人肝癌细胞株（通用10篇）
人肝癌细胞株 篇1
恶性肿瘤致死的最主要原因是肿瘤细胞的扩散和转移,而经淋巴道转移是肿瘤细胞扩散和转移最重要和最常见的途径之一。已有的研究发现,炎症、外伤或肿瘤时可出现淋巴管新生[1,2,3],淋巴管新生的基本过程包括内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成,新近研究表明,肿瘤淋巴管新生与肿瘤淋巴道转移关系密切。肿瘤细胞与淋巴管内皮细胞互动过程中,诱导了肿瘤淋巴管新生[4]。然而有关肝癌淋巴管新生尚未见报告。本实验拟通过transwell小室非接触式体外共培养HLEC和HepG-2细胞,观察HepG-2细胞对HLEC增殖,迁移和管样结构形成的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
HepG-2细胞株由大连医科大学附属第一医院中心实验室提供。HLEC购自上海丽臣商贸有限公司。基质胶购自GIBICO公司。台盼蓝购自迈晨科技有限公司。胎牛血清(FBS),低糖IMDM培养基,高糖DMEM,胰蛋白酶:购自GIBICO公司。
1.2 细胞培养
将HepG-2细胞常规复苏后接种于含10%新生牛血清的低糖IMDM培养液于37℃,CO2体积分数为5%的培养箱中培养。取对数生长期细胞用0.25%的胰蛋白酶消化,行细胞计数。HLEC培养与HepG-2细胞培养方法基本相同。实验均在细胞对数生长期内进行。
1.3 建立HLEC与HepG-2细胞共培养系统
根据实验不同选择不同孔径的insert(上室)和不同规格的培养板(下室)建立起transwell共培养系统。培养板预先用自制的鼠尾胶包被。首先取对数生长期的HepG-2细胞,消化制成细胞悬液,接种于下室内,于5%CO2、37℃、饱和湿度的孵箱中培养。12h后,取处于对数生长期的HLEC,消化制成细胞悬液,接种于上室,然后放于孵箱中共培养。
1.4 细胞增殖实验
取transwell(0.4µm孔径,6孔培养板)小室,6孔培养板预先用自制的鼠尾胶包被。将HLEC消化制成细胞悬液,调整细胞数为1×104/mL,接种1mL于下室内,于5%CO2、37℃孵箱中培养。12h后,HepG-2细胞重悬,调整细胞数为1×104/mL接种于上室,同时设立空白对照组(未加HepG-2细胞),然后放于孵箱中共培养。绘制细胞生长曲线:实验中各组分别设6个时间平行孔,每个时间点又分别设3个复孔。每隔24h、连续6d对HLEC进行台盼蓝染色。每个样本随机选取5个视野(×200)计数,并记录每个时间点的平均细胞数。以培养时间为横坐标、平均细胞数为纵坐标绘制细胞生长曲线。本试验重复3次。
1.5 细胞迁移实验
取transwell(8µm孔径,24孔培养板)小室,其中小室内预先铺设基质胶10µL。首先将HepG-2细胞消化制成细胞悬液,调整细胞数为1×104/mL分别接种1mL于下室内,于5%CO2、37℃孵箱中培养。12h后,将HLEC消化制成细胞悬液,调整细胞数为1×105/mL,0.1mL接种于上室,并设立空白对照组(下室未加HepG-2细胞),孵箱中培养24h后取出insert上室,用棉签轻轻擦去内表面的基质胶和HLEC。将insert上室置入95%乙醇中固定10分钟,行HE染色。倒置相差显微镜下照相,计数迁移到insert外表面的细胞数量。每个样本随机计数5个视野(×200)的细胞数,取平均值进行比较,实验重复3次。
1.6 基质胶实验
选择孔径为0.4µm的insert(上室)和6孔培养板(下室)建立起transwell迁移系统,6孔培养板预先铺设基质胶800mL/孔,基质胶(10g/L)与无血清的EBM-2(含10µg/LVEGF-C)按4:1加入。首先将HLEC消化制成细胞悬液,调整细胞数为1×104/mL,分别接种1mL于下室内,于5%CO2、37℃、饱和湿度的孵箱中培养。12h后,将HepG-2细胞消化制成细胞悬液,调整细胞数为1×105/mL,0.1mL接种于上室,同时设立空白对照组(上室未加HepG-2细胞),然后放于孵箱中共培养。24h后,倒置相差显微镜亮视野观察淋巴管内皮细胞聚集和管状结构形成情况。镜下(×200)随机选取5个视野,计数HLEC聚集数量和管状结构形成情况,实验重复3次。
1.7 统计方法
采用SPSS 11.5统计软件处理实验数据,进行统计学分析,结果以均数±标准差表示。与对照组比较采用t检验,两实验组均数比较采用方差检验,以P<0.05作为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 成功构建HLEC与HepG-2细胞transwell共培养体系,其中HLEC于上室,HepG-2细胞于下室。
2.2 HepG-2细胞对HLEC增殖的影响
通过绘制细胞生长曲线,观察HepG-2细胞对HLEC增殖的影响。结果表明,与HepG-2细胞共培养体系中HLEC增殖速度明显高于HLEC单独培养组(P<0.05,图1A,图1B)。
1.单独培养的HLEC;2.与HepG-2细胞共培养系统中的HLEC
2.3 HepG-2细胞对HLEC迁移的影响
通过细胞迁移实验,观察HepG-2细胞对HLEC迁移的影响。结果表明,与HepG-2细胞共培养体系中HLEC迁移率(2.03±0.21)显著高于单独培养的HLEC迁移率(1.00±0.06,P<0.05,图2A,图2B)。
2.4 HepG-2细胞对HLEC管状结构形成的影响
通过基质胶实验,观察HepG-2细胞对HLEC管状结构形成的影响。使用基质胶作为淋巴管样结构形成的支持物,结果表明,与HepG-2细胞共培养体系中HLEC成管率(1.67±0.12)显著高于单独培养的HLEC成管率(1.00±0.08,P<0.05,图3A,图3B)。
3 讨论
作为肿瘤早期转移的主要方式,淋巴道转移机制的解析,对于肿瘤转移早期治疗有深远意义[5]。新近,肿瘤淋巴道转移机制研究取得进展,研究表明,肿瘤淋巴管生成与肿瘤淋巴道转移关系密切。
1.单独培养的HLEC;2.与HepG-2细胞共培养系统中的HLEC
1.单独培养的HLEC;2.与HepG-2细胞共培养系统中的HLEC
恶性肿瘤组织周围存在着淋巴管新生和淋巴管扩张的现象,恶性肿瘤具有使其周围淋巴管数目增加的特性,从而提高转移性能[6,7]。有关肿瘤淋巴管新生与肿瘤淋巴道转移的关系,已在诸多肿瘤研究中基本达成共识。有关肝癌淋巴管新生的研究未见报道,肝癌是以血管转移为主的恶性肿瘤,研究表明,淋巴道转移仅占肝癌转移总数的12.6%。我们关注了肝癌细胞与淋巴管内皮细胞互动过程中,对淋巴管内皮细胞生物学行为的影响,人淋巴内皮细胞体外培养为从细胞水平研究淋巴管生成提供了一个很好的研究平台,我们采用transwell小室建立HLEC与HepG-2细胞非接触共培养体系:下层培养液中HepG-2细胞的成分可以影响到上室内的HLEC细胞,从而分析下层HepG-2细胞分泌或代谢产物对上室内HLEC增殖、迁移、管状形成等的影响[8]。通过共培养体系,可以在相对接近体内环境下观察细胞与细胞之间的相互影响。
我们的研究表明HepG-2细胞能够促进HLEC细胞的增殖、迁移及管状形成,提示肝癌细胞能够诱导肿瘤淋巴管形成,肝癌淋巴管形成,可能参与了肝癌淋巴道转移。
参考文献
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人肝癌细胞株 篇2
采用微管吮吸技术测定大鼠肝癌细胞的黏弹性;研究了秋水仙素、细胞松弛素D以及两者混合作用后对于肝癌细胞黏弹性的影响.结果表明:用CD处理癌细胞后发现癌细胞的弹性系数K1明显下降.与对照组相比:微丝骨架被CD抑制后,在加入Col后肝癌细胞的弹性系数K1显著降低;而微管骨架被col抑制后,在加入CD后肝癌细胞的`弹性系数K1、K2和μ无明显变化.提示在微管骨架系统完整的情况下,微丝对肝癌细胞的黏弹性系数的的影响起主要作用.而微管骨架系统受到破坏后,微丝需借助于微管网络的作用来影响细胞的黏弹性.本研究对揭示癌细胞中骨架系统之间的交互作用对于细胞黏弹性的影响提高实验依据.
