人心肌细胞（共7篇）
人心肌细胞 篇1
摘要：干细胞是动物体各种组织器官的最初来源,具有自我更新、无限增殖与多向分化能力。诱导人胚胎干细胞分化为心肌细胞,可以为药物的发现、筛选和毒性检测,心脏组织的修复、移植与再造等提供材料。文章对人类胚胎干细胞定向分化为心肌细胞的条件、分子机理、应用及其所面临的问题等研究进展综述如下。
关键词：干细胞,胚胎干细胞,心肌细胞,定向分化,分子机制,临床应用
心血管病被称为人类健康的“三大杀手”之一,发病率逐年提高,是目前全球发病率最高的疾病。由于成年心肌细胞再生能力有限,心脏移植成为治疗慢性心力衰竭的唯一有效手段。但由于供体有限、免疫排斥、手术及术后维护价格昂贵等原因,使得心脏移植手段不能在患者中大规模实行。因此,临床上迫切需要一种更好的治疗方法。 人类胚胎干细胞( hESCs) 的研究使心脏病患者看到了希望,是近年来医学及生物研究领域的热点和前沿。目前,胚胎干细胞可以被诱导分化为心肌细胞［1］,移植到体内具有很强的扩增能力并能够行使一定的生理功能［2］,而基于细胞的心脏治疗已经进入二期和三期临床试验。人类胚胎干细胞系的建立及向心肌细胞诱导分化的研究为再生医学的临床应用提供了新的细胞来源,为hESCs分化为心脏的基因表达和功能研究奠定了基础。
1 hESCs定向分化为心肌细胞的分子机制
由hESCs诱导为心肌细胞时可通过多种途径,包括生长因子诱导分化、转基因分化、END - 2 细胞共培养等。通常以悬滴培养制备拟胚体( EBs) ,然后经过贴壁培养诱导得到具有自主节律收缩的EBs和心肌细胞,见表1。
注: 资料来源于参考文献[3]。
心肌细胞的搏起频率在不同时期存在变化,直接贴壁法诱导分化的心肌细胞在第11 ~ 15 d是细胞团出现跳动的主要时间区,平均跳动频率为( 63. 0 ±7. 0) 次/ min,持续跳动时间能维持3 个月以上［4］。对小鼠胚胎干细胞分化的研究发现,贴壁时间是影响分化的重要因素,4 d内贴壁可以显著抑制其向心肌分化,其机制可能是EBs贴壁激活了酪氨酸蛋白激酶( Src)［5］。
hESCs的分化还受离子通道、收缩反应、细胞受体、电刺激等因素协同作用。在研究周期性拉伸对心肌细胞作用时发现,钠离子电压门控通道Nav1. 5 表达上调5. 25 倍,钾离子通道Kir2. 1 则上调3. 23倍［6］。说明功能性心肌细胞的形成与离子通道和细胞收缩现象的出现密不可分。肾上腺素的刺激效应能够被其受体阻滞剂所阻断,乙酰胆碱能降低心肌细胞的搏起频率并且高浓度时能使心肌细胞停搏,因此心肌细胞的搏动频率能够被不同受体所控制［7］。此外,在一定电刺激环境下可以促进心肌细胞特异性基因HCN1、MLC2V、SCN5A、SERCA、Kv4. 3 和GATA4的表达,从而促进心肌细胞的分化和成熟［8］。
2 hESCs及来源于hESCs的心肌细胞在药物发现、筛选和毒性检测中的作用
药物开发中毒性检测是必要步骤,而对心肌细胞毒性的检测是极其重要的一个环节。人类胚胎干细胞诱导的心肌细胞( hESC - CMs) 在体外培养条件下,功能性离子通道数目增加,心肌细胞特异性基因MLC - 2a、ANF、α - MHC等表达量增加,在肌动蛋白和电生理特性上相当于幼稚型心肌细胞,能够用于药物的筛选,并且不存在伦理问题,试验周期短,成本低,容易建立体外模型。心肌药物筛选着重于对心肌细胞电生理、收缩特性及心肌损伤标志物的检测。
心肌细胞的电生理现象主要包括动作电位、离子电流、细胞耦联等。通常通过对最大舒张电位、极化速率、动作电位时程、动作电位振幅、搏动频率、去极化速率等研究来反映心肌细胞的生理状态。其中离子电流是hESC - CMs搏动的基础,任何影响离子通道的药物均可引起心律失常。如L - 型钙离子通道阻滞剂硫氮酮能够降低hESC - CMs的搏动频率甚至使其停搏［9］。hERG ( IKr) 通道在动作电位复极时起着重要作用,E - 4031 是该通道抑制剂,可以使场电位时程( FPD) 延长,降低hESC - CMs的搏动频率［10］。此外还有研究发现,某些心脏药物如奎尼定、丙胺苯丙酮可以增加搏起频率,而普鲁卡因、美西律、氟卡尼则没有类似的效用。由此可见,hESC - CMs对心率不齐药物敏感,可用来评价药物导致的心律不齐等毒性。
而对我国传统中药的研究发现,黄芩、葛根、丹参、银杏等中药的有效成分黄酮苷可以改善小鼠心脑血管系统,促进hESC - CMs的形成; 人参、三七等中药的有效成分皂苷可以抗心肌缺血,促进心肌局部糖皮质激素的分泌,从而诱导胚胎干细胞分化为心肌样细胞［11］。因此,由我国传统中药提取的有效成分可以作为现在流行西药的发展和补充。
3 hESCs及其诱导的心肌细胞在再生医学研究中的应用
hESCs具有分化的全能性,在体外可以被诱导分化为多种类型的心脏细胞,包括心室肌、心房肌、结细胞及浦肯野细胞,因此hESCs在心肌修复及心肌再生方面有重要应用价值。基于hESCs、hESCs源性心肌细胞的细胞治疗及体外构建三维组织,经组织移植进行心肌的修复与再生。细胞移植受到普遍关注,如在心肌梗死动物模型中,患心肌梗死的猪在第14 天通过胸腔镜引导注射hMSCs至梗死边缘区,进行心脏梗死面积和血流动力等方面的观测研究,结果一段时间后心梗面积减少,心脏收缩和舒张恢复良好［12］。心肌组织移植是将hESCs与具有良好的生物相容性和一定生物力学特性的支架材料复合,在体外或者体内构建出可供移植的组织物。因此,得到良好的支架材料是其应用的重点,而腹膜高度血管化,经适当处理后得到的大网膜可以作为心肌细胞的支架,其保留的血管网、黏附分子及糖胺聚糖有利于心肌细胞血管网的重建。最近研究发现,将新生大鼠的心肌细胞接种到经过低渗、冷冻、解冻、脱水、脱脂、水化等步骤处理的猪大网膜基质上,在第3 天进行肌钙蛋白和胶原蛋白双染色,其共聚焦图像能够发现细胞和基质已经存在相互作用,第7 天发现组织细胞存在收缩能力,并且细胞与支架之间的间隙被逐渐填补［13］。不管对于细胞移植还是心肌组织移植,它们在试验中的良好表现均预示了其在将来临床应用中具有美好的前景。
4 hESCs及其诱导的心肌细胞在应用过程中所面临的问题
