兔肝癌模型（共7篇）
兔肝癌模型 篇1
制备适合的肝脏肿瘤模型以供介入放射学研究是改进、发展介入治疗方法必不可少的研究手段。目前,VX2 兔肝癌肿瘤模型是唯一可复制的较大动物肝脏肿瘤模型,该模型较多地被用于肿瘤影像方面的研究,也是目前可适用于介入放射学研究的动物模型。其成模方式常用以下几种: 细胞悬液注入、碎组织块注入、组织块植入、影像设备引导下经皮注入等[1,2]。这几种成模方式各有优劣,可以分成注入式成模和植入式成模。本研究着重分析其成模后血管造影和碘油栓塞表现与成模方式的关系。
1材料和方法
1.1 材料
大白兔20只,雌雄不限,体重2.44±0.36kg。分成2组,每组10只。均采用开腹方式造模,另外传代种兔2只。VX2细胞株由北京市肿瘤防治研究所提供。麻醉剂(速眠新Ⅱ、氯丙嗪)、数字减影血管造影机(DSA)Siemens Multistar T.O.P、造影剂欧苏300(生理盐水稀释1/3),超液化碘油(Guerbet,France),1.2/2.3Fr微导管导丝。
1.2 方法
1.2.1 冻存的细胞株复苏后,用2ml注射器取细胞悬液0.5ml 注射于种兔双后肢肌肉内,3周后可扪及较硬小球形肿瘤生长,监测肿瘤生长至2.0～3.0cm 时,无菌条件下切开皮肤剥离肿瘤备用。速眠新Ⅱ0.15ml/kg+氯丙嗪0.15ml/kg 皮下注射全麻后,于上腹正中做5.0cm切口,充分暴露出肝左中间叶。A组(细胞悬液注入组),将新鲜肿瘤组织剪碎、分子筛过滤,然后于显微镜下计数并标定浓度为5×107个·mm-3,用1ml注射器取标定好的细胞悬液0.2ml 注入兔肝左中间叶,轻压止血后关腹。B组(组织块植入),将新鲜肿瘤组织,切割成大小约为1mm×1mm×1mm 小块,开腹后用尖刀于兔肝左中间叶做一个2.0mm宽、5.0mm深切口,将小瘤块埋入切口内轻压止血后关腹。术后予以受试动物青霉素40万单位肌注预防感染,连续3天。14天后,全麻开腹观察各组肿瘤模型生长情况,记录肿瘤大小、个数、有无腹腔内种植。
1.2.2 肝血管造影 将荷瘤兔用前述方法全麻后,固定于手术台上,备皮、常规消毒、铺巾。沿右下肢内侧腹股沟下方血管走向纵行切开皮肤3.0 ～ 4.0cm,暴露出股动脉鞘。一般股动脉夹于股静脉与股神经之间的深部,钝性分离出股动脉约2.0cm,近、远端各穿4号丝线1根,远端结扎后提起,用18 G塑料套管针刺入股动脉,退出针芯见鲜红色血液喷出,沿塑料套管置入微导管及导丝并接防返流阀;于主动脉T11水平以1.5 ml/ s、总量8 ml做腹主动脉造影,确定腹腔干开口;将可塑形微导丝成“J”型引导微导管选入腹腔干造影(0.7 ～ 0.8 ml/ s),造影前经导管注入0.5ml 1%利多卡因防止肝血管痉挛;进一步超选至肝固有动脉处,以0.5 ml/s造影观察肝内血管情况及肝内肿瘤血供情况。透视监视下用 1ml 注射器漂注超液化碘油0.3 ～ 1.0ml,栓塞满意的标准为肿瘤区碘油沉积满意,肝固有动脉血流缓慢。完成全部操作后拔管,结扎股动脉近端。
1.2.3 统计学处理,实验数据以均数±表示,应用SPSS13.0软件行独立样本t检验。
2结果
2.1 成瘤情况
移植14天后,全麻下开腹观察。A组1例移植后未见肿瘤生长,造模成功率9/10,B组全部造模成功。A组肿瘤平均最大径1.3±0.7 cm,B组肿瘤平均最大径1.8±0.4 cm。A组肝表面肉眼可见平均肿瘤个数(2.8±1.8)多于B组(1.3±0.7,P<0.05)。
肿瘤在肝实质内呈膨胀性生长,多突出于肝脏表面。A组多为一主病灶,边缘类“飞碟形”向周围正常肝组织浸润,无包膜,周围可有数个小子灶,或者有多个瘤灶其中一个较大(图1～4);B组多为边缘较为清楚的球形病灶,周围及其它肝叶无子灶(图5～8)。CT扫描为边缘较清楚的圆形低密度灶,增强扫描边缘明显强化(图2)。大体标本见: 肿瘤结节呈灰白色,鱼肉样,质硬,其周边血管较丰富(图6)。
2.2 血管造影表现及碘油栓塞情况
两组全部实验动物,超选肝固有动脉全部成功。B组有两例成功超选入肝右动脉。肿瘤血管造影及染色情况: A组肿瘤多无明显的肿瘤供血动脉,而是有多支细小的血管供血,实质期肿瘤染色区多呈片状边缘不清、浓淡不均染色(图3),B组则大部分可见较明显的肿瘤供血动脉,肿瘤周边染色明显,肿瘤中心染色稍淡(图7)。A组碘油沉积较弥散,不能形成明显的球形碘油沉积灶且周围正常肝组织内有较多碘油沉积(图4),B组因可见较明显的肿瘤供血动脉,超液态碘油漂注过程中可见肿瘤优势血供及盗血情况,碘油沉积较明显聚集于肿瘤区域呈球形(图8)。A、碘油用量为(0.7±0.4ml)明显大于B组(0.3±0.1ml,P<0.05,表1)。
3讨论
VX2 细胞株是由Shop 病毒诱发的兔乳头状瘤衍生的鳞状细胞癌经70余次移植传代而建立起来的肿瘤细胞株,命名为VX2[3]。它具有很强的侵袭转移能力,可在新西兰大白兔的任何内脏、骨骼及软组织生长,兔肝VX2 肿瘤是目前唯一较成熟的能在较大动物建立的可移植性肝肿瘤模型。
3.1 成模方式与肿瘤数目、形态
注入式成模是用注射器将瘤细胞混悬液注入兔的肝脏内,以选用较小号的注射器为宜。其原因是兔的肝包膜很薄,大号的注射器刺入后出血较多;刺入深度以小于0.5cm,过深则可能刺入肝内较大的脉管系统,人为的造成肿瘤播散性生长及较早出现远处转移。细胞悬液的注入量以0.5ml以内为宜,剂量过大则不可避免的使兔肝脏局部组织内压力增高,细胞悬液沿针孔外溢,形成局部粘连甚至腹腔种植。可见影响注入式成模的操作因素较多。
细胞悬液注入(A组)成模的肿瘤形态较不规则且其肿瘤边缘与正常肝组织界限模糊,切面可呈铁饼形、彗星形等,相邻肝脏组织或腹腔脏器常有转移灶,其肿瘤表面常常不光滑并有大网膜轻度粘连;成瘤数目较多,常在中央较大肿瘤周围见多个小子灶。究其原因: (1)细针穿刺肝脏过程中,不可避免的损伤肝内微小脉管系统,细胞悬液中的瘤细胞可经脉管系统播散;(2)细胞悬液注入后局部压力增大,同时为防止返流于穿刺部压迫,促使瘤细胞转移;(3)退针后,尽管对穿刺部进行压迫防止返流,但仍不可避免会有少量瘤细胞沿针道播散。
而组织块植入(B组)的方式影响因素就少得多,需要注意的仅是在组织块埋入过程中避免小块瘤组织的脱落。由于埋入后瘤细胞很少会进入兔肝的脉管系统,因此不易出现较早的肿瘤转移,有利于延长荷瘤兔的生存期;所长成的肿瘤数目明显少于瘤细胞注入,绝大多仅生成一个肿瘤;生成肿瘤形态规则,多为球形,边缘清楚,少有子灶。
过去我们的实验[4]也采用过瘤细胞悬液注入的方法进行肿瘤模型的制备,由于模型仅用于造影观察及肿瘤有无生长,因此对肿瘤的形态要求不高。而放射介入方法对肝脏肿瘤进行治疗的前提条件是: 肝内的肿瘤为富血供且有相对独立的肿瘤供血动脉。所以载瘤动物模型的好坏将直接影响到介入治疗的进行及疗效的观察,也就是说仅仅是移植出肿瘤是不能满足放射介入学需要的。良好的能满足介入放射学需要的荷瘤动物模型应该是形态较规则的球形、有丰富的血供及明确的肿瘤供血动脉[5,6]。对比之下小瘤组织块植入的方法刚好能满足这种需要。
3.2 成瘤的形态、数目与血管造影
