纤维连接蛋白（精选7篇）
纤维连接蛋白 篇1
肾小体基膜由胶原、非胶原糖蛋白和蛋白多糖构成[1],层黏连蛋白(laminin,LN)是一种由许多具有不同结构和功能区域构成的存在于基膜中的大分子非胶原性糖蛋白[2],纤维连接蛋白(fibronectin,Fn)是细胞外基质(ECM)的重要组成部分,其最重要和最根本的功能特性是参与细胞与细胞、细胞与基质之间的黏连。LN和Fn表达于肾脏发育过程的多种结构中,但具体部位尚有争议[3],其在小鼠肾发育中的系统研究国内外也少见报道。笔者通过免疫组织化学技术结合体视学方法研究小鼠肾小体发育过程中两者的表达,探讨其在肾小体发育过程中的表达规律及其与肾小体发育和成熟的关系。
1 材料和方法
1.1 实验动物和标本制备
取成年健康昆明小白鼠,按雌雄比例1∶1同窝饲养,采用检查阴道栓脱落的方法确定雌鼠受孕时间,以观察到阴道栓脱落的最早时间计为胚龄(embryonic days,E)0 d[4]。记录受孕时间,并将孕鼠分笼饲养,每日早8时、晚5时观察生产情况,以观察到仔鼠出生的最早时间计为生后(postnatal days,P)0d,记录出生日期。选取E12、14、16和18 d的胎鼠和P1、3、7、14、21、28和40 d的仔鼠,每组5只。将孕鼠用乙醚麻醉后剖腹取出胎鼠,E12 d胎鼠全胚固定,E14、16和18 d的胎鼠剖腹取出左肾。P1、3、7、14、21、28和40 d的仔鼠断头处死后取出左肾,用排刀法沿横轴将肾切开,入10%中性福尔马林固定,常规石蜡包埋切片,切片厚5μm,供免疫组织化学染色用。
1.2 试剂
抗LN多克隆抗体购自博士德公司,Fn多克隆抗体购自Santa公司,SABC试剂盒和DAB显色剂购自博士德公司。
1.3 免疫组织化学染色
切片常规脱蜡至水,3%H2O2消除内源性过氧化物酶活性,经酶消化和热修复后,滴加正常山羊血清封闭液、一抗(1∶100)后过夜。滴加生物素标记的二抗37℃孵育30 min,滴加SABC 37℃孵育20 min后DAB显色5 min,脱水,透明,封固,光学显微镜观察。上述各步骤均用PBS缓冲液冲洗,用PBS代替一抗作阴性对照。阳性表达呈不同程度的棕黄色,两者均位于基膜,而阴性部位未着色。
1.4 体视学测量
每个动物的肾脏系统随机取5张切片,每张切片在油镜下,按“S”形选取视野,采用方格测试系统,交点计数法分别测算LN和Fn在基膜阳性表达的面密度值,公式:Sv=2 Ix/Lc(Lc=ΣPc·a),式中Sv为面密度值,表示LN或Fn在肾小体基膜处的相对含量,Ix为肾小体LN或Fn阳性表达的基膜与测试方格的交点数,Pc为方格系统落在参照系(相应的各期肾小体)的点数,a为方格两点间的距离,相当于实际长度的0.1 mm[5]。
1.5 统计学分析
应用SPSS 11.5统计软件包进行单因素方差分析,所有统计数据用均数±标准差(x±s)表示,采用q检验进行两两比较,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 免疫组织化学染色结果
肾小体的发育经历了逗号小体(Ⅰ期)、S小体(Ⅱ期)、毛细血管袢阶段(Ⅲ期)肾小体和较成熟阶段(Ⅳ、Ⅴ期)肾小体5个阶段[6]。
E12 d时LN在输尿管芽周围密集的间充质细胞即出现了表达。从E14 d始,可以看到肾小体发育的5个阶段:Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期和Ⅴ期肾小体的基膜上均有表达。随着肾小体的发育和成熟,LN在肾小体系膜区、肾小囊基膜均有表达。阴性对照肾小体无LN的表达(图1)。
E12 d时,Fn在输尿管芽的基底膜处及其周围的生后肾组织内单个间充质细胞周围表达。从E14 d开始,Fn在逗号小体(Ⅰ期)的第1裂隙内未见表达,而其在S小体(Ⅱ期)的基底膜处有表达。从E16～E18 d,在毛细血管袢阶段(Ⅲ期)和较成熟阶段(Ⅳ、Ⅴ期)的肾小体基底膜处Fn呈阳性表达,肾小囊亦阳性。从P1～P3 d,Fn在发育各期的肾小体的基底膜处均有表达。从P7～P42 d,生肾区消失,Fn表达于较成熟阶段(Ⅳ、Ⅴ期)的肾小体的基底膜处,肾小体近血管极处亦阳性。阴性对照肾小体内无Fn的阳性表达(图2)。
2.2 体视学测量结果
小鼠肾小体不同发育阶段LN和Fn在基膜表达的面密度见附表。LN和Fn从开始表达到肾小体的发育成熟,其各自的表达量差异有统计学意义(P<0.05)。LN每1个时期的表达量均大于Fn的表达量。
注:与Ⅰ期比较,P<0.05;2)与Ⅱ期比较,P<0.05;3)与Ⅲ期比较,P<0.05;4)与Ⅳ期比较,P<0.05
3 讨论
哺乳动物肾发生的标志是输尿管芽长入未分化的间充质相互诱导的过程(上皮-间充质相互诱导机制)。与此同时,未分化的间充质细胞在输尿管芽诱导下形成最初的生后肾组织,然后进一步发育形成由Ⅰ期和Ⅱ期肾小体所构成的生肾区,经Ⅲ期肾小体从而分化形成Ⅳ、Ⅴ期的肾小体[7,8]。实验观察到E12 d时LN和Fn在小鼠输尿管芽及其周围密集的间充质细胞均有表达,MINER[9]和EKBLOM等等学者也报道LN和Fn在输尿管芽及未分化的间充质周围均有表达,黄松明等[3]学者在研究人胚胎肾时也提出LN在输尿管芽细胞周围呈阳性表达,Fn呈弱阳性表达,所以笔者推测LN和Fn均参与小鼠上皮-间充质相互诱导过程的发生。
实验观察到在肾发育早期LN表达于小鼠输尿管芽细胞周围,随着肾小体的发育成熟,分别表达于肾小体发育的各期:即Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期和Ⅴ期肾小体的基膜上,同时在肾小体系膜区、肾小囊基膜均有表达,其面密度值均逐渐增加,表明它们的表达量逐渐增加。这些结果表明LN在小鼠肾小体发育成熟过程中的表达存在着时间上的顺序性,提示LN在小鼠肾小体发育早期即起作用且参与了肾小体的晚期成熟。它在维持成熟肾小体形态、肾小体基膜通透性等方面发挥作用。LN在基膜形成之前表达于输尿管芽细胞周围,基膜形成之后仅表达于基膜存在的部位,说明LN在肾组织中的分布具有特异性。这种分布的特异性可能与诱导小鼠肾小体的正常分化、发育,维持正常肾小体形态和功能有着密切关系[10]。