心肌修复与再生的最基本目的是替代失去生理功能的心肌细胞,实现其输血功能的恢复,因此心肌的修复与再生要求其具有自动节律性及电生理传导功能,实现血管再生并且能够满足机体新陈代谢的需要,但研究发现,就心肌细胞修复与再生来说,单纯的细胞修复存在其明显不足,细胞在注射区游走,难以局限在修复区域,细胞存活率低。对于细胞移植来说,静脉注射的效果最好,但大部分细胞最终堆积在肺部,4 h后只有不到1% 的细胞到达预定部位,此外冠状动脉与心肌细胞的直接注射也存在类似问题［14］,然而对生物材料水凝胶等研究可以得到启发［15］。组织移植的难点是如何将细胞生存的微环境、心血管系统和心肌细胞整合到统一的支架中,并将其移植到患者体内使其参与心脏的生理反应。因此,目前来看,今后的研究重点仍将是体外脉管系统的构建,种子细胞的快速大规模制备和体外培养环境的优化。此外,显微手术中血管系统的处理、组织移植后宿主的影响和调节等因素也可限制其应用。
人心肌细胞 篇2
1材料与方法
1.1 材料
人心肌细胞购于北方伟业发展有限公司, DMEM培养基、胰蛋白酶 (美国Gibco公司) , 胎牛血清 (杭州四季青) , D-2葡萄糖、MTT试剂盒 (美国Sigma公司) , 脂联素Human gAcrp (Pep rotech) , Trizol试剂 (上海生工生物工程技术服务有限公司) 。
1.2 人心肌细胞的培养及分组
HCM培养于含10%胎牛血清、5.5 mmol/L D-葡萄糖、100U/ml链霉素的DMEM培养液, 并置于含5%CO2的37°恒温培养箱中孵育, 每3～4天用0.25%胰酶消化传代, 待细胞生长成亚融合状态时。取部分细胞以1×104/ml接种于96孔细胞培养板, 待细胞贴壁后, 改用无血清DMEM培养液使细胞同步化生长24 h后, 弃上清液, 将其分为正常对照组 (5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培养液) 、高糖组 (30.0 mmol/L葡萄糖的DMEM培养液) 、脂联素组 (30.0 mmol/L+2.5 μg/mlADPN的DMEM培养液) , 以备MTT用。剩余细胞换为无血清DMEM培养液使细胞同步化生长24 h后, 将其分为正常对照组 (5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培养液) 、高糖组 (30.0 mmol/L葡萄糖的DMEM培养液) 、脂联素组 (30.0 mmol/L+2.5 μg/mlADPN的DMEM培养液) 。
1.3 MTT法测HCM增殖
每组设4个复孔, 同时设调零孔, 进行培养, 为排除营养成分消耗对试验结果产生误差于48 h更换培养液一次。培养24、48、72 h后进行MTT检测, 每孔加入5 mg/ml的MTT20 μl, 继续孵育4 h, 吸取上清, 每孔加入二甲基亚枫 (DMSO) 150 μl, 振荡10 min, 于酶标仪490nm处测吸光度 (OD值) 。
1.4 统计学方法
各实验组数据以均数±标准差
2结果
在24 h高糖组与正常组比较人心肌细胞增殖有促进作用 (P<0.05) , 而高糖组与脂联素组比较没有统计学差异 (P>0.05) 。48、72 h高糖组与正常对照组比较细胞增殖受抑制 (P<0.05) 。在加入脂联素后48、72 h脂联素组与高糖组比较细胞增殖增加, 随时间的延长细胞增殖增加明显, 有统计学差异 (P<0.01) 。 (见表1)
注:*P<0.05;#P<0.01
3讨论
糖尿病性心肌病是一种特异性的心肌病, 是糖尿病的严重慢性并发症之一, 其典型病理改变为心肌细胞肥大, 心肌间质增生及纤维化、心肌局灶性坏死、心肌血管壁增厚等。Braunwald等[3]认为糖尿病心肌病的可能原因包括胶原和终末糖基化产物修饰的细胞外基质蛋白积聚, 导致心肌的顺应性和舒张功能受损, 心肌钙调控异常, 蛋白激酶-C (PKC) 的激活, 心脏自主神经功能紊乱, 基因突变等。病程早期以心脏舒张功能异常为主, 后期收缩功能也受损, 出现心力衰竭的临床表现。其中, 心肌细胞功能受损是糖尿病心肌病发生、发展的关键。
本研究结果显示, 高糖环境下心肌细胞的增殖受到抑制, 可能是由于高糖通过葡萄糖依赖性通路选择性激活PKC, 尤其是PKC-β1.从而引起细胞信号传导异常而引起细胞凋亡和纤维化。Min等[4]通过对NF-кB途径抑制检测新生大白鼠心肌细胞中PKC/NF-кB/TNF-а、c-fos表达, 认为高血糖可以通过PKC/NF-кB/TNF-а、c-fos信号转导途径引起心肌细胞肥大。高糖还可激活p38MAKP, 直接底物磷酸化AP-1、c-myc、c-jun等, 调节基因表达[5], 促进心肌细胞肥大。
ADPN是近年发现的一种由白色脂肪组织分泌的蛋白产物, 由位于3q27的apM1基因编码, 相对分子质量约3×104, 具有244个氨基酸残基。正常情况下, ADPN的血浆浓度为5～30ug/ml, 约占总血浆蛋白量的0.01%。其是一种具有对糖尿病保护作用的蛋白质, 多项研究证明其具有抗炎、抗纤维化、抗动脉粥样硬化等多种作用。国外实验研究, Yajing[6]等对雄性小鼠心肌细胞经脂联素干预后也发现细胞死亡减少, 起到对糖尿病心肌保护作用。对多种细胞研究显示[7]:在活体内ADPN下调Bcl-2 基因的表达, 同时也可能抑制NF-Kb以及上调VEGF的转录因子的激活。但目前对糖尿病心肌病研究较少, 尤其脂联素对心肌细胞保护的机制尚不清楚, 本实验结果示加入脂联素后阻断了高糖对心肌细胞的损害, HCM增殖能力增加, 并呈时间依赖性, 提示脂联素可能通过抗炎、抗纤维化作用直接或间接起到保护心肌细胞的作用, 为临床应用脂联素治疗糖尿病心肌病提供了理论依据。
参考文献
[1] Fujioka D, Kawabata K, Saito Y, et al.Role of adiponectin receptors in endothelin-induced hypertrophy in cultured cardiomyocytes and their expression infracted heart.Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2006, 290:H2409-H2416.