A组成瘤的数目明显多于B组,多表现为一主瘤灶周围见多少、大小不等的子灶,或者数个瘤灶中有一个较大。而这些反映到血管造影上则表现为,动脉期供血动脉的特点不突出,使各个肿瘤的染色程度不同,如各个小肿瘤相互融合则造影时可见染色区浓淡不均,边缘不规则。而B组由于成瘤多为一个,且有相对较明确的肿瘤供血动脉,造影过程中可见自肝动脉分出肿瘤供血动脉,呈“抱球状”,实质期肿瘤染色较明显,边界较清楚。栓塞治疗后则表现为浓聚的碘油沉积灶,周围正常肝组织内较少碘油沉积。因此,A组荷瘤动物模型不利于在实验中应用: (1)由于移植的肿瘤数目较多,使得对肿瘤体积评估的困难明显增加,不利于治疗前后的比较;(2)肿瘤的大小与肿瘤的坏死有直接关系,直径大于2.0cm的肿瘤将不可避免的发生坏死、血供减少,这样肝内的多个肿瘤处于不同的生长状态,不利于判断其对治疗因素的反应;(3)使治疗前各组肿瘤的可比性降低。
3.3 成模方式与血管造影及治疗
VX2兔肝癌模型用于血管造影或介入治疗可采用外科的方法,如: 直接穿刺肝固有动脉同时夹闭近端及肝左动脉[7]、直接穿刺胃十二指肠动脉同时夹闭肝总动脉[8]或者直接穿刺胆囊动脉同时夹闭肝固有动脉[9,10]。尽管这些操作都能完成对肝脏动脉的超选择性灌注或者栓塞,但其最大的弊端是改变了治疗时肝动脉的血流动力学状态,无法顾及肿瘤优势血供现象,以及在栓塞剂注入过程中不能通过影响设备进行监视。在用外科方法进行栓塞治疗时由于没有影像设备的监视,为了保持组间的可比性,通常是事先确定出注入栓塞剂的剂量,而不是在栓塞过程中根据栓塞剂沉积情况及血流状态来决定,这与用于人体介入治疗方法的差别较大。而本实验中的栓塞过程完全与用于人的治疗方法相同,使得实验结果更适用于将来指导对人肝癌的治疗。
由于兔的肝固有动脉非常纤细,受到刺激后极易发生痉挛,且在栓塞过程中由于缺血导致的疼痛使兔剧烈挣扎易使导管移位,在开始栓塞前宜适当调整麻醉深度,在注入栓塞剂的过程中宜每次少量注入0.2 ～ 0.3ml,然后用含利多卡因的盐水在透视监视下推入。表1表明,A、B两组间栓塞前的肿瘤体积无统计学差异,但两组的平均碘油用量A组用量多于B组。这也从另一方面说明移植肿瘤的形态不理想将会影响肿瘤“盗血”现象对栓塞剂的浓聚,在无法超选择肿瘤供血动脉的情况下使栓塞剂沉积范围增大,栓塞剂用量增加且栓塞效果不佳。瘤组织块植入方式成瘤的肿瘤染色形态更规则,明确的肿瘤供血动脉,使碘油更易沉积于肿瘤内,用量少且沉积更接近球形而周围正常肝组织内栓塞剂较少。
对于兔肝VX2 移植模型肿瘤的病理过程及转移的时机,本研究结果提示, 2 周以内由于肿瘤相对较小、肝功能变化不大、基本无肝外转移、血供丰富可作为介入治疗肝癌模型。 接种3 周以后,相对于动物肝脏肿瘤体积已较大,肝功能已有明显变化,同时肿瘤内可能已出现较大坏死,富血供状态相对已不明显,且留给介入治疗后观察疗效的生存期较短,因此VX2瘤株接种3周以后已不适用于介入治疗实验。
综上所述,尽管VX2兔肝癌肿瘤模型的制备方式可以有很多种,但所成模型的基本要求是同批移植成型的肿瘤在大小及生长形态上无显著差异,而且针对应用于介入放射学研究目的动物模型,瘤组织块植入方式成模的肿瘤形态更为接近球形、有相对明确的肿瘤供血动脉激流内血供相对丰富,最适合应用于介入放射学研究。
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兔肝癌模型 篇2
1 材料与方法
1.1 实验动物
经郑州大学实验动物伦理委员会批准。由河南省实验动物中心提供新西兰大白兔68只,体重2.6~2.9 kg,雌雄不限。VX2荷瘤兔购置于中山大学动物实验中心。
1.2 肝癌模型的建立
动物需术前12 h禁食,4 h禁水。采用开腹种植接种瘤组织块的方法进行兔VX2肝移植瘤模型的种植,所有模型均由同一组医师(1名外科主治医师,1名住院医师)进行。于剑突下1 cm腹部正中线逐层切开,切开皮肤后,结扎手术区域腹壁血管,于结扎线中间,进一步切开,刀口长约1.5 cm。开腹后,可见肝左叶位于切口正下方,用无菌纱布轻轻拉出肝脏,用无齿钳在肝左叶打一小斜行隧道,深约4 mm。棉签轻压止血后,用眼科镊将瘤块置于隧道底部,然后夹取2 mm×2 mm大小明胶海绵1小块植入隧道内。填塞后,用组织胶粘合隧道口,并腹腔喷晒4万单位庆大霉素,逐层缝合关腹。碘伏消毒手术区域。术后肌肉注射庆大霉素8万单位,连续3 d。
1.3 实验方法
68只成功种植的模型兔平均随机分为两组:生理盐水滴注对照组(B组)和抗血管生成药(恩度)治疗组(A组)每组34只。于种植后14 d均做CT能谱扫描(Gemstone Spectral Imaging,GSI)成像。扫描后,动物苏醒后,将恩度和生理盐水均采用耳缘静脉滴注的方法,按照3 mg/kg的剂量进行注射,连续注射7 d。每天滴注完毕后,拔出留置针,将实验动物放回实验笼内,由专门的饲养人员饲养。种植后21 d(治疗后7 d)对所有移植瘤模型做能谱CT扫描。用药及后续观测采用单盲法进行,给药人员在治疗及观侧整个过程中不知道动物具体的分组用药情况。
1.4 检查设备
GE Discovery CT750 HD扫描仪进行扫描。先扫平扫,然后进行三期增强扫描,采用能谱模式采集图像。管电压:80 k Vp和140 k Vp快速瞬时切换;管电流,采用管电流选择在噪声指数(Noise Index,NI=8.0)的条件下选择Auto m A。层厚与层间距均为5 mm,转速为0.6 s/rot,螺距0.984:1。检测血管选择腹主动脉,采用智能追踪技术(Smart Prep)触发扫描,监测扫描间延迟(Monitoring ISD)选择2.0。
1.5 GSI能谱分析
感兴趣区(ROI)选择在肿瘤组织和邻近无瘤肝组织,注意感兴趣选取时要避开大血管,肿瘤感兴趣选取时要选择肿瘤周边强化明显的区域,尽量避开液化坏死,并尽可能多的包括肿瘤组织。在生成的碘基图上连续三个层面测量肿瘤组织、邻近无瘤肝组织的碘含量ICtICl以及相应层面腹主动脉的碘含量ICaa。每个层面均测量三次,取平均值。然后计算分别计算治疗前后标准化碘含量(Normalized Iodine Concentrations,NIC)计算公式为NIC=ICROI/ICaa,标准化碘含量为感兴趣区的碘含量与同层面腹主动脉碘含量的比值。
1.6 统计学方法
采用SPSS 16.0统计分析软件,对模型种植后14、21d肿瘤组织以及无瘤肝组织标准化碘含量(NIC)采用两个独立样本的t检验。治疗后治疗组、对照组肿瘤组织的标准化碘含量分别比较采用两个独立样本的t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
从建模后14 d到治疗后,治疗组肿瘤的大小无明显变化,而对照组肿瘤体积明显增大,部分肝癌模型出现腹水、转移征象(图1)。
注:上层为治疗组7 d和14 d;下层为对照组7 d和14 d。
实验组、对照组肿瘤组织和无瘤肝组织的NIC比较差异具有统计学意义(P<0.05)。治疗前(建模后14 d)分别比较试验组、对照组肿瘤组织的标准化碘含量(NIC)和无瘤肝组织的NIC,均无统计学差异(P>0.05)。治疗后,治疗组肿瘤区域和无瘤肝组织区域的NIC均较对照组减低(P<0.001)(表1,图2)。
图2对照组、实验组治疗前后肿瘤组织、正常肝组织碘含量
治疗后,治疗组肿瘤区域的NIC(0.570±0.029)较治疗前(0.725±0.073)明显减低(P<0.001),而无瘤肝组织区域的NIC(0.482±0.046)较治疗前(0.487±0.043)无明显差异(P>0.05)。对照组肿瘤区域与无瘤肝组织的NIC较治疗前均增高。
