人肺癌细胞/药理学

人肺癌细胞/药理学（精选7篇）

人肺癌细胞/药理学 篇1

1 资料与方法

1.1 一般资料

本文收集受检者31292例中, 其中男20920, 女10372, 年龄18～92 (平均48) 岁, 经其它多种方法确诊为肺癌者1783例, 而癌痰细胞学检查阳性者为1655例, 痰细胞学阳性诊断率为92.8%。

1.2 检查方法

嘱患者嗽口并做深呼吸几次, 随后咯出积于喉及鼻腔的陈腐分泌物, 再用力从肺部深处咳出4～5口痰, 置于腊盒内, 立即送检。再用竹签挑取带有血丝的粘液、乳白色痰丝、或透明蛋清样有弹力状痰1mL左右, 置于玻片上, 然后用竹签将唾液或多余痰液刮去, 剩余痰约0.2mL (黄豆粒大小) , 用竹签拉成1.2cm×3cm, 厚约1～2mm的痰膜, 用等量酒精950ml与乙醚固定15～20min, 行HE染色, 少数病例做巴氏染色及Saccamanna浓集痰法。

2 结果 (表1)

在15150例中, 经他法确诊为肺癌者965例, 痰细胞学检查阳性者830例, 其发生部位与痰细胞检出例数的关系如表2。

3 讨论

本文检查阳性率为92.8%, 与国内外先进水平是一致的。我们认为如下几方面是提高痰病理细胞学诊断的关键[1～3]。 (1) 痰标本必须合格, 即切实是从肺内深处咳出来的。 (2) 痰标本必须新鲜, 否则因痰内酶较多, 使细胞自溶分解影响阳性率。 (3) 必须仔细准确挑取痰的有效部分, 至少制片3张。 (4) 血丝粘痰、乳白色痰丝、透明蛋清样有弹力痰, 癌细胞检出率最高;灰黑色痰、泡沫痰、口水很少检出癌细胞。鲜血痰如伴有淋巴增多, 多提示肺不张或肺结核出血的可能。早期肺癌, 肺泡细胞癌咳痰、咳血为本病初发症状。有1/3病例咳血为肺癌唯一初发症状, 而97%以上病例伴有血丝痰。 (5) 涂片厚薄适宜, 过厚影响观察, 过薄阳性低。 (6) 我们选用快速HE法, 对粘稠较厚痰标本, 具有很强染色能力, 细胞结构清晰, 癌细胞与非癌细胞经染色后有明显着色差异。 (7) 精心观察、反复查找、准确报告。例如癌细胞易引起出血和凝固坏死, 其间杂有零乱蓝色棕色碎片, 提示癌阳性背景。如涂片有大量炎症细胞及尘埃细胞、无中层、基底细胞、柱状上皮等深层细胞, 提示痰留取不合格所致。在辨认细胞时要抓住主要特征[4～6]。如鳞癌胞浆偏酸, 形态多形性, 有角化珠;腺癌, 成堆成团核偏位, 胞浆有空泡, 常成桑椹样、花瓣状、戒指样结构等特点;未分化癌细胞呈浆少、裸核、镶嵌结构[7～8]。

本文从表2看出肺癌右肺上叶者较下叶者癌细胞检出阳性率高;我们认为这主要是肺叶距支气管较近, 癌细胞易于咳出之故;但中心型肺癌已发展到晚期, 癌肿与周围组织有广范性粘连, 特别是癌肿周围有较厚纤维性假气膜, 堵塞支气管口, 此时痰细胞检出很困难。本文1例中心型肺癌, 癌肿距支气管只有3cm, 肿物大小为9.0cm×8.0cm, 但由于癌肿与心包明显粘连, 被较厚的结缔组织包裹, 压迫支气管出口, 虽经10次痰检都未得到阳性结果。

癌肿组织类型对痰细胞检出的影响, 从表1可见, 鳞癌较其它类型肺癌检出率高, 这可能是此类癌肿多起源于支气管, 癌细胞容易脱落加之这种癌细胞较为典型, 容易辨认而检出率高;其次为未分化癌 (特别小细胞未分化癌) ;腺癌检出率较低且易误诊。本文中有4例认为腺癌细胞, 经反复追访检查表明, 误诊原因系把异型增生之肺泡上皮误认为是腺癌细胞。肺泡细胞癌检出率一般较腺癌低, 本文有26例, 检出率低的原因, 我们认为与其组织特点有关;癌细胞立方形或矮柱状排列于肺泡壁上, 有的脱落到肺泡壁内, 当病人咳痰时癌细胞可随稀薄蛋清样痰咳出。

文献记载癌细胞的检查次数与癌细胞的检出阳性率成正比。我们认为连续2次检出率即可达到85%以上。痰的癌细胞有人错误的认为只有晚期才能查到。本文有1例曾经在全国各地经CT、气管镜检查, 均未明确诊断, 但经我们3次查痰都找到了典型的未分化癌细胞, 最后手术切除, 病理证实小细胞肺癌[4～8]。因此, 我们认为痰的脱落细胞病理学检查, 对咳嗽、咳血为本病第一初发症状的病例, 虽然其它检查阴性, 而痰的脱落细胞检查却有可能明确诊断。而且对某些肺癌如肺泡细胞癌、鳞癌等是必不可少的早期诊断手段之一。

摘要：目的提高肺癌痰脱落细胞检出准确率。方法通过31292例痰标本脱落细胞检查, 以及多种影响因素观察研究。结果肺癌痰脱落细胞准确率, 与痰标本的留取、精选有效部分涂片、应用HE染色、认真仔细查找, 准确熟练辩认等环节密切相关, 对肺癌细胞病理学分型有一定帮助。结论痰脱落细胞检验诊断其方法简单易行, 准确可靠, 经济适用, 弥补CT、MRI、X线等其它方法不足, 对肺癌早期诊断早期治疗, 有重要诊断价值。

关键词：肺癌,脱落细胞病理学,结果分析

参考文献

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[4]王永才, 赵成艳, 朱杰.重新评估痰脱落细胞对肺癌的诊断意义[J].辽宁医学杂志, 2003, 2 (1) :53～55.

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[6]王永才.穿刺脱落细胞诊断学[M].北京:科学技术文献出版社, 1993:398～417.