作 者：冯全义 吴泽志 刘彬 蔡绍皙 周婵 林才 李校 付小兵 FENG Quan-yi WU Ze-zhi LIU Bin CAI Shao-xi ZHOU Chan LIN Cai LI Xiao-kun FU Xiao-bing 作者单位：冯全义,周婵,FENG Quan-yi,ZHOU Chan(西南大学生命科学学院,重庆,400716)
吴泽志,蔡绍皙,WU Ze-zhi,CAI Shao-xi(重庆大学生物工程学院,重庆,400044)
刘彬,LIU Bin(西南大学生命科学学院,重庆,400716;重庆大学生物工程学院,重庆,400044)
林才,LIN Cai(温州医学院附属第一医院烧伤外科,温州,325000)
李校,LI Xiao-kun(吉林农业大学生物工程技术研究院,长春,130000;温州医学院附属第一医院烧伤外科,温州,325000)
付小兵,FU Xiao-bing(中国人民解放军总医院创伤修复及细胞生物学实验室,北京,100853)
树莓可抑制肝癌细胞生长等 篇3
记者衣晓峰报道树莓可明显抑制肝癌细胞系增殖，使肝癌细胞血管内皮生长因子(VEGF)的表达减弱，并使抑癌基因野生p53的表达增强。由哈医大附属第四医院刘明博士完成的一项国家自然基金课题，为果蔬预防原发性肝癌提供了重要的理论依据。这一成果前不久获得了2008年度黑龙江省医药卫生科技进步奖一等奖。
树莓也称木莓、托盘、覆盆子，含有大量的维生素c、维生素E、超氧化物歧化酶、Y－氨基丁酸等抗衰老物质及鞣化酸等抗癌物质。
研究结果表明，随着树莓中植物化学物质浓度的增加，总抗氧化自由基清除能力也随之增强。0.25毫克／毫升～10毫克／毫升的树莓提取物对肝癌细胞系HepG－2的抑制率呈逐渐增加趋势，最高抵制率可达90％左右。应用聚合酶链反应检测结果显示，树莓提取物在体外有较强的抑制VEGF表达及影响野生p53表达的能力，随树莓提取物浓度升高，VEGF表达减弱，野生p53表达增强。
在利用化学毒物黄曲霉毒素和二乙基亚硝胺建立的稳定大鼠原发肝癌模型上，随着树莓提取物浓度的增高，实验组大鼠肝脏上的瘤径变小，肿瘤的数量减少，成瘤率减低，结节程度减轻，肝癌细胞VEGF、增殖细胞核抗原表达的程度亦明显降低。
美开发小样本癌症诊断技术
美国研究人员在近日出版的《医学》杂志上发表论文称，他们发明的一种机器可通过分析更细小的样本，如一滴血液或身体的一小块组织来分析癌症蛋白并跟踪治疗效果。
科学家称，新技术可能标志着外科手术活检的结束，活检通常需要移除大块的身体组织，而且要使用麻醉剂。
斯坦福大学的研究人员发明的这台机器，利用与癌症相关蛋白的电荷将这些癌症蛋白区分开来——电荷根据蛋白表面变化的不同而变化。科学家接着使用抗体来鉴定不同蛋白的数量和位置。新技术能够探测常见的人体淋巴瘤样本上的癌症基因的活跃程度，甚至可区分出不同类型的淋巴瘤。
领导该项研究的斯坦福大学肿瘤学教授迪安·菲尔斯表示，他们不仅能够探测皮克(10～12克)级的蛋白质，也能探测到蛋白被改变时的细微变化。
研究人员称，这个系统也能用于更快更方便地监测癌症治疗的效果。尽管该研究的重点主要在于血癌，科学家们也希望能够将其应用于固体肿瘤，他们目前正在使用该技术测试脑部和颈部肿瘤。
研究人员表示，他们已在一个淋巴瘤病人身上证明了一种降低胆固醇药物的抗癌效果，而且，他们也发现，这项技术对来自于实验室老鼠及培养肿瘤细胞的淋巴瘤样本也能起作用。
过量摄入肉类和乳品会损害精子质量
最新一期美国《生育与不孕》月刊上的一项研究发现，与常吃蔬菜和水果的男性相比，摄入过量肉制品和全脂乳品的男性的精子质量比较差。
据路透社新近报道，西班牙阿利坎特的研究人员对61名参加生育能力检查的男子进行调查。结果发现，其中一半男子精液质量较差，他们和另一半精液中拥有正常的精子数量的男子相比，大都摄入了过多的加工过的肉制品和脂肪含量很高的乳制品。
在所有这些男子当中。精子质量高的人则在日常饮食中选择了更多水果、蔬菜和低脂乳品。
负责此项研究的海梅·门迪奥拉桥说。他们的研究结果不能表明蔬菜和水果可以提高精子质量，但无疑证实一个平衡的膳食结构对生育能力至关重要。
门迪奥拉桥表示，水果和蔬菜中舍维生素c、番茄红素等丰富的抗氧化剂。而环境中的污染物通过饲料进入牲畜体内，在肉类和其他高脂肪食品的生产加工过程中也会产生多种化学物质。如果大量食用肉类、乳品等来源于牲畜的食品，这些物质将在人体内积聚。
门迪奥拉桥特别指出，虽然欧洲自1988年开始禁止使用带有激素的添加剂饲养牲畜，但此次调查的对象出生于上世纪70年代，所以无法排除肉类和乳品中的激素对他们造成的影响。
吸毒成瘾与大脑杏仁核有关
北京大学中国药物依赖性研究所的一项研究发现，吸毒者之所以“一朝吸毒，终身想毒”。是因为人体大脑杏仁核内部存在一种名为细胞外蛋白激酶的调节因子。这种调节因子正常情况下并不表达，但药物戒断之后便会逐渐诱导人体，使人对毒品产生渴求。该成果最近获得2008年度中华医学科技奖二等奖。
人肝癌细胞株 篇4
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株
人肝癌细胞株来自上海肿瘤研究所。
1.1.2 药物和试剂
β-榄香烯为大连金港制药集团有限责任公司产品。RPMI 1640及新鲜小牛血清由西安保泰克生物技术有限公司提供。用含10%小牛血清RPMI 1640培养液配制成浓度分别为1、10、100和1 000 nmol/L的溶液, -20℃冰箱保存备用。细胞在含10%小牛血清RPMI 1640培养液中, 37℃体积分数为5%的CO2条件下培养。每3～4 d按1 ∶ 4～1 ∶ 5传代。Giemsa染色剂按文献[6]配制, 4℃冰箱保存备用。流式细胞仪分析试剂盒[DNA anal-yse kit, KINESISR50]由BIO-RAD公司提供。
1.1.3 实验仪器
FACSCalibur流式细胞仪 (美国BD公司产品) , 6 MeV直线加速器 (美国瓦里安2300CD型, PRIMUS, X线, 6 MeV, 剂量率400 cGy/min) 。CO2细胞培养箱 (美国Nuair公司产品) 。
1.1.4 分析软件
ModFit LT for Mac V2.0。
1.2 方法
1.2.1 β-榄香烯放射增敏试验
指数生长期贴壁细胞 (5×106) 个, 加入含不同浓度 (1, 10, 100, 1000 nmol) 紫杉醇的培养液培养, 对照组仅用培养液培养。分别于给药后2, 6, 12, 24 h, 弃含药物的培养液, PBS洗涤3次, 更换新的不含药物的培养液, 立275即用直线加速器分别照射2, 4, 6, 8, 10 Gy, 照射后单细胞悬液制备、细胞定量接种培养、染色及克隆计数同上, 实验重复3次, 取均值。
1.2.2 放射增敏率的计算
用β-榄香烯组细胞存活分数校正β-榄香烯联合放射组细胞存活分数, 校正后的细胞存活分数=β-榄香烯联合放射组细胞存活分数/β-榄香烯组细胞存活分数。绘制单独放射及校正后不同药物浓度-时间条件下的β-榄香烯联合放射组剂量-存活率曲线。按拟合多靶单击公式S=1-1 (1-eD/D0) N推算出ACC-2单独放射及不同时间-浓度条件下β-榄香烯联合放射的D0, 算出不同时间-浓度条件β-榄香烯联合放射的辐射增敏率 (SER) 。SER=单独放射组D0/β-榄香烯联合放射组D0。SER>1表示β-榄香烯对ACC-2细胞有辐射增敏作用。
1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期
对照组及药物组弃培养液, PBS洗涤3次, 0.25%胰蛋白酶消化, 制备单细胞悬液, 2 000 r/min离心10 min, 弃上清液, 预冷的70%乙醇固定, 4℃保存过夜。1 500 r/min离心10 min, 弃上清, PBS洗涤3次, 制成单细胞悬液500 μl, 加入流式细胞仪分析试剂盒 (DNA anal-yse kit) , 避光室温孵育30 min, 上机检测细胞周期分布百分率和凋亡细胞百分率, 每份标本检测10 000个细胞。分析软件分析成图, 实验重复2次。
2 结果
2.1 β-榄香烯对人肝癌细胞的放射增敏作用
不同时间-浓度条件下药物+放射组的细胞存活分数较放射组均有不同程度下降。药物组细胞存活分数校正后, 10 nmol/L, 24 h;100 nmol/L, 24 h;1000 nmol/L, 24 h时间-浓度条件下的SER>1, 提示上述条件下β-榄香烯对人肝癌细胞有放射增敏作用。其中100 nmol/L β-榄香烯作用24 h对人肝癌细胞的放射增敏作用最大, SER为1.71 (见表1) 。
2.2 不同时间-浓度条件下β-榄香烯对人肝癌细胞细胞周期的影响
随时间和β-榄香烯浓度增加, 人肝癌细胞的G2/M期细胞分布百分率相应地逐渐上升, 在100 nmol/L, 24 h达到高峰, G2/M期细胞百分率约为54.13%。而>6 h, 在相同作用时间下, 随浓度升高到1000 nmol/L, G2/M期细胞分布百分率又逐渐下降 (见表2) 。
2.3 不同时间-浓度条件对β-榄香烯诱导人肝癌细胞凋亡作用的影响
大部分时间-浓度条件下β-榄香烯并无诱导细胞凋亡, 仅10 nmol/L, 12, 24 h;100 nmol/L, 12, 24 h;1000 nmol, 24 h等5个时间-浓度条件下β-榄香烯诱导人肝癌细胞细胞凋亡。其中, 诱导细胞凋亡百分率的最高峰出现在10 nmol, 24 h水平, , 细胞凋亡百分率约20.71%。此后, 随时间减少以及浓度升高而逐渐递减 (见表3) 。
3 讨论
β-榄香烯能对细胞产生强大的G2/M期阻滞作用。而G2/M期被证明是细胞周期中对放射最为敏感的时相[1]。Lang首先提出并证明β-榄香烯具有放射增敏作用且G2/M期阻滞作用是其放射增敏的主要机制。研究表明β-榄香烯的放射增敏作用与其G2/M期阻滞作用密不可分[5,7]。β-榄香烯联合>3 Gy剂量放射能诱导大量细胞凋亡, 显示β-榄香烯放射增敏可能与β-榄香烯诱导细胞凋亡有关[8]。
本研究将β-榄香烯放射增敏实验结果与各时间-浓度条件下人肝癌细胞的G2/M期分布百分率相对比, 发现发生放射增敏效应的两个时间-浓度组100 nmol/L, 24 h和1000 nmol/L, 24 h的G2/M期细胞分布百分率与其他时间-浓度条件相比有非常明显的升高 (P<0.01) , 存在明显的G2/M期阻滞现象。G2/M期阻滞较显著的100 nmol, 24 h组的放射增敏率也高于G2/M阻滞较弱的1000 nmol/L, 24 h组, 表明β-榄香烯的G2/M期阻滞作用与其对人肝癌细胞放射增敏作用相关。检测结果显示, 随着β-榄香烯作用时间的延长, 人肝癌细胞G2/M期分布百分率逐渐上升, 呈时间依赖性效应。而在相同时间条件下, 随浓度增大, G2/M期细胞百分率渐大, 在100 nmol/L时达到最高。当浓度增加到1000 nmol/L, G2/M期细胞百分率又出现下降, 二者之间差异有统计学意义 (P<0.05) 。后者, 在其他文献中也见到类似报道[9]。研究者认为产生这一现象可能是过高浓度的β-榄香烯可阻滞细胞于G1/S期或直接导致部分G2/M期细胞死亡[10]。研究显示1000 nmol/L组的S期分布百分率均高于100 nmol/L, 且二者之间差异有统计学意义 (P<0.05) 。
β-榄香烯能够诱导细胞凋亡的早有报道[5]。Olive对0.01μg/ml浓度β-榄香烯作用24 h后里淋巴母细胞的细胞周期进行分析时发现, 较低浓度β-榄香烯作用较短时间即可以诱导细胞凋亡, 放射增敏率较高的条件下, 亚G1期比例也出现明显升高, 表明β-榄香烯放射增敏作用与非G2/M期依赖的细胞凋亡有关[10]。本研究细胞凋亡百分率检测结果显示, 诱导细胞凋亡百分率的最高峰出现在10 nmol/L, 24 h水平。但随时间减少以及浓度升高而逐渐递减。具有放射增敏效应的条件下均有不同比率的细胞凋亡产生。而细胞凋亡比率最高的10 nmol/L, 24 h组, G2/M期细胞百分率却较低, 而放射增敏效应较高 (SER=1.29) 。本研究显示, β-榄香烯放射增敏效应与β-榄香烯G2/M期阻滞作用及诱导细胞凋亡作用相关, 提示β-榄香烯对人肝癌细胞放射增敏作用并非单一机制的现象, β-榄香烯的G2/M期阻滞作用和诱导细胞凋亡作用均可起重要的作用。有关作用的机制, 有待今后进一步探讨。
摘要：目的通过体外实验探讨β-榄香烯对人肝癌细胞株的放射增敏作用机制。方法用克隆形成法检测不同时间-浓度条件β-榄香烯和/或放射作用后的人肝癌细胞株存活分数, 计算放射增敏率 (SER) 。用流式细胞仪分析不同时间-浓度条件下β-榄香烯对细胞周期和细胞凋亡的影响。结果10、100、1000nmol/Lβ-榄香烯作用24h后SER分别为1.32, 1.71和1.36。β-榄香烯作用时间和浓度越高, 人肝癌细胞G2/M期的比率也越高。100、1000nmol/Lβ-榄香烯作用24h后, G2/M期比率明显升高。10nmolβ-榄香烯作用24h细胞凋亡百分率20.71%。结论β-榄香烯对人肝癌细胞有放射增敏作用, 其作用机制可能与对诱导肝癌细胞凋亡和β-榄香烯对细胞的G2/M期阻滞有关。
关键词：肝癌细胞,β-榄香烯,放射增敏
参考文献
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人肝癌细胞株 篇5
[关键词] RMP基因；肝癌细胞；基因稳定性；细胞运动
[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2011）24-41-02
Effect of RMP gene on stability and migration ability of hepatoma carcinoma cells
ZHOU Feng
Department of Pharmacy,Jiangxi University of TCM Science and Technology College,Nanchang 330025,China
[Abstract] Objective To study the effect of RMP gene on stability and migration ability of hepatoma carcinoma cells. Methods Randomly divided SMMC-7721 cells into experimental group and control group. The author synthesized the siRNA eukaryotic expression vector of RMP gene,and transfectioned the vector to SMMC-7721 cells of experimental group.Screen the experimental groups with G418 for the cell strains with interfered RMP gene,and detectedthe expression of RMP gene in 2 groups by RT-PCR.It tested the migration ability of 2 groups of cells with scarification experimentation. Results Stable cell strains of interfered RMP gene had been built successfully. Compared to control group which hasn't been interfered, the experimental group cells had a weaker expression of p21 gene and a lower ability of migration. Conclusion The RMP gene contributes to the stability of hepatoma carcinoma cells and affects the migration ability.
