胶原凝胶（精选6篇）
胶原凝胶 篇1
前言
聚乙烯醇(PVA)是一种无毒性、具有生物可降解性和良好生物相容性的高分子材料[1],力学性能优良、化学性质稳定、易于成型,可作为医药、化妆品行业中的功能材料。但其表面缺乏细胞识别位点,细胞相容性较差,不能单独作为组织工程支架应用[2]。
胶原具有优良的生物相容性和低抗原性,可以介导细胞间的传导和相互作用,其纤维状结构非常有利于组织培养中的细胞黏附、增殖和分化等功能,在生物医学领域有着广泛的应用价值。胶原支持很多不同组织的生长,但单纯胶原凝胶力学强度较差,耐热性不好[3]等,限制了其在组织工程领域[4]的应用,需对其改性来弥补其不足[5,6]。
因此,以聚乙烯醇和胶原为原料制备复合型材料,成为一种简单有效的解决途径。聚乙烯醇-胶原水凝胶(PVA-Collagen Hydrogel,PCH)由于毒性低、生物相容性好等特点,在生物、医学、微生物、渔业、食品等领域已有广泛的应用,因而最早引起人们的关注[7]。所以将聚乙烯醇与胶原以不同配比制备胶原-聚乙烯醇水凝胶,可提高两者的应用性能。使得胶原/PVA复合水凝胶既具有天然蛋白质的可生物降解性、生物相容性等,又具有较好的吸湿性能[8,9]和力学性能。
在胶原-聚乙烯醇(PVA)水凝胶研究领域中,一些研究人员利用化学交联法制备水凝胶,比如溶液共聚、阴阳离子共聚法[7,10,11,12,13,14,15,16,17,18],其缺点在于交联条件过于激烈,大部分游离基团均以共价键的形式被交联而失去反应活性。本试验将PVA改性后,温和条件下使其与胶原共价交联,同时辅以物理交联制备复合水凝胶。本论文主要通过不同原料配比的水凝胶在不同介质中的溶胀率变化情况,研究水凝胶的溶胀特性、影响因素及影响程度,并且通过数学方程拟合对其平衡溶胀比进行计算。同时,探讨了电解质和p H对所制备PCH溶胀特性的影响程度,旨在更好地掌握水凝胶的溶胀规律,为其在体表创伤修复中的应用奠定基础。
1 试验部分
1.1 试剂及仪器
PVA(聚合度:1700±50,醇解度99%,成都科龙化工公司);
胶原(猪皮为原料自制[19,20],冻干保存;经丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测,在116k Da附近有2条相邻带,在200k Da附近有一条带);
1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐盐酸(EDC·HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(纯度均>99%,上海延长生化试剂有限公司);
其它试剂均为市售分析纯试剂,使用前未经纯化处理。
恒温水浴锅(KXS型,成都科析仪器成套公司);
电子天平(FA2004N型,上海箐海仪器有限公司)。
1.2 试验步骤
1.2.1 胶原-聚乙烯醇水凝胶的制备
1.2.1. 1 PVA的改性
将PVA于60℃条件下溶于二甲亚砜(DMSO),待完全溶解后加入少量三乙胺(TEA),水浴升温至75℃。然后将丁二酸酐的DMSO溶液逐滴加入,反应持续4.5h后,将溶液降至室温。将反应液再缓慢倒入快速搅拌的20%氢氧化钠甲醇溶液,使改性的PVA充分凝聚沉淀。然后依次用蒸馏水、0.2mol/L的盐酸溶液、蒸馏水洗涤,最终洗涤液的p H值为5~6。产物经真空干燥后密封保存,标记为s P-VA。采用酸碱滴定法测定s PVA中的羧基含量为(0.119±0.012)mmol/g。
1.2.1. 2 胶原溶液的配制
取自制胶原,准确称重后溶于0.1mol/L醋酸溶液,4℃条件下搅拌溶解后配成浓度为0.5%的胶原溶液,保存备用。
1.2.1. 3 胶原-PVA水凝胶的制备
利用EDC和NHS交联s PVA与胶原。s PVA与胶原的绝干质量比及对应的编号如表1所示,EDC和NHS的剂量均为0.03mmol/g溶液。对于一定质量的s PVA溶液,胶原溶液与EDC和NHS的用量是一定的。NHS先被加入s PVA溶液,待NHS完全溶解后,再加入EDC。搅拌60min后,加入胶原溶液,在25℃下搅拌4~5h。随后,将反应液缓慢倒入培养皿(直径9cm),立即在-20℃下冷冻;冷冻10~12h后,然后再解冻4~5h。以上冷冻-融解步骤视为一个冻融周期。经过5个冻融周期后,将制备的水凝胶放入蒸馏水中浸泡3d(常换水),除去残余的交联剂。最后将水凝胶冻干后干燥密封保存。
1.2.2 胶原-聚乙烯醇水凝胶的溶胀研究
1.2.2. 1 胶原-聚乙烯醇水凝胶在蒸馏水与生理盐水中的溶胀情况
称取一定质量不同配比的PCH分别浸泡在蒸馏水和生理盐水中,置于25℃水浴中,每隔20~30min取出水凝胶后用湿润的滤纸拭去其表面水分,称量其溶胀后质量,反复多次至溶胀时间为5~6h;将水凝胶浸泡过夜,次日再间隔一定时间取出称重,总时间为24h左右。对试验结果进行分析,讨论水凝胶在水中的溶胀情况以及电解质对其溶胀的影响。
1.2.2. 2 溶液p H对水凝胶溶胀的影响
称取一定质量不同配比的胶原-聚乙烯醇水凝胶分别放入不同p H值的溶液(电解质浓度均为0.1mol/L)中,置于25℃的水浴中,称量方法同上所述。分析试验结果,研究PCH在不同p H条件下的溶胀情况。
1.2.2. 3 胶原-聚乙烯醇水凝胶在不同p H下的溶胀情况
称取一定质量不同配比的凝胶分别放入Na Ac-HCl缓冲液(p H=1.9)中,置于25℃的水浴中,每隔20min取出水凝胶用湿润的滤纸拭去其表面水分后进行称量,然后重新放入溶液中,如此反复3次后将水凝胶放入TrisHCl缓冲液(p H=8.4)中,同样每隔20min进行测量并重复3次。将一次p H=1.9、一次p H=8.4条件的溶胀过程称为一轮,共进行3轮酸性-碱性交替条件的溶胀,对结果进行分析讨论。以上缓冲液的电解质浓度均为0.1mol/L。
上述各个条件下不同水凝胶的溶胀情况,均根据不同时间点溶胀前后的质量情况计算溶胀比,溶胀比(Q)的计算按照式(1)进行:
式中:mt为溶胀时间为t时水凝胶的质量,m0为干凝胶的质量。
2 结果与讨论
2.1 胶原-聚乙烯醇水凝胶在蒸馏水与生理盐水中的溶胀情况
不同编号的水凝胶材料在蒸馏水和生理盐水中的溶胀比情况如图1和图2所示。根据对各组水凝胶溶胀的变化规律,认为采用数学方程对水凝胶的溶胀情况进行拟合,可以更好地了解水凝胶的溶胀特性,图1、图2中的曲线即为各组水凝胶的方程拟合曲线。
拟合所采用的数学方程是二元指数相关方程(Two-phase Exponential Association Equation),方程形式如式(2)所示。因方程的变化趋势和水凝胶的溶胀过程相似,所以采用此方程进行拟合,以求得水凝胶的平衡溶胀比,更加科学准确。PCH在蒸馏水以及生理盐水中溶胀比的拟合方程参数,以及根据拟合结果计算出各水凝胶的平衡溶胀比如表2所示。
由图1与表2可以看出:不同配比的水凝胶在蒸馏水中的平衡溶胀比不一样,平衡溶胀比大小:1号<2号<3号<4号<5号。其平衡溶胀速率都很大,但仍有细微的差别,平衡溶胀速率也呈现:1号<2号<3号<4号<5号。一般认为,高分子凝胶材料的溶胀通常包括3个连续的过程。首先,水分子扩散进入到凝胶内部;随后,凝胶中高分子链发生松弛;最后,整个高分子链在水中伸展,凝胶网络达到溶胀平衡[16]。在影响聚乙烯醇—胶原水凝胶的平衡溶胀比的因素中,理论上讲,水凝胶的平衡溶胀比会随着聚乙烯醇含量的增加而增加,因为PVA的亲水基团显然比胶原的多,因为PVA的每一个结构单元都具有亲水性基团羟基,但试验结果表明:水凝胶的平衡溶胀比随着胶原的含量增加而增加。产生此现象的原因可能是胶原-聚乙烯醇水凝胶材料中形成的,是以PVA碳-碳刚性骨架为主的网络结构,随着胶原柔性链段含量的增加,在溶液中伸展的越开,空隙越多,可以与水结合的部位和空间也随之增多,因此平衡溶胀比有增大的趋势。至于不同配比凝胶的溶胀速率相差不大,可以这样理解:由于反复冻融使得PVA分子链与胶原分子链之间产生物理交联,所以凝胶溶胀时PVA分子链的伸展与胶原分子链的伸展相互牵制,这种牵制作用的结果,使PVA分子链伸展的快慢程度与胶原分子链伸展的快慢程度趋于一致,从而体现出凝胶的溶胀速率很少受其组成影响的特性[17]。