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[8]李元堂, 李桂琴.临床脱落细胞学图谱[M].济南:山东科学技术出版社, 2001:230～241.

人肺癌细胞/药理学 篇2

1材料与方法

1.1 细胞系 人肺腺癌细胞系A549, 人脐静脉内皮细胞系ECV304。细胞培养于含有10%胎牛血清的和1%双抗的DMEM培养液中, 于37℃、湿度饱和的CO2培养箱中培养。

1.2 绿茶为市场上的绿扬春茶叶, 经过浸泡, 取水溶物, 经过过滤、冷冻干燥, 溶解于超纯水中, 抽滤分装, 备用。

1.3 细胞增殖实验 培养于含有GTC的培养液中生长汇合的A549细胞, 经过胰蛋白酶消化, 悬浮于完全培养液中, 按照3×104 细胞/孔接种于24孔板中 (培养液中含有GTC) , 于37℃、湿度饱和的CO2培养箱中培养, 每隔24 h用胰蛋白酶消化, 台盼兰染色, 应用血球计数板计数活细胞数, 共计数4 d。每组细胞设置4个复孔, 实验重复3次。

1.4 细胞划伤实验 培养于含有GTC的培养液中的A549细胞生长至80%～90%汇合, 用小的黄色枪头沿着细胞表面划出“伤口”, PBS洗3遍, 置于含有10%胎牛血清的和1%双抗的DMEM培养液中, 于37℃、湿度饱和的CO2培养箱中培养16 h, 在相差倒置显微镜下j计数迁移到“伤口”区域的细胞数, 实验重复4次。

1.5 Transwell 细胞浸润实验 按照文献方法进行[6]。经过无血清 (含GTC) 培养过夜的A549细胞经过胰蛋白酶消化, 按照3×105 细胞/ml悬浮于含有 0.1%牛血清白蛋白的无血清的DMEM (含有GTC) 中。在Transwell上层小室中加入100μl的细胞悬液, 置于含有10%胎牛血清的DMEM的下层培养小室中, 于37℃、湿度饱和的CO2培养箱中培养8 h, 取出上层小室, 用棉棒剔除附着于上表面的细胞, 然后于冰甲醇中固定15 min、Giemsa染色30 min, 将含有迁移细胞的碳聚酯膜切下置于载玻片上 (甘油封片) , 在显微镜下计数迁移细胞数。

1.6 A549细胞于内皮细胞黏附实验 ECV304细胞生长在覆盖有盖玻片的6孔板中置90%汇合。培养于含有GTC的培养液中生长汇合的A549细胞, 经过胰蛋白酶消化, 悬浮于完全培养液中, 将300 μl的A549细胞悬液 (1×106细胞/孔) 加到相应的ECV304单层细胞中, 混匀, 37℃培养45 min, 然后用黏附缓冲液温柔地洗细胞3次, 去除未黏附地细胞, 再经1% 的戊二醛固定, 计数黏附的细胞数。

2结果

2.1 GTC对A549细胞增殖的影响

经过体外计数实验, 由图1可见, GTC可以显著抑制A549细胞的体外增殖。

2.2 GTC对A549细胞迁移的影响

通过单层细胞“划伤”实验可见GTC可以降低A549细胞的迁移 (图2) ;Transwell浸润实验也证实, GTC可以降低A549细胞的浸润、转移 (图3) 。

2.3 GTC对A549细胞与内皮细胞黏附的影响

GTC可以抑制A549细胞黏附到ECV304单层细胞上。

3讨论

目前市售茶叶主要分为3种类型, 即绿茶、红茶和乌龙茶[7], 它们的不同之处在于炒制方法不同, 主要的化学成分也不同。大约只有20%的茶叶是绿茶, 在绿茶的炒制过程中, 能够防止绿叶中的多酚类物质的被氧化。而在红茶的炒制过程中, 绝大部分的多酚类物质被氧化, 乌龙茶中也含有部分被氧化[7]。绿茶的生物学活性在于其含有不同的儿茶酚类和表没食子酸盐等具有抗氧化作用的物质[8]。

流行病学的研究显示多喝绿茶可以改善乳腺癌的预后[9], 在亚裔美国人的研究报道中, 绿茶的摄入量与乳腺癌的发病率呈负相关[10,11]。绿茶中所含有的多酚类物质的药用特性在于其抗氧化和抗炎症等的活性[12]。最近的研究显示, 这些物质可对肿瘤的发生和发展过程中多个过程通过多种机制进行干涉[13,14,15]。研究显示, 富含多酚类物质的绿茶具有抗肿瘤转移的潜能, 绿茶也能显著降低亚洲妇女的乳腺癌和卵巢癌的发病风险。虽然有关绿茶及其成分的功能的研究在许多体内外模型中已经证实其具有抑制乳腺癌和卵巢癌等的作用[16,17], 但是其作用方式和可能的作用机制尚不清楚。相关研究也显示, 绿茶中的成分复杂, 不同产地的茶叶可能其成分也不完全相同, 是否还有其他活性物质在起作用尚不完全清楚, 同时也说明绿茶在抗肿瘤方面的机制可能比较复杂[3,4,5]。因而, 进一步研究、筛选茶叶的有效成分就显得特别重要。

人肺癌细胞/药理学 篇3

1 材料和方法

1.1 试剂

白杨素为美国Sigma公司产品,用医用无菌生理盐水配成1.0mmol/L的母液,即配即用。白杨素衍生物5-烯丙基-7-二氟亚甲基白杨素(ADFMChR),由湖南师范大学医学院药学系药物化学室合成,分子式:C1904H14F2;分子量:344,性状:淡黄色晶体;纯度:99.0%。ADFMChR用DMSO溶解,PBS稀释,过滤灭菌,配成2mmol/L的母液,临用时用PBS稀释至所需浓度。顺铂(DDP)为齐鲁制药有限公司;RPMI 1640培养基,Gibco公司产品;四甲基偶氮唑盐(MTT)为美国Sigma公司产品;二甲基亚砜(DMSO)为美国Amresco公司产品。

1.2 细胞培养

肺癌细胞株A549购自武汉大学中国典型培养物保藏中心(中国武汉市)。用含10%小牛血清,(1×105) U/L青霉素及(1×10,)U/L链霉素的RPMI 1640完全培养基中,在37℃,5%CO2及饱合湿度条件下培养,(2～3)天传代1次,取对数生长期细胞用于实验。