[Key words] RMP gene;Hepatoma carcinoma cells; Gene stability;Migration ability
RMP（RPB5-mediating protein）是RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymeraseⅡ，RNAP Ⅱ）第5亚基RPB5的调节蛋白，其通过与RPB5的特异性结合来调节RNAPⅡ的转录活性，调节多种基因的转录和表达[1-2]。RMP最早于1995年由Cheong等采用Far-Westen印迹法，以32P标记的重组人RPB5探针从人肝癌细胞株的cDNA文库中筛查得到[3]。目前已有研究表明：RMP是一个重要的转录因子，在基因转录、细胞凋亡、基因组稳定以及肿瘤发生发展中均可能起重要作用[4]。笔者通过合成RMP基因的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）真核表达载体，转染到肝癌SMMC-7721细胞中，研究RMP基因对肝癌细胞稳定性及迁移能力的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
SMMC-7721肝癌细胞株从苏州大学医学部细胞生物学系实验室购买；G418从Sigma-aldrich公司购买；RT-PCR试剂盒从Fermenant公司购买。RPIM1640培养液和小牛血清从Gibco公司购买。
1.2 方法
将肝癌SMMC-7721细胞等量分为实验组与对照组，分别置于含15%小牛血清的RPIM1640培养液中，将其放入7.5% CO2的培养箱中以37℃恒温培养24 h。分离出处于对数生长期的细胞进行实验。向实验组中加入2 mL含6μg转染液，在相同条件下继续培养24 h。用G418筛选实验组中干扰RMP基因的细胞株。共72 h后，RT-PCR检测实验组与对照组RMP、p21 mRNA的表达情况。用Bandscan软件测出两组细胞能RMP/GAPDH和p21/GAPDH的灰度值（%）做比较。用体外划痕法检测两组细胞的迁移能力。
1.3 统计学处理
用SPSS13.0软件对所得数据进行分析，数据用（）表示，进行t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
RT-PCR结果显示实验组RMP表达水平比对照组明显下降，实验组p21mRNA水平也显著低于对照组，说明干扰RMP基因降低了p21的表达，p21对维持DNA的稳定性起重要作用，说明RMP基因有维持细胞基因稳定性的作用。用体外划痕法比较实验组与对照组的细胞迁移能力，发现实验组的划痕宽度高于对照组，说明实验组细胞的迁移能力明显低于对照组，RMP基因对保持细胞的迁移能力有重要作用。见表1。
3 讨论
肝癌是死亡率仅次于胃癌、食道癌的第3大常见恶性肿瘤，目前正严重影响着越来越多的国人的生活质量。RMP作为一
种重要的转录因子，在基因组稳定、细胞运动、肿瘤发生发展中均可能起到重要作用。如何确定RMP基因对肝癌细胞稳定性以及迁移能力的影响，成为笔者研究的方向。
在本研究中，笔者将合成的小干扰RNA成功转染到SMMC-7721肝癌细胞中，筛选出稳定表达的细胞株作为实验组。利用RT-PCR技术检测发现，与对照组相比，实验组细胞RMP基因表达水平明显降低（P＜0.05），而且实验组p21 mRNA水平也显著低于对照组（P＜0.05），说明RMP基因被干扰以后，能相应减弱p21 mRNA的表达水平，而p21基因对细胞周期调控有重要作用，那么RMP基因对维持细胞稳定性也能起到一定作用。通过体外划痕试验，笔者发现实验组的划痕宽度显著高于对照组（P＜0.05），说明成功干扰RMP基因的细胞株的迁移能力下降，提示RMP基因在保持细胞的迁移能力中也有重要作用，其中体外划痕实验的结果与连晓宁等[4]的研究结果一致。
综上所述，笔者认为RMP基因与肝癌的发生、发展有一定联系，并且RMP基因对维持肝癌细胞的稳定性起重要作用，可能是和p21基因协同调控肝癌细胞的细胞周期，还能保持细胞的迁移能力，为肝癌的基因治疗提供了新的研究方向。
[参考文献]
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[4] 连晓宁，杨慧翠，曹锴，等.RMP siRNA对SMMC-7721肝癌细胞增殖和迁移能力的影响[J].肿瘤，2010，30（1）：15-20.
人肝癌细胞株 篇6
关键词：硒酸酯多糖(KSC),紫杉醇(TAX),肝癌细胞HepG-2,MTT,q值
硒酸酯多糖(kappa-selenocarrageenan,KSC)又称硒化卡拉胶,为硒与卡拉胶合成的新型生物活性多糖,具有抗氧化、抗肿瘤、提高免疫力及降低化疗药物的毒副作用等活性[1,2]。研究表明KSC对多种体外培养的肿瘤细胞均有生长抑制作用[3,4,5],但KSC与其它化疗药物联合抗肝癌的作用鲜有报道。本文采用MTT法观察KSC联合紫杉醇对人肝癌细胞株HepG-2的抗肿瘤活性,根据金氏公式[6]定量分析两药合用时的相互作用效果,以了解KSC与紫杉醇联合用药的特性和临床应用的可行性。
1 材料与方法
1.1 材料
细胞:人肝癌细胞株HepG-2。
试剂:RPMI1640培养基(美国GIBCO产品),胎牛血清(杭州四季青),硒酸酯多糖(张家港天赐福生物工程有限公司惠赠,硒含量为1.68%),噻唑蓝(MTT)、PI染料和二甲基亚砜(DMSO)均为美国Sigma公司产品。
仪器:自动酶标仪550(日本BIO-RAD公司),倒置显徽镜(日本NIOKO公司),CO2孵箱(日本株式会社)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
HepG-2细胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液(青霉素100IU/mL,链霉素100U/mL)中,于37℃、5%CO2孵箱中培养,细胞为上皮样贴壁生长,每2~3天传代1次。
1.2.2 MTT实验
取对数生长期的HepG-2细胞制成4×104个细胞/mL的悬液,按4 000个/孔接种于96孔板,每孔加100μL。24h后加入各种不同浓度药物的实验组(KSC组、紫杉醇组、KSC+紫杉醇联合组),每孔加100μL,使KSC的终浓度为15、30、60、120mg/L,TAX的终浓度为0.2、0.5、1、2、5nmol/L,联合组为KSC(15、30、60、120mg/L)+1nmol/L TAX,KSC(30mg/L)+TAX(0.2、0.5、1、2、5nmol/L),对照组加等量不含药物的培养液,每个剂量5个平行孔。于5%CO2,37℃培养箱中继续培养24、48、72h后,弃上清,每孔加100μL的MTT,继续培养4h后,弃上清,每孔加200μL的DMSO,微量振荡器摇匀,用酶标仪,在参考波长490nm,检测波长570nm条件下测定光密度值(OD),以溶剂组处理的肿瘤细胞为对照组,用下面公式计算药物对肿瘤细胞的抑制率。
抑制率=(对照组平均OD值-加药组平均OD值)/对照组平均OD值×100%
1.2.3 药物联合作用效应计算
以药物浓度作为因变量,细胞抑制率作为应变量,即x=药物浓度,y=抑制率,建立回归方程。利用该方程求出药物中效浓度(抑制率为50%时药物的浓度,IC50)。计算两种药物单用及合用72h时的中效浓度。
协同效应判断:为判断两药合用是拮抗、相加或增强的协同效应,按照金氏公式求q值。q=E(A+B)/[EA+(1-EA)×EB],E(A+B)为两药合用时的抑制率;EA、EB为各药单用时的抑制率。q<0.85表示两药相互拮抗;q>1.15表示两药作用增强;q=0.85~1.15表示两药作用相加。
1.2.4 统计学处理
所有数据均用表示,使用统计软件SPSS16.0中方差分析和q检验进行样本均数之间的两两比较,药物中效浓度的计算采用回归方程。
2 结果
2.1 KSC、TAX单用及联合对HepG-2细胞增殖的影响
KSC、TAX单独作用于HepG-2细胞24、48、72h后,细胞生长明显受抑制,其抑制率随药物浓度和作用时间的增加而升高,具有剂量和时间依赖性,与对照组相比差异显著(P<0.01);联合用药组与对应浓度的单一用药组相比,对HepG-2细胞的抑制效果更加显著,30mg/L的KSC与TAX(0.2、0.5、1、2、5nmol/L)合用72h,可使紫杉醇的抑制率从单独用药的16.32%~66.56%提高到联合用药的47.73%~80.64%,1nmol/L TAX与KSC(30、60、120mg/L)联合72h的抑制率分别为KSC单独用药的1.289、1.186、1.168倍,联合用药组与对照组相比吸光度有显著性差异(P<0.01)(表1,图1)。
注:与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。
2.2 按中效方程式算出两种药物单用及合用时的中效浓度(IC50)、相关系数(r)
根据MTT法测定的吸光度列出直线回归方程,得到KSC、紫杉醇单独或联合作用于HepG-2细胞72h的中效浓度(表2)。单用时的中效浓度:KSC为46.632mg/L,TAX为1.684nmol/L,1nmol/LTAX与KSC联合应用时的中效浓度为31.684mg/L,30mg/L KSC与TAX联合时的中效浓度为0.272nmol/L,远小于单一应用时的中效浓度。
2.3 KSC与TAX抗HepG-2细胞的协同效应
两药合用时,按金氏公式计算q值,判断两药之间是协同、相加或拮抗。结果表明,KSC的浓度为30~120mg/L时,与1nmol/L TAX联合应用表现为相加作用(q=0.900~0.989),TAX为0.5~5nmol/L时,与30mg/L的KSC联合效果亦表现为相加作用(q=0.882~0.974),而且协同效果呈两药剂量依赖性提高(见表3、表4)。
3 讨论
肝癌是我国常见和高发的恶性肿瘤,临床上常采用顺铂、羟基喜树碱、阿霉素、丝裂霉素等作为化疗药物[7],但易产生耐药性。紫杉醇(paclitaxel,商品名Taxo1)是从红豆杉中提取的一种化合物,由于具独特的抗癌机理和广谱高效的抗癌活性,是继阿霉素和顺铂后最热点的抗癌药物之一,目前,紫杉醇已成功用于治疗晚期卵巢癌、乳腺癌等,尤其对耐常规药物的肿瘤取得了较好的疗效。有研究报道,紫杉醇能抑制体外培养的肝癌细胞增殖,诱导细胞凋亡[8],使细胞阻滞在S期和G2/M期[9]。紫杉醇作为化疗药物临床上效果显著,但存在一些毒副作用,如过敏反应、神经系统损伤、造血抑制、心脏毒性等。临床恶性肿瘤的化疗中KSC具有良好的化疗辅助治疗作用,已证实硒酸酯多糖、富硒麦芽等有机化合物可拮抗顺铂、环磷酰胺等细胞毒药物所致的耳毒性、肾毒性、生殖系统和免疫造血系统毒性,促进宿主造血和免疫功能的恢复[10,11]。同时,研究也发现硒与肿瘤细胞的耐药性相关,硒与柔红霉素抗癌药物联合应用其疗效优于单一用药时的抗肿瘤效应,其机理可能为硒竞争性地结合P-糖蛋白(P-gp),或通过调节细胞内药物与其作用靶部位结合,增强柔红霉素的抗癌效应,从而在一定程度上克服耐药[12]。