由图1、图2和表2可以看出:不同配比的水凝胶在0.9%的生理盐水中的平衡溶胀比及其平衡溶胀速率的溶胀规律,与水凝胶在蒸馏水中的溶胀规律类似。可以发现:2号与3号水凝胶在盐水中的平衡溶胀比相对于蒸馏水中的平衡溶胀比有所减小,且减小幅度较大,3号减小幅度最大;1号、4号、5号在盐水中的平衡溶胀比相对于蒸馏水中的平衡溶胀比有所增加,但增幅很小,增幅1号>5号>4号,可能是因为生理盐水的电解质浓度很低,所以影响不明显而已。因此,我们得到初步结论:电解质对平衡溶胀比与平衡溶胀速率的影响较弱,电解质可降低水凝胶的平衡溶胀比。胶原-PVA水凝胶在较低离子强度下,具有较高的平衡溶胀比。由于存在Donnan效应,溶液中的无机离子通过溶胀进入到水凝胶内,一方面使凝胶内外的渗透压降低,另一方面大量的自由离子迁移进入凝胶内部,对聚电解质分子网络产生静电屏蔽作用,使得分子链间的静电斥力作用减弱,阻碍了水合作用,这2种作用都会使水凝胶的平衡溶胀比下降[18]。还可能是因为聚乙烯醇之间的氢键缔合结构因电解质的存在而使数目有所增加,故溶胀比减小[21]。Na Cl的加入,使溶液的极性增强,从而使疏水效应增强;由于Na Cl的存在,大分子链周围单位体积中水分子的数目相对降低,使亲水作用下降[22]。
4号、5号水凝胶平衡溶胀比小幅度的增加,可能是因为生理盐水的电解质浓度很低,所以影响不明显,又因其含有胶原,可能存在类似低电解质溶液促进蛋白质溶解的作用。
采用数学方程对水凝胶溶胀过程的拟合结果较为理想。水凝胶在蒸馏水和溶液中的溶胀规律相似,均表现出前期快速溶胀,后期缓慢达到溶胀平衡的规律。通过拟合,不仅可以从图中明显地看出水凝胶的整个溶胀过程,发现其规律,而且可根据拟合结果对水凝胶的平衡溶胀比进行推算,从而便于进行相关研究。
注:Qe为平衡溶胀比(单位g/g)。
2.2 溶液p H对PCH溶胀的影响
2.2.1 水凝胶在不同p H溶液中的溶胀情况
不同配比的水凝胶分别在p H值为2~11的各组溶液中的溶胀比随时间的变化情况如图3与图4所示,由拟合计算结果得出的平衡溶胀比如表3所示。
通过对图3、图4与表3中每一种水凝胶平衡溶胀比的比较可知:在相同p H溶液中,水凝胶的平衡溶胀比都是1号<2号<3号<4号<5号,规律类似PCH在蒸馏水中的溶胀情况。PCH在不同p H溶液中的平衡溶胀比与在蒸馏水中的情况相比,1号和2号的Qe值均有所增加,而3号、4号的检测结果有所波动,平衡溶胀比有部分增加、也有减小,5号的平衡溶胀比则稍有降低。PCH的溶胀行为除了受水凝胶配比和溶液中的电解质影响以外,还会与溶液的p H值有关系。原因在于1号与2号水凝胶中的胶原含量较少,链段较刚性,离子浓度对其影响较小,但PVA的含量较高,其羟基的质子化作用可使链段伸展,同时胶原氨基的质子化或羧基的去质子化,可使得凝胶内的孔隙增加,平衡溶胀比增加。5号水凝胶则是因为胶原含量较高,链柔性较高,离子强度对其有较大的影响,使其平衡溶胀比下降。3号水凝胶的溶胀情况可能是水凝胶配比、溶液中的电解质和溶液的p H值综合影响所致。
2.2.2 相同配比的PCH在不同p H溶液中的平衡溶胀比
相同配比PCH在p H值为2~11溶液中的平衡溶胀比变化如图5所示。大致规律为,在较低和较高p H值的溶液中,凝胶的平衡溶胀比都比中性溶液中的高,且在酸性条件下凝胶的平衡溶胀比略高于碱性条件下凝胶的平衡溶胀比。可见,胶原-PVA水凝胶具有一定的p H响应性。这是因为在高分子网络中的胶原分子链上既有酸性基团—COOH,又有碱性基团—NH2。当溶胀介质p H值低于胶原的等电点时,—NH2被质子化而带正电荷。同时PVA分子链中的—OH也部分质子化而带正电荷,由于整个高分子凝胶网络带正电荷而使分子链间相互排斥,易于伸展,凝胶表现出较高的溶胀比。当溶胀介质偏碱性时,—COOH则转变为—COO-,使凝胶网络带负电荷,高分子链间相互排斥而易于溶胀[23]。但当溶胀介质的p H值进一步增加时,凝胶的溶胀比略有下降,这可能是由于在更高值的溶胀介质中,凝胶网络中PVA分子链上的羟基去质子化作用增强,使其自身伸展受到限制,从而在凝胶内部形成PVA分子链的局部收缩,又因为分子链与胶原分子链间存在次级键,所以分子链的这种局部收缩会引起整个凝胶网络溶胀比的下降。在胶原等电点附近,—NH2与—COOH之间离子键合,形成一种较紧密结构,因而不易溶胀。同时由Donnan平衡理论可知,凝胶的溶胀主要是由凝胶内外自由离子浓度差所产生的渗透压决定。当溶胀介质p H较低时,水凝胶主要带电基团是质子化的氨基(—NH3+),当p H较高时,是脱质子化的羧基(—COO-),在这些范围内,凝胶内部自由离子的浓度大于环境中离子自由浓度,由此产生的渗透压使凝胶吸水膨胀以降低凝胶内电荷。当p H正好处于胶原-PVA的等电点时,—NH3+和—COO-所带电荷相当,相互之间的静电吸引使水凝胶内自由离子浓度几乎为零,外界渗透压使水凝胶脱水收缩。但是只有3号材料在碱性条件下呈现下降的规律,可能是因为3号水凝胶的配比使得PVA的羟基去质子化作用,随着溶液p H值的增加而增加,链段因斥力作用减弱而收缩[24],而胶原中的—COO-间的排斥作用不及前者,因此3号的平衡溶胀比有所减小。1号、2号水凝胶虽然也会因PVA的羟基去质子化作用随着溶液p H值的增加而增加,链段因斥力作用减弱而收缩,但是又因为其链段较刚性,当收缩到一定范围时便不再收缩,胶原中的—COO-间的排斥作用便占主要作用,从而平衡溶胀比有所增加。4号、5号水凝胶则是因为胶原含量的增加,胶原中的—COO-间的排斥作用增强,所以平衡溶胀比有所增加。
2.3 水凝胶在不同p H溶液中的溶胀-消胀行为
不同水凝胶在p H=1.9和p H=8.4溶液中的溶胀比随时间的变化如图6所示。通过图6可以看出:1号-4号水凝胶在溶胀-消胀试验的时间内吸水到达平衡后,未出现较为明显的溶胀-消胀特性,并未进一步吸水或失水。5号水凝胶在试验时间范围内,有一定的溶胀-消胀特性。可能原因主要是1号、2号、3号和4号中的胶原含量过低,氨基与羧基含量少,凝胶内与正(负)离子结合的量少,很难因带同种电荷而排斥使得聚合物松弛,溶胀比发生改变。除此之外,还因其在p H不同的溶液中,平衡溶胀比本来改变就不大,对p H敏感度不高。还可能因为试验时间较短而未发现其轻微的溶胀-消胀特性。而5号水凝胶出现明显的溶胀-消胀特性,斜率出现了较大的负值,在p H值为8.4时有失水现象发生。5号水凝胶可能因其胶原含量相对较高,所以对溶液p H较为敏感。从表3可以看出:随着胶原含量的增加,水凝胶在p H=1.9的溶液中的平衡溶胀比相对于其在p H=8.4的溶液中的平衡溶胀比,从增加逐渐到减少的过程,进一步说明关于溶胀比变化的解释是正确的。
3 结论