[2] Liao Y, Takashima S, Maeda N, et al.Exacerbation of heart failure in adiponectin-deficient mice due to impaired regulation of AMPK and glucose metabolism. Cardiovasc Res, 2005, 67:705-713.
[3] Braunwald.Heart disease:A Textbook of Cardiovascular Medicine.6thed, 2001:2133-2150.
[4] Min W, Bin ZW, Quin ZB, et al.The signal transduction pathway of PKC/NF-kappaB/c-fos may be involved in the influence of high glucose on the cardiomyocytes of neonatal rats. Cardiovasc Diabetol, 2009, 11:8-8.
[5] Way KJ, Isshiki K, Suzuma K, et al. Expression of connective tissue growth factor is increased ininjured myocardium associated with protein kinase C beta2 activation and diabetes. Diabetes, 2002, 51 (9) :2709- 2718.
[6] Min W, Bin ZW, Quin ZB, et al.The signal transduction pathway of PKC/NF-kappaB/c-fos may be involved in the influence of high glucose on the cardiomyocytes of neonatal rats. Cardiovasc Diabetol, 2009, 11:8-8.
人心肌细胞 篇3
1材料和方法
1.1 对象
1.1.1 病例组
冠心病的诊断依据WHO标准并经PTCA、超声心动图、MR、CT等证实, 其中48例AMI (男28例, 女20例) , 年龄 (58.3±10.1) 岁。其中20例下壁梗死 (男12例, 女8例) , 28例前壁梗死 (男16例, 女12例) 。81例不稳定型心绞痛 (UAP) (男56例, 女25例) , 年龄 (61.0±7.4) 岁, I级15例, II级28例, III级38例。
1.1.2 对照组
健康查体者40例 (男30例, 女10例) , 年龄 (41.0±11.3) 岁。经病史、体检、心电图、心肌酶谱、超声心动图等检查, 除外器质性心脏病。
1.2 方法
1.2.1 样本采集
对照组体检时静脉采血1次, AMI组和UAP组分别于入院时静脉采血1次。4℃3000转/min离心分离血清, Backman-counit公司生产的Access全自动微粒与化学发生免疫分析仪, 测定血清cTnI和SF。β2 MGRIARit由北京原子原研究所提供, HS-CRP采用超敏免疫片浊法。
1.2.2 统计学方法
数据以
2结果
2.1 正常对照组与AMI、UAP患者血清HS-CRP、SF、β2
MG和cTnI的检验结果 (详见表1) 。
2.2 HS-CRP、SF、β2 MG和cTnI的特异性与AMI出现症状后3、6、9
h的敏感性 (详见表2) 。
注:与对照组比较, *P<0.01, **P<0.001
48例AMI的血清HS-CRP、SF、β2 MG和cTnI的水平较之正常对照组明显增高, 而81例UAP较之正常对照组为增高。
cTnI的特异性明显高于HS-CRP、SF、β2 MG, 而AMI出现症状后, 9 h敏感性亦明显高于HS-CRP、SF和β2 MG。
3讨论
AMI是临床常见的多发病, 如何及时正确地诊断和救治对挽救濒死心肌、改善预后、降低急性期病死率和死亡率具有重要意义。由于急性冠脉综合征 (ACS) 临床和病理生理研究的深入, 炎性反应在ACS发生发展中的作用已引起人们的关注。而HS-CRP是常见的炎性反应指标, HS-CRP水平增高与动脉样硬化形成过程密切相关。HS-CRP被视为粥样病灶不稳定的标志之一, 故能以HS-CRP评估心肌损伤的程度, 判断预后的病程变化。48例AMI和81例UAP的HS-CRP水平明显高于正常对照组 (P分别<0.001和<0.01) , 肌损伤的程度与HS-CRP的增高水平密切相关, 从而表明HS-CRP是动脉粥样硬化病变进展过程中, 反应疾病演变的一个重要标志之一, 随着AMI入院后病情逐渐平衡, 动脉粥样斑块趋于稳定, HS-CRP水平逐渐下降[1]。
冠心病 (CHD) 是指冠状动脉样硬化 (AS) 引起的管腔狭窄和阻塞所致的病变, Sullivan认为:铁催化LDL的氧化是斑块形成的主要原因, 氧化的LDL引发巨噬细胞, 将脂质大量内吞, 产生泡沫细胞, 在血管内皮下, 聚集形成斑块, 引起血管损伤。这一假说被大量的研究证实。48例AMI, SF明显增高 (P<0.001) , 而81例UAP, SF增高 (P<0.01) 。SF水平较低者, AS进展缓慢, SF持续高水平者AS进展较快, 说明CHD的发生、发展过程中, SF和LDL起着协调促进作用[2]。
β2 MG在AMI发病机制中的作用可能是与其他大分子物质形成复合物, 循环中的β2 MG-IgG复合物易被某些器官, 如心脏 (包括心内膜) 所截留, 为心脏的局部病变提供了重要基础, 最终使冠状动脉痉挛, 导致心肌缺血、梗死。由于β2 MG对心肌的损害, 可使心肌变性成为自身免疫损害, 使心肌的损伤进一步加重。所以, 81例UAP血清β2 MG为 (4.83±1.57) μg/L, 明显高于正常对照组 (P<0.01) , 而48例MAI血清β2 MG为6.01±1.83 μg/L, 增高更明显 (P<0.001) 。随访中发现AMI和UAP血清β2 MG水平>5.2 μg/L, 再次发生心肌梗死;<5.2 μg/L的AMI和UAP治疗明显好转, 无1例发生梗死。总之, 血清β2 MG水平增高导致血管内膜损伤, 血小板聚集和血管痉挛, 三者的相互作用导致心肌梗死。
cTnI是一种特异心肌收缩调节蛋白, 位于心肌纤维蛋白中, 在心肌细胞膜完整的情况下, 不能透过膜进入循环, 所以正常人血清cTnI水平很低。40例正常对照血清cTnI为 (0.011±0.006) ng/ml, 心肌细胞早期损伤时, 游离于膜浆内的cTnI快速释放入血循环, 血清cTnI水平于3～5 h增高, 肌原纤维不断崩解破坏, 以固定形式存在的cTnI不断释出, 血清水平于24 h达高峰, 5～10 d后降至正常。48例AMI血清cTnI为 (0.090±0.028) ng/ml (P<0.001) , 而81例UAP血清cTnI为 (0.058±0.012) ng/ml (P<0.01) 。AMI是心肌的急性缺血性坏死, 在冠状动脉病变的基础上, 发生冠状动脉供血急剧减少或中断, 使相应的心肌严重而持久地急性缺血所致, 病理表现为心肌细胞凝固性坏死、嗜酸性增强, 出现肌浆凝聚和肌原纤维溶解[3]。
从表2说明, AMI时HS-CRP、SF、β2 MG和cTnI的特异性分别为55.8%、50.4%、61.3%和98.2%, 以cTnI为最高;而敏感性虽然HS-CRP、SF、β2 MG和cTnI随AMI持续而增高, 但以cTnI为最高。因此, 笔者认为:血清cTnI不愧是MAI诊断和治疗、随访的新方法, 应以推广。
摘要：目的研究心肌细胞损伤标志物与急性心肌梗死的关系。方法检测并分析急性心肌梗死 (AMI) 患者血清心肌细胞损伤标志物HS-CRP、SF、β2MG和cTnI水平改变。结果①AMI患者血清HS-CRP、SF、β2MG和cTnI水平较正常对照组明显增高, UAP患者血清HS-CRP、SF、β2MG和cTnI水平较正常对照组增高;②血清CTnI水平诊断AMI的特异性明显高于HS-CRP、SF、β2MG, AMI出现症状后9h血清cTnI诊断敏感性明显高于HS-CRP、SF和β2MG。结论AMI患者血清HS-CRP、SF、β2mg和cTnI水平升高, 血清cTnI水平是AMI诊断和随访较好指标。
关键词：急性心肌梗死,心肌细胞损伤标志物,肌钙蛋白I
参考文献
[1]Braunwald E, Antman EM, BeasleyJW, etal.ACC/AHAguide-lines for the management of patients with unstable angina and non-st-segement elevation myocardial infarction a report of American College of Cardiology/American Heart Association task force or parcitce guideline.J Am Coll Cariol, 2000, 36 (3) :970.