本研究结果表明,KSC与紫杉醇单独用药时均可抑制人肝癌细胞HepG-2的生长,并呈剂量和时间依赖性,二者联合应用时,尤其是在药物浓度较大时,对人肝癌细胞株HepG-2有协同相加作用,说明两药联合应用比单独应用时抗肝癌效果更好。另外,紫杉醇作用HepG-2细胞72h的中效浓度(IC50)从单用时的1.684nmol/L降至联合时的0.272nmol/L,降低了紫杉醇的用量及毒副作用。总之,本研究发现KSC与紫杉醇联用后,可增强对肝癌细胞的增殖抑制,提示二者联用可能是提高肝癌疗效的一种有效方法,并且临床上指导医生筛选出最合理的联合用药方案,使化疗药物的毒副作用进一步减少,有效率进一步提高。
参考文献
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人肝癌细胞株 篇7
1 资料与方法
1.1 主要试剂
RPMI1640培养基及AIM-V无血清培养基购自美国Gibco公司;淋巴细胞分离液Ficoll-Paque Plus购自Amersham Biosciences公司;基因重组人GM-CSF购自厦门特宝生物工程有限公司;基因重组人IL-4购自美国PeproTech公司;TNF-α购自上海赛达生物药业有限公司;荧光标记抗体PE标记的鼠抗人CD80,APC标记的鼠抗人CD83,FITC标记的鼠抗人CD86,PerCP标记的鼠抗人HLA-DR购自美国BD公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术公司。
1.2 细胞株
人肝癌细胞株Hep G2及人肾癌细胞株769-p购自武汉中国典型培养物保藏中心，常规培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，培养条件为37℃，二氧化碳浓度5%。
1.3 HS P 70的提取纯化
收集传代培养的HepG2肝癌细胞约2 g，悬浮于10 m L低张缓冲液中(30 m M碳酸氢钠，pH=7.2)，反复冻融3次，20 000 r/min高速离心2 h，取上清，经截留分子量100 kD的超滤离心(Vivaspin，德国Sartorius)，取滤出液，再经截留分子量10 kD的超滤离心(Vivaspin，德国Sartorius)，取浓缩液，加PBS至10 m L，加至DEAE纤维素柱(DE52，英国WHATER MAN)，阶段氯化钠浓度洗脱，收集160 m M氯化钠浓度洗脱段蛋白，SDS-PAGE考马斯亮蓝染色及western-blot分析鉴定。
1.4 DC的体外培养
健康自愿者外周静脉抗凝血，经Ficoll-Paque Plus密度梯度离心获得PBMC，用PBS液洗涤2次，悬浮于AIM-V无血清培养基中，调整细胞浓度在5×106/m L，在37℃、5%二氧化碳和饱和湿度的细胞培养箱中培养，2 h后去除悬浮细胞，贴壁细胞加入含有1 000μ/m L GM-CSF和1 000μ/m L IL-4的AIM-V无血清培养基中继续培养，第2天及第5天补加细胞因子，于第7天加入HSP70(实验组)或肿瘤细胞裂解物(对照组)，24 h收获DC，进行检测实验。
1.5 流式细胞仪测定DC表型
收集DC，离心，PBC洗涤，调整细胞浓度1.5×106/m L,100μL/管，分别加入20μL CD80-PE、CD83-APC、CD86-FITC、HLA-DR-PerCP鼠抗人荧光单抗，4℃标记30 min,PBS洗2次，调整细胞浓度1.0×106/m L，用流式细胞仪测定。用WinMDI 2.9软件进行分析。
1.6 DC与自体T细胞共培养
外周静脉抗凝血经Ficoll-Paque Plus密度梯度离心获得PBMC后，在二氧化碳细胞培养箱中经2 h静止后的悬浮细胞，离心，加入细胞冻存液，调整细胞浓度1.0×107/m L，-80℃冻存。第7天复苏，分装培养瓶，按1∶10的比例分别加入不同组DC细胞，3 d后收集细胞。
1.7 体外杀瘤活性检测
分别用HepG2细胞及769-p细胞为靶细胞，共培养3 d的T细胞为效应细胞，效靶比1∶1,2∶1,4∶1和8∶1，孵育24 h后用CCK-8试剂盒进行杀伤活性检测。
1.8 统计学分析
采用SPSS 11.5统计软件，计量数据以均数±标准差(x±s)表示，两组间均数比较用t检验，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 HS P 70的纯化鉴定
经过2次超滤和DEAE纤维素柱的分离后，得到纯度较高的分子量约为70 kD的蛋白质，经蛋白电泳及免疫印迹分析证实该蛋白质即为HSP70，见图1。经BCA法测定溶液中HSP70浓度计算，每1克肿瘤细胞可获得大约30μg的HSP70。
2.2 HS P 70体外致敏对DC表型的影响
贴壁的PBMC经加入含GM-CSF、IL-4的无血清培养基培养1 d后开始出现少数细胞悬浮生长。第3天细胞出现不规则形态，悬浮细胞增多。第5天细胞表面伸出毛刺样突起，数量增多，体积增大，成簇生长。第7天大部分细胞悬浮并聚集成簇，外形不规则，体积为原来的1～2倍，具有典型的树突状突起。外周血单个核细胞，经GM-CSF、IL-4诱导可大致获得5～10%PBMC数量的DC。加入HSP70后，DC表面成熟标志CD83、CD80、CD86、HLA-DR的表达明显增加(见表1)，与加入肿瘤裂解物对比，差异有显著性，而加入肿瘤裂解物组与空白对照组相对比差异无显著性。
注：1)与空白组比较，P>0.05;2)与对照组比较，P<0.01;3)与空白组比较，P<0.01
2.3 HS P 70致敏的DC特异性增强T细胞杀伤肿瘤的能力
与不同组DC共培养的T细胞对肝癌HepG2细胞及肾癌769-p细胞的杀伤能力有着显著的不同。用HSP70致敏的DC活化的T细胞对与HSP70同源的肝癌细胞有较高的杀伤活性，而对非同种肿瘤肾癌的杀伤活性较低，两组相比差异有显著性。用肿瘤细胞裂解物体外致敏DC共培养的T细胞对同源的肝癌细胞及非同源的肾癌细胞杀伤活性均较低，两组相比差异无显著性。用HSP70致敏与用肿瘤细胞裂解物体外致敏DC共培养的T细胞对同源的肝癌细胞杀伤活性明显增高，两组相比差异有显著性。见图2。
3 讨论
HSP是广泛存在与原核及真核生物细胞中的高度保守的蛋白质家族，在热应急等不良环境因素下表达增加，具有“分子伴侣”作用，参与多种胞内蛋白的折叠、装配及转运[6]。很多研究发现，肿瘤组织内的HSP与肿瘤的免疫反应密切相关，具有“伴移抗原肽”的特性，起到抗原呈递分子的作用，并具有细胞因子样的作用，刺激DC及巨噬细胞产生炎性细胞因子及趋化因子[7,8]。其中研究较深入的HSP成员是HSP70、HSP90及gp96。有学者的实验证明，肿瘤细胞内的HSP70，而非HSP90、HSP60或gp96，是活化DC的主要HSP成员[9]。从肿瘤组织提取的HSP70实际上是结合有多种肿瘤抗原决定簇的热休克蛋白70-多肽复合物(heat shock protein70-peptide complexes,HSP70-PC)，可激发多克隆CTL反应，具有良好的肿瘤疫苗的作用，已有进入临床研究的报道[10]。但未能取得预期的疗效，这和肿瘤患者体内的免疫抑制状态，尤其是DC的功能缺陷可能密切相关[11]。笔者以前的研究发现，用HSP70体外致敏DC可很好地使其活化，可能是解决这一矛盾的很好途径[12]。本研究中应用人肝癌株HepG2中纯化的HSP70(实际上即是HSP70-PC)体外致敏DC，获得了相同的结论。用HSP70体外致敏DC后能够使其高表达CD83、CD80、CD86、HLA-DR等成熟标志，而对照组用肿瘤裂解物致敏DC，并未能促使其成熟。通过体外杀瘤实验对比分析，用肿瘤裂解物致敏DC体外刺激T细胞并未增强其杀瘤活性，而用HSP70致敏的DC却能够特异性地增强杀伤其同源肿瘤的活性，这表明HSP70不但能够携带肿瘤特异性抗原，通过DC呈递给T细胞，而且HSP70具有诱导DC成熟的能力。诸多的研究报道，只有成熟的DC才能有效活化T细胞，而未成熟的DC是导致肿瘤免疫耐受的重要原因之一[13]。这提示HSP70可能是较理想的可用于体外致敏DC的肿瘤抗原。
对于HSP70的生化提纯方法已有很多研究，PENG等[14]证实用明胶亲和层析、Deoxyspergulin亲和层析或ATP-agarose亲和层析获得的HSP70没有结合抗原多肽，不具免疫活性，而用ADP亲和层析提纯的HSP70结合有抗原多肽，能够激发针对这些抗原多肽，而非HSP70本身的特异性抗肿瘤免疫反应。本研究对HSP70的纯化方法进行改良探索，应用两次超滤除去大部分非目的蛋白，再用离子交换层析获得纯度较高的目的蛋白，提纯过程更加简便快速，而能达到和笔者以前提取方法及目前广为采用的亲和层析法相近似的目的蛋白获得率[15,16]。通过对体外致敏DC功能的观察证明这种方法获得的HSP70是具有免疫活性的蛋白。这为HSP70的提纯应用提供了一个快捷有效的方法。
摘要：目的 用改良的方法提取纯化人肝癌细胞中的HSP70,通过观察其对DC瘤苗的体外活化,证实其免疫活性。方法 利用两步超滤及离子交换层析提纯HSP70,体外致敏外周血单核细胞来源的DC,检测DC表面成熟标志的变化。再将此DC与T细胞共培养,用CCK-8试剂盒检测其对HSP70同源及非同源肿瘤的杀瘤活性。结果 用这种改良的简便快捷的HSP70生化提纯方法可获得与其他常被采用方法相似得率的目的 蛋白,用其体外致敏DC可使其高表达CD80、CD83、CD86及HLA-DR等成熟标志。用此DC与T细胞体外共培养后,具有较高的对HSP70同源肿瘤的特异性杀伤活性。结论 用此改良的提纯方法,可获得具有免疫活性的HSP70,在体外具有很好的活化DC瘤苗的能力。
人肝癌细胞株 篇8
过氧化物酶(peroxiredoxin,Prx)是具有过氧化物酶活性的巯基特异性抗氧化蛋白[2]。Prx 6个家族成员中,Prx1在包括肺癌在内的多种人类肿瘤中表达异常增加[3,4]。本研究主要分析正常肝细胞和肝癌前病变细胞中过氧化物酶1(peroxiredoxin 1,Prx 1)的表达情况,探讨Prx1通过表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)/Akt信号通路肝癌前病变细胞生长增殖情况。此外,本课题还在肝癌移植瘤模型中证实了Prx 1对肿瘤生长和恶性转化的影响。本研究结果表明肝癌前病变细胞中Prx 1表达增加,Prx 1能够促进肝癌前病变细胞中表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)表达,并激活EGFR/Akt信号通路,移植Prx 1表达能够抑制肝癌移植瘤模型中肿瘤生长和转移。