3 讨论
病变的血流动力学变化是诊断疾病及判断预后的重要因素之一[2],肿瘤的血管对于肿瘤的生长有着非常重要的作用,肿瘤实质中只有拥有大量的供血血管时,肿瘤才能持续生长,如果肿瘤的供血血管减少,肿瘤的生长就会受到明显的抑制,甚至出现凋亡和坏死,影像学中对于判断肿瘤的血流动力学变化,以往文献中报道[3,4]有灌注成像,灌注成像的缺点是辐射剂量较高,对于肝癌化疗后需多次影像学检查判断化疗效果的患者,增加了风险。李剑颖[5]指出能谱CT是通过后处理软件处理在不同基物质的条件下例如碘-水,实现物质分析,在碘基图上可以测量碘含量。双源CT的体模实验[6,7,8]以及大量的临床实践已证实通过相应软件可以获得组织器官以及病变的碘含量,碘含量值和血管生成因子之间有一定的相关性。本实验通过动物实验建立肝癌模型,并采用抗肿瘤血管生成药物重组人血管内皮抑制素(Endostar,恩度)进行干预,在能谱CT上做了能谱分析,通过测得标准化碘含量(NIC)判断在治疗过程中肝癌的血流动力学。
本实验结果显示,动脉期,实验组、对照组肿瘤组织的NIC均高于邻近无瘤肝组织的NIC,肝癌模型中移植瘤是肝动脉供血,动脉期,移植瘤的血供较邻近无瘤肝组织血供丰富。治疗后,治疗组肿瘤区域的NIC较对照组减低,且较治疗前减低,而对照组肿瘤区域的NIC较治疗前增高,说明重组人血管内皮抑制素有抗血管生成的作用。对照组邻近无瘤肝组织较治疗前NIC升高,是因为,无抗血管生成药物的干预,移植瘤的血管生成向邻近正常肝组织浸润。本研究结果能很好的为肝癌抗血管治疗中血流动力学变化提供影像学信息。
随着更先进的影像扫描设备及后处理软件的开发应用,特别是高空间分辨率的多层螺旋CT成像及能谱单能量成像有助于肝脏小病灶的检出,同时联合功能学变化信息,能谱CT将会有更广阔的临床应用前景。
摘要：目的 分析能谱CT对兔VX2肝癌模型抗血管生成疗效评估的价值。方法 将开腹种植成功的68只肝癌模型,平均分为2组,对照组于移植瘤术后14 d开始,每天静脉注射和治疗组相同剂量安慰剂,生理盐水,连续注射7 d。治疗组每天静脉注射重组入血管内皮抑制素连续注射7 d。对建模成功的两组兔VX2肝移植瘤在种植后14 d、21 d均行能谱扫描。将重建图像数据传输到影像后处理工作站进行分析。在碘基图上定量测量肿瘤区域、邻近无瘤肝组织、腹主动脉的碘含量,分别计算标准化碘含量(NIC),比较治疗前后,肿瘤区域之间标准化碘含量的差异。结果 治疗前,实验组、对照组肿瘤组织NIC均大于邻近无瘤肝组织,之间的差异具有统计学意义(P<0.05),而实验组和对照组之间无统计学差异。重组人血管内皮抑制素(Endostar,恩度)治疗后,治疗组肿瘤区域NIC小于对照组,并且小于治疗前肿瘤区域NIC,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 重组人血管内皮抑制素(恩度)表现出明显的抑制肿瘤血管生成作用,在化疗的过程可通过能谱扫描评价抗血管治疗的效果。
关键词：兔VX2肝癌模型,能谱CT,碘含量,血管内皮抑制素,肿瘤血管生成
参考文献
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国内肝癌转移动物模型研究概况 篇3
1 建立肝癌转移动物模型的影响因素
1.1 瘤源
就目前应用的肝癌转移动物模型来看, 瘤源大多包括以自发性或诱发性动物肿瘤为来源建立的移植性肿瘤、已建立的人癌细胞株、临床手术标本三部分。以自发性或诱发性动物肿瘤来源, 由于瘤源是鼠源性, 与人体肿瘤差异较大, 所以其应用价值受到限制。已经建立的人癌细胞株, 虽然易于保存和应用, 但由于体外环境和体内环境的差异及传代时消化酶破坏等因素的影响, 其转移性在动物体内的表达结果不甚理想, 也限制了进一步应用。临床手术标本由于材料来自人体, 一般所采用的组织块移植法保留了人体肿瘤完整的组织学特征, 故成为近年来新建肝癌转移模型的主要瘤源。如复旦大学肝癌研究所[2]利用人肝癌标本建立的裸小鼠人肝癌高转移模型LCI-D20, 该模型自发转移率达100%, 同时具淋巴道和血道转移的特点;后又在此基础上建立高转移细胞系MHCC97[3]。郑建明等[4]建立的模型局部侵袭率为100%, 自发远处转移率为57.8%。郜永顺等[5]用新鲜人肝癌组织建立的裸鼠模型, 出现了肝内、肺和骨转移。但是利用手术标本移植往往要重复多次, 或移植数例方可成功, 移植裸鼠体内时要新鲜, 无坏死, 无包膜, 这是移植成功的关键。
1.2 移植部位
肿瘤移植按移植的部位可分为异位移植和原位移植。部位不同可影响移植瘤的生物学特性。如皮下异位移植虽能维持来源肿瘤的组织结构和生理生化特性, 但由于其外被包膜, 多呈局限性生长, 少见或未见转移。原位移植理论起源于PEGET的“种子与土壤”学说, 即只有种子 (瘤细胞) 与土壤 (相应的微环境) 相互作用才能产生转移瘤。原位移植可获得在人体内相同或相近的微环境, 该环境能提供多种促进肿瘤生长的因子, 故移植成功率高。而且移植部位供血丰富, 移植的肿瘤组织容易浸润和扩散, 更能客观模拟人体肿瘤浸润和转移的过程。这克服皮下移植瘤在侵袭和转移表达上的缺陷。目前建立肝癌转移动物模型大多采用原位移植的方法[2,4,5]。
1.3 免疫状态
裸鼠虽然缺乏功能性T细胞, 存在免疫功能缺陷, 但体内尚有较高的NK细胞活力、B细胞活性和非依赖性T细胞免疫活性, 这可能在抵抗移植肿瘤中起作用。不同鼠龄NK细胞活性不同, 如移植在年幼或新生裸鼠体内的肿瘤更易生长和形成转移。不少学者报道, 在幼年裸鼠 (3周龄) 体内表现为明显侵袭和高度自发性或试验性转移的肿瘤, 在成年鼠 (6-8周龄) 体内, 往往呈局限性生长或低转移。但有人将肝癌C5F细胞接种到4周龄BALB/cA雄性裸鼠皮下, 裸鼠衰竭时处死未发生肺转移, 而接种到7周龄雌性裸鼠的则有大体肺转移形成, 认为年龄在此模型中不是影响转移灶形成的主要因素[6]。如果利用T、NK细胞, T、B细胞以及T、B、NK细胞联合免疫缺陷小鼠可以提高肿瘤移植的成功和转移率。如徐冰等[7]利用NOD-SCID小鼠建立的人肝癌模型比用裸小鼠建立的模型更容易发生体内的转移。有人将Walker-256癌肉瘤接种于肝脏内建立大鼠肝硬化肝癌模型, 并行脾切除术, 认为脾脏在肿瘤免疫中有一定抑制肿瘤生长及转移的作用, 荷瘤早期切除脾脏可能加速肿瘤的生长、转移[8]。
1.4 其它
人体肿瘤在动物体内传代时间过长, 可能会发生染色体变异。陶文照等[9]通过观察和分析连续传代20年的肝癌裸鼠皮下移植及原位模型的病理变化特征, 发现肿瘤局部侵袭及转移的恶性生物学行为未发生改变, 但肿瘤细胞分化更差, 部分肿瘤细胞染色体变为裸鼠染色体, 这可能与裸鼠内环境影响和瘤细胞的多潜能分化有关。
有研究者发现, 肝门阻断所导致的缺血再灌注损伤能加速裸鼠肝肿瘤细胞的生长, 促进癌旁组织中与转移复发相关基因 (VEGF、MMP-9) 的表达, 这为肝癌切除术后的复发与转移提供依据[10]。
在移植模型操作上, 要提高肝癌模型的稳定性, 保证瘤株活性和提高操作技术是试验的关键。移植用瘤块必须选用皮下瘤周边呈鱼肉样、质地偏硬的肿瘤组织;从制备瘤块到关腹的各个环节都应严格无菌操作, 积极防止感染;保证种瘤器械专用, 防止因腹壁或邻近脏器、腹腔肿瘤种植影响动物自然生存期[11]。