[2]肖创清, 何云南.血清铁蛋白放射免疫分析的临床应用价值.放射免疫学杂志, 2005, 18 (1) :60.
人心肌细胞 篇4
1 骨髓间充质干细胞 (MSCs)
MSCs是存在于骨髓中的非造血干细胞, 是中胚层发育的早期细胞, 具有多向分化潜能, 不仅能分化为造血实质, 支持造血, 还可分化为多种造血以外的组织细胞, 特别是中胚层和神经外胚层来源的组织细胞。在实验条件控制下能分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、肝细胞、内皮细胞、骨骼肌细胞和心肌细胞[1,2]。
2 MSCs的分离方法
2.1 贴壁筛选法
抽取骨髓后直接加入培养基, 制成细胞悬液, 以合适的细胞浓度接种培养。培养在早期可混杂多种细胞, 红细胞由于不贴壁随着换液不断被清除;混杂的巨噬细胞、造血细胞、脂肪细胞等可以在传代时利用其与培养介质贴附牢固而MSCs在消化酶的作用下较快与培养皿分离的特点进行纯化。此法虽相对粗糙, 但操作简便, 分离到的细胞分化潜能较好。
2.2 梯度离心法[3]
根据骨髓中细胞成分比重的不同, 分离含有MSCs的单个核细胞群, 再在塑料培养瓶中贴壁培养。但是, 不同密度的分离液比重的微小差别可能筛选不同的细胞群, 对MSCs的纯度影响亦较大。Manas等[4]比较Percoll和Ficoll分离的骨髓标本, 结果表明在外观上Percoll分离者形态均匀, CD14/CD34/CD45均阴性, Ficoll分离者CD34阴性、而CD14/CD45均阳性。国内也有研究发现, 用Ficoll (1.077 g/m L) 分离人骨髓后, 相当部分细胞呈现CD44-/HLA-DR+, 表明有成纤维细胞混入到单核细胞中;而用Percoll (1.073 g/m L) 分离, 细胞较为均一, 具有独特的表型及化学特征[5]。
2.3 免疫或流式细胞分离法
通过MSCs表面带有或缺失的抗原成分进行正选或负选, 从而获得相对较纯的MSCs。有研究用CD105包被免疫磁珠, 经双抗体程序 (DAP) 和单抗体程序 (SAP) 分别分选人CD105+MSCs, 表明SA法分选效率较高[6]。Kopen等[7]用免疫磁珠分选小鼠CD11b+MSCs, 亦获得较高的分选效率。Orilic等[8]用免疫磁珠结合流式细胞仪, 从骨髓分选Linc-kit+细胞获得更高的效率和专一性, 但分选过程中的机械剪切力和高能激光可能对MSCs有一定损伤。Vlasselaer等[9]发现经流式细胞仪分离到的Sca-1阳性MSCs, 培养过程中大多数不贴壁, 并在24 h内死亡, 且成骨分化活性很低。
3 将MSCs诱导分化为心肌细胞的方法
3.1 化学试剂诱导
Makino等[10]在体外实验中利用5-氮胞苷将永生型骨髓间充质干细胞诱导分化为成心肌细胞系细胞。发现当用3 mol/L的5-氮胞苷诱导细胞24 h后, 即可在显微镜下观察到能够自发性跳动的细胞亚克隆, 这些亚克隆被命名为成心肌细胞系细胞。国内学者多数认为10 mol/L 5-氮胞苷诱导分化的阳性率最高。此外, Shim等[11]利用含有抗坏血酸、胰岛素和地塞米松的培养基培养骨髓间充质干细胞5～6代后, 亦将骨髓间充质干细胞诱导分化为心肌样细胞。
3.2 体外微环境培养
3.2.1心肌细胞培养液:
龚觉晓等[12]将新生1～3 d内的SD大鼠乳鼠用胰蛋白酶解法将心室肌消化成细胞悬液, 差速离心分离出心肌细胞培养液成功诱导MSCs分化成为心肌样细胞,
3.2.2心肌细胞裂解液:
吕学翔等[13]将生长较好的第1、2代心肌细胞制成106/m L的细胞悬液, 迅速置于-70℃冰箱中, 4～5 h后取出融化, 用吸管反复吹打细胞悬液, 如此反复3次后将细胞裂解液在2 000 r/min的条件下离心10 min, 将上清用0.45μm的滤器过滤后在其内成功诱导MSCs分化成为心肌样细胞。
3.3 心肌细胞培养液与化学诱导剂相结合
Cheng等[14]将人心肌细胞条件培养基与普通的细胞生长培养基按一定比例配制成心肌细胞分化诱导培养基。在利用心肌细胞分化诱导培养基开始对脐带血中的MSCs进行诱导分化培养时, 同时给予10μmol/L的5-氮胞苷进行诱导24 h, 结果14 d后, MSCs分化为心肌细胞的比例较上述几种办法明显增高, 转化率高达70%左右。
4 诱导后MSCs的细胞形态学变化及心肌特性检测
4.1 形态学变化
MSCs诱导分化培养基刺激孵育24 h, 一般从第3 d开始, 可见MSCs的自我修饰现象, 即细胞的伪足渐渐回缩, MSCs由螃蟹样的多伪足形态逐渐转变为橘子样形态。随着诱导时间的延长, 逐渐转变为纺锤形、梭形的心肌纤维样细胞。
4.2 免疫组化检测
用免疫组化方法检测心肌的一些特异性蛋白, 如横纹肌肌动蛋白, 是分布于肌节Z线处的细胞骨架蛋白, 主要存在于胚胎及新生动物心肌中, 具有收缩功能, 分布广泛;c Tn T是心肌特异性肌钙蛋白T, 是心肌细胞中一种调节蛋白, 在钙离子参与下调节、控制收缩蛋白的舒缩活动。此外细胞心肌特异性结构蛋白还有Troponin-T、Connexin 43, 心钠素 (Atrial Natriuretie Peptide, ANP) 、脑钠素 (Brain Natriuretie Peptide, BNP) 等。
4.3 RT-PCR检测
主要是检测一些心肌特异性基因的表达情况, 如ANP基因、BNP基因、p-MHC基因、a-心肌肌动蛋白基因和a-骨骼肌肌动蛋白基因等, 以及GATA4、TEF-1和Nkx 2.5/Csx等心肌特异性转录因子。
人心肌细胞 篇5
1材料与方法
