RHD灭活疫苗的抗体效价要高。
3.3 张冰等以自制的兔病毒性出血症病毒组织灭活疫苗,经过5次免疫家兔后,抗体效价可达12 log2以上,采集兔血清,以此治疗攻毒兔,结果大部分兔都存活;临床应用效果也表明,经此血清治疗自然感染兔,其治愈率达80%以上。本次试验采用3次免疫非免疫家兔,用兔病毒性出血症灭活疫苗进行基础免疫和兔病毒性出血症病毒强毒进行加强免疫后,抗体的平均效价为9 log2。张冰等是经过5次免疫后抗体效价为12 log2,而本次试验是采用3次免疫,因此,这可能是我们制备的抗体效价略低的原因。
3.4 目前,兔病毒性出血症的防制主要依赖于兔病毒性出血症组织灭活疫苗的免疫接种,但兔群一旦感染了兔病毒性出血症病毒之后,各种药物治疗除了防止继发感染外,唯一有效的治疗方法是给感染兔群注射抗兔病毒性出血症高免血清。因此,筛选合理的免疫程序制备高效价的抗血清显得尤其重要。
3.5 当前检测抗体的方法有很多,但由于血凝及血凝抑制试验所需的设备简单,操作方便、易行,凝集现象明显,易于观察,故本次试验采用了血凝及血凝抑制试验检来测血清抗体效价。
摘要:本试验采用兔病毒性出血症灭活疫苗、兔病毒性出血症灭活疫苗和兔病毒性出血症病毒强毒两种不同的免疫程序来免疫家兔, 采用血凝及血凝抑制试验检测血清的抗体效价。结果表明:经3次免疫后, 疫苗免疫程序组免疫家兔的抗血清平均效价为9log2, 未免疫家兔的抗体平均效价为2log2。
抗生素效价测定 篇6
关键词:盐霉素钠,SL效价迅速定量法,紫外分光光度法,旋转蒸干
SL是一种以钠型形式存在的羧酸聚醚类抗生素, 对革兰氏阳性菌、真菌有很强的杀灭作用, 尤其对鸡的球虫病有特效, 能促进肉鸡、肉牛等家禽动物的生长发育, 提高增重率, 主要用于动物的饲料添加剂。由于现在兽药生产均要通过兽药GMP认证, 出口国外的也要申请FDA或COS等相关的认证, 其中清洗验证是一个关键的步骤。本方法通过分光光度法测定已知浓度的SL系列标准溶液与模拟清洗液 (自来水稀释SL标准溶液) 的吸光度, 确定效价和吸光度的关系, 计算测定结果的回收率和线性关系来确认设备的清洗液的清洁度, 且此方法具有较高的准确性和可操作性。
1 实验部分
1.1 主要仪器与试剂
旋转蒸发器:R-201型, 上海申科机械研究所;电热恒温水浴锅:HH·SH-4S, 上海悦丰仪器仪表有限公司;液环真空泵:2BC-2J, 广一集团广州市第一水泵厂;超声波:CQ-30, 广州经济技术开发区明珠电器有限公司;分光光度计:UV-2401PC, 日本岛津。
SL标准品原液 (500μg/ml) 的制备:将SL标准品进行干燥 (60±2℃真空干燥3h) , 准确称量干燥后的SL0.05±0.005g放入200ml具塞三角瓶中, 用无水乙醇准确调制到500μg/ml。 (使用期限2星期、冰箱保存) (1) SL标准品/无水乙醇溶液的配制:用移液管准确量取定量的原液 (500μg/ml) 至容量瓶中, 用无水乙醇稀释成浓度分别为1、5、10、25、50、75、100μg/ml。 (2) SL标准品/自来水溶液的配制:用移液管准确量取定量的原液 (500μg/ml) 至容量瓶中, 用自来水稀释成浓度分别为1、5、10、25、50、75、100μg/ml。显色液 (对二甲替氨基苯甲醛溶液) 的配制:称取0.3±0.03g对二甲替氨基苯甲醛放入100ml容量瓶中, 添加无水乙醇约50ml使溶解后, 加入0.1ml硫酸, 用无水乙醇稀释至100ml。 (用时配制)
1.2 实验方法
用移液管准确吸取各浓度的S L标准品/自来水溶液20ml, 分别加入到100ml的茄形烧瓶中, 在50±3℃条件下进行旋转减压蒸馏。茄形烧瓶中没有水滴, 但有白色残渣时, 蒸馏结束, 蒸馏时间约为15min~20min。然后准确加入20ml无水乙醇至茄形烧瓶中, 用超声波震荡3min, (以下步骤一起处理) , 分别吸取各浓度样品溶液和SL标准品/无水乙醇溶液5ml, 加入5ml显色液, 摇匀后立刻放入70±3℃水浴锅中水浴20min, 拿出后放至室温, 以无水乙醇为空白、在600nm波长处测定溶液的吸光度。