实验也观察到Fn在除逗号小体以外的各期肾小体基底膜处均有表达,其面密度值均逐渐增加,表明它们的表达量逐渐增加。在以往的研究中,S小体期内Fn是否表达存在争议。EKBLOM等学者提出逗号小体内未检测出Fn,而在S小体的第一裂隙内可检测出Fn。而黄松明等[3]学者则提出Fn在逗号小体及S小体内均未见表达。并且在体外培养的正常内皮细胞、系膜细胞也可分泌Fn[11,12,13]。结合笔者实验的结果Fn在除逗号小体以外的各期肾小体基底膜处均有表达,且表达量逐渐增加,因此推测Fn参与小鼠肾小体发育成熟的过程,并在维持肾小体形态方面发挥作用。Fn未表达于逗号小体,笔者推测可能是由于Fn未参与原始血管(内皮细胞)侵入小泡体出现第一裂隙的过程。Fn可促进微血管内皮细胞的迁移[14],而Fn又表达于S小体的第一裂隙及S小体以后的各期肾小体的基底膜处,笔者推测Fn可能参与了小鼠肾小体内微血管的分化。同时,Fn在肾小体血管极处也有表达,说明Fn也参与了小鼠血管极的形成过程。
综上所述,LN和Fn对肾小体的发育和成熟起到了重要作用,但是其对肾小体发育的作用机制及程度有待进一步阐述。近年来研究表明,由于某种原因,在肾小体发育过程中LN和Fn改变可引起多种先天性肾疾病,如Alport综合征[15]、薄基底膜肾病[16]、多囊肾和肾缺如等[17]。因此,在分子生物学水平进一步研究LN和Fn对肾小体发育的作用机制,研究其在肾小球疾病中表达的异常,将有助于人们更好地认识其生理功能和在肾脏疾病中的作用,为临床探索肾小球疾病治疗手段提供新的思路。
纤维连接蛋白 篇2
关键词：双胎妊娠,无症状,胎儿纤维连接蛋白,宫颈长度,早产
超声检测宫颈长度和阴道后穹隆分泌物胎儿纤维联接蛋白 (f FN) 检测用于早产预测是当前国内外产科研究热点之一, 但对于无症状的双胎妊娠孕妇研究少有报道。而在临床上很多双胎妊娠孕妇可以无先兆早产症状而突然发生早产。目前早产的临床预测方法有超声宫颈长度测量、f FN测定, 但在双胎妊娠中, f FN阳性预测早产发生风险的价值, 目前还有争议。一项关于双胎妊娠的前瞻性研究[1]发现, 在妊娠18, 24, 28, 32周连续检测f FN和宫颈长度, 发现f FN检测结果与自发性早产没有相关性, f FN不能确定双胎妊娠是否会发生早产。经阴道宫颈长度测量可以预测双胎妊娠早产, 但宫颈长度的敏感度较差, 不适合单独用来预测早产。Fox等[2]研究发现, 无症状、宫颈长度正常双胎孕妇的f FN阳性时, 32周前早产风险较大;有症状的双胎妊娠中检测f FN的阴性预测值更有益于预测早产, 与单胎妊娠相同。
当前超声测量宫颈长度有经腹、经阴道、经会阴三种途径, 尽管有多项研究表明, 经阴道超声测宫颈长度是较可靠的预测早产的方法, 甚至被认为是首选方法[3], 但临床中发现有些患者由于阴道出血或恐惧阴道检查等不能完成阴道超声检查, 而经腹超声检查也能测量宫颈长度。经腹测量宫颈长度能否用于预测早产, 特别是双胎妊娠的早产, 国内外相关研究较少。本研究旨在探讨经腹测量宫颈长度、f FN测定及两者联合检测对无症状双胎妊娠孕妇早产的预测价值。
1 资料与方法
1.1 一般资料
以2011年—2014年在我院进行常规产检的无症状双胎妊娠孕妇98例为研究对象, 平均年龄 (29.5±4.6) 岁, 检测孕周 (28.5±2.3) 周。排除有如下情况者:既往有宫颈功能不全病史者、宫颈环扎术后、有早产史者、产前或产时发现严重胎儿畸形者、未能获得妊娠结局资料者。追踪孕妇的妊娠结局。
1.2 方法
1.2.1 检测方法
于孕24周~35周进行经腹超声测量宫颈长度和阴道分泌物f FN的检测。①孕妇取膀胱截石位, 窥器暴露阴道宫颈, 将无菌拭子置于阴道后穹隆10 s采集阴道分泌物。采用美国Hologic公司的f FN快速测试条, 将拭子头插入缓冲液中, 并充分混合10 s~15 s, 将f FN测试条下端插入缓冲液中放置10 min, 取出测试条并判读。②适当充盈膀胱后, 用彩色多普勒超声对孕妇行经腹B超, 测量宫颈内口与外口的距离, 每人复测2~3次, 以最短数据作为宫颈长度。
1.2.2 诊断标准
①f FN检测以测试条出现2条可见线为判断阳性标准, 否则为阴性。②超声检测宫颈长度<30 mm和 (或) 宫颈内口宽度≥1.5 cm为阳性。
2 结果
98例孕妇中发生早产23例, 占23.5%, 分娩孕周为 (35.7±2.7) 周。f FN阳性、宫颈长度<3.0 cm、两项指标联合检测预测双胎妊娠早产的结果见表1、表2、表3。f FN阳性预测双胎妊娠早产的敏感度为78.3%、特异度为52.0%、阳性预测值为33.3%、阴性预测值为88.6%;宫颈长度<30 mm预测双胎妊娠早产的敏感度为69.6%、特异度为77.3%、阳性预测值为48.5%、阴性预测值为89.2%;f FN和宫颈长度联合检测预测双胎妊娠早产的敏感度为82.0%、特异度为76.7%、阳性预测值为49.3%、阴性预测值为91.7%, 见表4。
3 讨论
近年来辅助生殖技术得到了广泛应用, 双胎妊娠的发生率呈逐年上升趋势, 早产在双胎妊娠中较常见且发病率较高。而且双胎早产儿较单胎在孕周相同时体重更低, 造成围生儿病死率及发病率均显著升高, 所以预防双胎妊娠早产显得尤为重要。但是, 对于无症状的双胎妊娠, 关于f FN、宫颈长度与早产间关系的研究报道不多。
经阴道超声测宫颈长度是较为可靠的预测早产方法。贺瑶谦[4]做的一项Meta分析发现:对无症状双胎妊娠的孕妇, 经阴道超声测量宫颈长度, 在20周~24周测量, 以25 mm为界值时, 预测34周前早产的准确率较高;以30 mm为界值时, 预测35周前早产的准确率较高。但也有研究发现用腹部超声测量宫颈长度预测双胎妊娠早产有一定的意义[5]。本研究中采用腹部超声测量宫颈长度, 以30 mm为界值, 预测双胎妊娠早产的敏感度为69.6%、特异度为77.3%、阳性预测值为48.5%、阴性预测值为89.2%, 提示经腹超声测宫颈长度预测早产是有较大临床意义的。而且腹部超声测量宫颈长度因其为无创操作, 孕妇容易接受, 使用方便, 即便是胎膜早破和阴道出血的孕妇也可进行检查。因此经腹超声测宫颈长度对预测双胎妊娠早产具有较高的临床价值, 临床上可广泛应用。
对于有先兆早产症状或早产高危因素者, 有研究发现[6]:阴道分泌物f FN对预测7 d及14 d内分娩有较高的阴性预测值及特异度。2007年Singer E等人研究发现[7], 如单胎妊娠一样, 对于双胎妊娠, f FN的阴性预测值很高。f FN可以作为有早产症状的双胎妊娠的有效评估工具, 因为f FN阴性提示2周内分娩的风险很低。2011年易清华等人研究发现[8], 对于双胎妊娠孕妇, f FN及宫颈长度联合检测较两项单独检测预测早产的敏感度、准确度提高, 提示可联合应用于临床筛查双胎妊娠早产高风险。本研究结果显示, f FN和宫颈长度两项指标联合检测预测无症状的双胎妊娠早产的敏感度为82.0%、阴性预测值为91.7%, 均较两项单独检测时高。提示对于无症状的双胎妊娠孕妇, 宫颈长度和f FN联合检测可更好地预测早产发生。