1.1实验材料SD大鼠(180g~200g)购自上海莱斯克动物有限公司;Bax一抗购自美国Abcam公司; HRP-羊抗鼠二抗购自santa cruz公司;脂质体和Tri- ozol购自Invitrogen公司;SYBR Green通用型qPCR Master Mix购自罗氏生物;Real-time PCR扩增仪购自Applied Biosystems;逆转率试剂盒购自TAKARA公司;经修饰的Bax-siRNA由吉玛生物合成;;TUN- NEL试剂盒购自罗氏生物;TTC染液购自南京森贝伽生物科技有限公司。
1.2急性心肌梗死大鼠模型构建及治疗45只大鼠随机分为假手术组、心梗组和Bax干扰组。所有大鼠采用10%的水合氯醛麻醉,固定大鼠并打开胸腔,假手术组不做左冠状动脉前降支结扎。心梗组和Bax干扰组大鼠开胸后行左冠状动脉前降支结扎术。模型构建成功标志为:大鼠左心室前壁苍白,多导生理记录仪显示大鼠心电标准 Ⅱ 导联,ST段抬高和(或)T波抬高。手术结束后所有大鼠关闭胸腔,手术切口注射青霉素抗感染。假手术组和心梗组在术前12h心肌组织内注射100μL脂质体,Bax干扰组大鼠术前心肌注射脂质体与Bax siRNA的混合物100μL。术后72h处死大鼠,取心肌组织进行指标分析。
1.3大鼠心肌组织Bax mRNA表达水平变化大鼠心肌组织0.1g加入1 mL riozol中匀浆,然后加入2 0 0μL三氯甲烷振荡混匀,冰上静置分层,1 2 0 0 0 r/min离心15min,上清加入等体积的异丙醇中,冰上放置30min使RNA沉淀,然后12 000r/min离心15 min,弃上清,沉淀部分用预冷的75%乙醇溶液洗涤2次,8 000r/min离心10min,沉淀用DEPC水处理的双蒸水溶液中。 分光光度仪测量RNA浓度采用TAKARA逆转录试剂转录成cDNA。
设计大鼠Bax的PCR引物,引物序列如下:Bax- F:5′-GGCGATGAACTGGACAAC-3′;Bax -R:5′- CCGAAGTAGGAAAGGAGGC-3′。引物由上海英俊生物公司合成。对引物特异性和退火温度进行优化。 然后按照下述反应体系制备反应混合物:2×SYBR Green通用型qPCR Master Mix 10μL,上游/下游引物各(10μmmol/L)各1μL,cDNA 1μL,补双蒸水至终体积为20μL。根据检测样本的数量配制相应的体积,对应加入PCR板中,每孔20μL。1 500r/min离心将反应混合物甩至管底,根据下列反应条件进行PCR:预变性:95 ℃,30s;变性:95 ℃,3s;退火延伸: 60 ℃,30s;构建溶解曲线。 最后从实时荧光定量PCR仪上直接读取数据。
1.4大鼠心肌组织Bax蛋白质表达水平变化大鼠心肌组织取出后用10%甲醛固定,石蜡包埋,切片,经抗原修复后,切片用3%过氧化氢-甲醇液室温处理20 min,清除内源性的过氧化氢酶,PBST洗涤3次,每次5min。用10%山羊血清37℃封闭30min,然后滴加一抗工作液4 ℃孵育过夜;次日37 ℃回温30min后用PBST洗涤3次,每次5min;在切片上滴加二抗工作液37℃孵育30 min,然后PBST洗涤3次,每次5 min;DAB显色,苏木精复染,盐酸酒精返蓝。然后梯度脱水,中性胶封片。评定方法:每张切片随机选取10个视野,放大400倍,采用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统对免疫组化进行半定量分析。
1.5大鼠心肌组织梗死范围分析大鼠心肌组织切成厚度2mm的薄片,置于1%的TTC磷酸缓冲液中37 ℃染色20min。理论上正常组织应该为红色,梗死组织为白色。然后再显微镜下将梗死组织与正常心肌组织分开,用分析天平称取正常组织和梗死组织的湿重,梗死范围为梗死组织重量占左心室总质量的百分数。
1.6大鼠心肌细胞凋亡指数心肌组织切片经抗原修复脱蜡后,PBST洗涤3次,每次5min。此后步骤严格按照TUNEL试剂盒操作说明进行操作。观察时标本放大400倍,随机选取梗死区和周边区域10个视野,计算凋亡细胞占总细胞的比例作为心肌细胞的凋亡指数。
1.7统计学处理采用SPSS 17.0统计学软件分析, 计量资料以均数±标准差(x±s)表示,多组计量资料采用方差分析,组间两两比较采用LSD法。P<0.05表示差异有统计学意义。
2结果
2.1大鼠心肌组织Bax mRNA和蛋白质水平变化(见图1) 与假手术组比较,心梗组和Bax干扰组大鼠心肌组织中Bax mRNA和蛋白质水平明显升高(P<0.05)。Bax干扰组大鼠心肌组织中Bax mRNA和蛋白质水平较心梗组明显下降(P<0.05)。
2.2大鼠心肌组织梗死范围比较(见图2) 采用TTC染色法分析了大鼠心肌梗死模型不同处理后大鼠心肌组织梗死范围变化,心梗组和Bax干扰组大鼠心肌组织梗死范围较假手术组明显增加(P<0.05)。 而Bax干扰组大鼠心肌组织梗死范围较心梗组明显下降(P<0.05)。
2.3大鼠心肌细胞凋亡指数比较大鼠心肌细胞的凋亡主要存在于梗死边缘,而远离梗死区细胞凋亡水平较低。假手术组大鼠心肌凋亡指数仅为(3.54± 1.02)%,而心梗组和Bax干扰组大鼠心肌细胞的凋亡指数分别为(51.32±7.02)%和(20.45±6.77)%。心梗组和Bax干扰组心肌细胞凋亡指数明显高于假手术组(P<0.05)。Bax干扰组大鼠心肌细胞凋亡指数明显低于心梗阻(P<0.05)。
3讨论