1 材料与方法
1.1 细胞培养和EGF处理
在含10%(v/v)小牛血清、100 u/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基中培养人正常肝细胞株L02和CCL13细胞。所有细胞在37℃下含5%二氧化碳CO2和95%空气的培养箱中培养。细胞血清饥饿24 h后,用含10 ng/ml EGF的无血清培养基继续培养10 min。立即收获细胞并对其进行冷冻以用于后续实验。
1.2 活性氧(reactive oxygen species,ROS)形成检测
使用二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(2’,7’-Dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA)荧光染料分析细胞提取物中ROS形成速率。DCFH-DA通过与ROS反应氧化为二氯荧光素(fluorescent dichlorofluorescein,DCF)。从485 nm激发波长和530 nm发射波长上的荧光增加斜率计算ROS形成速率,使用标准DCF校正。
1.3 肝组织活检
肝组织活检钳,检查肝癌患者血常规、肝功能、凝血酶原时间和活动度、B超、心电图,对患者进行屏气动作训练。B超术前定位,取右腋中线第8~9肋间或腋前线第9~10肋间隙为穿刺点,于患者深呼气末屏气时采用16号活检枪,1 s负压吸取肝组织,标本放入10%甲醛中固定、石蜡包埋,常规做苏木精一伊红(HE)染色、Masson及网状纤维染色,视临床病情需要加做免疫组织化学及特殊染色。术后予束腹带包扎4 h,卧床休息8 h,监测血压、脉搏,1周内避免剧烈活动。
1.4 肝细胞原代培养
肝组织活检取下标本后,立即置入含青霉素(100 u/ml),链霉素(100μg/ml)的无血清DMEM培养基内,并于1 h内处理。组织块置于培养皿中,加入DMEM液,用眼科剪将不需要的血块和组织(坏死组织或结缔组织等)除去,再用DMEM液漂洗两次后剪成约1mm3大小,加入1g/L胶原酶Ⅵ消化液37℃消化30 min,细胞悬液纱布过滤,1 000 r/min 5 min离心2次,弃上清;800 r/min 4 min离心2次,弃上清,每次以DMEM液重悬沉淀。细胞沉淀重悬于含100 ml/L FBS的DMEM中,测细胞活力,以>1×109个/L的浓度接种于25 ml培养瓶,50 ml/L二氧化碳CO2培养箱37℃孵育。24 h后换液,去除未贴壁细胞,加入DMEM液(含10 mg/L胰岛素,1 mmol/L谷氨酰胺,100 u/ml青霉素,100μg/ml链霉素,100 ml/L FBS)。37℃50 ml/L二氧化碳CO2培养箱内静置培养。每两天半换液,每天倒置显微镜观察,成纤维细胞通过反复贴壁分离法、机械刮除法去除,得到纯化的表皮样生长细胞,每3天传代1次。
1.5 Prx 1短发卡RNA表达载体的构建
本研究构建了表达短发卡RNA(sh RNA)的含人类u6启动子的自失活逆转录酶病毒表达载体。Bam HⅡ/HindⅢ双酶切MSCV表达质粒和p M-SCV-EGFP-Neo载体,双酶切获得片段链接重组,将识别Prx 1或错义序列的短发卡RNA重组至p M-SCV-EGFP-Neo载体。Prx 1 sh RNA能够识别人类Prx 1 c DNA(NM002574)的474-492碱基对。寡核苷酸对的序列为:5'-GATCCGTTCTCACTTCTGTATCT ATTCAAGAGATAGATGACAGAAGTGAGAATTTTT TGGAAA-3'和5'-AGCTTTTCCAAAAAATTCTCACT TCTGTCATCTATCTCTTGAATAGATGACAGAATGA GAAC-3'。错义序列为:5'-GATCCCGTTCTCCGAAC GGTGCACGTTTCAAGAGAACGTGCACCGTTCGGA GAATTTTTTGGAAA-3'和5'-AGCTTTTCCAAAAAA TTCTCCGAACGGTGCACGTTCTCTTGAAACGTGCA CCGTTCGGAGAACGG-3'。采用ABI 3700毛细管测序仪(Applied Biosystems)确认序列准确性。
1.6 构建稳定表达细胞株
使用Lipofectamine 2000试剂将Prx 1或错义sh RNA表达载体转染至Phoenix包装细胞。48 h后,收集上清液,0.45μm滤膜过滤,并于-80℃冰箱保存。将过滤后的Prx 1或错义sh RNA病毒上清液与4μg/ml凝聚胺(脂质体转染增强剂)分别共同感染Hep G2细胞。连续2 d每8 h将新鲜的病毒上清液加入到细胞中。含有2μg/ml嘌呤霉素的生长培养基中培养10 d,选取感染成功细胞用于后续实验。
1.7 蛋白质印迹分析(Western blot)
弃去培养皿中DMEM培养基,用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution,PBS)轻柔洗涤去除杂质,按每皿50 L加入含2%苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)的蛋白裂解液,冰上裂解5 min,收集裂解产物超声破碎10 min后4℃12 000 rpm离心30 min。收集上清蛋白液,采用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法对蛋白含量定量后备用。定量过的样品按每泳道30 g蛋白含量进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,结束后用湿转法将蛋白转至硝酸纤维素膜上,5%脱脂奶粉室温下封闭1 h,加入一抗(兔抗小鼠Prx 1,1∶2000;β-actin,l∶1 000;兔抗小鼠p-Akt,1∶500),4℃过夜。山羊抗兔二抗(1∶20 000)室温下1 h,化学法发光,压片后分析结果。最后用SPSS 18.0图像分析系统测定各条带灰度值。
1.8 体内成瘤实验及肝转移瘤确定
将培养至对数生长期的各组细胞用0.25%的胰酶消化,并将细胞浓度调整为106/ml,将500μl细胞悬液注射至非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠背部皮下。8周后引颈处死,分离肿瘤组织,并测量肿瘤组织体积,肿瘤组织制作成冷冻切片用于免疫荧光分析。使用游标卡尺每周2次测量分析肿瘤生长情况,肿瘤体积由公式(长度×宽度2)/2估算。
注射肿瘤细胞后8周后将小鼠处死。将每只小鼠的肝脏从周围组织中剖离,之后将肝脏横切。通过气管注射墨汁直至肝脏染黑。随后将肝脏切开,随后将标本放置在Fekete溶液中24 h漂白肝脏表明肿瘤结节。对比染色形成白色肝脏转移瘤和黑色正常肝脏组织之间的明确区分。
1.9 统计学方法
采用SPSS19.0统计学软件包进行数据处理,计量资料以均数±标准差形式(±s)表示,进行描述性统计分析、样本的正态性检验、方差齐性检验、单因素方差分析(one-way ANOVA)及LSD-t检验(多个样本均数间两两比较采用)。除方差齐性检验时取P<0.10认为检验结果有统计学意义外,所有统计学分析均取P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 异常肝细胞中Prx 1和p Akt上调
本实验通过获取配对肝细胞,并检测配对肝细胞中Prx 1蛋白表达差异情况,探讨癌前肝细胞中Prx 1的表达情况。原代肝细胞从肝癌组织、近癌肝组织和远癌肝组织中分离培养。与正常肝细胞比较,异常(癌前病变,源自近癌肝组织)肝细胞Prx 1表达上调(见表1、图1)。正常细胞到异常细胞的表型转化与Akt等细胞内信号分子变化有关,采用Pearson直线相关分析p Akt水平与Prx 1蛋白表达水平之间的关系,用相关系数r表示,结果显示:Akt水平与Prx 1蛋白表达水平呈正相关(r=0.863,P<0.01),提示p Akt水平上升与Prx 1蛋白表达水平紧密相关。
提取远癌肝组织(正常肝组织)和近癌肝组织(恶性转化肝组织)蛋白,Western blot检测Prx 1、p Akt、Akt及β-actin在两组肝组织中的表达差异。
N1-4:远癌肝组织;A1-4:近癌肝组织
2.2 Prx 1增强EGF介导的EGFR与Akt激活
与空白对照组肝细胞株L02比较,癌前病变肝细胞(CCL13)中Prx 1蛋白表达明显上升,差异有统计学意义(t=5.738,P=0.037)。基线状态时,L02或CCL13细胞中均未检测到Akt激活(见图2A)。与Prx 1低水平表达的L02细胞比较,Prx 1表达较高的CCL13细胞中EGF介导的Akt激活明显增加,差异有统计学意义(t=8.412,P=0.001)(见图2B)。5种关键性EGFR磷酸化残基中,只有酪氨酸1173残基对EGF处理有反应;这种残基被称为导致Akt激活的磷酸化位点,结果提示原代肝细胞中,Prx 1水平较高增加了Akt信号,Prx 1可能与EGF介导的信号通路有关。
2.3 Prx 1表达敲除对肿瘤生长和体内新陈代谢的影响
Western blot检测表明,转染稳定表达靶向Prx 1的短发卡RNA(sh Prx-1)Hep G2细胞中Prx 1表达明显受到抑制,与对照组比较,差异有统计学意义(t=12.341,P=0.000)(见图3A),证实sh Prx 1转染成功,但是转染sh Prx 1对Hep G2细胞内ROS产生无影响,与对照组比较,差异无统计学意义(t=0.124,P=0.892)(见图3B)。Prx 1表达敲除后显著地抑制了肿瘤生长,第24天开始,sh Prx 1组肿瘤体积均明显比无义sh RNA转染组小(均P<0.05)(见图4)。第56天时,在SCID鼠体中皮下注射每种细胞3×106个,并检查肝转移瘤确定远端转移特性。如图5所示,敲除Prx 1降低了Hep G2移植瘤中肝转移瘤的发病率,sh Prx 1组肝转移瘤数量明显少于无义sh RNA转染组(t=6.132,P=0.035)。
A:L02和CCL13肝细胞血清饥饿培养24 h后,10 ng/ml EGF处理10 min,提取细胞总蛋白,Western blot检测Prx 1和p Akt的表达情况。B:Western blot检测总EGFR和各EGFR磷酸化形式的表达
此外,磷酸化Akt程度与Prx 1蛋白表达水平密切相关,Pearson直线相关分析血清磷酸化Akt程度与Prx 1蛋白表达水平呈正相关(r=0.954,P<0.01)(见图6)。肿瘤中Prx 1表达敲除后的作用持续至首次注射肝癌细胞56d后,Prx 1表达敲除肝肿瘤p Akt表达水平较低,该结果表明,Prx 1在调节人类肝癌Akt激活中起主要作用。