综上所述, 应该对所有妊娠24周~35周的无症状双胎妊娠孕妇常规进行f FN检测及B超测量宫颈长度, 以便能预测早产并及时处理。对于两者均阴性的孕妇, 减少孕妇焦虑的同时, 也可以合理分配医院资源, 节省患者的开支。
参考文献
[1]Gibson JL, Macara LM, Owen P, et al.Prediction of preterm delivery in twin pregnancy:a prospective, observational study of cervical length and fetal fibronectin testing[J].Ultrasound in Obstetrics and Gynecology, 2004, 23 (6) :561-566.
[2]Fox NS, Saltzman DH, Klauser CK, et al.Prediction of spontaneous preterm birth in asymptomatic twin pregnancies with the use of combined fetal fibronectin and cervical length[J].American Journal of Obstetrics and Gynecology, 2009, 201 (3) :311-313.
[3]Crane JM, Hutchens D.Transvaginal sonographic measurement of cervical length to predict preterm birth in asymptomatic women at increased risk:a systematic review[J].Ultrasound Obstet Gynecol, 2008, 31 (5) :579-587.
[4]贺瑶谦, 解丽梅.经阴道超声测量宫颈长度预测无症状双胎早产的诊断效能的Meta分析[J].中国医科大学学报, 2014, 43 (11) :1023-1027、1032.
[5]靳瑾, 张国伟, 钟梅.超声测量辅助生殖技术后双胎妊娠患者宫颈长度及其对妊娠结局的影响[J].中国优生与遗传杂志, 2013, 21 (7) :124-125.
[6]吴玲, 孟海英, 梁心玲, 等.阴道分泌物胎儿纤维连接蛋白与宫颈长度联合预测早产的多中心前瞻性研究[J].中国医药导报, 2013, 10 (9) :62-64.
[7]Singer E, Pilpel S, Bsat F, et al.Accuracy of fetal fibronectin to predict preterm birth in twin gestations with symptoms of labor[J].Obstet Gynecol, 2007, 109 (5) :1083-1087.
纤维连接蛋白 篇3
1 资料与方法
1.1 一般资料
本组112例先兆早产孕妇均为2009年10月至2010年10月我院产科门诊收治的患者, 患者年龄22～32岁, 平均年龄 (27.5±4.9) 岁。112例均为单胎初产, 孕龄24～34周, 患者无任何早产高危因素, 无其他合并症和产科并发症。
1.2 方法
1.2.1 标本采集
嘱患者采集前禁止其他阴道治疗、检查和性生活48h。取膀胱截石位, 使用窥阴器打开阴道暴露宫颈, 将无菌拭子放置于阴道后穹窿10～15s, 采集分泌物。
1.2.2 fFN测定以酶联免疫吸附法 (ELISA) 测定fFN水平。
将拭子头插入缓冲液中, 并充分混合10～15s, 将f FN快速测试条下端插入缓冲液中准确放置10min, 取出测试条并判读。fFN≥50as/mL为阳性。
1.3 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件对所得数据进行统计学处理, 计数资料采用百分率表示, 组间显著性检验采用χ2检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
112例出现先兆早产症状的孕妇中, 有3项以上早产症状患者26例, 其中fFN阳性16例, 发生早产15例;fFN阴性10例发生早产3例。fFN检测的敏感性为88.89%, 特异性为87.50%。有3项以下临床症状组fFN阳性为62例, 发生早产62例, fFN阴性24例, 发生早产3例, fFN检测的敏感性为94.47%, 特异性为72.41%, 见表1。
3 讨论
目前, 临床上往往依据宫颈评分、胎膜是否破裂、宫、缩情况等判断先兆早产。由于这些指标个体差异大、主观性强而使其准确性较低。fFN相对于传统的预测早产的指标, 可以更准确的筛选出早产高危人群, 从而给予及时准确的干预措施, 预防早产的发生[1]。fin属于糖蛋白, 有20种不同的分子形式, 来源于肝细胞、癌细胞、纤维母细胞以及羊膜细胞, 主要分布于绒毛、胎盘子宫连接处、绒毛膜间隙基质和羊水中, 在胎盘与子宫蜕膜的相互粘附和保护方面起着重要作用[2]。由于孕21周以后, 绒毛膜与蜕膜的融合阻止了fFN的释放, 正常孕妇在22～35周时, fFN的含量极低。早产发生前发生绒毛膜-蜕膜界面的进行性蛋白水解破坏, 导致完整的或降解的绒毛膜或蜕膜细胞外基质蛋白释放人宫颈和阴道分泌物中, 同时促进胎膜从子宫下段的病理性分离, 因此, 在孕22～35周之间, 宫颈分泌物中fFN的水平与是否发生早产有很好的相关性。Loekood等最早开始应用fFN检测用于早产预测研究, 并发现对先兆早产孕妇发生早产有较高的预测价值。目前临床已有检验药盒, 进入实用阶段。王焕英研究认为fFN检测的阴性预测值临床意义更大, 联合宫颈长度指标判断可提高准确率。王彩霞等[3]显示, fFN检测与宫颈长度测量对早产的阴性预测值为92.9%。戴森戈等[4]研究认为联合IL-6检测可提高fFN检测对早产的诊断准确率。但上述研究结果与刘津予[5]的研究结果不一致, 数据出入较大, 具体原因未明。
本研究显示宫颈分泌物胎儿fFN检测对早产的预测敏感性达到88%以上。达到临床应用要求, 切本监测为无创检测, 刺激性小, 检测操作不会造成进一步伤害, 不加重患者临床症状。
综上所述, 我们认为宫颈分泌物胎儿fFN检测可有效预测早产, 特别是临床症状明显的早产的发生, 结合临床症状可准确预测早产的发生, 便于临床及时采取有效措施进行临床干预治疗。
参考文献
[1]仇东辉, 边巍.胎儿纤维连接蛋白在早产预测诊断中的研究近况[J].中国优生与遗传, 2008, 16 (5) :137～138.