1.3 动物模型制作

取SPF级BALB/c-nu小鼠购自中国药品生物制品检定所(许可证号:SCXKⅡ-00-0010) 24只,6周龄,体重(16～18)g。取对数生长期A549细胞,用无菌PBS调整A549细胞浓度为(3×107)/mL,在BALB/c-nu小鼠背部皮下接种A549细胞0.1 mL,待皮下移植瘤体积达75 mm3左右时(约10天),按瘤体积和荷瘤鼠体重均衡原则分为6组,每组4只,即I组:模型对照组(NS 0.1 mL/10g,i.p);II组:顺铂组(DDP,2.0mg/kg.bw,i.p);Ⅱ组:ChR组(20.0 mg/kg.bw,i.p);IV～VI组:ADFMChR组(低剂量5.0 mg/kg.bw,中剂量10.0mg/kg·bw,高剂量20.0 mg/kg·bw组,i.p)。隔日给药1次,共计8次,给药期间每4日用游标卡尺测量移植瘤最长径(L)和最短径(W)。末次给药48小时后脱臼处死小鼠,切除移植瘤。移植瘤体积V=L×W2×0.52,绘制移植瘤生长曲线。

1.4 移植瘤的组织形态观察

立即取部分移植瘤,10%中性福尔马林固定液固定。分别用70%、80%、90%、95%、100%浓度的乙醇溶液脱水(6～12)小时,二甲苯透明45min,浸蜡(58～62℃)(2～3)小时。切片厚度(4～6)μm;HE染色,光学显微镜下观察皮下移植瘤的组织形态。

A.生理盐水(NS 0.1ml/10g,i.p)组×400;B.顺铂(DDP 2mg/kg,i.p)组×400;C.白杨素(ChR 20mg/kg,i.p)组×400;D.低剂量ADFMChR(ADFMChR 5mg/kg,i.p)组×400;E.中剂量ADFMChR (ADFMChR 10mg/kg,i.p)组×400;F.高剂量ADFMChR (ADFMChR 20mg/kg,i.p)组×400

1.5 统计学方法

数据以均数±标准差()表示,采用SPSS15.0软件进行方差分析。

2 结果

2.1 ADFMChR对人肺癌A549裸鼠移植瘤生长的影响

结果表明,ADFMChR显著抑制A549细胞裸鼠移植瘤的生长,呈剂量和时间依赖性(图1)。

与NS组比较,P<0.01

2.2 ADFMChR对人肺癌A549细胞移植瘤组织形态的影响

移植瘤组织病理学检查,光学显微镜观察:生理盐水组,裸鼠移植瘤可见瘤细胞呈片状,条索,腺样结构,瘤细胞大小不一,核染色深浅不一(图2 A)。证实肺癌(A549)裸鼠皮下移植瘤制备成功。顺铂组,皮下组织内可见瘤细胞结节,瘤结节境界清楚,可见核固缩、碎裂、坏死瘤细胞(图2 B)。说明常规化疗药物顺铂(DDP)能有效杀伤肺癌裸鼠移植瘤细胞。白杨素组,皮下组织内可见肿瘤细胞结节,瘤细胞呈巢状分布,癌巢间有少量纤维结缔组织间质,瘤细胞胞浆丰富,淡红色,核圆形,核仁明显(图2 C)。反映先导化合物白杨素杀伤移植瘤细胞作用弱。低剂量ADFMChR组,皮下组织内可见边界清楚瘤细胞结节,瘤结节周围有少量纤维包膜,瘤细胞形态不规则(图2 D)。中剂量ADFMChR组,皮下组织内可见边界清楚的瘤结节,瘤结节周围有少量纤维组织,瘤结节内部分细胞染色较浅,空泡变性,形成小腔,癌巢内有少量纤维组织及血管(图2 E)。高剂量ADFMChR组,肿瘤细胞退形性变,核固缩,核碎裂(图2 F)。提示高剂量的ADFMChR能杀伤肺癌裸鼠移植瘤细胞。

3 讨论

增强现有抗肿瘤药物的抗瘤作用,而不增加其对宿主的毒性,是发展抗肿瘤药物应用的研究方向之一。有研究表明,某些黄酮类化合物如芹菜素、毛地黄黄酮等能有效诱导肿瘤细胞凋亡,而对没有转化的正常细胞不具有上述作用[7]。这些发现激发了人们从天然植物中制备抗肿瘤药物的热情。近年来,黄酮类化合物的抗肿瘤作用研究已成为医药学的一个研究热点。

Comte等[8]通过对白杨素进行不同的化学修饰,发现白杨素通过烷基化,亲水性下降,脂溶性增强。其中化合物8-二甲基丙烯基白杨素作用强于环胞霉素A。Park等[9]合成并比较了系列6,8一二取代卤化、氧化和甲基化白杨素衍生物,其中6,8-二甲基白杨素抑制COX-2和PGE2的作用最强。本研究结果显示:ADFMChR处理肺癌A549细胞48h,其抑制率高于先导化合物ChR,而与DDP接近。说明白杨素衍生物ADFMChR对肺癌A549细胞殖活性的抑制作用较强。李姣玲[10]发现ADFMChR对体外培养人卵巢癌细胞CoC1的增殖具有明显的抑制作用,呈剂量-效应关系和时间-效应关系,与本研究结果相似。

评价抗肿瘤药物常用的动物模型有:人癌小鼠肾包膜囊下移植瘤、S-180小鼠肉瘤、Lewis肺癌以及人癌裸鼠移植瘤模型等。裸鼠是一种细胞免疫缺陷小鼠,具有接种成功率高和直接观察药物对恶性肿瘤作用的优点,故本文采用人肺癌A549裸鼠皮下移植瘤治疗实验评价ADFMChR的体内抗肺癌作用。本研究表明,ADFMChR与DDP、ChR均能有效地抑制肺癌裸鼠皮下移植瘤的生长,ADFMChR抑制作用与DDP类似而强于ChR,呈时间和剂量依赖性,表明ADFMChR具有较强的体内抗肺癌活性。8-硝基白杨素对小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤和肺转移瘤结节具有明显抑制效应,且均呈剂量相关性[11],说明白杨素衍生物抗肿瘤效果优于白杨素,与本研究结果类似。