急性心肌梗死发生后除了心肌坏死外,心肌细胞凋亡也是急性心肌梗死后心肌发生的另一重要的生物学过程,急性心肌梗死后心肌细胞凋亡主要位于缺血坏死边缘,而远离梗死区心肌细胞凋亡较少［８］。这一结果与本研究相一致。心肌细胞凋亡可导致心肌细胞的大量丢失,进一步增加心肌损伤,促进了疾病的发展。因此有效的降低心肌细胞凋亡对降低急性心肌梗死患者疾病进展,争取更多的治疗时间有着重要的意义。细胞凋亡是一个高度调控的过程,此过程受到诸多的细胞因子和调节蛋白的参与,其中Bax蛋白是细胞凋亡途径中重要的分子。Bax蛋白是Bcl-2家族成员之一,其与Bcl-2的比例直接决定着细胞的命运。 近年来,临床研究显示在急性心肌梗死后数小时内,心肌组织中的Bcl-2表达量会有一定程度的增加,其可抑制心肌细胞的凋亡,起到保护心脏的作用,但是这种高表达只能短暂的,在疾病进展数小时后,心肌细胞中Bcl-2蛋白很快消失,继而出现Bax蛋白的高表达, Bax蛋白高表达使细胞命运趋于凋亡,其可通过与Bcl-2形成异源二聚体或者自身形成同源二聚体,介导细胞的凋亡,在急性心肌梗死组织中则而表现出心肌细胞大范围凋亡［９，１０］。因此有效的预防急性心肌梗死患者心肌组织中Bax蛋白的高水平表达可能对急性心肌梗死患者心肌组织具有一定的保护作用。RNA干扰技术是利用双链RNA高效、特异性降解细胞内同源信使RNA,从而阻断特定基因表达,使细胞出现靶基因缺失的表型方法［１１，１２］。
本研究采用RNA干扰技术沉默了急性心肌梗死大鼠心肌组织中的Bax,分析其在急性心肌梗死大鼠心肌保护中的作用。
本研究设计的并经特殊修饰的Bax siRNA可在体内起到抑制Bax表达的作用,结果显示,在经Bax siRNA处理后大鼠心肌组织中Bax mRNA和蛋白质水平较心梗组明显下降。实验进一步分析了Bax沉默对急性心肌梗死大鼠心肌梗死范围的影响,显示经Bax siRNA处理的大鼠心肌梗死范围较心梗组大鼠明显下降,但是仍然高于假手术组,提示Bax沉默可降低急性心肌梗死大鼠心肌梗死范围,起到保护心肌功能的作用。在心肌细胞凋亡方面,Bax siRNA明显降低了急性心肌梗死大鼠心肌细胞的凋亡,与心梗组比较具有统计学意义。Bax基因沉默可显著降低急性心肌梗死大鼠心肌组织的梗死范围,同时降低心肌细胞的凋亡指数,对心脏功能具有一定的保护作用。
摘要：目的 探讨RNA干扰Bax对急性心肌梗死大鼠心肌细胞的保护作用。方法 采将45只大鼠随机分为假手术组、心梗组和Bax干扰组,采用结扎左冠状动脉前降支建立急性梗死大鼠模型,术后假手术组和心梗组心肌内注射脂质体,Bax干扰组心肌注射脂质体与Bax siRNA的混合物。治疗后72h处死大鼠,取心肌组织,采用荧光定量PCR和免疫组化分析心肌组织中Bax mRNA和蛋白质水平,采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑染色法测定心肌梗死范围,并用TUNEL染色法分析心肌细胞凋亡指数。结果 与假手术组比较,心梗组大鼠Bax mRNA和蛋白质明显增加(P<0.05)。与心梗组比较,Bax干扰组大鼠Bax mRNA和蛋白质水平明显下降(P<0.05)。与假手术组比较,心梗组和Bax干扰组心肌梗死范围明显增加(P<0.05)。与心梗组比较,Bax干扰组大鼠心肌梗死范围明显下降(P<0.05)。与假手术组比较,心梗组和Bax干扰组大鼠心肌细胞的凋亡指数明显增加(P<0.05)。与心梗组比较,Bax干扰组大鼠心肌细胞凋亡指数明显下降(P<0.05)。结论 Bax基因在大鼠心肌梗死模型心肌组织中的沉默可明显降低心肌梗死范围,降低心肌细胞的凋亡,对心肌具有很好的保护作用。
人心肌细胞 篇6
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
FACS Calibur型流式细胞仪(美国Becton-DickinSon公司)。清洁级SD24h新生乳鼠。RPMI1640液体培养基和胎牛血清,购于Hyclone公司;Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(购于美国BD公司);二甲基亚砜(DMSO购于美国GIBCO公司)溶液10μL/mL储备液;西洋参茎叶总皂苷(解放军总医院病理生理室王琛博士惠赠)。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养
无菌操作取出大鼠心脏,立即在无菌D-Hanks液中洗去残血,分离出附着组织,剪成约1 mm3大小碎块,经反复D-Hanks液洗涤、0.15%胰蛋白酶消化,差速贴壁法,制备成心肌细胞悬液,最后用15%胎牛血清的DMEM培养液稀释成细胞密度为3×105/mL,接种于25 mL培养瓶中,放入37℃、5%CO2孵育箱内进行原代培养。
1.2.2 心肌细胞缺氧/复氧模型
按Li等[6]将心肌细胞置于缺氧仓内,通入95%N2-5%CO2混合气,缺氧4h小时后放回CO2孵箱37℃,常规培养12h后检测。
1.2.3 心肌细胞分组及诱导凋亡
将培养细胞心肌细胞分为正常组、缺氧/复氧损伤组、缺氧/复氧加西洋参茎叶总皂甘诱导的乳鼠心肌细胞组(西洋参茎叶总皂甘剂量:40 mg/L,80mg/L,160mg/L)用培养液将细胞稀释为106/mL,混匀后放入37℃,5%CO2的孵箱继续培养24h后分别检测。
1.2.4 流式细胞检测
采用FACS Calibur型分析流式细胞仪,用CELL Quest获取和分析数据。488nm激发光源,先将对照管上样,通过调整参数FAS和SSC,在散色光点图(FSC/SSC)中清楚显示出一个清晰、集中的细胞群体。在获取细胞前,根据FAS/SSC的特点,设定阈值,避免碎片和噪声干扰,确定电压及放大器数值后,再以门中细胞进行设门(gate),使门中细胞占95%以上,收集10000个门内细胞。以门中细胞进行后续荧光信号检测,将对照组细胞的荧光强度设定为非特异性本底荧光,并在此基础上确定阳性荧光表达率。调定流式细胞仪,FL1荧光通道检测Annexin V的荧光强度,FL2荧光通道检测PI的荧光强度。分别将设定阴性对照管使荧光散点图中细胞集中在左下(LL)象限,保持FL1、FL2电压不变。上样调整仪器荧光补偿值,进行校正后,即可分析样本,每个样本均获取10000个细胞,数据以List Mode的形式储存,采用CellQest功能软件进行分析。