[2]王焕英.胎儿纤维连接蛋白联合宫颈长度预测早产的临床观察[J].浙江临床医学, 2010, 12 (5) :453～455.
[3]王晓彩, 张彦璎, 邵晓明.胎儿纤维连接蛋白检测在早产预测中的临床价值[J].淮海医药, 2010, 28 (2) :148～149.
[4]戴森戈, 张文淼.宫颈分泌物中胎儿纤维连接蛋白和血清白细胞介素-6在早产预测中的价值[J].现代中西医结合杂志, 2008, 17 (26) :4051～4053.
纤维连接蛋白 篇4
1 资料与方法
1.1 一般资料本次受检对象为随机选取2013年12月~2 0 1 4 年12月入院存在先兆早产征象的96例孕产妇,年龄2 5~29(26.8±1.6)岁;孕周28~37(29.1±1.1)w;初产妇43例,经产妇53例。全部属于单胎头位,不存在产科并发症、子宫畸形或者胎膜早破。诊断标准:孕周达到28w,不超过37w;规律宫缩(2 0min在4次及以上,60min在8次及以上),持续时间30s以上;宫颈口扩张<2cm。
1.2 方法
1.2.1 胎儿纤维连接蛋白检测
所有受检对象取膀胱截石位,通过窥阴器将阴道打开,使宫颈充分暴露,将无菌拭子于阴道后穹隆部位放置10~15s,搜集分泌物。选取美国ADZEA公司的f FN快速测试条,通过ELISA法对胎儿f FN水平进行检测,f FN水平超过50ng/ml即为阳性[3]。
1.2.2 B超宫颈监测
选取日本日立公司EUB彩色多普勒超声仪,超声频率控制在7MHz[4]。所有受检对象排空膀胱,于阴道中置入超声探头,对子宫内口至子宫外口距离进行监测,该距离为宫颈长度[5]。宫颈长度<3cm即为异常。供给监测3次获取平均值,调整期间防止对宫颈管造成压迫,防止在宫缩过程中进行监测[6]。
1.3 观察指标
所有受检对象行胎儿纤维连接蛋白检测联合B超宫颈监测后,采用回顾性分析法,根据医院早产预测相关规范准则设计调查表,对所有受检对象7d内、8~14d、15d~37周内早产预测价值展开观察对比,将研究所采集的各式各样临床指标统一纳入至调查表中,通过电子计算机进行统计学处理事项。
1.4 统计学分析
采用SPSS 13.00软件包进行数据统计处理,研究获取的相关数据通过均数±标准差(±s)呈现,计量数据对比应用t值检验,计数数据应用χ2值检验,由P<0.05说明数据对比结果具备统计学意义。
2 结果
2.1 胎儿纤维连接蛋白检测联合B超宫颈监测价值
胎对所有患者开展宫颈长度检测,以宫颈长度≤3cm为异常,早产率97.6%;相较于宫颈长度>3cm患者早产率3.6%显著更高(χ2=18.29,P<0.05),见表1。
2.2 胎儿纤维连接蛋白检测联合B超宫颈监测敏感性和特异性
胎儿纤维连接蛋白检测联合B超宫颈监测的敏感性和特异性,在7d内、8~14d、15d~37周内分娩的敏感性都是100.0%,特异性分别是92.8%、100.0%及100.0%,见表2。
3 讨论
早产可导致胎儿出现各脏器发育不成熟,可出现听力障碍、脑瘫、视网膜病变、肺透明膜病等一系列健康问题,给家庭带来沉重的心理和经济负担。f FN检测技术,属于一项临床高效早产预测诊断技术,经对孕产妇阴道分泌物展开检测,能够有效作用于预测产妇分娩时间,为医务人员针对孕产妇及早产儿采取针对治疗、护理方案提供便利[8]。妊娠宫颈变化为产妇分娩的重要标志,鉴于此宫颈评价对早产预测有着十分重要的临床意义[9]。阴道超声可以一定程度呈现宫颈结构,相关医学研究指出早产的危险性伴随宫颈长度缩短而提升[10]。
本次研究结果显示,对所有患者开展宫颈长度检测,以宫颈长度≤3cm为异常,早产率97.6%;相较于宫颈长度>3cm患者早产率3.6%显著更高(P<0.05);胎儿纤维连接蛋白检测联合B超宫颈监测敏感性和特异性,在7d内、8~14d、15d~37周内分娩的敏感性都是100.0%,特异性分别是92.8%、100.0%及100.0%。与高霞等[3],张惠云等[4]报道的结果基本相符。
总之,胎儿纤维连接蛋白检测联合B超宫颈监测对早产有着一定的临床预测价值,且有着较高的敏感性、特异性,具备临床推广借鉴意义。
参考文献
[1]唐春艳.胎儿纤维连接蛋白联合B超测量宫须管长度在早产预测中的应用价值[J].中国医药科学,2013,3(7):189-190.
[2]肖苑玲,罗智菊,赖玉芳.胎儿纤维连接蛋白检测联合宫颈长度对孕妇早产的预测价值分析[J].中国现代药物应用,2015,9(10):85-86.
[3]高霞,曾琴,李咏梅.宫颈超声检查联合胎儿纤维连接蛋白检测对预测早产的临床价值[J].现代妇产科进展,2013,22(12):1018-1019.
[4]张惠云,何春梅,甘灿,等.f FN检测联合宫颈长度对孕妇早产的预测价值分析[J].中国医学创新,2014,11(33):134-136.
[5]郭仲杰,董涛威,陈慧.胎儿纤维连接蛋白检测在早产预测中临床价值的研究[J].热带医学杂志,2011,(9):1029-1031.
[6]杨琼敏.胎儿纤维连接蛋白检测在早产预测中的应用分析[J].大家健康(学术版),2014,(7):150-151.
[7]王晓彩,张彦璎,邵晓明.胎儿纤维连接蛋白检测在早产预测中的临床价值[J].淮海医药,2010,(2):148-149.
[8]别荔,蒋玉霞,沐朝阳.100例胎儿纤维连接蛋白检测在早产预测中的临床应用价值[J].宁夏医学杂志,2014,(11):1058-1059.
[9]顾逢春,朱玉莲,徐玉娟.胎儿纤维连接蛋白联合宫颈长度检测在早产预测中的临床价值[J].临床和实验医学杂志,2013,(2):140-141,143.