2 结果与讨论
2.1 预处理
自来水的存在会影响结果的准确性, 加水配制 (模拟清洗液) 的标准溶液在旋转蒸发时小心处理, 保证蒸干茄形烧瓶中样品溶液的水分;且SL迅速定量法中加入无水乙醇操作要准确和速度快以减少乙醇挥发, 减少测定误差。
2.2 测定结果及计算结果的回收率和相关系数 (表1, 图1)
紫外分光光度法是一个经典且快速检测SL效价的方法, 从表1看测定结果的平均回收率97.4%, 说明模拟清洗液旋转蒸干后用SL迅速定量法测定具有很高的准确性;表2的相关系数R2=0.9996说明SL效价在1~100μg/ml范围内与其吸光度 (600nm波长) 具有很好的直线线性关系。
3 结语
紫外分光光度法可用于测定经过预处理的模拟清洗液中SL效价含量, 具有准确性和可操作性, 从而可应用于测定生产中的设备清洗液中SL的效价来评价SL设备用自来水清洗的清洁度。
参考文献
[1]曾兆国, 李成梅, 陈红梅, 等.文红测定盐霉素中间体效价的新方法——分光光度法[J].养殖与饲料, 2008 (5) .
抗生素效价测定 篇7
试验通过对鸡新城疫病毒液高倍浓缩, 然后用不同稀释浓度的抗原制备灭活疫苗, 研究其抗体效价水平, 为鸡新城疫灭活疫苗, 特别是鸡新城疫-禽流感二联灭活疫苗、鸡新城疫-传染性支气管炎-减蛋综合征三联灭活疫苗、鸡新城疫-传染性支气管炎-减蛋综合征-禽流感四联灭活疫苗等鸡新城疫相关的多联灭活疫苗的研发及生产奠定基础, 现报道如下。
1 材料
1.1 毒种及抗原
NDV La Sota株生产毒种, 由杭州荐量兽用生物制品有限公司保存;ND HI抗原及阳性血清, 购自中国兽医药品监察所。
1.2 种蛋及试验鸡
以发育良好的10~11日龄的非免疫鸡胚作为制苗材料, 种蛋ND HI抗体效价不高于1∶4;SPF种蛋, 购自北京梅里亚维通实验动物有限公司;SPF鸡胚, 自北京梅里亚维通实验动物有限公司购进SPF种蛋, 孵化后置实验动物房隔离器内饲养。
1.3 主要仪器与试剂
Pllicon切向流超滤系统、标准膜堆 (膜类型为Biomax100、膜面积为0.5 m2) , 均购自密理博中国有限公司;酪胨琼脂 (G.A) 、硫乙醇酸盐培养基 (T.G) 、葡萄糖蛋白胨汤 (G.P) , 购自北京中海动物保健科技公司。
2 方法
2.1 NDV La Sota株病毒液的制备
选择发育良好的10日龄非免疫鸡胚, 取生产用种毒10 000倍稀释, 经尿囊腔接种, 0.1 mL/胚。接种后密封针孔, 于37.8 ℃条件下继续孵育, 不必翻蛋。鸡胚接种后, 每日照蛋1次, 将60小时前死亡的鸡胚弃去。此后, 每隔4~6 h照蛋1次, 随时取出死亡胚, 直至96小时, 不论死亡与否, 全部取出, 气室向上直立, 于2~8 ℃条件下冷却24 h;无菌吸取尿囊液, 将若干个鸡胚分为1组, 吸取胚液放于同一灭菌的容器内, 每组抽样测定血凝价, 低于1∶128 (采用微量法) 者弃去。同时做无菌检查, 应无细菌生长。
2.2 病毒液的浓缩
将病毒尿囊液先用灭菌的100目/cm2的不锈钢漏斗滤过, 再用离心机以3 000~5 000 r/min离心10 min进行预过滤;然后将预过滤的盛有病毒液的容器通过无菌管道与超滤装置连接, 并反复循环通过超滤装置, 直至达到要求的浓缩终点。
2.3 病毒含量的测定
将病毒液用灭菌生理盐水进行10倍系列稀释, 取1×10-7, 1×10-8, 1×10-9这3个稀释度的病毒液于尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5枚, 0.1 mL/胚。置37 ℃条件下孵育, 48 h以前死亡的鸡胚弃去不计, 48~120 h内死亡的鸡胚随时取出, 直至120小时, 取出所有活胚, 逐个收获鸡胚尿囊液, 分别测定红细胞HA效价, HA效价≥1∶160者判为感染, 计算鸡胚半数感染量 (EID50) 。