胶原-聚乙烯醇水凝胶有如下溶胀特性:原料的不同配比对PCH溶胀速率有很大的影响,胶原含量越高,溶胀速率越大,其中4号与5号水凝胶的溶胀速率都很快,在溶胀近100min左右时就可以达到溶胀平衡,而3号水凝胶达到溶胀平衡需400min左右,且1号和2号水凝胶则需时更长。水凝胶的配比还对平衡溶胀比有较大的影响,水凝胶中胶原含量越大,平衡溶胀比越大。胶原相对于聚乙烯醇碳碳刚性骨架来说,是相对柔性结构,可更为伸展。因此胶原含量的增加可增大PCH溶胀速率与平衡溶胀比。而又由于胶原具有部分蛋白质的两性性质,所以电解质的浓度可对PCH的溶胀性质有影响,比如影响其水化层和双电层厚度等。电解质可降低胶原含量较高的PCH的平衡溶胀比。不同p H对PCH有影响,对于胶原含量较少的水凝胶来说,不同p H溶液均可增加其平衡溶胀比,而对于胶原含量高的水凝胶,不同p H溶液均可减小其平衡溶胀比。因此,PCH具有一定的p H敏感特性,一定的p H溶胀-消胀性能。
摘要：采用经化学改性的含羧基的聚乙烯醇、胶原为原料,经物理交联,即反复冻融法制备了胶原-聚乙烯醇水凝胶。研究了不同原料配比的胶原-聚乙烯醇水凝胶的溶胀动力学、pH敏感性及pH溶胀-消胀特性,并利用数学方程拟合的方法计算其平衡溶胀比,尽量减少了因样品溶胀不足或测量误差导致平衡溶胀比估算的不准确性,使所得数据更加科学准确。结果显示:制备的胶原-聚乙烯醇水凝胶具有很快的溶胀速率,如胶原含量为9.09%的4号水凝胶可在100min内达到90%的平衡溶胀率,且随着胶原含量的增加,溶胀速率随之加快;电解质可降低其平衡溶胀比;有一定的pH敏感性和pH溶胀-消胀特性,胶原含量的增加可使水凝胶的pH溶胀-消胀特性更加显著。
关键词：聚乙烯醇,胶原,水凝胶,溶胀
胶原凝胶 篇2
体表创伤敷料对于创伤治疗的重要性和意义不言而喻,这也驱使各国的研究者开发各种新型材料。目前,对于体表创伤的愈合理论,普遍接受的是1962年由Winter提出的湿性愈面修复材料的要求而被广泛关注,成为研究热点,并有部分成果用于临床应用且取得良好效果[2,3]。合理论[1]。根据湿性愈合理论的要求,体表创伤敷料应该具有理想的物理机械性能、适当的保湿性能和一定的生物降解性能,这也为体表创伤敷料提出了较为关键和具体的要求。正因如此,水凝胶由于具有符合理想创
然而,以聚乙烯醇(PVA)为原料制备得到的水凝胶,由于表面缺乏细胞识别位点,细胞相容性较差,因此很难单独作为组织工程支架应用。胶原是一种具有优异生物相容性和低抗原性的天然高分子材料,可以介导细胞间的传导和相互作用,将其用于体表创伤敷料,能够支持很多不同组织的生长。因此,以PVA和胶原为原料制备复合型天然高分子水凝胶成为一种新的发展方向。除此之外,水凝胶还可作为药物缓释或控释的载体,减少用药并提高疗效。有研究者就以PVA、N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)与丙烯酸(AAc)等为原料,制备具有温敏性的水凝胶薄膜材料[4,5,6,7,8]。
文章拟以P(NIPAM-co-AAc)、PVA和胶原为主要原料,制备具有环境敏感性的功能性高分子水凝胶。利用PVA构建具有良好物理机械性能的高分子网络结构,辅以胶原蛋白改善材料的生物相容性。在此基础上,以分子设计的思路合成相转变温度在人体生理温度附近的PNIPAM基共聚物,并以此作为温度敏感控件,构建具有智能环境响应能力的高分子水凝胶材料。主要结构特征如图1所示。
1 试验部分
1.1 主要试验材料与仪器设备
胶原按实验室已建立的方法自制及纯化[9];
聚乙烯醇(PVA),分析纯,平均聚合度1 700±50,醇解度99%,成都科龙化工有限公司;
1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),分析纯,上海延长生化试剂有限公司;
P(NIPAM-co-AAc),实验室自制;
其它化学试剂均为市售分析纯试剂,如未特殊说明均为直接使用,使用前未经任何提纯或附加操作。
精密增力电动搅拌器,JJ-1,江苏金宇环宇科学仪器厂;
真空冷冻干燥机,Freeze 6,Labconco;
万能拉力机,AI-7000S,台湾GoTech。
1.2 试验内容与方法
1.2.1 PVA-P (NIPAM-co-AAc)-Col水凝胶的制备与响应曲面设计
(1)PVA的改性及改性PVA溶液的配制
为了获得含羧基的聚乙烯醇材料,本试验选择丁二酸酐与聚乙烯醇进行反应。改性后得到的产物标记为改性PVA(sPVA)[10]。
取适量密封保存备用的sPVA,加入适量蒸馏水使其浓度达到18%左右,于60℃搅拌溶胀约2h后,升温至90℃,继续搅拌至完全溶解成均匀溶液,再按照18%的sPVA浓度补加蒸馏水至预定重量,搅拌均匀后自然冷却至室温,静置脱泡备用。
(2)P(NIPAM-co-AAc)聚合物的制备及溶液的配制
以APS和TEMED为氧化还原体系,分别作为反应的引发剂和加速剂,以BIS作为交联剂,采取无皂乳液聚合法合成P(NIPAM-co-AAc)共聚物。取纯化后冷藏保存的AAc,用约0.5mol/L NaOH溶液溶解并调pH值至4.0,使AAc单体浓度为10%。准确称取BIS和APS,用蒸馏水配制成浓度约为1%的交联剂溶液和10%的引发剂溶液,冷藏保存。准确称取已纯化的NIPAM单体,按NIPAM与AAc单体摩尔比9:1加入AAc单体溶液和0.15%BIS交联剂溶液,加入蒸馏水使混合后总重为50g,搅拌溶解成澄清均匀溶液后加入加速剂TEMED,再将混合溶液倒入恒压加样漏斗。准确称取0.08%的APS溶液,加入蒸馏水至总重为50g,转入三颈瓶中通氮气驱氧约30min后置于70℃水浴中,搅拌状态下将已转入恒压加样漏斗的单体混合溶液缓慢滴加到三颈瓶中,单体溶液滴加总时间为2h,加完后继续搅拌反应2h,整个反应过程始终保持通氮气驱氧。反应完成后将三颈瓶移出水浴,搅拌状态下冷却至室温,将冷却后的反应液转移入截留分子质量为10 000的透析带中,用蒸馏水透析,最后将纯化的产物冷冻干燥,得到白色粉末状共聚物,标记为P(NIPAM-co-AAc)聚合物[4,5,6,7,8]。经检测,该共聚物的低临界相转变温度(LCST)在人体生理温度(37℃)附近。
取适量密封保存备用的P(NI-PAM-co-AAc)共聚物粉末,加入适量蒸馏水使其浓度为5.0%,室温下搅拌溶解成澄清均匀溶液,静置脱泡后备用。
(3)胶原溶液的配制
取适量密封保存备用的胶原海绵,准确称量后加入0.1M HAC配制成浓度为1.0%的胶原溶液,置于冰箱中4℃条件下充分搅拌溶解,静置脱泡备用。
(4)水凝胶的制备与响应曲面设计
在前期的研究基础上,对响应曲面设计进行了修正。选择三因素Box-Behnken方法进行设计,主要考察PVA的浓度(CPVA)、P(NIPAM-coAAc)共聚物与PVA的比例(NA/PVA)、以及反复冻融循环次数(FTC)对水凝胶性能的影响。响应曲面设计的因素与水平如表1所示,利用Minitab软件生成试验方案如表2所示。
取适量上述配制的sPVA溶液,按照表2中规定的P(NIPAM-coAAc)共聚物与PVA的比例(质量比)加入P(NIPAM-co-AAc)共聚物溶液,室温条件下搅拌混匀后加入NHS,溶解后再加入EDC,充分搅拌反应液约30min后加入胶原固含量为PVA重量10%的胶原溶液,连续搅拌反应约5h;其中NHS和EDC的用量为0.03mmol/g(以混合总质量计);反应完成后,将上述反应液静置过夜,充分脱泡后将10g反应液倒入直径为90mm的培养皿中,置于-20℃冰箱中冷冻10～12h,然后再将冷冻的样品置于室温条件下融解7～8h,该冷冻-融解过程称为一次冻融循环,按照表2中规定的次数完成各组样品的冻融循环后,将水凝胶样品置于蒸馏水中充分浸泡,以除去未完全反应的单体。最终将制备得到的部分水凝胶冷冻干燥,密封保存用于各项表征检测,部分水凝胶直接用于力学性能以及含水量的测试。响应曲面设计方案中的各编号样品均制备3个以上平行样,每个响应值检测重复3次,检测结果以均值±标准偏差的形式表示,且当P值小于0.05时认为具有统计学意义。