纤维连接蛋白 篇5
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂与药品
链脲佐菌素 (streptozotoci, STZ) 购于美国Sigma公司, 玉米须水提物 (stigma maydisaqueous extract, AESM) 由齐齐哈尔医学院药研所提供, 兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗体 (美国Santa Cruz公司) , 两步法即用型试剂盒 (天津灏洋公司) , 血糖试纸 (北京厚美德生物技术有限公司) , 实时定量RT-PCR试剂盒 (大连宝生物工程有限公司) 等。
1.1.2 仪器
测力得血糖仪 (台湾厚美德公司) ;紫外分光光度计 (日本岛津公司) ;荧光定量PCR仪 (美国ABI生物公司) ;石蜡切片机 (德国Leica公司) ;Nikon倒置荧光显微镜照相系统 (日本尼康公司) ;Image-Pro Plus图像分析软件 (Media Cyber-netics公司) ;石蜡切片机 (德国Leica公司) 等。
1.1.3 实验动物
雄性SD大鼠60只, 购自北京维通利华实验动物技术有限公司, 合格证号:SCXK (京) 2012-0001, 10周龄, 体重 (200±20) g。标准化房笼喂养, 每笼4只, 自由进食饮水每天光照12 h。
1.2 实验方法
1.2.1 玉米须水提物提取方法
干燥玉米须粉碎, 称取200 g玉米须粉, 用1.5 L蒸馏水于50℃水浴振荡器中提取两遍, 共3 h, 尼龙布过滤收集滤液;将滤液离心取其上清液, 于80℃水浴锅中浓缩至小体积后, 然后将小体积溶液用真空干燥器继续干燥, 直至水分完全蒸发, 即得玉米须水溶性提取物。实验时, 蒸馏水溶解配制。
1.2.2 实验动物分组及模型建立
参考文献[2-5]并改良。大鼠适应性喂养1周后, 按体重随机分为正常对照组 (N组) 10只、实验组50只。实验组喂以高糖高脂饲料 (猪油12%, 蔗糖22%, 胆固醇2%, 胆酸钠1%, 普通饲料63%) , 正常对照组喂以常规饲料。喂养4周后, 实验组动物禁食12 h, 腹腔注射STZ30 mg/ (kg·d) , 每天1次, 共3 d (STZ用0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲液配制, 稀释为p H 4.2) 。稳定7 d后, 尾静脉取血, 连续3 d以血糖>16.7 mmol/L尿糖 (++) 以上、尿量大于对照组的50%, 24 h尿蛋白大于对照组的50%者为DN造模成功, 其中5只不成模, 3只死亡。同时正常对照组腹腔注射等量无菌柠檬酸缓冲液。将DN大鼠随机分为4组 (10只) :模型对照组 (M组) ;玉米须水提物低剂量组 (L组150 mg/kg) ;玉米须水提物中剂量组 (D组300 mg/kg) ;玉米须水提物高剂量组 (H组600 mg/kg) ;M组与N组给予等量生理盐水灌胃。每日1次, 连续给药8周。
1.2.3 标本收集
8周后, 将大鼠置于洁净代谢笼内准确收集24 h尿液, 以4℃3 000 r/min离心5 min, 将分离的上清尿标本分装后保存于-80℃冰箱中待测。称重后, 以戊巴比妥钠麻醉经股动脉采血后, 立即离心后转移血清, 测血清指标;处死全部大鼠, 并迅速剖取双肾, 剥去肾包膜, 称肾重后, 于4℃冷生理盐水洗净。左肾置于4%多聚甲醛溶液中固定, 行常规病理分析;右肾保存在液氮中准备Real-timeeRT-PCR分析。
1.2.4 指标检测及方法
①肾指数=肾重 (g) /体重 (g) ×1 000;②血液与尿液相关指标:全自动生化仪测定空腹血糖 (fasting blood glucose, FBG) 、血清尿素氮 (blood urea nitrogen, BUN) 、肌酐 (creatinine, SCr) ;24 h尿蛋白定量采用磺基水杨酸法测定;③免疫组化检测肾小球中TGF-β1表达:取各组大鼠左肾, 石蜡包埋, 酒精脱水, 5μm连续切片, 免疫组化染色后, 观察肾小球中TGF-β1表达, 每组样本随机抽取切边各5张, 每张切边选取10个视野, 采用Nikon倒置荧光显微镜进行拍照, 应用Image-ProoPlus图像分析软件分析免疫组化结果, 计算棕黄色阳性面积与整个视野的相对面积比, 平均值为该切片的相对阳性着色面积比;④实时定量荧光PCR技术检测肾组织中TGF-β1和FN的表达:取出液氮中冻存的右肾, 切取250 mg左右组织, 剪碎, 冰浴中充分匀浆组织, 以预冷Trizol反复吹打细胞, 抽提总RNA, 在紫外分光光度计260 nm和280 nm下确定浓度和纯度。根据反转录试剂盒提供的实验步骤, 反转录合成c DNA, 反应条件:42℃, 60 min;70℃, 2 min;1个循环;再经荧光实时PCR仪定量分析。GAPDH为内参。PCR反应参数:预变性:95℃10 s 1个循环;PCR反应:95℃变性5 s, 60℃退火31 s, 70℃延伸30 s, 共40个循环。大鼠TGFβ上游引物 (长度251 bp) :5'-GTTGTTGCGGTCCACCAT-3', 下游引物:5'-CTGATACGCCTGAGTGGCT-3'。大鼠FN上游引物 (长度251 bp) :5'-GTTCTGTCCGTTTTCATTGACAAACT-3', 下游引物:5'-TTGATGGCT-GTGAAAGGC-3'。
1.3 统计学方法
实验数据以均数±标准差 (±s) 表示, 所有数据均采用SPSS 14.0分析数据, 单因素方差分析检验多组平均数之间的差别, 两组间比较采用LSD-t检验, P<0.05认为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠空腹血糖和体重的变化
与N组相比, M组大鼠FBG明显增加, 各剂量组大鼠体重均明显降低 (P<0.05) ;与M组比较, D组和H组可显著降低糖尿病大鼠FBG, 差异有统计学意义 (P<0.05或P<0.01) 。见表1。
2.2 各组大鼠肾脏生化指标的变化
与N组比较, M组大鼠肾重、肾指数、Scr、BUN和24 h尿白蛋白明显增加 (P<0.05) ;与M组比较, D组和H组可明显降低糖尿病大鼠肾重、肾指数、Scr、BUN和24 h尿白蛋白 (P<0.05或P<0.01) , 差异具有统计学意义。见表2。