A:Western blot检测3种细胞株中Prx 1的表达情况;1:对照组Hep G2细胞;2:转染无义sh RNA组Hep G2细胞;3:转染Prx 1sh RNA组Hep G2细胞。B:Prx 1表达对Hep G2细胞荧光素酶的影响;1:转染无义sh RNA组Hep G2细胞;2:转染Prx 1 sh RNA组Hep G2细胞
3 讨论
本文实验结果发现癌前病变肝细胞中Prx 1表达水平明显高于正常肝细胞,在恶性肝癌组织中Prx 1表达水平也显著升高。进一步研究发现,正常细胞向异常细胞转化过程中的Prx 1表达升高与Akt激活增加有关。采用sh RNA抑制肝癌细胞中Prx 1表达后,肝癌细胞移植瘤模型中肿瘤生长和转移明显受到抑制,提示Prx 1可能与肿瘤进展和侵袭有关,而Akt激活降低与肿瘤发生减少显著相关。
以往研究认为Prx 1能够增强细胞生存能力,是因为Prx1具有抗氧化剂作用[5]。Prx1在N端(Cys52)含有具有催化作用的半胱氨酸,该半胱氨酸能够通过巯基氧化(Cys52-SOH,次磺酸)降低细胞内ROS水平。Cys52-SOH在C-端,Cys173能够通过保守解离的半胱氨酸形成一种分子间的双硫键,该双硫键通过硫氧还蛋白(Trx)/硫氧化还原蛋白还原酶(TR)等体系的电子供体还原为活性巯基形式,Cys52-SH[6,7]。体内外研究均表明抑制Prx 1表达能够增强肠癌肺癌放射治疗敏感行。这些研究均证实以下这一观点:Prx 1是抗氧化蛋白,因为抑制Prx 1表达引起放射敏感性增强是由于ROS产量升高。尽管以往体内外研究都发现抑制Prx 1表达能够显著增强POS产生,但是本研究中Prx 1表达下调肝癌细胞中ROS并未显著增加,本研究结果与Kim等[8]研究结果一致,Kim等发现放疗后,Prx 1过表达在抑制了c-Jun N-端激酶激活(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和凋亡性细胞死亡。然而,Prx 1的抗氧化活性功能对于该过程并不是必需的,因为野生型Prx 1和缺少抗氧化活性的突变Prx 1(Prx-1C52S)都能通过与GSTpi-JNK复合物结合高效阻断JNK激活和细胞凋亡。
本研究结果还表明Prx 1具有调控人肝细胞中EGFR介导信号通路的潜在作用。Prx 1高表达细胞中配体诱导EGFR Tyr1173残基磷酸化增强,从而导致Akt激活。Prx 1增强EGFR信号功能的分子机制仍需进一步研究。近期研究表明,Prx 1具有分子伴侣的功能,且这一功能不依赖于Prx 1的过氧化物酶活性[9]。作为伴侣蛋白,Prx 1改变了各种细胞蛋白的功能和活性,包括c-Abl酪氨酸激酶、巨噬细胞移动抑制因子、c-Myc致癌基因、雄激素受体等。Prx 1具有多种生理功能的重要原因就是Prx 1能够与生长调节蛋白相互作用。近期蛋白质组学分析提示Prx 1能够与细胞内信号转导蛋白Ezrin相互作用。Ezrin是一种磷蛋白,能够增强生长因子诱导磷酸化,并将PI3K/Akt等信号通过蛋白间直接相互作用转导至下游。Ezrin是论证Prx 1增强EGFR-Akt生存信号通路功能的理想靶点。
本文研究结果进一步揭示Prx 1能够通过EGFR-Akt信号通路介导细胞正常至异常转化、肿瘤形成、转移,提示Prx 1可能是肝癌早期检测重要靶点。目前有许多研究致力于基于靶点策略进行肿瘤早期检测,但是这些靶点都专注于个别靶分子。随着Prx 1研究的深入,与Prx 1相互作用的靶分子/效应分子的范围可能进一步扩展。尽管这些相互作用的功能结果需要以细胞类型和组织环境限制模式进行检测和阐述,但抑制Prx 1表达能够同时作用多个靶点蛋白干预肝细胞癌形成。
摘要：目的 探讨过氧化物酶1(Prx 1)在肝癌形成和恶性进展中的作用。方法 蛋白质印迹法(Western blot)检测远癌肝组织和近癌肝组织中Prx 1、p Akt及Akt表达差异。肝细胞饥饿培养24 h后,10 ng/ml表皮生长因子(EGF)处理10 min,提取总蛋白,Western blot检测Prx 1、p Akt、不同位点磷酸化表皮生长因子受体(EGFR)和总EGFR。Western blot检测检测未处理组、转染无义sh RNA组及转染Prx 1 sh RNA组Hep G2细胞中Prx 1蛋白的表达。DCFH-DA法检测3种Hep G2细胞中活性氧簇总量。转染无义sh RNA组及转染Prx 1sh RNA组Hep G2细胞皮下注射至SCID小鼠,注射后每周测量1次皮下肿瘤体积。Western blot检测两组小鼠皮下肿瘤组织中Prx 1和p Akt的表达情况。结果 与正常肝细胞比较,Prx 1在肝转化细胞中表达升高。Prx1增强了EGF介导的EGFR和Akt激活。Prx 1表达沉默抑制了Hep G2体内成瘤能力。减少Hep G2皮下移植瘤的肝转移。Prx 1表达沉默还抑制了Akt体内激活。结论 Prx 1具有调控人肝细胞中EGFR介导信号通路的潜在作用。Prx 1能够通过EGFR-Akt信号通路介导细胞正常至异常转化、肿瘤形成及转移
关键词：过氧化物酶1,肝癌,移植瘤
参考文献
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人肝癌细胞株 篇9
1 材料与方法
1.1 主要材料与试剂
人肝癌HepG2细胞株(武汉凯泰新生物技术有限公司馈赠)、RPMI1640培养液由干粉(美国Gibco公司)按说明配制并加10%新生胎牛血清(杭州四季青公司)和青链霉素混合液(碧云天公司),胰蛋白酶(美国Amresco公司)、钼酸氨(天津化学试剂厂,纯度99.0%)、AnnexinV-FITC/PI凋亡试剂盒(南京凯基公司)、碘化丙啶(PI)和RNA酶试剂(Sigma公司)。
1.2 主要仪器与设备
超净工作台(BCM21000型,苏州净化设备有限公司)、CO2恒温培养箱(SWJ2300TVBB,美国Quene公司)、倒置显微镜(OLYMPUS2CK40,日本OLYM-PUS公司)、酶标仪(STATFAX22100型,广州市倍威仪器有限公司)、流式细胞仪(BDLSRⅡ,美国BD公司,)。
1.3 方法
1.3.1 药物制备
钼酸氨以生理盐水溶解配成1000 mg/L的溶液,滤菌后置4℃冰箱保存,临用前用培养基稀释成所需浓度。
1.3.2 细胞培养
人肝癌HepG2培养于含10%胎牛血清、青霉素和链霉素各1×105U/L的RPMI1640培养基中,在5%CO2、37℃的培养箱中换液传代培养,至稳定生长。
1.3.3 CCK-8法测定细胞抑制率
收集处于对数生长期的HepG2细胞,制成4×104/L单细胞悬液,以4×103细胞/孔接种到96孔板(每孔接种100μL),细胞贴壁后,吸去培养孔中的液体,分别加入含有不同终浓度钼酸氨(0.101、0.202、0.404、0.606 mol/L)的培养液200μL,继续分别培养24、48、72 h,同时设空白调零组(不加细胞仅加入等量培养液),以及阴性对照组(加细胞同时加入等量培养液),每组设6个复孔。在上述药物作用不同的时间点,各孔加入CCK-8 10μL,继续培养3 h,在酶标仪上以490 nm的波长测定吸光度(OD)值。结果判定:细胞生长抑制率=(对照孔平均OD值-实验孔平均OD值)/(对照孔平均OD值-空白孔OD值)×100%。
1.3.4 流式细胞仪检测细胞周期
取对数生长期的HepG2细胞,用胰酶消化后按每孔4.0×105个细胞接种于6孔板2 m L,24 h后换液,分别加入含有不同终浓度钼酸氨(0.101、0.202、0.404 mol/L)的培养液4 m L,继续分别培养24、48、72 h,同时设阴性对照组(加细胞和等量不含钼酸氨的培养液)。在上述药物作用不同的时间点收集细胞,PBS洗涤1次,-20℃预冷的70%乙醇固定3～4 h,PBS洗1次后各管加入600μL PI和RNA酶混合液,避光染色30min,流式细胞仪检测细胞周期,Modfit LT-Unititle软件分析数据。
1.3.5 流式细胞仪检测细胞凋亡
细胞培养、接种、分组及作用时间同细胞周期测定,不同的时间点收集细胞,预冷PBS洗涤2次,用90μL Annexin V Binding Buffer重悬细胞,加入Annexin V-FITC和PI溶液各5μL,室温避光孵育15 min,加入200μL Annexin V Binding Buffer,于1 h内流式检测,BD-FACSDiva软件分析数据。
1.4 统计学处理
应用SPSS 11.5统计软件进行Friedman检验,以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 钼酸铵作用后Hep G2细胞形态学变化
不同浓度的钼酸铵作用于HepG2细胞24、48、72 h后,倒置显微镜下观察,对照组细胞贴壁生长状态佳,细胞轮廓清楚,呈梭形,随着培养时间的延长,细胞数量明显增加,而0.101 mol/L组细胞,随培养时间的延长细胞变化不明显:0.202 mol/L组细胞,1～2 d变化不明显,培养3～4 d,可见贴壁细胞中部分为圆形,有少量细胞漂浮在培养液中,细胞数目与对照组相比明显少:0.404、0.606 mol/L组细胞培养2d,细胞出现明显变化,细胞贴壁状况不良,圆形细胞及细胞碎片较多,有较多细胞漂浮在培养液中,贴壁细胞密度下降,培养3～4 d,上述变化更加明显。
2.2 钼酸铵对Hep G2细胞增殖的影响
CCK-8法检测结果显示随着药物浓度增大和作用时间延长,钼酸氨对HepG2细胞增殖抑制存在着明显的剂量-效应关系和时间-效应关系(P<0.05)即剂量越大、药物作用时间越长,则对HepG2细胞的抑制率越高,见表1和图1。
注:Friedman检验不同浓度、不同时间抑制率的χ2,P值分别为
2.3 钼酸铵对Hep G2细胞周期分布的影响
流式细胞仪检测细胞周期结果显示不同浓度钼酸铵对HepG2细胞作用24、48、72 h后,与对照组相比,细胞周期中各期细胞发生改变,即G0/G1期细胞及细胞凋亡率上升,S期和G2/M期细胞下降,差异性有显著(P<0.05),且与钼酸铵浓度和作用时间具有剂量依赖性和时间依赖性。见表2和图2-4。
注:Friedman检验χ2=9,P=0.029
2.4 钼酸铵对Hep G2细胞凋亡的影响
不同浓度钼酸铵对HepG2细胞作用24、48、72h后,流式细胞仪检测细胞凋亡,与对照组相比,随着钼酸铵浓度的增加和作用时间延长,活细胞数百分比(Q3)逐渐减少,凋亡细胞数百分比(Q4+Q2)逐渐增加,且呈剂量依赖和时间依赖关系,差异有统计学意义(P<0.01),见表3和图5-7。
注:Friedman检验χ2=19.2,P=0.000
3 讨论
钼是人体14种必需的微量元素之一。其生理功能主要是通过各种钼酶的活性来实现。钼是醛氧化酶、黄嘌呤氧化酶、硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶等的重要组分。钼酶存在于所有生物体内,参与蛋白质、含硫氨基酸和核酸的代谢[4]。