李华珍[12]、许金华[13]对ADFMChR诱导人卵巢癌CoC 1细胞凋亡机制进行了研究,结果表明与ADFMChR活化PPARr,抑制NF-kB表达有关。本研究证实白杨素衍生物ADFMChR较其先导化合物ChR具有更强的抑制人肺癌A549裸鼠异种移植瘤作用。这为深入开发ADFMChR作为新型抗癌治疗候选药物提供了依据,具有潜在临床实际应用价值。

摘要：目的:研究5-烯丙基-7-二氟亚甲基白杨素(ADFMChR)对人肺癌A549细胞移植瘤生长的抑制作用。方法:建立人肺癌A549裸鼠移植瘤模型,测定荷人肺癌裸鼠的移植瘤大小;HE染色,光学显微镜下观察移植瘤组织形态学特征。结果:ADFMChR对肺癌移植瘤生长具有显著抑制作用。HE染色镜下观察,ADFMChR处理的人肺癌裸鼠移植瘤组织内细胞退形性变,核固缩,核碎裂。结论:ADFMChR显著抑制人肺癌A549细胞裸鼠移植瘤的生长,呈剂量依赖性。

人肺癌细胞/药理学 篇4

1 资料与方法

1.1 一般资料

2005年8月—2008年1月我科在化疗时联合应用重组人血管内皮抑制素共治疗晚期NSCLC病人23例,男18例,女5例;年龄41岁～65岁;均为经病理学和细胞学检查确诊,常规治疗失败的Ⅲ期、Ⅳ期NSCLC病人,其中腺癌14例,鳞癌9例。治疗前医生预计病人的生存期大于3个月,病人有经济能力,自愿接受重组人血管内皮抑制素的联合治疗。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法

重组人血管内皮抑制素的规格是每支15 mg,临床常规使用剂量为7.5 mg/m2,冷藏保存在冰箱里。治疗前将重组人血管内皮抑制素从冰箱取出,加入250 mL生理盐水中,以输液泵100 mL/h～20 mL/h的速度匀速输注,每天1次,连续用药14 d,间歇1周,再延续下1个周期治疗,每个病人通常进行4个周期的治疗。

1.2.2 观察指标及判定标准

①用药1个月后,按照世界卫生组织(WHO)疗效评价标准进行疗效评价,分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、稳定(SD)和疾病进展(PD)。②不良反应评价参照实体瘤的疗效评价标准,抗癌药物毒性反应分为0度～Ⅳ度[3]。

2 结果

2.1 治疗效果观察结果

本组23 例病人中完全缓解0例,部分缓解 4例,稳定14例,疾病进展5例;18例病人的生存质量较未使用重组人血管内皮抑制素前有所改善,生存期较预期长。

2.2 不良反应发生情况(见表1)

3 护理

3.1 用药前护理

3.1.1 心理护理

重组人血管内皮抑制素的费用比较昂贵,而且使用的时间较长,不容易立即见到效果。因此,在第1次使用重组人血管内皮抑制素治疗前,应详细、耐心向病人及家属解释重组人血管内皮抑制素的药理作用、用药目的、可能出现的不良反应及应对措施,以及对治疗晚期非小细胞肺癌的效果、预后,加之家属更多的情感和经济支持,增强其治疗的信心,保证治疗方案的顺利完成。

3.1.2 治疗前准备

病人每个疗程需要连续使用重组人血管内皮抑制素14 d,至少将进行4个周期的治疗,所以最好在开始治疗前先为病人留置外周穿刺中心静脉置管术(PICC)导管。了解病人有无药物过敏史和心脏病史,了解相关检查结果,开始用药后为病人接上床边心电监护仪、输液泵,必要时备好吸氧用物。每次用药时均严格按照药物配置程序和按医嘱规范用药。

3.2 用药中不良反应观察及护理

用药前应向病人及家属详细介绍重组人血管内皮抑制素的不良反应主要是心脏反应、胃肠道功能紊乱、头痛、头晕,偶见消化道反应及变态反应,但反应均较轻,并且是可逆的,让他们减轻焦虑、恐惧感,有足够的心理准备以配合治疗。

3.2.1 心脏反应

本组2例病人在接受重组人血管内皮抑制素治疗时出现轻度胸闷、心慌,心电图示窦性心动过速,轻度ST-T改变,经对症用药和吸氧后,症状得到缓解。

3.2.2 消化道反应

本组1例病人在第2个治疗周期时出现腹泻症状,2例病人的肝功能异常。遵医嘱口服止泻药对症处理;口服肌苷片、肝太乐片控制转氨酶,无需停药。指导病人应进食清淡、易消化、不含碳酸和乙醇的饮料,避免进食高脂肪、油炸食品;注意补充足够的液体,注意休息。

3.2.3 皮肤反应

本组1例病人在首次使用重组人血管内皮抑制素的过程中出现了全身斑丘疹,伴瘙痒,经常规抗过敏药物治疗后皮疹自行缓解,在以后的治疗过程中未再发生。

3.3 用药后护理

从病人开始接受重组人血管内皮抑制素治疗后,应指导病人注意休息,避免劳累;多饮水,注意保暖,避免到人群密集处,防止交叉感染;鼓励病人多进食营养丰富无刺激性饮食,忌食辛辣,刺激性食物,养成良好生活习惯,适当运动;定期复查血常规、肝肾功能、心电图检查,以便观察和了解其他毒副反应的发生,以便采取相应的处理。

4 小结

重组人血管内皮抑制素是一种血管内皮抑制剂,晚期NSCLC病人在化疗时联合应用重组人血管内皮抑制素,具有靶向明确、毒副反应小、不产生耐药性等优点并可增加药物的疗效,而且改善病人的主要临床症状(如咳嗽、咳痰、咯血、疼痛等),从而可提高病人的生活质量。

重组人血管内皮抑制素作为一种新的靶向治疗药物投入临床使用,在使用前不仅应熟悉该药物的药理作用、用药目的、可能出现的不良反应以及预防和应对措施,还应向病人和家属提供及时准确的药物信息;在用药过程中应严格按程序执行,并给予病人有针对性的健康宣教;对出现不良反应的病人提供及时周到的护理,才能保证重组人血管内皮抑制素充分发挥作用,达到良好的治疗目的,提高病人的生活质量。