1.2.2 PVA-P (NIPAM-co-AAc)-Col水凝胶的验证试验
采用响应曲面设计进行PVA-P(NIPAM-co-AAc)-Col水凝胶的制备与分析以后,拟对其结果的准确性和可靠性进行验证和探讨。选择不同于响应曲面中的试验参数,按照相同流程和方法重新制备PVA-P(NI-PAM-co-AAc)-Col水凝胶并进行相同项目的检测表征。同时,利用响应曲面设计得出的结果进行理论计算,比较实际检测结果与理论计算结果之间的差异,以对试验结果进行验证。验证试验的编号以及主要参数列于表3。
1.3 PVA-P (NIPAM-co-AAc)-Col水凝胶的表征
(1)水凝胶的力学性能检测
使用电子拉力机进行抗张强度和断裂伸长率的测定,同时计算材料的杨氏模量,与材料的抗张强度、断裂伸长率一并分析。
(2)水凝胶的含水量测定
水凝胶试样的含水量(WC)可以通过样品干燥前后的质量差计算得到。
其中,W1为干燥恒重前水凝胶试样的质量,W2为干燥恒重后水凝胶试样的质量。
(3)水凝胶的溶胀率测定
将密封保存备用的水凝胶剪成合适大小的小块,准确称重后分别浸泡于含有蒸馏水和生理盐水的15mL离心管中,于25℃水浴中静置24h以上;用湿润的滤纸吸取吸水后的水凝胶试样的表面水,准确称重,根据水凝胶试样浸泡吸水前后的质量差值计算其平衡溶胀率。
其中,Qe是吸水溶胀平衡的溶胀率,W0是水凝胶冻干试样的质量,We是水凝胶吸水平衡后的质量。
(4)水凝胶的透水汽性测定
采用医药行业标准《YY/T0471.2-2004接触性创面敷料试验方法第2部分透气膜敷料水蒸气透过率》中规定的方法进行干态透水汽性和湿态透水汽性的检测。在测定PVA-P(NIPAM-co-AAc)-Col水凝胶的湿态透水汽性时,分别在35℃和39℃条件下进行测定,以分析水凝胶材料是否表现出应有的温敏性质。
2 结果与讨论
2.1 PVA-P(NIPAM-co-AAc)-Col水凝胶的响应曲面分析
2.1.1 水凝胶的抗张强度分析
根据抗张强度的响应值,选择完全二次方程分析并绘制了水凝胶抗张强度的响应曲面,如图2所示。
在可进行分析的几种模型中,完全二次模型可以很好地拟合PVA-F(NIPAM-co-AAc)-Col水凝胶的抗张强度。从抗张强度的响应曲面图上可以看出:原料中PVA的浓度对结果具有明显影响。从CPVA与其它2个因素的响应曲面图上可以清楚的看到,在水凝胶冻融次数和温敏共聚物使用量保持不变的情况下,水凝胶的抗张强度几乎随着PVA的浓度直线上升。其原因在于PVA是以碳碳单键为基础构成主链骨架的大分子材料,在受到拉力作用时,PVA主链能够表现出很强的抗张作用;同时,经与温敏共聚物和交联剂改性以后,PVA长链分子与其它2种大分子共价交联并在水凝胶中互相缠绕成空间网状结构。因此,水凝胶中PVA含量的高低直接决定了其抗张强度的大小。
相对而言,冻融次数和温敏共聚物比例对抗张强度的影响就要小很多。从图2中可以看出,在固定水凝胶中PVA浓度的情况下,增加冻融次数和减小温敏共聚物的加入比例都能较小程度地增加水凝胶抗张强度。这与其他研究人员得出的结论基本一致[11]。原因在于,增加冻融次数可以加强PVA的结晶程度,更加有序的高分子排列结构具有更好的应变耐受能力;而在水凝胶中胶原与PVA的比例与交联剂用量都是固定的,所以减少加入温敏共聚物的量可以一定程度上减小在水凝胶中的占位作用,减小对PVA结晶的影响,从而提高抗张强度。
进一步运用Minitab软件对试验结果进行多元回归拟合,得到关于抗张强度的完全二次回归模型拟合方程,如式3和式4所示。在进行验证试验时,给定了试验参数以后,就可以采用式3对响应值进行计算预测,而利用式4中各项的系数大小可以对比因素的线性关系、平方关系和交互关系对响应值的影响程度。由公式4中的编码方程可以看出,对水凝胶抗张强度影响最大的因素是平方项,其次为FTC2和NA/PVA2,线性项中CPVA的影响再大一些,其它线性项以及交互项的影响都较小且比较接近。
(A=CPVA;B=NA/PVA;C=FTC;后同)
式3 PVA-P(NIPAM-co-AAc)-Col水凝胶抗张强度的完全二次拟合未编码方程
式4 PVA-P(NIPAM-co-AAc)-Col水凝胶抗张强度的完全二次拟合编码方程
2.1.2 水凝胶的断裂伸长率分析
根据PVA-P (NIPAM-coAAc)-Col水凝胶的断裂伸长率检测结果绘制响应曲面图,如图3所示。观察发现,在3个因素的两两交互作用响应曲面中,CPVA对水凝胶的断裂伸长率的影响还是比较明显的。与CPVA对水凝胶抗张强度的影响规律有所不同的是,PVA浓度对断裂伸长率的影响不完全是正面的,即断裂伸长率随着PVA浓度的增加出现极小值。水凝胶的断裂伸长率主要受到水凝胶中高分子的分子质量及分布、分子长链的结晶和交联缠绕程度等因素的影响,网络结构越强硬,则在受力拉伸时越容易应力集中而断裂。在制备不同PVA-P(NIPAM-co-AAc)-Col水凝胶试样时,各种原料的分子质量基本是保持不变的,主要的区别在于制备工艺。因此,水凝胶中高分子长链的结晶和交联是决定性因素。水凝胶断裂伸长率出现极小值的原因就在于水凝胶中高分子结晶和化学交联很高,使高分子网络结构的柔韧性降低。从式6可以发现,平方项的影响最大。
胶原凝胶 篇3
1 材料与方法
1.1 软骨细胞分离、培养及鉴定
取3 月龄新西兰兔1 只(第四军医大学实验动物中心提供),耳缘静脉空气栓塞处死,无菌条件下,切取双耳廓全层,眼科剪去除耳廓皮肤、皮下组织及软骨膜,PBS液(含青、链霉素各200 U/ml)漂洗3 次,剪成1 mm×1 mm×1 mm软骨碎片,置于100 ml培养瓶中,加入20 倍体积的0.1%Ⅱ型胶原酶(Gibico公司,美国),37 ℃恒温震荡器内消化10 h, 250目尼龙网筛过滤除去未消化完全的软骨残片,1 000 r/min离心4 min收集细胞,沉淀细胞用PBS液洗2 次,DMEM培养液(Gibeo公司,美国)制备细胞悬液,接种培养瓶常规培养,传代扩增。
1.2 PLGA三维支架制备
运用计算机辅助设计(CAD)与低温挤压成型工艺结合制作直径8 mm、厚2 mm PLGA支架材料(在清华大学激光快速成型中心完成)。
1.3 胶原凝胶包埋软骨细胞接种PLGA三维支架
冰浴中,将软骨细胞以5×107 个/ml的密度与II型胶原(Sigma,美国)充分混合,每块消毒预湿的PLGA三维支架加入细胞-胶原混合液,使细胞悬液充分占据PLGA空隙。置于37 ℃,CO2 培养箱中孵育40 min凝固后,加入培养液培养, 隔天换液,植入前复合物于体外培养3 d。切取部分组织在倒置显微镜下观察细胞附着情况,另取部分组织, 3%戊二醛固定,梯度脱水,临界点干燥,喷金,扫描电镜(S- 3400N,日本日立)观察。
1.4 复合物的植入
10 只7 周龄裸鼠常规饲养1 周,植入手术及动物饲养均在第四军医大学动物实验中心进行。复合物植入6 只裸鼠背部皮下,为实验组。另外4 只植入单纯支架无细胞为对照组。植入12 周后,处死动物收集样本。大体观察,随机取材料边缘样本以4%中性甲醛液固定行组织学染色。
1.5 组织学检查