十多近年来,随着人们对钼的认识的逐步深入及国内外大量的流行病学调查研究和试验研究[5,6,7,8]的进展,进而发现钼除了作为人体必需微量元素发挥多种生理功能外,还对肿瘤的发生、发展具有预防和抑制作用,其抗癌机理可能有:(1)钼是抗氧化剂,有阻断过氧化物生成的作用,从而防止氧化损伤。(2)钼是硝酸还原酶的组份,此酶防止硝酸盐及亚硝酸盐与二级胺生成亚硝酸胺化合物;(3)钼对肝P450酶和去甲基化酶的活性有影响,小浓度可促进亚硝胺代谢并减少肝脏DNA化合物的生成;大浓度钼可减慢亚硝胺的代谢;(4)钼有封闭类固醇类激素受体的作用,像黄体酮受体,雄性激素受体,钼也是体内转失活雌激素进入活性体的抑制剂,因为乳腺是雌激素调节的靶器官,雌激素是促进乳腺正常和异常生长的因素,钼使乳腺雌性激素受体失活减弱激素致癌过程的促进作用[9]。
该实验结果表明:(1)钼酸铵在体外能明显抑制人肝癌细胞HepG2的生长和诱导细胞凋亡,并呈一定的量效和时效关系,不同浓度钼酸铵对HepG2细胞的增殖抑制率和细胞凋亡率随着药物浓度的增加和时间的延长而升高,明显高于对照组(P<0.0l)。(2)钼酸铵对HepG2细胞周期各时相有一定影响,随着钼酸铵浓度的增加和作用时间的延长,G0/G1期细胞显著增多,S期和G2/M期细胞减少,并出现凋亡峰。说明钼酸铵可以诱导肿瘤细胞出现G1期→S期阻滞和细胞凋亡,使许多肿瘤细胞不能进行DNA合成,从而起到抑瘤作用。抑瘤药物对细胞周期的影响可以通过阻滞G1期→S期阻止DNA复制或阻滞S期→M期抑制细胞分裂而抑制肿瘤细胞的生长。G1期是细胞DNA复制前期,是合成细胞生长所需要的多种蛋白质、RNA等重要物质的关键时期;S期完成DNA合成,DNA含量在此期增加一倍,此两期皆是药物等因素作用的靶点,抑制细胞周期G1期或S期,从而抑制肿瘤细胞增殖[10]。该研究说明在钼酸铵的作用下,HepG2肿瘤细胞的DNA合成复制受到抑制,导致细胞增殖分裂减慢并部分凋亡。
综上所述,钼酸铵能抑制人肝癌细胞的体外增殖,其机制可能与阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡有关,其作用的具体分子机制尚需进一步探讨。
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人肝癌细胞株 篇10
1 资料与方法
1. 1 材料
人肝癌细胞株Hep G2由卫生部细胞移植实验室提供;Ang II购自 ( 美国 ) Sigma生物香港公司;胎牛血清购自杭州四季青生物科技;Ang II1型受体阻滞剂厄贝沙坦 (valsartan) 购自大连美仑生物科技公司;CCK-8试剂盒购自七海生物科技有限公司;ELISA试剂盒购自美国R&D公司;RNA提取试剂、Revert Aid TM反转录试剂盒购自TaK aR a生物技术有限公司;Quanti FastSYBR Green PCR试剂盒购自德国QIAGEN公司。所有引物由Primer Premier 6软件设计, 并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.2 实验方法
1.2.1细胞培养:人肝癌Hep G2细胞培养于含有10%胎牛血清、青霉素100 U/ml和链霉素100μg/ml的DMEM高糖培养液中, 37℃、5%CO2条件下培养, 1~2天换液1次, 处于对数生长期的细胞每2~3天传代1次, 待细胞融合达到85~95% 后, 用0.25% 的胰酶消化、传代, 取对数生长期的细胞进行试验。细胞计数采用血球计数板, 对数生长期细胞制备成细胞悬液, 滴加少量细胞悬液在盖玻片边缘, 使悬液充满盖玻片和计数板之间, 静置3分钟, 显微镜下观察, 计数四个大方格内的细胞数, 压线细胞只计左侧和上方的, 细胞团计数为单个细胞, 细胞密度 = (4大格细胞总数 /4) ×104个 /ml, 若细胞团较多说明分散不好, 则需重悬。
1.2.2 Ang II对Hep G2细胞增殖作用的检测:取对数生长期的Hep G2肝癌细胞制成细胞悬液, 以0. 25% 胰酶 +EDTA进行消化, 将细胞密度调整为4×104个 /ml, 按每孔200μl铺于96孔培养板, 待细胞贴壁生长24小时后按下述进行药物处理:10-6mol/L Ang II药物处理组, 10-7mol/LAng II药物处理组, 10-8mol/L Ang II药物处理组和厄贝沙坦处理组 ( 加入厄贝沙坦10-6mol/L 2h后加入Ang II 10-7mol/L) , 每组设3个复孔。另设PBS处理组 ( 不加细胞 , 不加药物 ) 作为空白调零孔, 上述分组置于细胞培养箱中孵育, 从第24小时开始每12小时取出一组进行测定, 测定至第72小时每孔中加cck-8试剂20μl (调零孔中只加入新鲜培养液200μl和cck-8试剂20μl, 而无肝癌细胞) 。37℃、5% CO2的恒温培养箱中培养4小时后, 于全自动酶标仪 (波长 =450nm) 检测各孔吸光度值 (A= 各孔的O.D值-调零孔的O.D值 ) 并计算细胞增殖率以绘制细胞生长曲线及增殖曲线。附:细胞增殖率 (%) =[ (As-Ab) / (Ac-Ab) ]×100%;As:实验孔 ( 含有细胞的培养基、CCK-8、加药 ) ;Ac:对照孔 ( 含有细胞的培养基、CCK-8、未加药 ) ;Ab:空白孔 ( 不含细胞和药物的培养基、CCK-8) 。
1.2.3 酶联免疫吸附试验 (ELISA) 检测细胞培养上清中 b FGF 含量
(1) 药物处理后细胞培养上清的制备:选择对数生长期的细胞制成细胞悬液, 细胞密度调整为1×105个 /ml, 每孔2ml接种于6孔板上, 实验分组及药物处理同前, 每组设3个副孔。细胞培养箱培养48小时后收集细胞上清, 2000r/min离心10分钟, 收集上清 -20℃保存。
(2) 标准曲线的建立及上清b FGF的测定:实验前20分钟从冰箱中取出试剂盒, 以平衡至室温 (20.25℃ ) 。设标准孔8孔, 每孔中各加入样品稀释液100μl, 第一孔加标准品100μl, 混匀后用加样器吸出100μl, 移至第二孔。如此反复作对倍稀释至第七孔, 最后, 从第七孔中吸出100μl弃去, 使之体积均为100μL。第八孔为空白对照, 只加试剂稀释液100μl。样品孔中每孔各加入待测样品100μl, 再于样本和标准品孔中加50μl生物素化抗体工作液, 封板室温孵育120分钟后洗板5次后除空白孔其余每孔加入酶结合工作液100μl, 室温孵育60分钟后再次洗板5次, 洗板后每孔加入显色底物100μl, 孵育10分钟后每孔加终止液100μl, 混匀后在酶标测试仪450nm波长下检测吸光度 (O.D值) , 以标准品建立标准曲线, 样本品O.D值换算成终浓度后比较各组中b FGF的分泌情况。
1.2.4 实时荧光定量 RT-RCR 测定分组细胞中bF GFm RNA表达水平
(1) 引物设计与合成引物由Primer Premier6软件设计, 上海生物工程股份有限公司合成并纯化, 序列列表 (见表1) 。
(2) 实验分组取对数生长期的Hep G2肝癌细胞 制成细胞 悬液, 以0. 25% 胰酶+EDTA进行消化, 将细胞密度调整为1×105个 /ml, 按每孔2ml接种6孔培养板, 用含10% 胎牛血清DMEM培养基常规培养12小时, 待其贴壁后PBS冲洗两遍并换用无血清无双抗DMEM培养基继续培养, 并按实验要求进行处理和分组。1梯度药物浓度诱导处理组:10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol /L Ang II、厄贝沙坦及等量PBS作用后于细胞培养箱中培养48小时并收集细胞提取m RNA。2时间诱导处理组:10-7mol/LAng II分别处理12、24、36、48、60、72小时, 并设不加药物对照组, 收集不同时点的细胞提取m RNA。
(3) RNA提取及c DNA合成6孔培养板中每孔加入1.0ml的TRIzol, 按标准RNA提取步骤提取RNA, 所提之标本通过光密度分析结果A260/A280nm均处于1.9~2.3之间。取RNA3μl按试剂盒说明书逆转录成c DNA 10μl, 所依靠的反应体系:5×Prime Script? Buffer (forReal Time) 2μl, Prime Script? RT Enzyme Mix I0.5μl, Oligo d T Primer (50μM) 0.5μl, Random6 mers (100μM) 0.5μl, Total RNA 3μl, RNaseFree d H2O 3.5μl。所需反应条件:37℃15分钟, 85℃5秒。
(4) SYBR Green实时荧光定量PCR按试剂盒说明书配置成10μl标准反应体系, 包括:2×Quanti Fsat SYBR Green PCR Master Mix 10μl, Primer A 2μl, Primer B 2μl , RNase-free water4μl, c DNA 2μl。该反应体系所需反应条件:95℃30秒变性, 95℃5秒, 58℃20秒, 60个循环。β-actin基因反应条件:95℃30秒变性, 95℃5秒, 56℃20秒, 60个循环。扩增完毕后, 进行溶解曲线分析。
(5) 基因m RNA表达水平相对定量分析以β-actin为内参, 进行SYBR Green实时荧光定量PCR扩增, 测量各c DNA模板的Ct值, 通过Ct值进行相对定量分析, 实验组和对照组的基因表达的相对定量用2- △△Ct表示, 即2- △△Ct值表示实验组和对照组目的基因表达的倍数关系, 其中△△Ct= (实验组目的基因平均Ct值实验组内参基因平均Ct值) - (对照组目的基因平均Ct值 - 对照组内参基因平均Ct值) 。
1. 3 统计学方法
采用SPSS18. 0软件进行统计学分析, 数据均以χ±s表示, 采用单因素及多因素方差分析进行比较。P<0.05为差异有统计学意义, P<0.01为差异有显著统计学意义。
2 结果
2. 1细胞荧光染色结果
(图 1~4) 。
2. 2 AngI I 及厄贝沙坦对人肝癌 Hep G2 细胞增殖的影响
2.2.1作用浓度的影响:与对照组比较, 各AngI I处理组均能明显提高人肝癌Hep G2细胞的增殖 (P<0. 01) , 而厄贝沙坦处理组则显著抑制了Hep G2细胞的增殖 (P<0. 01) ;进一步比较发现, 10-6mol /L与10-8mol /L Ang II处理组两两比较差异无统计学意义 (P=0.196) , 而10-7mol/LAngI I处理组与10-6mol /L及10-8mol /L Ang II处理组两两比较差异均有统计学意义 (P=0.025、P=0.002) , 提示Ang II在10-7mol /L处作用达最大值, 且此作用可被厄贝沙坦所阻断 (表2) 。