参考文献

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人肺癌细胞/药理学 篇5

1 对象与方法

1.1 研究对象

取佳木斯大学附属第一医院胸心外科手术切除并经病理证实为非小细胞肺癌的肺癌组织标本 40例, (按照临床TNM分期, I期16例、II期15例、III期9例;按照组织学分级, 包括高分化13例、中分化11例、低分化16例) , 肿瘤直径>5cm 28例, <5cm 12例, 病理学或影像学检查伴淋巴结转移或远处转移者29例, 无转移者11例, 男27例, 女13例;年龄35～75岁, 平均55.4岁。20例非小细胞肺癌癌旁正常肺组织 (距肿瘤边缘>5cm) 作为对照, 并经病理切片证实。所有患者术前均未接受放疗、化疗及免疫治疗。

1.2 实验方法

采用常规免疫组化SP法。一抗为小鼠抗人PDCD5单克隆抗体, 质量浓度为0.8 g/L, 从北京宝赛生物技术有限公司购买; 二抗羊抗小鼠多克隆抗体, 购于福州迈新公司。

1.3 结果判定

含有棕黄色颗粒的细胞均为PDCD5阳性, 判定方法如下。A根据阳性细胞所占百分数定为0～3分。B根据细胞染色深浅定为0～3分, 共4级。判定标准:综合A项+B项判定方法定为4级标准。

1.4 统计学处理

不同组织学分级和TNM分期肺癌组织PDCD5的表达, 采用列联表的卡方检验分析和关联度测量。所有分析过程均采用SPSS15.0统计软件实现, 以P<0.05为差异具有显著性。

2 结果

不同组织学分级和TNM分期非小细胞肺癌组织PDCD5的表达, 癌旁肺组织及肺癌组织PDCD5阳性着色均为棕黄色, 主要见于细胞浆。统计学分析表明, 在TNM分期 (χ2=30.669, P<0.01) 及组织学分级 (χ2 =27.364, P<0.01) PDCD5表达阳性率差异有显著性, 两两比较各组间PDCD5表达阳性率差异也有显著性。同时计算列联系数, 按TNM分期, 列联系数为-0.642;按组织学分级, 列联系数为-0.685 (表1) , 提示随着肺癌临床分期上升和组织学分级的降低, PDCD5的表达逐渐减弱。

3 讨论

PDCD5基因是由北京大学人类疾病基因中心1999年在国际上首先报道的一个人类新基因, 参与调控细胞凋亡过程[1]。体外实验表明, PDCD5在多种肿瘤细胞系中均可促进肿瘤细胞发生凋亡, 对放、化疗起协同作用[2]。例如, Spinola等[3]研究证实, 肺腺癌组织中PDCD5的mRNA表达水平比正常肺组织低2.4倍。张岱等[4]应用免疫组化方法检测PDCD5蛋白的表达与卵巢上皮性癌的FIGO分期、组织学分级、病理类型相关。随FIGO分期与组织学分级升高, PDCD5蛋白的表达下调。本研究中, 我们应用免疫组化的方法首次检测了癌旁正常肺组织及非小细胞肺癌组织中新的凋亡相关基因PDCD5的表达及分布, 显示非小细胞肺癌组织PDCD5阳性表达率较癌旁肺组织减少, 同时PDCD5阳性表达率随非小细胞肺癌临床分期上升和组织学分级降低强度也减弱。提示PDCD5在非小细胞肺癌的浸润和转移中可能有抑制作用。目前用以评估预后的依据有临床分期和组织学分级, 但均存在一定缺陷。临床分期对晚期病例判断较为准确, 而对那些早期预后不良者判断较困难。组织学分级易受主客观因素影响, 可重复性差, 难以准确判断预后。在本实验中PDCD5在恶性程度低、侵袭力弱的非小细胞肺癌中阳性表达率均较高, 而在恶性程度高、侵袭力强的非小细胞肺癌中阳性表达率均较低, 这提示PDCD5在非小细胞肺癌发生、发展中起抑制作用, 在非小细胞肺癌恶性转化中可能起保护作用。由于PDCD5与非小细胞肺癌关系的复杂性, 对其分子机制的特别是对PDCD5基因调控和PDCD5调节的研究, 将有助于非小细胞肺癌的预防和治疗。

参考文献

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人肺癌细胞/药理学 篇6

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人肺癌A549细胞由中国科学院上海细胞所提供;PRMI-1640培养基和小牛血清购自Gibco公司;免疫组织化学SP试剂盒、DAB显色试剂盒、鼠抗人CD34单克隆抗体及二抗购自北京中杉生物技术公司;人肺癌A549细胞培养于含有10%小牛血清的RPMI-1640中,实验所用细胞均处于对数增长期;健康纯种BALB/C 4~5周龄雌性裸鼠由上海实验动物中心提供,在山东大学药学院动物实验中心SPF环境下饲养。

1.2 ASODN的设计与合成

根据HPSE基因序列(Gen Bank accession number:AF155510),设计ASODN序列:ASODN 5'-GGC TTCGAGCGCAGCAGCAT-3',Blastn结果证实在Gen Bank中ASODN仅与HPSE基因的相应位点匹配。该寡核苷酸序列由上海生工生物工程公司合成、纯化,行硫代磷酸化修饰,同时以荧光素FAM标记末端碱基。

1.3 ASODN转染A549细胞

采用阳离子脂质体(Lipofectamine)转染。寡核苷酸/脂质体复合物的配制:将寡核苷酸和10μL Lipofectamine分别加入装有100μL无血清RPMI-1640的两个聚苯乙烯管中进行稀释,室温静置15min后将两管稀释液轻柔混合,室温孵育30 min。取处于对数期生长的A549细胞,加入胰蛋白酶消化,将细胞接种于6孔板,置于37℃、5%二氧化碳(CO2)孵育箱培养48 h,待细胞长至80%融合时去除培养液,以温热无血清的RPMI-1640漂洗细胞2次,准备进行转染。分组转染:分ASODN组(转染时加脂质体和ASODN,ASODN浓度为400 nmol/L)、脂质体组(转染时仅加脂质体,不加ASODN)和对照组(不加脂质体,不加ASODN)3组,将经无血清RPMI-1640稀释过的寡核苷酸/脂质体复合物轻铺于细胞上,不加抗生素,37℃、5%CO2孵箱孵育6 h,再继续培养48 h,以备接种裸鼠用。