2 实验结果
2.1 流式细胞仪检测不同剂量西洋参茎叶总皂甘诱导内质网应激心肌细胞凋亡
将培养乳鼠细胞上流式细胞仪检测。从Annexine V-FITC/PI荧光双参数点图观察到(见图1)对照组细胞主要分布在左下象限,为非凋亡细胞活细胞,右下象限为少量凋亡细胞。损伤组右下象限出现大量凋亡细胞及死亡细胞。增加随着西洋参茎叶总皂甘剂量增加,死亡细胞显著减少,凋亡细胞相对减少(见图1)。
2.2 西洋参茎叶总皂甘诱导内质网应激心肌细胞凋亡变化
正常对照组细胞生长状态良好,细胞凋亡率3.34±0.78%,损伤组缺氧/复氧损伤组细胞凋亡率38.53±6.15%。根据剂量40mg/L,80mg/L,160mg/L的西洋参茎叶总皂甘诱导细胞凋亡分别是19.65±4.77%,15.32±3.24%,12.64±2.23%(见图2)。结果表明:随着剂量增加大剂量西洋参茎叶总皂甘可明显降低凋亡,与以往文献报道一致[7](p<0.01)。
3 讨论
细胞凋亡又称细胞程序性死亡(PCD)是指细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自身的程序,自己结束生命的过程,它是一个主动的、高度有序的基因调控过程[8]。随着对细胞凋亡的深入研究,除两条经典死亡受体活化和线粒体损伤介导的传导通路细胞凋亡,近来研究发现过度内质网应激可启动一条新的细胞凋亡信号传导通路[9],内质网功能紊乱将导致细胞Ca2+失衡以及错误折叠和未折叠蛋白在内质网腔内聚集,从而导致内质网应激[10,11,12]。内质网应激可特异性激活Caspase-12.Caspase-3等下游效应蛋白酶,它不同于前两条经典途径,短期的内质网应激有保护细胞作用,但长期的内质网应激将激活一些凋亡信号分子如Chop、JNK、Caspases,可引起细胞凋亡[13]。因此有关细胞凋亡的检测方法也得到广泛发展,流式细胞仪自20世纪70年代后开始应用,细胞凋亡检测从细胞核到细胞膜,从单一色到多色,根据细胞光散射性质结合特异性荧光,细胞发生凋亡时出现特异性变化。在许多细胞凋亡早期会出现胞质内Ca2+浓度迅速持续升高[14]。Annexin V是一种分子量为35-36KD的Ca+依赖性磷脂结合蛋白,在细胞凋亡早期细胞膜磷脂酸丝氨酸外翻细胞膜外表面[15]可与标志的Annexin V-FITC结合[16],利用这一特性可以检测细胞凋亡[17]。但此时细胞膜是完整的而检测核DNA的PI不能进入细胞核。应用流式细胞仪将细胞分为4个亚群区分正常组细胞、早期凋亡细胞和晚期凋亡及死亡细胞比率。本研究采用Raynal P等[18]建立双标记的流式细胞术结合Annexin-FITC/PI荧光染色进行西洋参茎叶总皂甘通过抑制过度内质网应急减轻大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤结果与报道一致[19]。高剂量西洋参茎叶总皂甘降低在缺氧/复氧后心肌细胞凋亡率,应用流式细胞仪检测西洋参茎叶总皂甘通过抑制过度内质网应急降低细胞凋亡具有快速、准确、信息量大的特点。为深入发展研究细胞凋亡机制,提供更加直观、敏锐的方法。
摘要：利用流式细胞仪观察西洋参茎叶总皂甘通诱导大鼠心肌细胞后内质网应急引起细胞凋亡。选用原代培养心肌细胞,将心肌细胞分为正常细胞对照组,缺氧/复氧组和缺氧/复氧后加入西洋参茎叶总皂苷组。按照40mg/L,80mg/L,160mg/L浓度培养24h后,应用流式细胞仪采用Annexin-V/PI诱导凋亡。结果显示应用流式细胞仪检测最终浓度为160mg/L西洋参茎叶总皂苷凋亡率明显低于缺氧/复氧组。流式细胞仪检测由内质网应急诱导细胞凋亡对研究细胞凋亡的机理提供一种快速、准确检测方法。
人心肌细胞 篇7
1 材料与方法
1.1 中药川芎含药血清的制备
选取健康未交配过的SD雄鼠30只[许可证编号:syxk (粤) 2013-0085, 广州中医药大学实验动物中心], 个体质量 (200±10) g, 适应性饲养3 d后进行实验。将其随机分为空白对照组、低剂量组及高剂量组, 每组10只。给予大白鼠川芎水煎液灌胃 (取一定量川芎饮片置容器中, 加水没过药面, 浸泡30 min后, 煎煮3次, 60 min/次, 合并水煎液, 过滤, 浓缩至含生药1 g/m L备用) , 低剂量组的剂量约为正常用量 (0.8 g/kg) 的5倍, 为4 g/kg, 2次/d, 连续3 d;而高剂量组则为正常用量的30倍, 为24 g/kg, 2次/d, 连续3 d, 空白对照组灌生理盐水 (4 m L/kg) 。人与大鼠动物等效剂量系数由《实验动物学》可知为6.3。每次给药10 min后, 对其进行取血, 将血液静置2 h后离心 (离心条件:3000 r/min, 离心10 min) , 离心后取上清液56℃加热30 min, 过滤, 保存于-20℃。体外含药血清按20%计算[7,8,9,10]。
1.2 胚胎干细胞培养
1.2.1 来源与试剂
小鼠胚胎干细胞选自中科院生化细胞研究所[11,12];DMEM高糖培养基、胎牛血清 (FBS) 、胰蛋白酶、明胶、β-巯基乙醇 (β-ME) 、丝裂霉素C、非必需氨基酸 (NEAA) 购自美国GIBCO公司, 白血病抑制因子 (LIF) 购自法国Millipore公司。
1.2.2 胚胎干细胞培养与诱导分化