(n=10, ±s)
注:1) 与正常对照组比较, P<0.05;2) 与模型对照组比较, P<0.05;3) 与模型对照组比较, P<0.01
注:1) 与正常对照组比较, P<0.05;2) 与模型对照组比较, P<0.05;3) 与模型对照组比较, P<0.01
2.3 免疫组化测定肾小球中TGF-β1表达情况
结果表明, 与N组比较, M组大鼠肾小球中TGF-β1阳性表达量明显增加 (P<0.05) ;与M组比较, D和H组可明显降低肾小球中TGF-β1阳性表达量明显增加, 差异有统计学意义 (P<0.05或P<0.01) 。见表3和图1。
2.4 实时定量PCR检测肾组织中TGF-β1和FNNm RNA的表达情况
不同时间点抽提的总RNA, 紫外分光光度计A260/A280比值均在1.8以上。结果表明, 以GAPDH为内参, N组、M组、L组、D组和H组TGF-β1的2-ΔΔCT值分别为 (0.78±0.09) 、 (2.63±0.22) 、 (2.24±0.25) 、 (2.01±0.37) 和 (1.56±0.28) ;FN的2-ΔΔCT值分别为 (1.05±0.15) 、 (3.42±0.43) 、 (2.96±0.24) 、 (2.52±0.34) 和 (2.18±0.17) ;与N组比较, M组大鼠肾组织中TGF-β1和FN m RNA的表达量明显增加 (P<0.01) ;与M组比较, L组和D组可明显降低各组大鼠肾组织中TGF-β1和FN m RNA的表达量, 差异具有统计学意义 (P<0.05或P<0.01) 。见图2和3。
A:N组;B:M组;C:L组;D:D组;E:H组
注:1) 与正常对照组比较, P<0.05;2) 与模型对照组比较, P<0.05;3) 与模型对照组比较, P<0.01
1) 与正常对照组比较, P<0.05;2) 与模型对照组比较, P<0.05;3) 与模型对照组比较, P<0.01
1) 与正常对照组比较, P<0.05;2) 与模型对照组比较, P<0.05;3) 与模型对照组比较, P<0.01
3 讨论
糖尿病肾病是糖尿病最重要和最严重的慢性并发症之一, 其病理特点为肾脏肥大, 肾小球、基底膜和系膜扩张增厚, 晚期则导致肾小球硬化。近年来研究表明, 炎症、转化因子及趋化因子的合成增加会引起肾脏的病理损伤[6]。然而, 在DN引起肾组织纤维化的病理变化过程中, TGF-β1是最强的细胞因子[7]。TGF-β1通过促进肾小球细胞外基质主要成分FN和Ⅳ型胶原的合成、抑制ECM降解酶类合成等机制, 从而引起肾小球肥大和ECM的过度积聚, 最终引发肾小球硬化。研究发现高糖刺激肾小球系膜细胞后, TGF-β1表达明显增加, 说明高糖作为一种刺激物质对肾小球系膜细胞起强烈的作用, 如果糖尿病患者长期处于高血糖状态, TGF-β1必会引起系膜细胞不可逆的纤维化[8]。
然而, TGF-β1表达水平高的部位, FN和Ⅳ型胶原增加, ECM积聚增多, 基底膜增厚[9]。因此, TGF-β1在糖尿病肾病发生发展过程中扮演重要的角色。
玉米须为禾本科玉蜀黍属植物的干燥花丝和柱头。现代药理研究证明玉米须有显著的利尿、降血糖、抗肾毒性、抑菌、降压、增强免疫等功效, 而且研究表明多糖、皂苷、黄酮类、甾醇类等为玉米须的主要生物活性成分[10,11]。本实验通过建立2型糖尿病肾病大鼠模型, 研究发现玉米须水提物能够降低糖尿病大鼠血糖、肾指数、血清尿素氮、血肌酐和24 h尿蛋白的水平, 抑制肾组织中TGF-β1的表达, 减少下游FN的合成, 从而抑制ECM的过度聚积, 减轻肾脏的病理损害, 可延缓DN进一步恶变。玉米须水提物的上述作用, 是否通过其对多种细胞因子和信号通路调控的途径来实现, 是笔者下一步研究的目标。
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融合蛋白连接肽的研究进展 篇6
构建融合蛋白的方法之一是将两个功能分子直接相连接,其中的功能分子通常包括蛋白质、蛋白质的球型结构域以及一些高表达蛋白序列(fusion tag)。另一种方法则是通过连接肽序列将功能分子连接起来,在这种方法中连接肽序列的选择尤为重要,除了必要的合适氨基酸组成之外,整个连接肽的折叠也必须在考虑之中。大量的研究[6,7,8]表明连接肽的柔性和疏水性对不扰乱蛋白质的功能结构域是十分重要的。但遗憾的是,现在对于连接肽序列的设计还没有可靠的选择标准。现在,大多数连接肽序列的设计和选择仍主要依赖于直觉,尽管依赖于蛋白质的一级结构来预测其二级结构已经产生了重大的进步,但是我们对于序列和结构之间的关系的了解还是很有限的。这种通过直觉来选择连接肽序列的过程通常会导致很大的不确定性,尤其是在较长的连接肽序列被选择的时候。
1 连接肽的设计及构建
1.1 连接肽的分子设计原理
将两个都有活性的蛋白构建形成融合蛋白时,我们需要考虑的就是当形成正确构象的融合蛋白后,各蛋白都能保持各自的活性。所以连接肽的设计必须使各功能蛋白满足以下两个条件:第一,两者的多肽链应不相互影响而折叠缠绕在一起而使彼此的活性丧失;第二,两者的活性中心要彼此远离,不会形成空间位阻而影响活性的表现,更不能使活性相互影响甚至抑制。若连接肽太长,两个蛋白质的协同作用可能减弱,若太短,可能影响到蛋白质的活性,只有适宜的连接肽不仅能将两个蛋白连接成一个大分子,而且不会影响到两个蛋白质保持各自的功能。但设计连接肽时,除要考虑保持蛋白的活性之外,还应尽量兼顾蛋白的表达、纯化、复性的方便等要求[9]。分子设计的结果只有通过蛋白质的活性检测才能得出结论。因此评判连接肽好坏唯一的标准就是药效,我们只能在计算机上初步筛选几种连接肽序列,如Malin Gustavsson[10]等在选择CBD-CALB(cellulose-binding domain-Candida antarctica lipase B)融合蛋白的连接肽时选择了6种长度在4~44个残基之间的连接肽,并使功能蛋白分别在酵母中表达,通过分析产物的活性而最终确定了一种合适的连接肽。
1.2 计算机辅助设计
Chiquito J.Crasto等设计出了一个计算机程序:LINKER[11,12],依赖于输入的参数,它能够自动产生一系列的连接肽序列。整个程序的流程如图1所示。可以通过如下网站来获得免费的服务。
http://astro.temple.edu/~feng/Servers/BioinformaticServers.htm.