1.4 Western blotting检测A549细胞HPSE蛋白的表达

收集各组1×106肺癌A549细胞,PBS漂洗,加入预冷至4℃的裂解缓冲液,冰浴20 min,离心(11180 g),取上清进行蛋白定量,加入1/5体积的5×上样缓冲液,沸水煮沸5 min,以40μL(64μg)每道上样,10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,转移至NC膜,4℃封闭过夜,加入1︰250稀释的兔抗人HPSE多克隆抗体(一抗),室温孵育2 h,TBST洗3次,加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(1︰2 000)孵育2 h,TBST洗3次,加ECL化学发光剂,X线片暗室曝光,常规显影、定影。将胶片用凝胶成像仪扫描入电脑,用Quantity One 4.4.0软件分析,得到所有条带的累积光密度值(IOD),计算目的条带与β-actin累积光密度值的比值。

1.5 裸鼠移植瘤模型的复制

将24只裸鼠随机分3组,即ASODN组、脂质体组和对照组,分别接种上述ASODN组瘤细胞悬液、脂质体组瘤细胞悬液和对照组瘤细胞悬液,每只裸鼠右侧背部皮下注射1×107/m L细胞悬液0.2m L。经7~10 d潜伏期,皮下移植瘤开始形成。每周观察裸鼠,用游标卡尺测量瘤体最长径(a)与最短径(b),按公式计算肿瘤近似体积V(mm3),V=πab2/6,并绘制肿瘤生长曲线。接种后第6周断颈处死解剖出瘤体,以10%中性甲醛固定,石蜡包埋,以备免疫组织化学之用。

1.6 移植瘤微血管密度(microvessel density,MVD)检测

1.6.1 免疫组织化学染色

二甲苯脱蜡15 min共2次,切片经100%酒精至70%酒精逐级水化;标本置于3%H2O2中,室温置放10 min,以阻断内源性过氧化物酶;将切片置于装有EDTA抗原修复液的容器中,放入微波炉中加热至容器内液体沸腾,冷却至室温;加上1︰10正常小牛血清,37℃温箱中孵育30min;滴加鼠抗人CD34单克隆抗体,置湿盒内4℃冰箱过夜;滴加生物素标记的二抗工作液,湿盒内30min;滴加SABC复合物,湿盒内37℃温箱孵育40min;DAB-H2O2室温下显色,显微镜下控制显色。以上各步骤之间均用PBS冲洗3次,共15 min。苏木素复染,酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封固,镜下观察。PBS代替一抗作阴性对照。

1.6.2 移植瘤MVD计数

按WEIDNER等[3]的方法,CD34结果判定以血管内皮细胞的细胞浆内或细胞膜出现棕黄色颗粒为阳性,不着色者为阴性。微血管判断不以红细胞的出现来确定是否为血管,也不以是否出现管腔来计数血管。凡染成棕黄色、数个内皮细胞或内皮细胞簇作为一个血管计数,凡管腔多于8个红细胞、带有肌层的血管均不计数。先用低倍光镜(×40)扫视整个切片,寻找高血管密度区“热点”区,再转到高倍镜(×200)下精确计数微血管数量。取3个热点区微血管数量平均值作为每例的微血管数。

1.7 统计学方法

采用SPSS Version 17.0软件包进行数据分析,计量资料以均数±标准差表示,两组间均数比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPSE ASODN抑制A549细胞HPSE蛋白的表达

实验结果显示,与对照组和脂质体组相比,ASODN组HPSE蛋白表达水平明显下降(0.14±0.01 vs 0.49±0.03、0.47±0.01,P<0.01),对照组和脂质体组之间比较差异无统计学意义(P<0.05,见图1)。由此表明,HPSE ASODN显著抑制HPSE蛋白的表达。

A:对照组;B:脂质体组;C:ASODN组

2.2 HPSE ASODN对肺癌移植瘤生长的影响

24只裸鼠均成活并于接种部位形成单一皮下移植瘤,移植瘤表面光滑,外观呈类圆形或分叶状,瘤组织质脆易碎。ASODN组裸鼠成瘤时间晚,到第6周时肿瘤体积明显小于脂质体组和对照组,差异有统计学意义(P<0.01),并且ASODN组瘤体分叶不明显;脂质体组和对照组移植瘤体积较大,瘤体分叶明显,但两组间肿瘤体积比较差异无统计学意义(P>0.05)(见图2、3)。

A:对照组;B:脂质体组;C:ASODN组

2.3 HPSE ASODN对肺癌移植瘤血管生成的影响

移植瘤组织内可见较多形态不规则,有或无明显管腔的新生血管,血管分布以癌巢组织的边缘处较为多见。各组肿瘤组织微血管密度情况见附表和图4,ASODN组瘤体组织中MVD计数明显降低,与脂质体组和对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01);脂质体组和对照组比较,两组MVD计数差异无统计学意义(P>0.05)。

注:覮与ASODN组比较,P<0.01

A:对照组;B:脂质体组;C:ASODN组注:覮与对照组、脂质体组比较,P<0.01

3 讨论

肺癌的发病率及死亡率不仅在欧美国家位居首位,在我国也成为城市居民恶性肿瘤死亡率的第1位[4]。肿瘤的生长和转移是一个依赖于血管的过程,血管的生成与实体瘤的发生、转移具有密切关系[5]。有证据表明,抑制实体肿瘤的血管生成,能够有效抑制肿瘤的生长,防止肿瘤发生播散和远处转移[3]。与传统化疗相比,抗血管生成治疗具有副作用少等优势,加之抗血管生成治疗不用考虑肿瘤组织的特异性,是目前肿瘤治疗的一种新途径[6]。HPSE是近年来克隆成功的惟一能特异性识别、裂解HSPG的HS侧链的一种葡萄糖苷内切酶,研究结果显示,HPSE在很多恶性肿瘤中均高表达,它不仅与肿瘤的侵袭、转移密切相关,而且在肿瘤血管生成方面发挥了重要作用[7,8,9,10,11]。