将冻存在液氮罐中的胚胎干细胞取出, 于37℃水浴锅中迅速融化, 将细胞立即转移至10 m L的ep管中, 加入适量的培养基, 采用300 rcf, 10 min离心, 去除上清液, 加入1 m L培养基吹打, 转移细胞并进行培养, 当细胞生长至70%左右时, 对细胞进行传代。培养液分四组, 即:川芎血清低剂量组、川芎血清高剂量组、大鼠血清组、胎牛血清组, 将收集到的川芎含药血清和大鼠血清、胎牛血清, 配制成10 m L备用, 各组培养液终浓度为20%。 (1) 悬滴培养:ES细胞中加入20%川芎含药血清 (低剂量组和高剂量组) 的分化培养液, 将细胞密度设置为3.75×104/m L。细胞培养在6 cm培养皿中, 取1.6 m L细胞置于10 cm的培养皿内盖上, 将内盖翻转使其生长, 加入5 m L PBS, 孵育1 h。 (2) 悬浮培养:细胞孵育后对细胞进行观察, 控制细胞悬滴液中细胞个数为1, 第2天于倒置显微镜下观察, 每个悬滴内均含有1个, 吸去PBS, 加入分化培养基, 移至6 cm中培养, 孵育2 h。 (3) 贴壁培养:细胞培养2 d后, 观察细胞个数, 大约为10个, 接种至4孔板, 第3天时肉眼观察每个培养皿中均可见数十个EBs。分别接种至事先用明胶包被的24孔板内, 每孔中加入2 m L分化培养液。
1.3 实时定量PCR检测心肌细胞特异基因β-MHC的表达
实验细胞分四组, 即川芎血清低剂量组, 川芎血清高剂量组, 大鼠血清组和胎牛血清组, 每组6孔。提取总RNA并测定浓度, 分析其完整性, 进而合成c DNA, β-MHC Forward:5’-AGAGCTCATCCTTTCTGGTCAT-3’, Reverse:5’-ACCATCTGACATTCTACAGTCT-3’;GAPDH Forward:5’-ATGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3’Reverse:5’-ATGCCTGCTTCACCACCTTCT-3’[4,5]。PCR体系为:12.5μL SYBR Green Realtime PCR Master Mix, 2.5μL样品溶液, 1.0μL引物加水至25μL。反应条件:95℃下加热60 s, 进行预变性;95℃变性15 s, 60℃退火15 s, 72℃延伸30 s, 如此循环40次。扩增后的产物主要是采用荧光检测, 用ABI 7500 Software v2.0软件对其进行分析, 绘制曲线表, 计算Ct值, 对系统数据处理后可以得出不同浓度对于细胞分化的影响。
1.4 统计学处理
使用SPSS 22.0软件对所得数据进行统计学分析, 计量资料以表示, 比较采用t检验;计数资料以率 (%) 表示, 比较采用字2检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 川芎诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞的分化
细胞培养2 d后呈密集状态, 一般为圆形, 细胞界限和形态不明显 (图1) ;体外细胞个头小, 但生长速度快 (图1~2) 。川芎分化液培养3 d的胚胎干细胞会收缩配体, 导致培养时间增加, 收缩越明显, 则时间越长。自发节律性收缩区域较大, 且细胞形态较单一 (图3~4) 。于细胞培养的第3 d可见零星EB球发生自发性节律性跳动, 5 d时约有70%的EB球出现节律性跳动, 低、高剂量川芎血清组 (图3~4) EB球发生自发性节律性跳动的细胞数量明显多于胎牛血清 (图1) 和大鼠血清组 (图2) 。
2.2 实时定量PCR检测心肌细胞特异基因β-MHC的表达
川芎低、高剂量含药血清组β-MHC表达量均明显高于胎牛血清组和大鼠血清组, 比较差异均有统计学意义 (P<0.05) ;川芎低剂量组β-MHC分化率明显高于高剂量组, 比较差异有统计学意义 (P<0.05) , 见表1。
* 与胎牛血清组和大鼠血清组比较，P<0.05；△与川芎高剂量组比较，P<0.05
3 讨论
随着人们生活水平的进步, 大部分人均处于亚健康状态, 心血管疾病是临床上常见的疾病。心血管疾病的临床突破主要来自胚胎干细胞的发展, 胚胎干细胞会根据诱导自发分化成多种细胞, 如心肌细胞和血管内皮细胞等[13,14,15]。心肌细胞对于恢复正常供血、免疫功能均有重要的意义[16,17]。一般情况下, 胚胎干细胞能够自然分化, 但分化率低, 因此提高分化率显得至关重要。临床上对于胚胎干细胞的研究较为广泛, 但是研究方向各不相同, 关于中药的研究更是凤毛麟角, 因为涉及人体、细胞、动物等各个方面, 给研究工作带来了一定的困难, 但也有部分学者取得了可喜的成果[18,19]。有研究方向为将细胞采用不同密度制成悬浮液, 采用不同的方法和改变环境进行培养, 分析其分化成心肌细胞的分化率。最后对具有促进分化功能的中药进行相关的安全性评价, 致力应用于临床。川芎是伞形科藁本属植物, 经研究表明, 其具有多种临床功效, 如使血管扩张、增加脑部血流量、改善供血、降低血液黏稠度及改善心肌缺血[20]。本课题组在研究川芎含药血清的胚胎毒性时发现川芎含药血清对胚胎干细胞转化为心肌细胞有促进作用 (P<0.05) , 而且尤以低剂量组为明显, 遂建立川芎诱导胚胎干细胞向心肌细胞分化方法, 可以提高胚胎干细胞的分化率, 有利于体外获得相关的大量心肌细胞, 将其应用于临床研究以及药物的研发和筛选。
摘要：目的:探讨川芎含药血清诱导小鼠胚胎干细胞 (ES) 分化为心肌细胞的特征, 建立简便、高效的定向诱导ES细胞向心肌细胞分化的体系。方法:观察川芎含药血清作用下ES细胞活性, 诱导第3天起可见自发性、有节律跳动的类胚体出现, 第5天达到高峰, 约有70%的拟胚体产生跳动。用RT-PCR法在跳动的拟胚体中检测心肌细胞特异性标志物β-MHC的表达。结果:川芎含药血清培养下的细胞β-MHC的表达水平和分化率均明显升高, 与大鼠血清组和胎牛血清组比较差异均有统计学意义 (P<0.05) 。结论:川芎含药血清可明显提高体外诱导胚胎干细胞向心肌细胞分化的效率。