2.2.2作用时间的影响:与对照组相比, 10-7mol/LAng II不同作用时间组均能明显提高人肝癌Hep G2细胞的增殖 (P<0. 05) ;而作用48小时组与作用60小时组比较差异无统计学意义 (P=0.491) , 以吸光度绘制细胞生长曲线 (图5) , 计算细胞增殖率并绘制细胞增殖曲线可见在第48小时细胞增殖达高峰 (图6) , 而此时厄贝沙坦处理组细胞抑制达最大 (表2) 。
注 :1) a: 当 Ang Ⅱ浓度为 10-6与 10-8mol/L 时细胞吸光度差异无统计学意义 (P=0.249) b: 作用时间为 60 小时与 72 小时相比细胞吸光度差异无统计学意义 (P=0.143) 2) 余任意药物诱导分组及时间分组细胞吸光度差异均有统计学意义 (P<0. 05)
2.3药物诱导后人肝癌Hep G2细胞b FGF的测定
2.3.1 bFGF标准曲线的制作:将标准品经配比倍比稀释的多个浓度的吸光值和浓度建立线性回归方程: y=0.0046x+0.2413, 见图7。
2.3.2不同药物处理对人肝癌Hep G2细胞分泌bF GF的影响:不同浓度Ang II组及厄贝沙坦处理组作用于人肝癌Hep G2细胞48小时后, 与同时间段阴性对照组比较, 均能明显促进 / 抑制HepG 2细胞b FGF的表达 ( P<0.01 ) 。不同药物诱导组间两两比较其差异亦具有统计学意义 (P<0.01) ( 表3) 。
注:a: 药物诱导处理组与对照组相比浓度差异均有统计学意义 (P<0.01) ; b: 不同药物诱导组比较差异均有统计学意义 (P<0.01)
2.4 SYBR Green实时荧光定量PCR检测人肝癌Hep G2细胞中b FGFm RNA的表达
2.4.1浓度诱导组:与空白对照组相比, Ang II不同诱导 分组bF GF m RNA的表达明 显增高 (P<0.01) , 10-6 mol /L组、10-7mol /L组和10-8 mol /L组组中bF GF m RNA的表达分别是空白对照组的1.135、1.476和1.269倍, 差异具有显著统计学意义 (P<0.01) , 而厄贝沙坦处理组中b FGFm RNA的表达则是空白对照组的0.799倍, 差异亦具有显著统计学意义 (P<0.01) , ( 见表4) 。
注 : a:10-6mol /L 组 与 10-8 mol /L 组 相 比 差 异 无 统 计 学 意 义 (P=0.156) ;b:10-7mol /LAng II 处理组与其他分组相比差异均有显著性 (P<0.01)
2.4.2时间诱导组:与空白对照组相比, 10-7mol /LAngI I不同时间诱导分组bF GF m RNA的表达均增高 (P<0.01) , 第12、24、36、48、60、72小时后药物诱导组bF GF m RNA的表达分别是空白对照组的1.116、1.172、1.173、2.593、2.075和1.301倍, 且第48小时分组与其他分组相比差异均有显著统计学意义 (P<0.01) , (见表5) 。
注:1) a:12h 处理组与 24 小时处理组 2-ΔΔCt值相比差异无统计学意义 (P=0.634) ; b: 12 小时处理组与 72 小时处理组 2-ΔΔCt值相比差异无统计学意义 (P=0.127) ;c: 24 小时处理组与 24 小时处理组 2-ΔΔCt值相比差异无统计学意义 (P=0.279) 2) 余任意时间处理组间2-ΔΔCt值差异均有统计学意义 (P<0.01)
3 讨论
肿瘤的发生、发展、侵袭与远处转移是一个序贯的发展过程, 其涉及到了肿瘤基因突变、供应血管生成、肿瘤细胞脱落与种植、远处转移形成等多个环节, 在这一过程中, 多种细胞因子、大分子蛋白等起到了重要的作用。丰富盘曲的血管是HCC的组织学特征, 而肿瘤血管的生成则是HCC血管侵犯和转移的标志和物质基础[5,6], 近年来, 对于肿瘤供应血管生成的研究愈发深入, 而如何抑制肿瘤血管的生成成为时下的研究热点[7]。肿瘤供应血管为肿瘤的生长提供营养、氧气和清除代谢废物, 肿瘤供应血管的生成机制复杂, 受多种细胞因子、黏附分子、基质蛋白酶及其抑制物、癌基因等正负调节因子的共同调控[8]。RAS血管紧张素系统在实体肿瘤中的表达包括血管紧张素原、血管紧张肽原酶、血管紧张素转化酶、AngI、Ang II及其受体等, 活跃的RAS系统可通过诱导血管内皮生长因子等活性成分的增加促使肿瘤供应血管的生成[9]。近年来的一些研究揭示RAS局部表达于一些成分不同的癌细胞和组织中, 包括肝癌、脑肿瘤、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、皮肤癌和子宫颈癌等[10, 11]。Ang II是RAS系统的组成成员之一, 在肿瘤的发生发展过程中起着促进供应血管生成的重要作用。Ang II在肿瘤血管生成过程中发挥与AngI相拮抗的作用, 能够抑制Ang I的作用并促进酪氨酸蛋白激酶受体2 (Tyrosine-protein kinasereceptor, Tie2) 信号转导过程, 这对于肿瘤血管发育的成熟和稳定起到至关重要的作用。碱性成纤维细胞生长因子 (b FGF) 是FGFs家族中的一员, 是广泛存在于体内多种组织的一类多肽生长因子, 在机体的胚胎发育、血管形成、创伤修复过程中起着重要的调节作用[12]。b FGF作为最早发现的促血管生成因子, 具有强烈的促血管生成作用, 可直接刺激内皮细胞增生和蛋白水解酶分泌, 并能调节内皮细胞表面整合素的表达进而促进内皮细胞的迁移[13], 大量研究表明b FGF在肿瘤的发生、发展和转移过程中起着重要作用。既往我们研究已经证实Ang II能够促进肝癌细胞中VEGFm RNA的表达[14], 相关研究亦发现肝癌组织中VEGF和b FGF的表达呈正相关[15], 而目前关于AngI I与b FGF两者之间关系的研究尚少, 因此我们通过体外细胞实验初步探讨Ang II与b FGF二者间的相互关系及其对肿瘤发生发展所起的作用, 并且结合既往的实验结果综合分析RAS系统在HCC发生发展中所起到的作用, 以期为今后的动物实验研究及临床试验应用提供理论依据。
本实验研究应用CCK-8法检测了Ang II及其受体拮抗剂厄贝沙坦对人肝癌Hep G2细胞增殖的影响。结果表明不同浓度的Ang II作用于人肝癌Hep G2细胞后, 均能明显促进细胞的增殖 (图1, 图3) , 且作用呈浓度 - 时间效应。研究中我们发现, 当Ang II浓度为10-7mol/L时作用最为显著 (图2) , 与其他分组相比差异有统计学意义 (P<0. 01) , 且该作用随作用时间延长而增强, 通过绘制细胞生长及增殖曲线我们也可看出当Ang II浓度为10-7mol/L, 作用48小时时细胞增殖达最大水平。而其受体拮抗剂厄贝沙坦则显著抑制了细胞的生长, 具有明显的抗肿瘤作用 (图4) , 其与药物处理组及对照组比较差异均有显著统计学意义 (P<0. 01) 。
通过采用ELISA方法检测细胞培养上清我们发现, 当Ang II作用浓度为10- 7mol/L时, 人肝癌HepG 2细胞所分泌的b FGF蛋白浓度达最大水平 [ (28.9400±0.42438) pg/ml], 且与其他分组相比差异具有统计学意义 (P<0.01) , 而其受体阻滞剂厄贝沙坦作用组蛋白分泌最少[ (17.4933±0.55806) pg/ml], 与对照组及Ang II组相比差异显著 (P<0.01) , 以上结果与Kim等[16]的研究结果基本一致, 提示b FGF与肝癌的发生发展如此之密切可能与其过度表达能够促使细胞恶性转化并促进供应血管形成有关。肿瘤内供应血管的形成与肿瘤的发生发展有着密切的关系, 供应血管为肿瘤组织提供养分, 使之得以迅速生长, 当肿瘤生长到一定程度时, 肿瘤血管也为其远处转移提供了便捷的通路, 在此过程中b FGF起到了关键作用[17]。
本研究还通过SYBR Green实时荧光定量PCR检测了人肝癌HepG 2细胞中bF GFm RNA的表达, 研究结果显示Ang II可上调人肝癌HepG 2细胞中bF GF m RNA的转录水平, 且该作用在10-7mol/L作用48小时达最大, 而其受体阻滞剂厄贝沙坦则能显著抑制Hep G2细胞中bF GF mR NA的表达, 这提示Ang II可以从基因及蛋白水平影响肝癌细胞中b FGF的表达, 通过上调bF GF mR NA, 促进b FGF的合成, 影响肝癌组织供应血管的生成, 进而促进肝癌的发生与发展, 贯穿于肝癌病理生理的整个过程, 这也与简明等[18]的结果相一致。有研究发现人纤维化及正常肝组织的c DNA均能扩增出血管紧张素受体1 (AT1R) 的目的片段[19], 相关研究亦证实了AT1R表达于多种肿瘤组织中[20,21]。而本研究证实了AT1R阻滞剂能显著抑制Ang II的促瘤作用, 通过阻断AT1R受体阻断其效应下调b FGFmR NA的表达, 减少b FGF蛋白的合成从而发挥抗肿瘤的目的。
因此, AngI I不仅能够促进人肝癌Hep G2细胞株的生长, 还可上调促血管生成因子b FGF的表达, 促进其分泌b FGF, 间接促进血管内皮细胞增殖, 参与肿瘤血管的生成。而利用Ang II受体 (AT1R) 拮抗剂干预细胞生长因子受体基因的表达, 不仅能够直接抑制肿瘤细胞的增殖, 而且还阻碍肝癌细胞合成分泌b FGF等血管生成因子从而拮抗癌组织血管生成, 从而发挥抗肿瘤的作用。通过本研究我们进一步明确了Ang II在体内外涉及肿瘤血管生成的生物学效应, 而AT1R阻滞剂作为一种临床抗高血压药物, 应用广泛且毒副作用较弱, 应用其抑制肝癌的生长及转移具有较佳的临床应用前景, 进一步深入研究了解血管紧张素II及其受体阻滞剂与肿瘤血管生成之间的关系及其具体作用机制, 有望为HCC临床治疗提供新的思路。
摘要：目的 研究血管紧张素Ⅱ (AngI I) 对人肝癌HepG 2细胞系中碱性成纤维生长因子 (bF GF mR NA表达的影响。方法 体外培养HepG 2肝癌细胞, 以不同浓度的AngI I对细胞进行药物处理并收集处理后不同时点的细胞, 每组设3个对照组, 采用酶联免疫吸附试验 (ELISA) 及荧光定量-聚合酶链反应 (RT-PCR) 法, 分别检测AngI I处理前后HepG 2细胞中bF GF的表达, 同时应用CCK-8法检测AngI I对HepG 2细胞增殖的影响。结果 AngI I在刺激HepG 2细胞增殖同时还上调细胞中bF GF mR NA的表达 (P<0.01) , 其作用随时间及浓度的增加而增强, 当AngI I浓度为107mol/L, 时间为48小时, 这种作用达到最高值, 且此作用可被AngI I1型受体 (AT1R) 拮抗剂所阻断。结论AngI I通过诱导人肝癌细胞中bF GFmR NA的表达, 上调肝癌细胞中bF GF的含量, 从而一定程度上促进了肝癌的生长及转移。