利用反义核酸对肿瘤进行反义基因治疗是近十几年兴起的一项治疗肿瘤的新技术。通过碱基互补原理,反义寡脱氧核苷酸与目的m RNA的特定序列特异性结合,形成DNA-RNA杂合双链,诱导内源性RNA降解酶H对m RNA链进行水解,并通过空间位阻效应阻断m RNA的剪切加工、转运和蛋白质的翻译合成,从而达到基因治疗的目的[12,13]。近年来,较多研究证明针对HPSE基因的反义核酸治疗对肿瘤的生长和转移有良好的抑制作用,显示出诱人前景[14,15,16]。

本实验通过硫代磷酸化修饰增强了HPSE A-SODN的稳定性和抗酶解能力,同时阳离子脂质体在一定比例内能中和HPSE ASODN所带的负电荷,使HPSE ASODN易于通过细胞膜,提高了转染效率。Western blotting结果显示HPSE ASODN能够明显降低A549细胞中HPSE蛋白的表达量;同时,动物实验发现ASODN组裸鼠不仅成瘤时间较脂质体组和对照组晚,而且该组裸鼠移植瘤体积较脂质体组和对照组小,到第6周时肿瘤体积明显小于脂质体组和对照组,差异有统计学意义(P<0.01),提示HPSE ASODN抑制了肺癌细胞的生长,显示出良好的抑瘤效果。与笔者的实验结果相一致,国外许多研究[10,14]已证明,抑制HPSE蛋白的活性和表达量,可减缓肿瘤细胞的生长和侵袭。

肿瘤MVD的检测是评价肿瘤血管生成的一个重要指标,多数学者充分肯定了MVD与肿瘤的生长、转移以及预后的密切关系,MVD高的肿瘤具有恶性程度高,易转移和复发的特点,被认为是判断肿瘤预后的重要指标[3,17]。通常通过免疫组织化学技术标记血管的内皮细胞来检测MVD,目前多采用WEIDNER所提供的技术[3]。本实验通过比较各组裸鼠移植瘤中MVD的差异来观察HPSE ASODN的抗血管生成作用,结果显示ASODN组移植瘤MVD计数较对照组和脂质体组明显减少,差异有统计学意义(P<0.01),提示HPSE ASODN明显抑制了移植瘤血管的形成。VLODAVSKY等[1]研究认为HPSE具有促血管生成作用:(1)直接作用,HPSE可直接作用于内皮细胞以生芽方式促进血管生成;(2)间接作用,通过释放HS与碱性成纤维细胞生长因子(basic fibrocast growth factor,b FGF)的复合物,产生HS降解片段以促进b FGF活性来间接诱发血管生成。本研究结果提示HPSE ASODN抑制肿瘤生长的机制与减少肿瘤的血管生成有关。新生的肿瘤失去血管的营养支持,生长速度明显减慢,实现抑瘤效应。

总之,本研究通过复制动物模型观察了HPSE ASODN的体内抑瘤作用,结果显示HPSE ASODN在体内能够抑制肿瘤的生长及血管生成,为HPSE ASODN应用于临床治疗提供了理论依据,有望成为肺癌治疗的一种新途径。

摘要：目的 探讨乙酰肝素酶反义寡核苷酸(HPSE ASODN)对人肺癌A549细胞裸鼠皮下移植瘤的抑制作用。方法 设计合成互补于HPSE mRNA起始密码区的HPSE ASODN,以阳离子脂质体Lipofectamine包埋后转染人肺癌A549细胞进行培养。实验分ASODN组、脂质体组和对照组,采用Western-blotting检测各组A549细胞HPSE蛋白的表达;将反义寡核苷酸(ASODN)转染成功的人肺癌A549细胞注射于裸鼠皮下复制移植瘤模型(ASODN组),绘制移植瘤生长曲线,以免疫组织化学方法检测移植瘤肿瘤微血管密度(MVD),比较3组间肿瘤体积和MVD的差异。结果 与对照组和脂质体组比较,ASODN组A549细胞HPSE蛋白的表达受到明显抑制,差异有统计学意义(P<0.01);ASODN组裸鼠成瘤时间晚,移植瘤体积明显小于脂质体组和对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。ASODN组、脂质体组和对照组移植瘤的MVD计数分别为(13.5±1.8)、(24.3±2.5)和(24.7±2.6),与脂质体组、对照组比较,ASODN组MVD计数明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 HPSE ASODN明显抑制裸鼠人肺癌移植瘤的生长和血管生成,有希望成为一种有效的肺癌基因治疗方法。

人肺癌细胞/药理学 篇7

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 材料

pcDNA3.1、阳离子脂质体 (lipofectamin peagant) , 购自Invitrogen公司;受体菌E.coli DH5α, 由东北农业大学生命科学与技术研究中心提供。鸡贫血病毒, 由东北农业大学生命科学与技术研究中心分离自哈尔滨郊区某鸡场, 命名为哈尔滨株;人肺癌细胞A549, 由北京第一医科大学惠赠。

1.1.2 试剂 Sma

Ⅰ、BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ、Sal Ⅰ、XbaⅠ, 购自New England BioLabs公司;dNTPs、其他限制性内切酶、T4 DNA连接酶, 购自宝生物工程 (大连) 有限公司;DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒, 购自上海华舜生物工程有限公司;Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒, 购自南京凯基生物科技发展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒DNA的分离

给1日龄SPF鸡接种鸡贫血病毒, 接种第7天取病鸡肝脏, 冷却后置于-20 ℃保存, 备用。

取因典型贫血病致死鸡的肝脏进行匀浆, 4 000 r/min离心并收集上清液, 加蛋白酶K和10%SDS至终浓度分别为300 μg/mL和0.5%, 37 ℃消化过夜。分别用酚、酚-氯仿、氯仿各抽提1次, 再用乙醇沉淀, 收集沉淀, 干燥后用TE溶解, 备用。