2 肝癌转移动物模型的观测方法
观察肝癌模型的转移情况, 大多要把动物处死或开腹。近年来计算机X射线断层扫描 (CT) 、磁共振成像 (MRI) 、正电子发射断层摄影术 (PET) 等影像学技术在肿瘤动物模型上的应用, 可以避免这种缺陷。如兔VX2肝癌大动物模型, 有人采用螺旋CT (SCT) 扫描检测, 对瘤灶的变化和远处转移情况进行动态观测, 病灶能清晰显示, 是对模型进行无创评估、快捷、并容易重复实施的检测手段[12];杜文华等[13]用二维超声检查发现该模型病灶回声特点缺乏特异性, 经内部彩色多普勒 (CDFI) 和能量多普勒 (PDI) 声学造影后, 兔肝内转移癌病灶周边及内部点状或条状血管数目增多, 尤以PDI变化最为明显。认为能量多普勒超声造影成像对肝脏转移性癌的血管特征等的诊断, 比常规的二维超声和CDFI具有更高的敏感性。孙宝昌等[14]用筛选的稳定表达荧光素酶的肝癌细胞 (BEL-7405) 单细胞克隆裸鼠皮下接种, 利用活体成像系统观察了肿瘤的生长过程, 肿瘤发光可随着观察时间的延长而增强, 为活体内监测肿瘤生长甚至转移提供方法。
肝癌早期癌细胞即可进入血循环, 血行微转移是肝癌发生转移的一个重要步骤, 因此有关肝癌模型血行微转移的研究近年来也有报道。有人通过用巢式PCR检测大鼠诱发性肝癌中的GPC-3 mRNA和AFP mRNA, 发现外周血GPC-3mRNA的阳性率与肝癌微转移的发生有明显的相关性, 且高于AFP mRNA的阳性率, 为肝癌微转移研究提供新的诊断指标[15]。血行性转移与血液中的肿瘤细胞负荷量密切相关, 及早发现并定量血中的肝癌细胞数对肝癌转移模型研究具有积极意义。而以往检测外周血甲胎蛋白信使核糖核酸 (AFP mRNA) 的方法多为定性法, 难以及时反映肿瘤发生转移的发展阶段, 吴晓凤等[16]以裸鼠肝原位移植肿瘤模型为对象, 用TaqMan实时定量逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR) 技术检测外周血AFP mRNA水平与原发性肝癌根治性切除术后复发转移关系, 认为外周血AFP mRNA可作为反映肝癌复发转移的敏感指标。
3 肝癌转移动物模型的建立方法
目前, 肝癌转移模型存在转移率较低、周期长、范围局限等缺点。李琦等[17]采用细胞浆肝内注射制作大鼠移植性肝癌模型, 从制作腹水瘤开始到肝肿瘤生长至0.6cm仅需2周时间, 而瘤块移植常需3-4周;该模型动物自然生成时间为3-4周, 晚期有肿瘤转移腹水形成。金昌德等[18]在HHCC细胞内转染可增强转移能力的βG基因, 采用裸鼠脾种植法复制肝癌转移模型, 可出现广泛转移, 在肝、肾、肠系膜淋巴结肉眼可见转移灶, 但βG基因转染HHCC细胞后其生物学特性有所改变, 这与临床原始癌症相比其特征有一定差异。建立肝癌高转移模型, 目前的方法有体内筛选和体外筛选两种方法。体内筛选即是将肝癌细胞悬液或组织块等移植于有利于肝癌表型表达的体内部位, 使发生转移, 然后将其转移灶再移植于动物体内, 如此反复数次便可能建立肝癌的高转移模型。一般多采用原位-转移灶循环筛选方法, 师长宏等[19]通过肝脏原位接种肿瘤细胞, 取其淋巴结转移灶反复肝内接种建立了人肝癌细胞系HCC-9724淋巴结转移模型, 50天肠系膜淋巴结转移率达100%。体外筛选法的理论基础是肿瘤细胞的异质理论, 即肿瘤本质上是由多克隆异质性细胞组成, 转移的发生主要取决于具有高转移能力的克隆株细胞存在于肿瘤细胞群体之中, 利用细胞克隆技术可以筛选不同亚群的肿瘤细胞。复旦大学肝癌研究所[20,21]用有限稀释法, 从高转移潜能人肝细胞癌细胞系MHCC97中筛选出两个不同转移潜能的克隆细胞株, 发现两个克隆株 (MHCC97H、MHCC97L) 的生物学性状不同, 其中MHCC97H的肺转移率为100%。此后, 用高转移性人肝癌克隆细胞株MHCC97H接种裸鼠, 进行3次肺转移筛选, 取肺转移瘤建成皮下接种后自发性肺转移的细胞系HCCLM3, 经皮下和原位接种均出现了自发性高转移。
4 模型评价
对转移模型转移程度的分级, 高进[22]认为转移率在70%以上为高转移, 转移率在30%-70%为中转移, 30%以下为低转移, 0%为不转移, 经过多年应用可作为重要参考标准。同时认为, 肿瘤转移程度应有确切定量概念, 肺内转移程度的大体观察可按肺组织表面结节大小和数目分为三级, 组织学分级可按肺内形成结节状转移灶和呈粟粒状或呈肺炎样实变区分为不同等级。
顾伟等[11]初步拟定了能模拟人类原发性肝癌发生发展的大鼠肝癌模型的分期标准, 用组织块肝内种植法复制大鼠移植性肝癌模型, 在不同时期分别观察模型, 认为大鼠移植性肝癌模型第5-11天相当于人类早期肝癌, 第18天后相当于临床晚期肝癌, 这对选择指导原发性肝癌治疗策略具有意义。
综上所述, 国内肝癌转移动物模型的研究近年来已经取得了一定的进展, 从最初的异位移植发展到原位移植, 由细胞移植倾向于组织块移植, 由试验性转移模型向自发性转移模型发展。免疫缺陷动物的使用也由单一免疫缺陷动物发展为联合免疫缺陷动物, 模型的观察方法上由于诊断技术的发展也变得丰富, 静态、定性的观察方法正向动态和定量方法上发展。同时, 随着研究的深入, 有关模型微转移观察的研究也将成为以后的亮点。然而对于转移模型如何获得高转移率、如何维持表达的稳定性仍将是肝癌及其它肿瘤转移动物模型需要解决的问题。
摘要：肝癌转移动物模型为肝癌转移机制研究和实验性治疗研究提供了实验技术平台。随着免疫缺陷动物的应用, 肝癌转移动物模型的研究也获得了新的发展空间。本文从建立模型的影响因素、观测方法、建立方法等方面对目前国内有关肝癌转移动物模型的研究现状进行简要阐述。
H22昆明鼠肝癌原位模型的建立 篇4
①实验动物昆
腹水型肝癌H22细胞
液, PBS溶液。1.2实验方法H22肝癌细胞株为实验室动物房内昆明鼠腹腔
液, 低速离心, 显微镜
水调整单细胞液浓度为2×107/m L备用。接种数量为H22小鼠肝癌单细胞悬液0.05m L (1×106个细胞) 于小鼠左肝膈面。手术步骤取小昆明鼠, 抓取固定, 腹部剃毛, 75%医用酒精消毒, 按小鼠体重的0.3%比例行水合氯醛腹腔注射麻醉, 麻醉起效后, 将小鼠四肢固定于小手术台上, 腹部75%医用酒精再次消毒, 取剑
突下上腹正中切口, 长约1.0cm, 剪开皮肤, 腹白线, 腹膜, 压迫止血, 轻轻挤压小鼠双侧腹壁, 将小鼠肝左叶挤压出腹腔, 将1×106个H22肿瘤细胞注入左肝膈面实质内, 退出针头, 轻压针眼, 取灼红的铁丝轻灼针眼, 封闭针道, 以防止肿瘤细胞逃逸, 发生腹腔种植, 将肝左叶轻轻送回腹腔, 查无活动性出血, 取1号丝线分别缝合腹白线及皮肤, 再次消毒, 术毕。2结果术后一周将100只小鼠麻醉后剖腹检查, 其中, 95只小鼠左肝叶可见肿块, 病灶突出肝脏表面, 灰白色, 质硬, 造模成功, 成瘤率为95%。病理学观察
可见核异型性明
或弥漫散在分布于肝脏组织, 其中, 22只小鼠出现右肝叶转移。3讨论H22肝癌细胞属于腹水型肝癌细胞, 国内外各
实验机构在既往的造模过程中, 往往因无法很好的解决H22腹腔种植, 腹水形成的问题从而导致造模失败, 采用笔者的方法, 简便易行, 费用低, 可很好的解决因肿瘤细胞逃逸, 腹腔种植导致腹水形成的问题, 模型成功率高, 效果确切可靠, 值得大力推广。