在大体观察后,取出标本以4%中性甲醛液固定,经系列脱水、石蜡包埋、切片,进行苏木精-伊红和番红“O”染色,光镜下观察软骨形成情况。
2 结 果
2.1 材料细胞复合体的倒置显微镜观察和扫描电镜观察
扫描电镜(图 1)见软骨细胞呈圆形包裹于胶原凝胶中,可见分裂的软骨细胞。倒置显微镜(图 2)下见软骨细胞呈单个、多层或团块状均匀分布于支架材料的孔洞中,细胞呈圆球形在支架材料内分布均匀。
2.2 体内植入物大体和组织学观察
10 只实验动物均存活,无感染,无移植物排出。肉眼观察(图 3)样本呈现瓷白色外观,组织工程软骨组织保持其初始外形,触之较硬,无血管生成。对照组无软骨组织形成。
组织学观察: 6只裸鼠背部取出的样本切片经HE染色,见样本表面为1~2 层梭形细胞(图 4~7), 深层为数层已形成软骨陷窝的圆形细胞,细胞大部分成熟, 细胞排列密集, 分布均匀,绝大部分细胞呈圆形,周围有陷窝,材料孔隙间软骨基质形成,可见岛状软骨组织形成。材料完全降解,可见材料降解所留的空隙。未见炎性细胞浸润。番红“O”染色见支架材料间及材料周围有大量异染组织,细胞胞质、胞核及细胞周围基质成分均有明显着色。
3 讨 论
传统的支架材料成型工艺包括:纤维编织法、纤维粘接法、溶液浇铸制孔剂浸出法和气压造孔法等[1]。但是这些工艺制造的支架均存在一定的局限,如溶剂残留、缺乏稳定的结构和力学性能差等缺点。随着先进的制造技术发展,快速成型技术进入支架的成形领域。快速成型技术制作的支架材料具有个体化、高孔隙率及高交通特性,其孔隙分布均匀。本研究所用的快速成型PLGA材料大孔直径为300~500 μm,孔隙率可达89.6%。符合软骨组织工程的要求,可充分保证营养物质的进出[2]。在软骨组织工程研究中,已有多种支架材料在实验及临床中试用。支架材料主要分为两类,一类是天然生物材料,另一类是人工合成生物材料[3]。它们各有自己的优缺点。天然材料的优点是细胞相容性好,能促进细胞的粘附与增殖及维持细胞表型;而人工材料具有较强的可控性,可精确控制其形状、相对分子质量、降解时间等,从而成为组织工程重要的支架材料。但人工材料本身的疏水性及材料表面缺乏与细胞粘附所需的识别位点, 导致支架的细胞相容性及细胞粘附性不足;软骨细胞接种支架时, 细胞在支架内分布不均且容易从支架流失[4]。而生物材料存在力学强度差, 易变形等不足[5]。将这2 类支架结合应用, 将可能提高细胞支架的体外复合效果,能够很好的维持软骨细胞的表型。
胶原凝胶具有良好的生物相容性和可降解性,可为细胞的增殖与分化提供有效的三维空间,较好的维持软骨细胞的表型[6]。有研究表明,将软骨细胞接种于胶原凝胶中, 是再造软骨组织的有效方法[7]。但胶原凝胶又存在易收缩,脆性大,操作困难和抗酶解能力差等缺点[8]。所以本实验将软骨细胞包埋于胶原凝胶后接种于高孔隙度快速成型三维支架,既能发挥三维支架具有较好力学强度及易于塑形等优点,又能发挥胶原凝胶对细胞的均匀包埋和粘附作用。已有研究表明胶原凝胶包埋大孔聚酯材料能够修复兔关节软骨的缺损[9]。
本研究结果表明, 结合胶原凝胶与具有一定力学强度的快速成型PLGA三维支架的优势, 通过胶原凝胶三维接种法, 能使软骨细胞均匀、高效种植于支架材料上, 同时, 还给软骨细胞提供了合适的三维生长环境,为工程化软骨的构建提供了一种简单、有效的细胞接种方法。在体内培养第12周表现出软骨组织结构,细胞间有大量糖胺多糖等细胞外基质沉积。因此本实验证实了凝胶包埋软骨细胞复合快速成型支架材料可以用于软骨组织的构建。胶原凝胶包埋软骨细胞复合快速成型PLGA后,有利于细胞的聚集及叠层生长,并促进细胞的成软骨表型及异位软骨组织的形成,形成的软骨组织变形小,结合了2 种材料的优点,进一步说明了胶原凝胶复合快速成型PLGA材料作为组织工程软骨支架的可行性。所以胶原凝胶包埋快速成型支架材料可作为载体复合细胞进行软骨组织工程研究。
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胶原凝胶 篇4
近年来,人们对可用于生物医用材料的水凝胶进行了大量的研究,尤其是具有环境敏感性的智能水凝胶受到了广泛的关注[1,2]。合成高分子的环境敏感性水凝胶材料易获得,且可塑性强,成为制备智能水凝胶的主要原料。但大部分合成高分子都存在细胞毒性、生物相容性低或不可降解性等缺点,限制了其应用,而很多天然高分子材料在这个方面却显示了独特的优势。因此,很多学者转向于采用天然高分子为原料制备智能水凝胶,如使用壳聚糖、蛋白质等为原料制备水凝胶。
胶原是哺乳动物体内含量最丰富的蛋白质,其由于独特的三股螺旋结构特点而具有良好的生物相容性、可生物降解性及促进细胞生长等特性[3],近年来在生物医用材料和高分子复合材料等方面的应用备受关注。然而,胶原在应用中还存在一些问题,如热稳定性等不能满足需要[4],因此需要通过改性来改善这些不足。IPN技术是近年发展起来的一种对聚合物进行改性的方法,其特有的强迫互容作用能使两种性能差异很大或具有不同功能的聚合物稳定结合,从而实现组分之间性能的互补;同时IPN 的特殊细胞状结构、界面互穿和双相连续等结构形态特征,又使得它们在性能或功能上产生特殊的协同作用,因此IPN 用作功能材料具有独特的优点[5]。
本实验的目的是想通过具有明显pH敏感性的丙烯酸与胶原通过互穿网络进行交联,制备出既具有胶原的良好生物相容性和可生物降解性又具有明显pH敏感性的水凝胶,并研究了其结构特征及理化性能。
1 实验
1.1 试剂及仪器
胶原(实验室自制,胃蛋白酶醋酸法提取);丙烯酸(AR,天津市博迪化工有限公司);过硫酸钾(AR,武汉化学试剂厂);硫代硫酸钠(AR,武汉化学试剂厂);Bis (Ultra Pure Grade,上海华舜生物工程有限公司)。酸度计(pHS-3E型,成都方舟科技开发公司);真空冷冻干燥机(ALPHA1-2LD型,德国);傅立叶变换红外光谱仪(MAGNA IR560型,美国);差示扫描量热仪(DSC200 PC型,德国)。
1.2 胶原/聚丙烯酸互穿网络水凝胶的制备
取一定体积丙烯酸放入100mL小烧杯中,然后加入10mL蒸馏水,称取一定质量的KOH使丙烯酸的中和度为80%,搅拌均匀后,加入Bis和Na2S2O3,搅拌均匀,最后加入K2S2O8,搅拌均匀。称取0.2g左右的胶原海绵,放入上述溶液中,封口,再将烧杯放置冰箱(4℃)过夜,取出后放在25℃水浴中反应24h,反应组成见表1。再将制备的样品用蒸馏水浸泡24h,每隔6h更换1次蒸馏水,以除去未反应的单体,最后将处理的样品进行冷冻干燥。
1.3 不同配比水凝胶的溶胀动力学
称取相同质量的各种干凝胶,分别置于40mL蒸馏水中,每隔一定时间取出凝胶,用湿润滤纸拭去其表面的水分,称其质量,按式(1)计算凝胶的溶胀比(Swelling ratio,SR):
SR=(ms-md)/md (1)
式中:ms为溶胀状态下凝胶的质量,md为干凝胶的质量。
按式(2)计算平衡溶胀比 (Equilibrium swelling ratio, SRe):
SRe=(me-md)/md (2)
式中:me为溶胀平衡状态下凝胶的质量,md为干凝胶的质量。
1.4 水凝胶的结构表征及热分析
将冷冻干燥后的水凝胶样品和胶原海绵分别磨碎后用KBr压片,测定其红外光谱;差示扫描量热采用DSC200 PC分析系统做DSC测试 (升温速率为5℃/min)。
1.5 水凝胶的pH敏感性
用HCl和NaOH溶液配制pH值分别为1～12的溶液,然后称取一定质量的干燥水凝胶分别放入上述不同pH值的溶液中,测定其平衡溶胀比。
2 结果与讨论
2.1 胶原/聚丙烯酸互穿网络水凝胶的制备过程