2.4 红细胞凝集价的测定
参照《中华人民共和国兽药典》附录中红细胞凝集试验 (微量法) 进行测定。
2.5 病毒液的灭活
向浓缩后效价测定合格的病毒液中加入10%甲醛溶液, 至终浓度为0.1%, 充分振荡均匀, 于37 ℃恒温灭活16 h。灭活后逐瓶抽样, 进行灭活检验。
2.6 无菌检验
参照《中华人民共和国兽药典》附录中无菌检验方法, 对G.A、T.G、G.P进行无菌检验。
2.7 灭活检验
取10日龄SPF鸡胚6枚, 于尿囊腔接种灭活后的鸡胚尿囊液, 0.2 mL/枚, 每日照蛋2次, 连续观察5 d。对所有胚液分别测定HA效价, 无论是否出现血凝均应盲传1代, 并测定血凝性。
2.8 疫苗的制备
将灭活后的NDV抗原液用灭菌生理盐水进行1∶4, 1∶8, 1∶16, 1∶32, 1∶64倍稀释, 根据抗原含量分为5组, 参照《中华人民共和国兽用生物制品规程》中鸡新城疫灭活疫苗制造及检验规程, 制备不同抗原稀释倍数的灭活疫苗。
2.9 疫苗的性状检验、无菌检验、安全检验、甲醛和汞类防腐剂残留量的测定
参照《中华人民共和国兽用生物制品规程》附录对各批疫苗进行性状检验、无菌检验、安全检验、甲醛和汞类防腐剂残留量的测定。
2.10 动物分组免疫
将60只30日龄SPF雏鸡随机分为6组, 每组10只。按照抗原含量为1∶4, 1∶8, 1∶16, 1∶32, 1∶64的稀释倍数分成5个免疫组, 颈部皮下接种, 20 μL/羽。同时设空白对照组。
2.11 HI抗体效价的测定
免疫21 d后, 每只鸡分别翅静脉采血, 分离血清。参照《中华人民共和国兽药典》附录中血凝抑制试验方法进行HI抗体效价的测定。
3 结果与分析
3.1 制苗用病毒液的生产情况及浓缩前后的检验
鸡新城疫病毒液经Pllicon切向流超滤系统浓缩10倍, 浓缩前后的检验结果见表1。
3.2 制苗用病毒液的无菌检验及灭活检验 (见表2)
由表2可知:所有样品均呈HA阴性且胚胎发育正常, 灭活检验合格。
3.3 疫苗的性状检验、无菌检验、安全检验及甲醛、汞类防腐剂残留量的测定 (结果见表3)
由表3可知:疫苗完全能够达到《中华人民共和国兽用生物制品规程》中的各项要求。
注:-表示阴性。
3.4 HI抗体效价的测定 (结果见表4)
由表4可知, 各试验组鸡HI抗体效价均能够达到《中华人民共和国兽用生物制品规程》中的要求。
4 讨论
研究证实, 鸡新城疫病毒La Sota株具有较好的免疫原性, 由其制备的鸡新城疫灭活疫苗可保护鸡100%抵抗强毒攻击而不发病, 是研制鸡新城疫及相关多联灭活疫苗的首选毒株。
提高单位体积的抗原含量是联苗生产的技术关键, 而抗原浓缩是达到此目的的理想办法[4,5,6,7]。本试验选用的美国密理博超滤浓缩装置系统, 对鸡新城疫病毒液浓缩效果较好, 使用方便。在浓缩过程的滤出废弃液中无抗原成分滤出, 没有抗原成分损失, 证明选择的用于分子截流的过滤膜包很合适。从浓缩前后胚液中抗原含量及HA效价检测结果看, HA效价和EID50与浓缩倍数在一定程度上呈正相关, 通过对浓缩后病毒液HA效价和EID50的控制, 可以保证使用浓缩后的胚液配苗。
利用血凝抑制试验评价免疫组鸡的抗体水平, 结果表明, 随着抗原含量的降低, HI抗体效价水平也下降, 这与李慧姣等[8]报道的免疫剂量与HI 抗体效价呈正相关的结果基本一致。用浓缩10倍的灭活抗原再稀释64倍制备的鸡新城疫灭活疫苗免疫鸡, 抗体效价能达到质量标准的要求。通过研究表明:制备与鸡新城疫相关的多联灭活疫苗, 可根据HA效价和病毒含量适当调整鸡新城疫病毒液的浓缩倍数, 从而确保疫苗质量和节约生产成本。
参考文献
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