在基础和临床的肿瘤研究中, 实验动物模型是人类肿瘤的复制, 一定程度上客观反映人类肿瘤疾病的发生、发展、侵袭及转移的过程。动物模型在肿瘤发生机制, 病理基础研究及治疗药物筛选等领域发挥着重要作用。肝癌动物模型是进行肝癌实验研究的最重要平台和方法。从19世纪以来各国均有许多实验室致力于小鼠肝癌模型的研究, 期望通过对动物肝癌模型的研究, 从根本上治愈这一疾病, 直到20世纪初, 人们经过不懈的努力, 终于获得小鼠自发性肝癌模型, 世界各国研究人员通过对肝癌动物模型不懈研究, 终于, 逐步建立了动物的自发性、诱发性、移植性、人类肝癌的异种移植模型以及转基因动物肝癌模型[2~4]。当然, 各种的动物肝癌模型都各自有其优缺点, 其中, 自发性肿瘤动物模型存在诱导时间长、诱导因素干扰多, 肝癌病灶的发生时间、病变数目、大小、部位等个体差异较大。诱发性肿瘤动物模型存在肝癌发病率低, 实验动物浪费率高, 模型稳定性差, 其病变的发生时间点较难预测的缺点, 因此, 该模型具有较大的研究局限性。而近年来, 伴随着分子生物学和转基因技术的飞速发展, 成功的建立了转基因动物肝癌模型, 该模型的建立使得肝癌的治疗研究手段极大丰富, 客观上推动了肝癌发病机制的分子基础的研究, 但于此同时, 因制作某些动物模型的复杂性及实际花费的高昂费用, 在很大程度上限制了该种模型在我国的推广和普及。。移植型肿瘤动物模型是指将来源于人动物或的癌细胞株或癌组织块通过手术或注射接种于实验动物体表、体内或机体其它部位所形成的肿瘤模型, 其中以裸鼠最常应用。1969年Rygaard通过实验研究证实了人肝癌裸鼠移植模型是除人体外最接近于人肝癌的实验模型, 该种模型的最大特点是造模周期短、成功率高, 该模型根据癌细胞或癌组织移植的不同部位可分为:皮下、肝脏 (原位移植) 以及腹腔内种植。在移植瘤模型中, 既往最常采用异位皮下移植, 该方法虽然成瘤率高, 但因受血供及细胞因子等微环境的限制, 不能反映肿瘤在人体中的特征[5]。与皮下移植瘤相比, 原位移植具有血液供应丰富及局部微环境更接近人体等优越性, 不仅移植成功率高, 而且更利于形成转移[6], 因此, 国内大多数研究机构及实验室都是以移植性动物模型为主要研究工具, 原位肿瘤移植模型它具有原肿瘤的组织结构, 有高度的临床相关性, 同时还保持了绝大多数的生物学特性, 其中还包括转移特性, 在这一新型模型的启发下, 人们相继建立了多种肿瘤的裸鼠移植模型, 但由于裸鼠费用较高, 造模操作过程中死亡率较高, 在国内一些基层实验室中很难常规开展, 而昆明鼠作为原位移植模型的研究可有效解决这一难题, 昆明鼠作为一种易饲养, 易存活, 更经济的实验动物, 在实验研究中发挥着重大的作用, 可以普遍开展, 更好, 更高效的推动肝癌疾病的基础和临床研究。
临床上, 肿瘤是机体中正常细胞在不同的始动与促进因素的长期作用下, 所产生的增生与异常分化所形成的新生物, 肿瘤的发生发展是一个连续的, 多因素相互作用所造成的不良后果, 在实际工作中, 以人体本身作为实验对象深入研究和探讨肿瘤的发生机制是缓慢而又难以控制的, 有些疾病还与伦理学相悖, 开展起来非常困难, 以此积累的实际经验是有限的, 不真实的、不可靠的, 而借助于动物模型的研究, 可以很好的解决这一难题, 我们可以准确的观察模型的实验结果, 与人类疾病进行比较对照、分析, 有助于快捷、有效、方便的认识人类疾病。在本实验中, 应用肝癌H22细胞直接种植于昆明鼠的肝内, 具有高度的临床相关性, 使其更好地模拟肝癌在人体内的生物学特性, 具有极大的应用价值, 且其造模成功率高, 易于制作, 有望成为未来人类研究肝癌的重要动物实验模型。
摘要：目的:建立H22昆明鼠肝癌原位模型, 探讨其基础和临床应用价值, 为肝细胞癌的实验研究打下基础。方法:严格无菌及无瘤技术条件下开腹为100只雄性昆明鼠采用肝癌H22细胞株肝脏接种, 建立小鼠肝癌原位模型。结果:100只昆明鼠中有95只造模成功, 22只小鼠出现肝癌右叶转移。结论:H22昆明鼠肝癌原位模型成功率高, 成本低, 值得推广, 是非常理想的研究肝癌的实验动物模型。
关键词：H22,肝癌,原位模型,动物实验
参考文献
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兔骨折延迟愈合动物模型的建立 篇5
1 资料与方法
1.1 骨折延迟愈合动物模型的制作
选取纯种新西兰大白兔30只 (普通级, 新疆维吾尔自治区实验动物中心提供) , 体重 (2.25±0.31) kg, 雌雄各半, 术前12 h禁食水, 备右下肢皮肤, 术晨用3%戊巴比妥钠按1 mL/kg剂量耳缘静脉注射麻醉。麻醉后取左侧卧位, 常规消毒右下肢, 铺巾。实验组15只, 在右小腿前外侧做长约4 cm直切口, 显露胫骨, 在距胫腓骨联合处以远1 cm处截骨, 再向远近端1 cm切除外骨膜、刮除骨髓及内骨膜, 同时以钢板固定, 断端间距1 mm。彻底止血, 依次缝合各层组织, 肌注青霉素8万单位, 连续3 d, 不做外固定, 放入笼内喂养, 对照组15只为不去除骨膜与骨髓截断后即行内固定。术后4、8、12周分别取5只动物进行X线检查后, 取大体标本观察并经病理组织学检查骨折愈合情况。
1.2 检测方法
1.2.1 大体观察
术后4、8、12周分别取标本观察骨折连接情况, 骨端骨痂增生情况。
1.2.2 病理组织学检查
术后4、8、12周分别取10只动物 (实验组与对照组各5只) 进行X线检查后, 麻醉后取出患侧胫骨, 取材包括骨折双侧正常骨端0.3 cm, 行常规脱钙、脱水、透明及石蜡包埋, 5 μm连续切片, HE染色, 光镜下观察。
1.2.3 放射学检查
于术后4、8、12周各取10只 (实验组与对照组各5只) 大白兔进行X线检查, 观察骨折线变化情况。
2 结 果
2.1 大体标本肉眼观察
术后4周, 实验组骨折区形成纤维连接, 无骨性连接, 两侧断端有少量骨痂形成;对照组已达骨性愈合。术后8周, 骨折区形成纤维连接, 少数骨折断端形成骨性连接, 两侧断端有较多骨痂形成;术后12周骨折绝大部分达到愈合, 只有1只实验动物未达骨性愈合。
2.2 病理组织学检查
术后4周, 实验组光镜下骨断端髓腔封闭, 有软骨细胞及骨细胞, 细胞呈无序排列, 纤维膜覆盖, 缺损区为纤维瘢痕组织 (见图1) ;对照组骨折断端连接良好。术后8周, 光镜下骨折断端可见较多骨痂形成, 排列有序, 缺损处可见骨痂连接 (见图2) ;术后12周, 骨折断端连接良好, 骨小梁已塑形 (见图3) 。
2.3 放射学检查
术后4周, 实验组所有试验动物均可见骨折线清晰, 有少量骨痂形成 (见图4) ;对照组骨折线已消失。术后8周, 骨折线模糊, 可见较多骨痂形成 (见图5) ;术后12周, 绝大多数已达骨性愈合 (见图6) , 仅1只实验动物未达骨性愈合。
3 讨 论
骨折愈合是一个复杂的组织学、生物学、内分泌学及生物力学的动态过程, 影响骨折愈合的因素众多[1], 主要在各种细胞的功能活动及多种生长因子的作用下, 诱导骨基质形成和钙盐沉积, 最后使骨折愈合。通常分为3个阶段:a) 血肿机化演进期;b) 原始骨痂形成期;c) 骨板形成塑形期。尽管骨愈合的能力很强, 但仍有5%～10%的骨折愈合受到干扰, 导致延迟愈合和骨不连。因此, 骨折延迟愈合的问题仍是当前骨科应重视的问题[2]。