胶原/聚丙烯酸互穿网络水凝胶的制备过程见图1,首先引发剂Na2S2O3和K2S2O8生成自由基SO-4·和S2O-3·,然后贯穿在胶原海绵中的丙烯酸在交联剂的作用下发生自由基聚合反应并与胶原形成互穿网络水凝胶。
2.2 胶原/丙烯酸配比对水凝胶溶胀过程的影响
在实际应用中,不仅要有较高的平衡溶胀比,而且还要有较快的溶胀速率。图2为胶原与丙烯酸的不同配比对水凝胶溶胀过程的影响,可知原料配比对溶胀速率的影响不大,但是对水凝胶的平衡溶胀比有很大影响,样品2的溶胀比最大,所以选定样品2对水凝胶结构特征进行测试。所制备的水凝胶的吸水率在13min时就可以达到93%左右,与传统的水凝胶相比,大大缩短了溶胀平衡的时间。
2.3 傅立叶变换红外光谱(FTIR)分析
胶原和水凝胶样品的红外图谱见图3。
其中3332cm-1为酰胺键峰A(N-H),3077cm-1为酰胺键峰B(C-H),1667cm-1为酰胺峰Ⅰ(C=O),1548cm-1为酰胺峰Ⅱ(N-H)。而样品中胶原与丙烯酸形成互穿网络后,酰胺键峰A由3332cm-1移至3321cm-1高频率方向,表明有氢键形成,同时表明胶原与丙烯酸发生了交联,使胶原结构更加有序。水凝胶在1667cm-1处也有强吸收峰,说明水凝胶的制备过程中保持了胶原的三股螺旋结构[6]。且水凝胶的红外图在1600cm-1附近没有出现强吸收峰(C=C),说明凝胶中不含丙烯酸单体。
2.4 水凝胶与胶原的热稳定性研究
表2为胶原和水凝胶样品的DSC分析结果。比较二者的热变性温度可知,水凝胶的热变性温度比胶原的升高了49.2℃,即水凝胶的热稳定性比胶原强很多。这表明胶原与丙烯酸之间发生交联,分子间的作用力增大,肽链的活动受到约束,发生相变化的难度增大,表现为相转变所需的热能增加和温度升高,材料的热稳定性增强,从而扩大了该材料的应用范围。
2.5 水凝胶的pH敏感性
不同配比水凝胶的pH敏感性见图4,它们均表现出明显的pH敏感性。水凝胶的这种pH敏感特性主要是由高分子网络中的-NH2和-COOH引起的。在酸性条件下,-NH2被质子化而带正电荷,此时凝胶亲水性加强,同时由于正电荷之间的静电排斥作用使整个凝胶链以伸展的构象存在,体系自由能降到最低,渗透压增大,水分子更易渗透到凝胶内,从而表现出较高的溶胀比;在碱性条件下,-COOH呈解离状态,也存在上述效应,从而也表现出较高的溶胀比。由图4可看出,在酸性条件下,不同配比的水凝胶在pH=2时溶胀比最大,在pH=1～2之间溶胀比减小,这是由于凝胶链的-COOH在较低pH值下几乎不以-COO-形式存在[7],导致亲水性和离子排斥作用下降,所以溶胀比较小;在碱性环境中,不同比例的水凝胶在pH=12时的溶胀比最大。当凝胶处于中性环境时,-COOH 部分解离形成-COO-,-NH2部分质子化形成-NH3+,正负电荷之间的作用导致凝胶收缩释放水分,从而出现最小的溶胀比。
2.6 水凝胶pH溶胀-退胀性能的研究
水凝胶在不同的pH值溶液中表现出不同的溶胀行为,研究了水凝胶在pH=2和pH=8条件下的溶胀-退胀过程,结果见图5。由图5可知,水凝胶的溶胀-退胀具有良好的可逆性,其机理与pH敏感性相同。水凝胶这种良好的pH溶胀-退胀可逆性,使其适用于药物控制释放和离子渗透性开关,并且在药物控释中还可以利用体内一些蛋白酶和微生物对胶原的降解作用进一步加快药物的释放。此外,由于-COOH和胶原对重金属都有一定的螯合作用,可利用pH敏感性通过改变pH值达到对重金属离子的最大吸收。
3 结论
以Bis为交联剂,采用互穿网络(IPN)技术制备胶原/聚丙烯酸pH敏感水凝胶,对其相关制备过程和性能进行了研究,得到以下结论。
(1)红外光谱和差示扫描量热法分析表明,在水凝胶的制备过程中保持了胶原的三股螺旋结构,且胶原与丙烯酸形成互穿网络后,使胶原肽链的活动受到约束,材料的热稳定性显著提高,从而扩大了材料的应用范围。
(2)原料的不同配比对水凝胶溶胀速率影响不大,但对水凝胶的平衡溶胀比有很大影响,其中样品2的溶胀比最大。
(3)制备的水凝胶具有较快的吸水率,在13min时可达93%左右,且具有明显的pH敏感性和良好的pH溶胀-退胀可逆性,适用于药物控制释放和离子渗透性开关,并且在药物控释中可以利用体内的一些蛋白酶和微生物对胶原的降解作用进一步加快药物的释放。此外,由于-COOH和胶原对重金属都有一定的螯合作用,可利用pH敏感性通过改变pH值达到对重金属离子的最大吸收。
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胶原凝胶 篇5
胶原以其低抗原性、良好的生物相容性及能够降解等优点,被认为是作为软骨组织工程的理想材料[1,2,3]。但其较差的力学性能和较快的降解速率[4],也在一定程度上限制了其广泛的应用。采用交联剂交联[5]、纳米微晶纤维素增强[6]、物理共混[7]等方法,可以对胶原进行改性,但实际应用效果有限。
本文以自制I型胶原蛋白、海藻酸钠和经过氧化处理的微纤化纤维素为原料,利用氧化微纤化纤维素(OM-FC)分子上的醛基与胶原(Col)大分子上的氨基之间的席夫碱反应,及海藻酸钠(SA)与钙离子之间的离子交联,制备了OMFC/SA/Col复合水凝胶,研究了氧化微纤化纤维素对水凝胶体系的增强效果,分析了复合水凝胶的结构和形貌,并研究了其亲水性和力学性能。
1 试验部分
1.1 主要原料和仪器
Ⅰ型胶原、氧化微纤化纤维素(氧化度:0.188 9),自制;
海藻酸钠,分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司;
其它试剂均为分析纯。
VERTEX70型红外光谱仪,德国布鲁克公司;
Quanta200型扫描电镜,美国FEI公司;
UV2550型紫外-可见分光光度计,日本岛津公司。
1.2 OMFC/SA/Col复合水凝胶的制备
于4℃下,将一定质量的胶原溶解于0.01mol/L醋酸溶液中,调节溶液p H值为7.0,向其中逐滴加入分散均匀的氧化微纤化纤维素悬浮液和浓度为2g/L的海藻酸钠溶液,持续搅拌20min后,在冰浴中超声除泡0.5h。然后,将上述混合溶液置于37℃水浴中,待凝胶明显出现,向其中缓慢滴加质量分数5%的氧化钙溶液,于37℃恒温培养48h。
1.3 力学性能
按照GB/T 1041-92要求制备试样若干,通过砝码压缩观察不同配比水凝胶的强度及弹性;通过微机控制万能材料试验机测定不同配比水凝胶的强度。负载测试元件500N,压缩速率1mm/min,压缩应变20%,以此模仿正常软骨的形变,以检测增强效果。
1.4 形貌表征
切取一小块制得的水凝胶,冷冻干燥后用液氮脆断。在试样台的表面和侧面分别贴上一层双面导电胶,将冻干水凝胶试样轻轻粘在试样台的表面上,经液氮脆断的复合水凝胶的断面轻轻粘在试样台的侧面,然后喷金观察复合水凝胶的断面形貌。
1.5 红外光谱分析
取冷冻干燥后的OMFC/SA/Col复合水凝胶试样和KBr,按照1∶100的比例研磨、压片,测试波长范围400~4 000cm-1。
1.6 亲水性
将制得的水凝胶保持湿态,测定其接触角,接触角越小材料的亲水性越好,反之,材料的亲水性越差。
2 结果与讨论
2.1 复合水凝胶的力学性能
图1为不同配比复合水凝胶用不同质量的砝码压缩时的结果。可知,加入氧化微纤化纤维素增强的复合水凝胶强度明显提高,并且随着氧化微纤化纤维素含量的增多,增强效果更好。在砝码去除后,砝码压缩造成的形变均有不同程度的回复,表明复合水凝胶具有较好的弹性。