图2是用计算机辅助设计出的一个柔性很好且长度合适的连接肽,其氨基酸序列为GGGSGGSG。设计此连接肽的目的是为了使融合蛋白中的hTNFA(人肿瘤坏死因子)与hTGFα(人转化生长因子)第三环区(hTGF3)在空间结构上互不干扰。由图2可见,hTGF3并不干扰hTNF与其受体的结合[13]。
1.3 连接肽的构建
目前构建的融合蛋白的连接肽其来源分为两大类,一类是融合蛋白表达载体上的、两个目的基因之间的连接序列,一般没有经过特别的设计;另一类是专门设计的连接肽,其构建方法分为两类:1)通过适当的限制性内切酶酶切位点将两个基因相融合;2)两个基因的PCR产物之间有20bp左右的重叠区域,把两个PCR产物混合作为模板,以上游基因的上游引物和下游基因的下游引物进行PCR,即重叠延伸剪接术(splicing by overlap extension)。
1.3.1 通过限制性内切酶酶切位点构建连接肽
该方法利用的是基因重组的最基本技术,其要求构成连接肽的DNA序列内存在限制性内切酶酶切位点,构建连接肽时分别在两目的基因的一端引入部分连接肽及其该酶切位点,可以通过限制性内切酶酶切位点将两目的基因的PCR产物相连接后克隆到载体上,如辣根过氧化物酶基因与血管内皮生长因子基因的连接[14];也可以将两个基因在克隆载体上拼接起来,如人/鲑降钙素嵌合基因[15]及嗜肺军团菌主要外膜蛋白S基因和鞭毛亚单位蛋白基因(mompS-linker-flaA)[16]融合基因原核表达载体的构建。
1.3.2 重叠延伸剪接术构建连接肽
重叠延伸技术可简单迅速地将两个DNA连接在一起,应用于嵌合基因的构建。所用的引物对只需具有互补的末端,那么在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,就可将不同来源的片段拼接起来。如人血清白蛋白-睫状神经营养因子突变体(HSA- AX 15( R13K))[17]及融合蛋白F1/V[18]的构建。
2 连接肽的分类及作用
2.1 连接肽的分类
依连接肽的长度,其被分为:小型连接肽(残基数<6)、中型连接肽(残基数6-14)、大型连接肽(残基数>14)。依连接肽的数目其被分为:1连接肽、2连接肽、3连接肽及>3的连接肽。依连接肽的结构域其大体上分为两种类型:螺旋状连接肽和非螺旋状连接肽[19]。含有33%的螺旋结构残基的连接肽被DSSP(Definition of Secondary Structure of Proteins,简称DSSP)定义为螺旋状连接肽,否则就是非螺旋状连接肽。至于连接肽的组成进一步的序列设定依赖于NCBI(National Centre for Biotechnology Information )中的二级结构单元,而其中的螺旋、直线、环状则由DSSP定义。
2.2 连接肽的组成
研究中指出,倾向于形成连接肽的氨基酸残基有脯氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺和甘氨酸是连接肽中首选的氨基酸残基。含有Gly-Ser的连接肽是目前所报道的用的较多的连接肽之一,尤其是其中的(Gly4Ser)3序列,因其具有较合适的氨基酸长度,同时具有疏水性和伸展性并能使功能蛋白具有较好的稳定性与生物活性,此连接肽已经成为了“通用连接肽”并广泛用于融合蛋白的构建。
2.3 连接肽的功能
连接肽是融合蛋白中不可或缺的组成部分,分析工具显示,连接肽的不同不会给融合蛋白的等电点带来不同,但是对于蛋白质的二级结构可能有些细微改变。连接肽的最直接功能就是辅助融合蛋白、优化分子折叠;当然还有基于此功能的优化蛋白质功能和协助新药开发等作用。
2.3.1 研究融合蛋白中某一功能基因的作用
为了研究某一功能基因的特殊作用,我们可以构建含有该功能基因的通用嵌合蛋白linker表达体系[20],通过多种其它基因的嵌合来更深入的了解此基因,还可以通过对比含有及不含有该功能基因的两种表达载体来研究[21]。
2.3.2 构建单链抗体
单链抗体是最近国内研究比较热门的课题,单链抗体是通过一段人工合成的连接肽Linker将天然抗体的轻重链可变区基因连接起来,具有良好的特异性抗原结合活性。目前许多学者用这方法构建出的单链抗体基因都表达出了活性产物[22,23,24],表明该类抗体具有极大的潜在应用价值。
2.3.3优化蛋白质功能
在多种研究中已经发现,有linker序列插入的融合蛋白要比没有linker插入的融合蛋白的活性要高得多,如乙肝病毒核心蛋白与人嗜酸性粒细胞来源的神经毒素(HBVc-linker-hEDN)融合蛋白[25],及谷胱甘肽转移酶和两个乙型肝炎病毒表面PreS1蛋白融合蛋白(GST-SLS)[26]的活性均较没有连接肽插入的融合蛋白的活性要高得多。
2.3.4 新药开发
研究者们通过连接肽将两药物蛋白融合在一起,可以获得一个新型的蛋白质药物,尤其是在两药物蛋白联合使用效果远大于各自单独使用的效果时,该新型药物的开发潜力则是巨大的,如人干扰素α2a(IFNα2a)和胸腺肽α1(THYα1)的融合蛋白有望被开发成为一类治疗病毒性疾病的新药[27],具有导向作用的IL2基因和具有细胞杀伤作用的绿脓杆菌外毒素(PEA)的融合蛋白有望成为具有靶向杀伤作用的抗癌新药[28],而幽门螺杆菌融合蛋白UreB-Omp11[29]为Hp多价抗原基因工程疫苗的研究奠定了基础。
3 用连接肽构建融合蛋白时出现的问题及解决
3.1 用连接肽构建融合蛋白时出现的问题
含有连接肽的融合蛋白在进行表达时,除了会遇到一般的融合蛋白的表达经常会遇到的问题(表达蛋白的溶解性、稳定性和fusion tag的存在)外,还会遇到更为严重的降解问题。
大量的研究工作表明,连接肽的长度、其氨基酸的组成、是否糖基化、连接肽与各个半分子间的适配性,甚至是连接肽的密码子都会影响融合蛋白的功能及稳定性。如军事医学科学院生物工程研究所构建的人血清白蛋白一睫状神经营养因子突变体融合蛋白(HSA-AX15(R13K))基因在毕赤酵母中表达时,两个蛋白的连接处出现了明显的降解。Malin Gustavsson等在毕赤酵母中表达纤维素结合结构域(cellulose binding domain, CT3D)和脂肪酶融合蛋白时也观察到了在两个蛋白的连接处易发生降解[30]。A Markaryan等将该种降解称为非典型加工[31](atypical processing)。
3.2 解决方法