一般来说, 骨折在3个月左右就能愈合, 超过3个月为延迟愈合。目前常用的标准为骨折9个月未愈合, 且3个月以上无愈合的迹象为骨不连。此标准适用于人类, 而对于动物模型则不适用。我们正常对照组研究表明兔胫骨正常愈合时间在4周左右。
骨延迟愈合是可以给予人为干预后避免骨不连发生的阶段, 因此研究骨折延迟愈合将具有重要意义。
治疗骨折延迟愈合, 近年无论是手术或非手术治疗都有明显进步, 前者包括游离植骨术, 带血管蒂肌骨瓣移植, 加压内固定或外固定术;后者包括体外冲击波治疗、经皮注射疗法、电刺激、骨诱导治疗、局部自体骨髓移植或注射金葡液, 机械刺激、震动波、生物因子治疗等。无论哪种方法均需首先通过大量的动物实验阶段, 从而进入临床试验阶段, 而建立贴近临床环境的骨折动物模型是研究骨折发生机制和新治疗方法的基础[3]。
目前, 对于骨不连动物模型研究及报道较多[4,5,6,7], 而骨延迟愈合动物模型则未见报道。Brownlow等[8]将新西兰大白兔胫骨截断, 去除相当于胫骨干直径长度的骨折端骨膜, 刮除相当于胫骨干直径长度的髓腔内组织, 用外固定架固定骨折端, 使骨折端保持2 mm的间隙。术后8周, 影像学和组织学表明骨折端类似于临床萎缩性骨不连的表现, 大量纤维组织填充。Eckardt等[9]改良上述方法, 用钢板取代外固定架固定骨折端, 成功制作出萎缩性骨不连模型。我们对Eckardt方法进行改进, 成功制备出骨折延迟愈合模型。
本实验选取新西兰大白兔作为骨延迟愈合实验对象, 分别在4、8、12周后处死动物, X线、大体标本、组织学检查以证明本造模方法的可靠性。本实验所选手术部位位于胫骨中下段, 解剖部位上肌肉覆盖较少, 红骨髓含量少, 临床上为易发生骨折延迟愈合或骨不连的部位。在骨折愈合过程中, 骨膜具有重要作用。外骨痂的形成取决于骨膜的成活与完整性, 骨膜的广泛撕裂会造成骨膜坏死, 加重骨端缺血坏死, 影响骨愈合。骨膜的完整性也有利于膜内成骨。临床工作中常常因操作不当导致骨折端过度骨膜剥离和扩髓而削弱骨愈合能力, 造成骨折延迟愈合。因此, 本模型在截骨时去除远近端各1 cm外骨膜、骨髓及内骨膜, 消除了骨外膜成骨及骨髓腔成骨因素;在骨折断端保留1 mm间隙, 增加骨愈合难度。这种模型比较接近临床环境。术后8周, X线片仍可见骨折线, 光镜下骨折断端可见较多骨痂形成, 排列有序, 缺损处可见骨痂连接;术后12周绝大部分骨折达骨性愈合。本实验表明, 所建立的动物模型具有骨延迟愈合的大体标本、影像、病理学改变, 又没有出现骨不连, 符合骨折延迟愈合的要求, 反映了骨折延迟愈合的一般特征, 是一种可靠而实用的实验性骨延迟愈合动物模型。
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兔肝癌模型 篇6
关键词：肝癌,H22细胞,原位移植模型,小鼠
肝癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一, 因其发病率高、恶性程度高、死亡率高, 素有“癌中之王”的称号[1]。目前已有大量研究为肝癌临床的治疗提供基础依据, 而肝癌动物模型一直是肝癌临床与基础研究工作的重要工具。目前有关人肿瘤转移模型大多是用裸大鼠、裸小鼠, 动物肿瘤则多数是用Wistar或SD大鼠建立的, 而用小鼠建立原位肿瘤移植模型国内外报道较少。小鼠作为一种更经济, 易饲养, 易获得的实验研究载体, 在发挥其普遍应用性方面有着重大的作用。小鼠肝癌原位移植模型作为一种新型的动物模型是否能更好地模拟人肝癌在体内发生、发展、侵袭及转移的过程, 本实验将研究报道如下。
1 材料与方法
1. 1 实验动物及瘤株
SPF级昆明小鼠40 只, 雄性, 鼠龄5 周龄, 体重约18 ~ 22g; 腹水型肝癌H22 细胞株, 由佳木斯大学中心实验室代为冻存。
1. 2 实验仪器及材料
台式低温高速离心机、切片机、光学显微镜、游标卡尺、电子精密天平、无菌操作台、10% 福尔马林固定液、水合氯醛、伊红、苏木素、琼脂糖等。
1. 3 模型制作
1. 3. 1 异位模型制作: 将冻存的肝癌H22 细胞株复苏, 体外培养至对数期后, 以生理盐水调整细胞浓度至1 × 107个/m L, 每只小鼠腹腔内注射0. 5m L, 共4 只。注射7d后在无菌条件下抽出腹水, 离心, 去除杂质细胞, 调整癌细胞浓度至1 × 107个/m L备用, 进行原位移植[2]。
1. 3. 2 原位模型制作: 采取开腹手术直接注入肝脏法。昆明小鼠共36 只。 ( 1) 取5 周龄小鼠, 抓取固定, 腹部剃毛, 75% 医用酒精消毒, 按小鼠体重的0. 3% 比例行水合氯醛腹腔注射麻醉, 麻醉起效后, 将小鼠四肢固定小手术台上, 腹部再次消毒, 取剑突下上腹部正中切口, 长约1. 2cm, 剪开皮肤、腹白线及腹膜, 压迫止血, 轻轻挤压小鼠双侧腹壁, 将小鼠肝左叶挤压出腹腔。 ( 2) 取无菌注射器将0. 1m L H22 肿瘤细胞注入左肝实质内, 退出针头, 轻压针眼, 取烧红的铁丝轻灼针眼, 防止肿瘤细胞逃逸, 发生腹腔种植, 将肝左叶轻轻送回腹腔。 ( 3) 查无活动性出血, 取1 号丝线缝合腹壁各层, 消毒, 小创口贴切口黏贴, 结束造模。
1. 4 观察指标及方法
1.4.1模型观察:定期观察荷瘤小鼠生存、活动状况及腹部体征。扪查腹部了解移植瘤形成时间、质地及大小, 以小鼠腹部可触及实体性包块为成瘤标志。留取10只荷瘤小鼠观察其带瘤的自然生存期。
1.4.2解剖学及病理学观察:当小鼠出现消瘦、精神萎靡等体征时处死小鼠。开腹肉眼观察肿瘤生长部位、质地、活动度、浸润、腹水及腹腔转移情况。游标卡尺测量瘤体的长 (l) 、宽 (w) 、高 (h) , 体积 (v) =π (l×w×h) /6计算[3,4]。10%福尔马林液固定瘤体, 石蜡包埋, 切片, 经HE染色作常规病理检查。
1.4.3血清学检测:小鼠处死前, 采用眼球摘除法取血, 及时分离血清。ELISA法检测AFP[5]、DCP[6], γ-GTⅡ检测用聚丙烯酰胺凝胶梯度电泳法分离, 凡出现Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ带任一条即可判定结果阳性[7]。
1. 5 统计学方法
采用SPSS17. 0 统计软件包, 计量资料采用均数加减标准差表示。
2 结果
2. 1 造模情况
模型成功率达94. 4% ( 34 /36) 。移植5d左右小鼠皮肤伤口愈合。10d左右中上腹可扪及直径约0. 4 ~ 0. 6cm, 位置固定、质地稍软的实体肿块。14d可扪及较明显的肿块, 随后肿瘤生长速度增快, 肿瘤大小略有差异。21d瘤径达2. 0cm左右, 可见腹部膨隆, 部分小鼠出现消瘦、精神萎靡、行动迟缓等现象。模型平均自然生存期28d。
2. 2 大体解剖观察
移植瘤形态相对规则, 成圆形或椭圆形, 大部分暗红色, 局部为白色, 实质性, 质较硬, 与周围肝组织间完全或部分包膜包绕, 表面有大小不等的结节, 以浸润性生长为主, 见图1。21d原位模型移植瘤平均体积 ( 664. 28 ± 72. 63) mm3, 平均重量 ( 1. 54 ±0. 23) g, 晚期出现肝内、皮下及肠系膜腹腔淋巴结转移率79. 4% ( 27 /34) , 大量腹水占35. 3% ( 12 /34) 。