不同氧化微纤化纤维素含量的复合水凝胶在形变量为20%时的压缩应力如图2所示。氧化微纤化纤维素的加入对复合水凝胶的增强效果明显,且随着复合水凝胶中氧化微纤化纤维素含量的增大,增强效果更加明显。在压缩过程中,当应变超过20%后继续压缩,mOMFC/(mSA+mCol)质量分数分别为0、10%、20%时制备的OMFC/SA/Col复合水凝胶不发生破坏,最后被压成薄片,如图3所示。只有20%比例的OMFC/SA/Col复合水凝胶在应变为80%左右被压碎。可见,复合水凝胶具有良好的韧性,并且氧化微纤化纤维素的含量过大时,由于交联度过大,材料脆性增加,韧性降低。
2.2 复合水凝胶的形貌分析
图4为不同复合水凝胶冻干样品的数码照片及其SEM图。由数码照片(a、b)可见,加入氧化微纤化纤维素后,OMFC/SA/Col复合水凝胶结构变得致密。扫描电镜(c、d)显示,未加入氧化微纤化纤维素的复合水凝胶呈多孔状,孔洞大小均匀,尺寸约为100μm,断面较为光滑。加入氧化微纤化纤维素后的复合水凝胶呈多孔结构,与不加氧化微纤化纤维素的复合水凝胶相比,孔洞尺寸相对较小,且断面较为粗糙。
a、b、c的砝码质量分别为20、50和100ga,b and c:20g,50g,100g weight,respectively
2.3 复合水凝胶的红外光谱分析
图5(a)为不同胶原和氧化微纤化纤维素配比的OMFC/SA/Col复合水凝胶的红外光谱图,图5(b)为氧化微纤化纤维素、海藻酸钠和OMFC/SA/Col复合水凝胶的红外光谱图。由图5(a)可以看出:不同配比的OM-FC/SA/Col复合水凝胶在3 400cm-1左右都有明显的特征吸收峰,这是复合水凝胶中氨基和羟基的伸缩振动所引起。在低于1 500cm-1左右的吸收是由羧酸根所引起。未加氧化微纤化纤维素试样在1 640cm-1左右的吸收较加氧化微纤化纤维素的组分小,且在1 537cm-1左右也有微弱吸收,这是由羰基的振动吸收所引起的;加氧化微纤化纤维素的试样在1 537cm-1有明显吸收峰,在1 640cm-1左右出现明显吸收峰,且随着氧化微纤化纤维素含量的增多吸收变强,为亚胺吸收峰。由图5(b)对比可以看出,氧化微纤化纤维素在2 720cm-1附近有醛基的特征吸收,而在OMFC/SA/Col复合水凝胶中吸收峰几乎完全消失,在OMFC/SA/Col复合水凝胶中1 640cm-1和1537cm-1处出现微弱的亚胺吸收峰,表明复合体系中有胶原氨基和纤维素上醛基发生了席夫碱反应。水在1635cm-1处有特征吸收,其中胶原和氧化微纤化纤维素比例为4∶0.5和4∶1时,在1 640cm-1附近席夫碱的亚胺吸收被水的吸收峰所掩盖。
a、c:mOMFC/(mSA+mCol)=0%(wt%);b、d:mOMFC/(mSA+mCol)=40%(wt%)a、c:mOMFC/(mSA+mCol)=0%(wt%);b、d:mOMFC/(mSA+mCol)=40%(wt%)
2.4 复合水凝胶的亲水性
图6为不同配比的OMFC/SA/Col复合水凝胶的接触角测试图。可以明显看出,无论OMFC/SA/Col复合水凝胶中氧化微纤化纤维素含量如何,其接触角都几乎为零。表明OMFC/SA/Col复合水凝胶具有很好的亲水性,且氧化微纤化纤维素的用量不影响其亲水性能。海藻酸钠分子上含有大量的羟基和羧基基团,对材料的亲水性有较大影响。4组试样中海藻酸钠的含量相同,其亲水性均优良且相差不大。
a、b、c、d代表mOMFC/(mSA+mCol)分别为:0、10%、20%、40%(wt%)a,b,c and d,represent the mOMFC/(mSA+mCol)of 0,10%,20%40%(wt%),respectively
3 结论
以自制胶原、海藻酸钠及氧化微纤化纤维素为原料,制备了复合水凝胶。通过FT-IR、SEM表征了其结构,通过压缩试验和接触角研究了其力学性能和亲水性能。结果表明:在氧化微纤化纤维素和胶原之间发生了席夫碱反应;氧化微纤化纤维素的加入可以改善复合水凝胶的力学性能,且氧化微纤化纤维素加入量越多,其强度越大;20%应变下,复合水凝胶的最高压缩应力可达0.45MPa,能够满足软骨浅表层对强度的要求,且应变可达90%以上,具有很好的韧性;复合水凝胶亲水性好,且氧化微纤化纤维素含量对复合水凝胶的亲水性能影响不大。
参考文献
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胶原凝胶 篇6
改性聚乙烯醇中的羧基含量可表征聚乙烯醇的改性程度, 可通过改变丁二酸酐与聚乙烯醇的用量比进行调节。本文中, 采用国家标准聚乙烯醇树脂残留乙酸根 (或醇解度) 测定方法 (GB 12010.5-1989) 中规定的酸碱滴定法, 测定改性后聚乙烯醇中的羧基含量, 以羧基含量作为丁二酸酐改性聚乙烯醇的评价标准。本试验中, 制备得到了羧基含量在0~0.2594mmol/g水平的改性聚乙烯醇样品。
1.3胶原基复合水凝胶的制备
1.3.1改性聚乙烯醇溶液的配制
准确称取适量干燥保存的s PVA加入到锥形瓶中。然后, 以10%s PVA浓度计算加入适量蒸馏水, 之后于60℃水浴条件下搅拌溶胀2h, 再升温至90℃, 继续搅拌至完全溶解成均匀溶液。按照10%s PVA浓度补加蒸馏水, 搅拌均匀后自然冷却至室温, 静置脱泡备用。
1.3.2胶原溶液的配制
取冻干保存的胶原海绵, 准确称重后溶于0.1mol/L醋酸溶液, 4℃条件下搅拌溶解后配制成浓度为0.5%的胶原溶液, 保存备用。
1.3.3水凝胶的制备与响应面设计
本论文拟采用响应面设计方法, 研究不同水凝胶制备工艺参数对水凝胶力学性能的影响。选取改性聚乙烯醇中的羧基含量 (COOH) 、改性聚乙烯醇与胶原的质量比 (s PVA/Col) 、交联剂用量 (EDC/NHS) 以及冻融循环次数 (FTC) 作为自变量, 因素与水平设置如表1所示。响应曲面设计方案按照四因素Box-Behnken方法进行设计, 利用Minitab软件生成试验方案表, 如表2所示。取适量s PVA溶液, 按照表2中所规定的EDC/NHS用量计算所需交联剂用量, 先加入NHS搅拌至完全溶解, 再加入EDC搅拌反应约30min。按照表2中规定的s PVA/Col质量比计算所需要的胶原溶液, 加入至上述混合溶液后, 25℃条件下连续搅拌4~5h。反应完成后, 称取约10g反应混合液至直径为9cm的培养皿中, 于-20℃冰箱中冷冻10~12h后, 置于室温条件融解4~5h, 该冷冻-融解过程称为一次冻融循环, 按照表2中规定的冻融循环次数完成水凝胶的制备。图2是水凝胶制备的示意图。制备得到的水凝胶在蒸馏水中浸泡3d, 频繁更换浸泡液去除未反应单体。最后, 将水凝胶冷冻干燥, 密封保存用于各项检测。响应曲面设计方案中的各个响应值检测重复3次, 检测结果以均值±标准偏差的形式表示, 且当P值小于0.05时认为具有统计学意义。
1.4胶原基复合水凝胶的力学性能检测
用滤纸将已经吸水达到平衡的水凝胶表面的水分吸掉后, 用模具取哑铃型样品, 试样长度为20mm, 宽度为5mm。采用定重式测厚仪测定试样厚度后, 使用电子拉力机进行抗张强度和断裂伸长率的测定, 试样运行速度为100mm/min。每个试样至少进行2次平行试验, 结果以均值±标准偏差的形式表示。
2 试验结果与讨论
2.1 抗张强度的响应曲面分析
以丁二酸酐改性聚乙烯醇和胶原为原料制备的s PVA-Col水凝胶外观白色, 厚薄均匀一致, 柔软滑顺, 具有较好的弹性和易于操作性。s PVA-Col水凝胶的抗张强度 (TS) 响应值列于表3, 利用软件对试验数据进行处理, 完全2次模型的拟合程度最高, 且具有统计学意义。s PVA-Col水凝胶抗张强度的响应曲面及等值线图如图3、图4所示, 方差分析列于表4。