解决融合蛋白中连接肽的降解问题主要从以下两个方面着手:一方面是从置换连接肽[32,33],改变两个半分子的相对位置以及突变连接肽附近的蛋白酶识别位点等方面进行改进;另一方面则主要从发酵表达的条件进行改进,如改变发酵的pH值、温度、溶氧等。
为了降低抗人纤维蛋白单链抗体-低分子质量尿激酶(IIn-UK)融合蛋白在CHO细胞中表达时出现的降解,刘志刚[31]等人利用分子生物学方法,对改造后的11种IIn-linker-UK或UK-linker-IIn突变体的表达产物进行了筛选,最终筛选到一种抗降解的新型单链抗体-低分子质量尿激酶融合蛋白。而在Jahic Mehmedali[34]等人发酵产生纤维素结合模块与纤维素酶6A和脂肪酶B融合蛋白(CBM-CALB)的过程中,他们采取了减少连接肽的长度、添加丰富培养基等方法但都没有起到显著的效果,但当他们把pH由5.0降至4.0时却起到了显著的效果。
目前,对于融合蛋白中连接肽的理论研究还很少,我们希望能够运用各种DNA分析软件(DNAssist)和蛋白质分析软件(ANTHEPROTV5)来分析预测融合蛋白的氨基酸序列、二级结构及理化性质,更好地了解蛋白质的生物功能,对新的蛋白质进行预测,用较低的成本和较快的时间就能获得性能稳定的融合蛋白[35,36]。
纤维连接蛋白 篇7
1 紧密连接的结构与功能
细胞间的连接主要包括紧密连接、黏附连接、缝隙连接及桥粒连接,其中最重要的是紧密连接。紧密连接是一个动态变化的、由多种蛋白及分子组成的功能复合体,形似狭长带状,相邻细胞互相包裹成一系列的“拉链样”结构[4]。紧密连接位于细胞连接的最顶端,通过冷冻蚀刻技术发现,紧密连接表现为一系列不连续的吻合点,中心点间隔鱼尾18nm,直径约为10nm。还有学者发现,紧密连接为一个单孔样的结构,该结构通道存在开放和关闭两种状态[5]。
紧密连接主要存在于上皮细胞、内皮细胞间的连接复合体中,该结构使相邻的细胞膜紧密的连接在一起,封闭上皮细胞间隙,其功能是允许离子及小分子可溶性物质通过,阻止毒性大分子及微生物通过[6]。有研究表明紧密连接的数目与细胞跨膜电阻抗的值成对数比的关系,当紧密连接受到破坏时,跨膜电阻抗的值相应的也会下降,所以跨膜电阻抗是监测紧密连接功能的重要指标[7]。
2 紧密连接蛋白的分类及调节
紧密连接蛋白主要包括闭锁蛋白、闭锁小带、连接相关分子等跨膜蛋白及丝状肌动蛋白等30余种胞内蛋白组成。按部位又可将紧密连接蛋白分为两类:一类为细胞膜蛋白,是构成选择性屏障功能的主要结构蛋白,包括Claudin蛋白、Occludin蛋白、紧密连接黏附分子(JAM)等;另一类是细胞质蛋白,可与多种蛋白质结合,能够连接膜蛋白与细胞骨架、传递信号分子。
Occludin蛋白是最早发现的紧密连接蛋白,含有4个跨膜结构,形成了2个细胞外环,1个细胞内环,主要依赖蛋白激酶C的调节。Claudin蛋白结构与Occludin蛋白类似,由学者认为Claudin蛋白与细胞通透性有关。JAM有4个异构体,含特征性的细胞外Ⅴ型结构域,在炎性介质大量表达时,JAM可能与免疫细胞的转移有关。ZO蛋白位于胞质内膜表面,有3个异构体,是紧密连接的结构性蛋白。
紧密连接蛋白的调控机制尚不完全清楚,有待进一步研究。有研究表明紧密连接主要由肌球蛋白轻链的磷酸化进行调节。其中Occludin蛋白以外环拉链式结合的方式产生严密的细胞旁封闭,还可与其他分子结合参与紧密连接形成的信号传导。
3 紧密连接蛋白对肺癌的影响
目前,与肺部肿瘤相关的紧密连接蛋白中,大多是关于Claudin蛋白的研究。Claudin蛋白对于上皮细胞的选择通透性及紧密连接程度有重要影响,起到了屏障保护作用,在维持细胞内环境稳定上起重要作用。大量研究表明,Claudins蛋白的异常表达与癌细胞的侵袭转移、癌细胞生长有密切的关系,且该蛋白在各型肺癌中的表达也有显著差异。
据研究表明,肺鳞状细胞癌中Claudin-1的表达水平高于肺腺癌,肺腺癌中Claudin-4及Claudin-5的表达高于肺鳞状细胞癌,而Claudin-1、Claudin-3及Claudin-4在小细胞肺癌和类癌中表达水平有显著的差异,Claudin-2、Claudin-3及Claudin-4在非小细胞肺癌和小细胞肺癌的表达水平有显著的差异,这提示这些紧密连接蛋白的表达水平可作为肺癌类别鉴别的分子标记。
紧密连接蛋白的表达除与疾病相关外,患者的生活习惯对其表达也有显著的影响。据研究表明,吸烟的肺鳞癌患者与不吸烟的肺鳞癌患者相比,Claudin-1的表达水平显著增高,这提示吸烟等有害因素导致肺癌高发可能与吸烟破坏正常细胞间的紧密连接有关。
紧密连接蛋白的异常表达与肺细胞癌变、侵袭、转移有密切的关系,这提示通过药物调控紧密连接蛋白的表达水平可能会有助于肺癌的治疗。目前这方面的研究较少,有研究表明非甾体类抗炎药物对Claudin-1、Claudin-2及Claudin-4的表达有抑制作用,这提示非甾体类抗炎药物对肺癌的治疗可能有一定作用。据一些基础研究报道,产气荚膜梭菌毒素可与Claudin-3及Claudin-4相应受体结合,导致细胞溶解,这提示未来产气荚膜梭菌对肺癌治疗可能有一定疗效。
除Claudin蛋白外,还有许多紧密家族成员参与肺癌的发生及转移过程,目前这方面报道还比较少,已见报道的一些蛋白有间隙连接蛋白Cx43及ZO-1蛋白。研究表明,不同分化程度的肺癌Cx43的表达水平有显著差异,Cx43表达越高,肺癌分化程度越高,预后越好,这提示间隙连接蛋白Cx43可能对肺癌的发生发展有一定抑制作用,其表达水平的高低可作为肺癌预后判断的一个分子标记。
ZO-1蛋白是正常上皮细胞的一个分子标志,据研究表明,ZO-1蛋白在肺癌组织中呈低表达状态,这提示ZO-1蛋白的表达状态可作为肺癌早期诊断的一个分子标记。进一步的研究表明,ZO-1蛋白的甲基化水平与肺癌细胞的淋巴转移和2年生存率有密切关系,癌细胞淋巴转移及2年生存率低的患者其ZO-1蛋白的甲基化水平高。
4 展望
紧密连接蛋白不同家族成员功能、结构及调节机制目前尚未完全明确,有些紧密蛋白对肺癌的诊疗价值还存在争议,调控紧密蛋白表达的调节因素尚不清晰,紧密连接蛋白与肺癌的发生、癌细胞的侵袭和转移中的具体作用机制仍有待进一步研究,总之了解紧密连接蛋白与肺癌的关系,是未来研究肺癌诊断、治疗和预后的一个新的途径,很多未知领域需要更多的学者进一步研究。
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