2. 3 病理组织观察
HE染色光镜下观察癌细胞表面不规则, 分化程度差, 核大成圆形, 深染, 核质比大, 游离核糖体增多等; 肿瘤边缘浸润肝组织, 转移淋巴结内可见大量癌细胞, 排列紧密, 见图2。
2. 4 血清AFP、DCP及 γ - GTⅡ检测
移植瘤保持了癌细胞分泌AFP、DCP, γ - GT的特点, 且 γ - GTⅡ检测均为阳性。
3 讨论
肝癌动物模型的建立包括诱发性、转基因及移植型, 移植型又包括异位移植型及原位移植型。前两种动物模型由于自发性肝癌发病率低且模型稳定率差、病变的发生时间较难预测, 且成本高、模型成功率低、癌细胞的形态学及免疫学特征常多样, 所以具有一定的研究局限性[8]。异位移植模型虽能维持来源肿瘤的组织结构及生物特性, 但很少发生转移, 从而影响了在研究人类肿瘤转移特性方面的价值。原位移植是二十世纪八十年代逐渐发展起来的一种移植方式, 与异位移植相比可以更好地再现临床肿瘤在人体内发生、发展及转移的全过程[9]。我们利用移植经腹水传代的H22 肿瘤细胞成功的建立了小鼠肝癌原位移植模型, 制模周期短、成本低, 成功率高达94. 4% , 转移率为79. 4% , 且降低了早期腹水的发生率, 晚期大量腹水占35. 3% , 未发现自发性消退, 还保持了绝大多数的生物学特性, 包括肿瘤的组织结构, AFP、DCP高分泌与 γ - GTⅡ阳性的特点, 基本模拟了人类肝癌的生长、浸润和转移的自然过程, 适用于对肝癌的药物治疗及侵袭、转移机制方面的研究。本实验表明, 小鼠肝癌原位移植模型可成为今后人类研究肝癌的重要动物模型。
本实验能够成功建立小鼠肝癌原位移植模型并发淋巴结转移的主要原因归结于以下几方面: ( 1) 精确的麻醉技术和熟练的手术技巧是减少小鼠因过麻死或手术出血过多而死亡的关键, 更是模型成功的重中之重; ( 2) 严格无菌操作, 防止因感染造成小鼠死亡影响实验结果; ( 3) 利用自身的腹水提取癌细胞, 其性质稳定, 异质性小, 直接接种于原位环境更有利于在体内生长; ( 4) 接种鼠在性别选择上, 尽量为雄性小鼠, 以防激素依赖性影响实验结果; ( 5) 在小鼠体重选择上, 以18 ~ 22g为宜, 体重过轻则因肝脏过小增加手术难度, 反之增加肝脏的排斥反应影响移植瘤的生长; ( 6) 癌细胞本身具有较强的恶性行为表达能力; ( 7) 开腹直接接种肿瘤细胞, 用烧红的铁丝轻灼针眼, 减少术中出血, 防止肿瘤细胞逃逸等造成腹腔种植及早期腹水的形成。
参考文献
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一种简易兔心肌梗死模型的建立 篇7
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
健康成年雌性日本大耳白兔20只, 兔龄5个月左右, 体质量2.0~2.5 kg, 由天津市津南区春乐实验动物养殖场提供, 动物合格证号为SCXK示2009-0004, 实验过程中对动物的处置符合中华人民共和国科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》标准。
1.1.2 主要试剂、仪器及手术器械
盐酸氯胺酮注射液 (福建古田药业有限公司) , 戊巴比妥钠 (天津市联星生物技术有限公司) , 盐酸利多卡因注射液 (天津金耀氨基酸有限公司) , 注射用青霉素 (哈药集团制药总厂) ;光电6511单道心电图机, PHILIPS IE33心脏彩色多普勒超声仪, 探头S5-1;深部拉钩、带线缝合针、剪刀。
1.2 心肌梗死模型制备
参照Fujita法[4]。氯胺酮25 mg/kg经肌肉注射, 同时1%戊巴比妥钠1 ml/kg经腹腔注射, 保持兔自然呼吸状态, 仰卧位将兔固定于动物手术板上, 心电图机肢体导联线与兔四肢相连接, 记录Ⅱ导联ECG。剪除胸前区毛, 碘伏消毒, 铺无菌巾, 切口用1%利多卡因1 ml局麻, 并预防心室颤动的发生。沿胸部中线纵切开皮肤、皮下组织、肌肉, 正中纵行剪开下段胸骨3 cm, 用拉钩轻轻拉开胸骨, 避免损伤胸膜和胸廓内血管, 用眼科剪纵行剪开心包, 暴露心脏, 拉开两侧心包及胸骨, 可清楚看到左前降支 (left anterior descending, LAD) 的伴行静脉及左心耳, 轻轻牵拉左心耳右移, 可见左室支 (left ventricular branch, LVB) 的伴行静脉, 用6-0外科Prolene线于LVB距离左心耳缘下5~10 mm内[3,5]“8”字缝扎LVB, 结扎远侧颜色变暗或发白, 搏动减弱, ECG示ST段上抬, 表明缝扎完全, 初步判断模型制作成功, 温生理盐水清洗心包腔, 心包不缝, 逐层关胸, 缝合切口。整个手术过程约30 min。如术中损伤胸膜引起气胸, 应尽快完成手术, 关闭胸腔后用注射器胸腔穿刺抽气, 恢复胸腔内负压。术后连续3 d肌注青霉素40万U, 1次/d。
1.3 模型监测及评价
1.3.1 ECG监测
实验兔四肢及胸前连接电极, 分别于冠状动脉结扎前、结扎后30 min、建模后4周行ECG检查, 记录Ⅱ导联。冠状动脉结扎后30 min较结扎前出现典型ST段弓背抬高, T波高耸;同时建模后4周出现病理性Q波作为建模成功的标准之一。
1.3.2 心脏彩超检查
实验兔于造模前及造模后4周行心脏彩超检查, 测定心率 (heart rate, HR) , 左室舒张末内径 (left ventricular end-diastolic diameter, LVEDD) , 左室收缩末内径 (left ventricular end-systolic diameter, LVESD) , 左室缩短分数 (left ventricular fractional shortening, LVFS) 。为减小检查造成的误差, 所有检查均由同一位医师在同一台机器上进行。各检测指标以系统默认方法计算, 以术后LVFS≤35%作为建模成功标准之一[6]。
1.3.3 病理组织学检查
造模后4周 (做完ECG和心脏彩超后) 处死动物, 取出心脏, 观察大体形态。标本置于10%福尔马林中固定, 石蜡包埋, 沿心脏长轴中点横切取材, 切片4μm厚, HE染色, 光镜下观察病理组织学改变。Masson三色染色, 光镜下观察梗死区与正常供血区心肌染色。
1.4 统计学处理
采用SPSS 17.0软件进行分析, 计量资料以表示, 统计学分析采用配对设计资料的t检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 建模存活率
术中1只兔发生麻醉意外死亡, 1只发生心室颤动死亡;术后2只发生伤口感染, 经清创抗感染后治愈;术后1只发生呼吸道感染, 医治无效, 术后3周死于心肺衰竭。建模后4周共存活17只兔, 存活率为85% (17/20) 。
2.2 ECG的演变
建模后4周存活的17只兔中:17只冠脉结扎前ECG正常 (图1) , 17只冠脉结扎后30 min ECGⅡ导联ST段均呈弓背抬高, T波高耸 (图2) ;16只术后4周ECGⅡ导联出现病理性Q波 (图3) , 1只未出现病理性Q波。16只符合ECG建模成功的标准。