1.2.2 VP3基因克隆、测序

根据GenBank中报告的cDNA序列, 用Primer Premier 5.0引物设计软件设计出1对寡核苷酸引物 (由上海生工生物工程技术服务有限公司合成) :primer 1为5′–ATGAACGCTCTCCAAGAAG–3′, primer 2为5′–GCCATCTTACAGTCTTATACGC –3′。PCR反应程序:94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min, 55 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 mim, 30个循环;最后72 ℃延伸5 min 。反应结束后用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测结果, -20 ℃保存, 备用。

回收纯化PCR产物用T4 DNA聚合酶将其末端补平后, 与用Sma Ⅰ消化的pUC18连接, 将重组质粒转化感受态细胞DH5α, 挑取若干个单菌落分别进行质粒扩增、提取。重组质粒pUC-VP3经PCR鉴定目的片段应为366 bp, EcoRⅠ和BamH Ⅰ双酶切鉴定目的片段应为390 bp, Pst Ⅰ酶切鉴定目的片段应为320 bp。将初步鉴定为重组质粒的菌液用质粒抽提纯化试剂盒提取质粒DNA, 对阳性克隆菌液进行测序。

测序反应见CEQ8000操作流程。收集GenBank数据库中收录的鸡贫血病毒基因, 在NCBI中用BLAST将克隆的基因与GenBank数据库进行序列比较, 用Gene Runner软件 (3.0版) 对VP3 DNA序列和氨基酸组成进行排序和数据整理。

1.2.3 VP3真核表达载体的构建

将经测序后的pUC-VP3用BamH Ⅰ和Xba Ⅰ把目的片段切下, 同时用相同的两种酶处理真核表达载体pcDNA3.1, 胶回收双酶切产物并连接, 质粒经相应的酶切鉴定无误后进行测序确证读码框正确, 获得pcDNA-VP3真核表达体系。

1.2.4 细胞培养及基因转染人肺癌细胞A549

人肺癌细胞A549在含10%胎牛血清的DMEM培养基于37 ℃、5%CO2的条件下培养, 待细胞生长汇合达80%时用0.25%胰酶消化, 1∶3传代, 选取对数生长期细胞进行试验。LipofectamineTM2000介导的基因转染按说明书进行。

1.2.5 RT-PCR检测

待细胞融合度达70% ～80%时常规消化、收集细胞, 用异硫氢酸胍一步法提取培养细胞中的总RNA, 在MLV逆转录酶的作用下以Oligo-dT为引物合成cDNA, 然后扩增特异的片段。同时以未转染细胞为空白对照和空质粒转染的细胞为阴性对照。

1.2.6 流式细胞术检测转染后基因诱导凋亡的细胞

收集转染前、转染后各时段的人肺癌细胞A549, 胰酶消化后制备成单细胞悬液 (用PBS调整细胞浓度至1×106个/mL) , 具体操作程序按Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒进行。

1.2.7 MTT法检测不同处理组A549细胞增殖情况

取空白对照组、阴性对照组、试验组不同时段 (12, 24, 48, 72 h) 细胞, 用MTT法检测细胞生长抑制率, 每组均设6个复孔。在酶联免疫检测仪上测定各孔的光吸收值OD490, 记录结果并绘制A549细胞增殖抑制曲线[4], 数据进行单因素方差分析, 以undefined表达结果, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 重组质粒pUC-VP3的鉴定结果 (见图1、图2)

1.PCR产物;2.DL-2 000 Marker。

1.EcoRⅠ/BamH Ⅰ双酶切产物;2.Pst Ⅰ酶切产物;3.λ-EcoT14。

图2中泳道1为pUC-VP3经EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ消化的产物;泳道2为经Pst Ⅰ消化的产物, 重组质粒出现约390 bp、320 bp的电泳条带, 与预期相符。

2.2 测序结果

随机挑选3个正向连接的阳性克隆, 所测得的序列完全相同, 该基因的开放读码框为366 bp, 编码121个氨基酸。有1个典型的核定位区, 氨基酸位置为111～121个 (RPRTARRRIRL) 。从氨基酸组成计算VP3等电点的理论值为10.02。在GenBank数据库中, 克隆的基因与CAV-1的VP3基因序列完全一致。

2.3 重组质粒pcDNA-VP3的酶切鉴定结果 (见图3)

1.DL-15 000 Marker;2.pcDNA-VP3;3.pcDNA-VP3经BamHⅠ /Xba Ⅰ双酶切的产物。

泳道3为pcDNA-VP3经BamH Ⅰ、Xba Ⅰ双酶切产物, 得到约400 bp的片段, 与预期相符。

2.4 RT-PCR检测结果 (见图4)

1.DL-2 000 Marker;2.空白对照;3.阴性对照;4.RT-PCR产物。

由图4可见, 泳道4为RT-PCR扩增产物, 得到长度约为400 bp的特异片段, 与预期相符, 非转染细胞和转染空质粒的细胞未出现阳性扩增。

2.5 流式细胞术检测结果 (见图5)

注:Ⅰ、Ⅲ.24 h、72 h阴性对照样本;Ⅱ、Ⅳ.转染后24 h、72 h试验组样本。

由图5 (左下象限FITC-/PI-显示为活细胞, 右下象限FITC+/PI-为早期凋亡细胞, 右上象限FITC+/PI+为非活细胞即坏死细胞和晚期凋亡细胞) 可以看出:24 小时时凋亡细胞由早期凋亡细胞组成;72小时时凋亡细胞由中晚期凋亡细胞细胞组成。试验组随着时间的推移凋亡细胞明显增多, 说明鸡贫血病毒VP3基因是以凋亡的方式诱导细胞死亡的。

2.6 MTT法检测结果 (见图6)

由图6可见:试验组细胞的增殖明显比阴性对照组和空白对照组细胞缓慢。A549细胞在12小时时细胞生长抑制率在各试验组间差异无统计学意义, 24, 48, 72 h的细胞生长抑制率分别为20.1%、40.7%、49.5%, 呈升高趋势, 提示VP3对A549细胞的生长具有抑制作用。

3 讨论

目前, 尚未见有关VP3基因促进肺癌细胞凋亡的研究。试验构建了pcDNA -VP3的真核表达载体, 并转入人肺癌A549细胞中, 证实VP3基因在体外对人肺癌细胞有明显的诱导凋亡作用, 抑制肺癌细胞增殖, 提示VP3有望成为一种有效的肿瘤抑制剂 (尤其是在肺癌治疗) 。

参考文献

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