观察s PVA-Col水凝胶的抗张强度响应曲面及等值线图可以发现:任一对因素的交互作用关系在给定的试验范围内, 都出现极大值区域。以下逐一分析各因素对抗张强度的影响规律与程度。首先, 可以看出冻融次数对水凝胶抗张强度的影响比较明显。其它3种因素的任一种与冻融次数的交互关系中, 水凝胶抗张强度都随着FTC的增加而增大, 且呈现较为明显的趋势。由FTC与其它因素交互作用的等值线图可以看出, 在本次响应曲面设计范围中, 抗张强度随FTC的增大并未达到上限, 等值线极大值均向上开放。这说明在s PVA-Col水凝胶形成过程中, 物理交联的形成及其交联程度, 对水凝胶的抗张强度具有非常明显的影响作用。这与文献中报道的反复冻融作用对PVA水凝胶具有增强作用的结论是一致的。
其它3种因素对水凝胶抗张强度的影响都是有交互作用的。s PVA中羧基含量的高低和交联剂的浓度, 将影响形成化学交联的几率, 而s PVA/Col的大小对于水凝胶中总羧基含量和氨基含量的比例有直接影响。从等值线图上可以看出:在其它因素确定不变的情况下, 随着COOH和s PVA/Col比例的增加, 水凝胶的抗张强度都会出现峰值。其原因在于当原料中能参与化学交联的羧基与氨基含量较为匹配时, 对提高化学交联程度有很大影响, 过高或过低的基团比例, 使得产生化学交联的增加比较有限。从与COOH相关的响应曲面图上可以看出:采用含有羧基的PVA制备的水凝胶的抗张强度, 要高于未经羧基化改性的PVA制备的水凝胶。这表明, 对PVA进行羧基化改性, 并进一步利用化学共价键进行交联, 对聚乙烯醇-胶原复合水凝胶力学性能的提升是有积极意义的。
同时可以看出, 在本次响应曲面设计中, 交联剂用量的影响不是十分显著。当其它各因素水平较为稳定时, 交联剂用量的增加并没有明显地提高水凝胶的抗张强度。其原因在于, 在本试验设计中, 原料中含有的活性羧基与氨基浓度都相对较低, 交联剂的用量始终处于过量的状态。因此, 进一步增加交联剂的用量不能提高水凝胶中的化学交联程度, 对水凝胶的抗张强度不会产生明显影响。
从s PVA-Col水凝胶抗张强度的方差分析结果中可以看出:P值小于0.05, 且F值大于临界值, 误差P值大于0.05。表明组间数据具有显著性差异, 试验结果具有统计学意义。从图5的残差检验结果可以看出:残差的出现基本呈正态分布, 且分布具有较好的随机性。进一步运用Minitab软件对试验结果进行多元回归拟合, 得到关于抗张强度的完全二次拟合方程, 如式1和式2所示, 其中式1是以未编码数据进行计算, 而式2是以编码数据为依据的。在进行验证试验时, 给定了试验参数以后, 就可以采用式1对响应值进行计算预测, 而利用式2中各项的系数大小, 可以对比因素的线性关系、平方关系和交互关系对响应值的影响程度。从式2可知, COOH2、s PVA/Col2、COOH、FTC2对s PVA-Col水凝胶的抗张强度具有明显的影响。
(A=COOH;B=s PVA/Col;C=EDC/NHS;D=FTC)
式1 s PVA-Col水凝胶抗张强度的完全二次拟合未编码方程
(A=COOH;B=s PVA/Col;C=EDC/NHS;D=FTC)
式2 s PVA-Col水凝胶抗张强度的完全二次拟合编码方程
2.2 断裂伸长率的响应曲面分析
s PVA-Col水凝胶断裂伸长率 (E@B) 的响应值如表5所示。用完全二次模型对断裂伸长率进行拟合, 拟合的P=0.001 8<0.05, R2=0.902 4, 方差分析的其它结果见表6, 响应曲面如图6所示, 图7为断裂伸长率的等值线图。
观察水凝胶的断裂伸长率响应曲面图可以看出, 各响应曲面均为开口向下的二次曲面。这说明在本试验条件下存在最佳因素水平, 能使水凝胶的断裂伸长率达到最大值。结合等值线图可以看出:在其它各因素水平保持不变时, 随着FTC的增大, 水凝胶的断裂伸长率先增大后减小, 这与冻融次数对抗张强度的影响是有所不同的。其原因是, 多次冻融能够使PVA水凝胶中的结晶度增加, 使得高分子长链的刚性增加, 从而提高断裂伸长率。但是当高分子网络的刚性达到一定程度以后, 分子间的柔韧性大幅下降, 使水凝胶呈现一定的脆性, 表现为断裂伸长率的下降, 这与其它试验中观察到的现象基本一致。
从响应曲面图以及等值线图中还可以看出:交联剂用量对于水凝胶断裂伸长率有一定的影响, 但并不十分明显。这是由于在本论文的试验条件下, 使用的EDC/NHS对于参与反应的PVA羧基和胶原的氨基而言, 是完全过量的。所以, 采用低浓度的EDC/NHS就足以促进PVA与胶原的共价交联, 过多的交联剂可能会使胶原中的活性基团完全反应, 从而使长链大分子的刚性增加, 失去一定的定向移动能力, 最终导致宏观强度略微降低。
从方差分析结果可以看出:该试验的组间具有显著性差异, 试验结果具有统计学意义。
进一步运用Minitab软件对试验结果进行多元回归拟合, 得到关于断裂伸长率的完全二次拟合方程, 如式3和式4所示, 其中式3是以未编码数据进行计算, 而式4是以编码数据为依据的。在进行验证试验时, 给定了试验参数以后, 就可以采用式3对响应值进行计算预测, 而利用式4中各项系数大小, 可以对比因素的线性关系、平方关系和交互关系对响应值的影响程度。根据式4的各项系数大小可以看到:各平方项对水凝胶的抗张强度具有较为明显的影响。同时, 交互作用中, COOH×s PVA/Col、COOH×FTC以及s PVA/Col×FTC也有相当的影响作用。
式3为s PVA-Col水凝胶断裂伸长率的完全二次拟合未编码方程
(A=COOH;B=s PVA/Col;C=EDC/NHS;D=FTC)
式4为s PVA-Col水凝胶断裂伸长率的完全二次拟合编码方程
3 结论
(1) 研究发现, 改性聚乙烯醇能够在1- (3-二甲氨基丙基) -3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺交联反应体系作用下, 与胶原发生共价交联。复配制备的s PVA-Col水凝胶的力学性能优良。
(2) 采用四因素响应曲面设计方法研究了改性聚乙烯醇中的羧基含量、改性聚乙烯醇与胶原质量比、交联剂用量以及冻融循环次数, 对水凝胶抗张强度、断裂伸长率等力学性能的影响。并最终通过筛选比较确定了s PVA-Col的主要制备参数。试验结果发现, 采用响应曲面对水凝胶的总体“输入”与“输出”的研究是基本可行的。
(3) 通过本项研究认为, 有必要结合水凝胶的交联密度、孔隙率、孔径等性能, 对水凝胶的结构与组成进行研究分析, 试图解释材料具有独特物化性质的原因所在。此外, 还需要对胶原基复合水凝胶进行生物学评价, 并对其体表创伤修复效果和其他生物相容性作出评价。 (全文完)
摘要：以丁二酸酐对聚乙烯醇进行改性制备改性聚乙烯醇, 使其在EDC/NHS交联反应体系下与胶原共价交联。然后, 再采用反复冻融物理交联的方式予以强化, 制备化学交联-互穿网络共存的胶原基复合水凝胶。为了更好地掌握过程中各因素对交联反应的影响, 采用响应曲面设计方法研究了改性聚乙烯醇中的羧基含量、改性聚乙烯醇与胶原质量比、交联剂用量以及冻融循环次数对水凝胶力学性能的影响。结果表明, 响应面模型可以很好地拟合试验条件下所得到的各响应值。与各单因素相比, 各平方项对水凝胶力学性能的影响更为明显。然而, 仍需进一步对其进行结构、化学性能、生物学性能及其体表创伤修复效果等方面的评价。