2.3 心脏彩超
实验兔术前均LVFS≥38%。术后4周存活的17只兔:14只LVFS≤35%, 其中5只提示室壁瘤, 2只提示心脏周围积液, 14只提示心室壁运动减弱, 均表明动物心功能下降;另外3只术后LVFS分别为37%、38%、39%。同时符合ECG和心脏彩超建模成功标准的兔14只 (表1) , 造模成功率70% (14/20) 。
注:HR:心率;LVFS:左室缩短分数;LVEDD:左室舒张末内径;LVESD:左室收缩末内径。与建模前相比, ﹡P<0.01;△P<0.05
2.4 病理检查
建模成功的14只兔心脏, 肉眼观局部粘连较多, 梗死瘢痕区明显变薄, 呈灰白色, 形状不规则, 主要在左室前侧壁及心尖部, 5例有室壁瘤形成;HE染色显示:梗死区心肌细胞排列紊乱, 可现空泡变性, 核溶解消失;Masson三色染色显示:梗死区心肌呈蓝色染色, 见图4。
注:A:正常心肌组织HE染色;B:梗死心肌组织HE染色;C:正常心肌组织Masson32三色染色;D:梗死心肌组织Masson三色染色
3 讨论
兔子心脏解剖结构以及冠状动脉的分支、走行、侧支循环与人类相似, 冠状动脉阻断后死亡率低[2,3], 而且兔子大小、价格适中, 容易操作和饲养, 因此, 兔子是制作MI模型较常用的动物。
开胸结扎冠状动脉是制作MI模型较常用的方法。传统MI动物模型制作需气管插管和呼吸机辅助呼吸:有的经左侧第4肋间隙[3]切断肋间肌入胸, 该术式虽然简单, 极易损伤胸廓内血管;有的经胸骨左缘胸肋关节处剪断Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ肋骨开胸[7], 该术式易损伤胸廓内血管致胸腔积血, 不仅影响手术视野的清晰暴露, 而且常常因大量失血发生各种并发症;肋骨断端若对位不良, 改变胸腔结构, 损伤心肺, 不利于所需指标的检测和术后恢复, 影响实验效果。兔口腔解剖复杂 (门切牙长, 嘴小, 喉部狭窄) , 气管插管困难, 易损伤呼吸道;应用小动物呼吸机不仅操作繁琐, 还易产生呼吸机应用相关性肺损伤, 均影响动物术后的恢复及建模成功的效果。而家兔的双侧胸腔互不相通, 胸骨后两侧的壁胸膜相互分离, 当沿胸骨中线或左缘开胸和打开心包胸膜, 暴露心脏时, 只要不损伤纵膈膜, 就不需要机械通气[8]:从剑突处开始剪开胸骨直至颈静脉切迹[4,9], 这种术式对心脏显露充分, 但手术创伤太大。本实验无气管插管和呼吸机辅助, 在动物自然呼吸空气下纵断下段胸骨3 cm (胸骨全长约6 cm) , 心脏显露良好, 不损伤肋骨、肋间肌肉、肋间血管和胸膜, 手术创伤小, 出血少, 有1例胸腔基本无出血, 开胸取心脏时未见明显粘连;不需气管插管、动物呼吸机、人工供氧, 对设备要求低。
兔冠状动脉除主干外均走行于心肌内, 直视下不能看见, 但常有伴行静脉走行于心脏表面。因此, 研究者常常凭借伴行静脉进行冠状动脉结扎, 制作MI模型。兔LAD是制作MI模型最常用的靶血管, 主要原因是LAD走行于前室间沟, 易暴露, 易操作。但兔的LAD个体差异较大, 长短不一, 多终止于前室间沟上1/3, 部分可达心尖, 甚至13%~14%无LAD[10,11], 供血范围差别太大, 成模率不稳定。而LVB发自于左旋支主干, 相当于人类心脏左缘支, 粗大行程长, 直达心尖或绕过心尖与右冠状动脉吻合, 供应左心大部[10,11,12]。本实验2/20只兔无LAD, 其中10/20只兔LAD长度大于前室间沟长度的1/3, 20/20只兔LVB粗大恒定, 故LVB是制作MI模型的理想靶血管。但LVB及伴行静脉位于心脏左缘, 打开心包后不能直接发现, 需要抬高心尖、右移心脏等, 笔者认为牵拉左心耳最简单:轻轻钳夹并向右牵拉左心耳, 缝扎LVB, 仅需几秒钟。因此通过结扎兔LVB制作MI模型。如果结扎位置过高, 所结扎的冠状动脉血管较粗, 肉眼易分辨, 易结扎, 结扎效果明显, 但有相当高的恶性心律失常和死亡率;而结扎位置过低, 所结扎冠状动脉较细, 肉眼难分辨, 手术操作难度加大, 结扎后梗死面积太小而无明显效果, 但能降低动物恶性心律失常率和死亡率。本实验中1例因结扎位置过高 (左心耳下缘) , 诱发室颤死亡。LVB结扎部位应在左心耳缘下5~10 mm内[3,5]。
如果建模成功后还需要后续治疗, 就不能以心肌病理切片作为建模成功的标准。以往研究多采用ECG动态变化作为建模成功的标准, 杨国勋等[13]制作兔MI模型后, 存活的10只兔, 术前ECG正常, 术后10 min内ECG显示ST段明显抬高 (>0.2 m V) , 术后6周出现病理性Q波, 但病理显示3只兔镜下仅见较小的心内膜下MI以及不连续的MI, 有2只兔未见MI。所以仅以ECG动态变化作为建模成功的标准不可靠。多次取血动态检测心肌酶的变化是临床上诊断急性MI常用的方法, 但兔耳缘静脉细, 兔静脉血采集困难, 而且心肌酶的升高受肌肉损伤程度、心肌梗死范围等的影响。冠状动脉造影是诊断MI的金标准, 但对设备、技术要求较高。急性MI后心脏彩超显示节段性室壁运动异常, 运动减弱或消失;陈旧MI还显示受累室壁变薄, 有僵硬感, 左心室收缩和舒张功能下降。本实验兔冠状动脉结扎前、结扎后30 min、建模后4周ECG出现心肌缺血的动态变化;心脏彩超提示术后4周较术前LVEDD和LVESD明显增大, LVFS明显降低。本实验以心电图的动态变化和术后4周LVFS≤35%作为建模成功的标准, 术后心肌病理切片证实心肌梗死率100%, 以双标准判定建模是否成功, 增加了造模成功的可靠性, 避免单一标准所导致的误差, 且简单易行。
传统人工通气MI模型围手术期死亡率相当高, 尤其是小动物可高达35%~50%[14,15]。本实验和Fujita等[4]的实验相比:建模后4周动物死亡率分别为15% (3/20) 和29.41% (5/17) , 本法稍佳可能与其创伤较小有关;二者造模成功率相似, 分别为70% (14/20) 和70.59% (12/17) 。
本实验不用气管插管和小动物呼吸机, 不需人工供氧, 不损伤胸膜、肋骨、肋间肌、肋间血管, 不用纵断全胸骨, 相对以往研究, 本实验对设备要求低, 操作简单, 对动物损伤小, 造模成功率高、围手术期死亡率低, 成本低, 并能提供良好的动物MI实验模型。
摘要：目的:探讨一种建立兔急性心肌梗死 (MI) 模型的简易方法。方法:健康成年雌兔20只, 在无气管插管和呼吸机的情况下, 正中纵行剪开下段胸骨, 同时保持肋骨和胸膜腔完整, 在左心耳缘下510mm内缝扎左室支 (LVB) , 建立MI模型, 结扎LVB30min后查心电图 (ECG) 。4周后, 行ECG、心脏彩超检查。符合MI心脏彩超和ECG造模成功标准的兔, 视为造模成功;并制作心肌病理切片, 行HE染色、Masson三色染色, 观察病理变化。结果:结扎LVB后, 兔ECG出现心肌缺血改变;术后4周动物存活率85%, 造模成功率70%, 左室舒张末内径 (LVEDD) 、左室收缩末内径 (LVESD) 、左室缩短分数 (LVFS) 与术前差异均有统计学意义 (P<0.05) , 病理切片显示心肌梗死。结论:采用纵剪胸骨下段、结扎LVB的方法制作兔MI模型, 该方法具有操作简便、模型可靠、成功率高、重复性好、术后能长期存活的优点。