巨噬细胞/药理作用

巨噬细胞/药理作用（共5篇）

巨噬细胞/药理作用 篇1

摘要：肝脏巨噬细胞在慢性肝损伤的发病机制中占有重要位置。肝脏巨噬细胞的抗原呈递功能缺陷, 导致机体不能及时将抗原信号呈递给吞噬细胞, 清除能力下降, 最终导致免疫机制损伤, 造成肝细胞炎性坏死。肝脏巨噬细胞具有异质性, 可分为“具有促炎性作用的”M1巨噬细胞和“具有免疫调节作用的”M2型巨噬细胞, 在肝脏出现损伤时可相互转化, 肝脏巨噬细胞细胞最基本的功能是平衡持续不断的免疫刺激及产生免疫耐受。肝脏巨噬细胞表面表达抗原呈递分子, 具有抗原呈递功能。本文重点介绍CD40、CD80、HLA-DR等抗原呈递分子在慢性肝损伤发病机制中的作用。

关键词：巨噬细胞,抗原呈递,慢性肝损伤

肝脏巨噬细胞是具有异质性的免疫细胞, 在内环境的稳态、疾病的进展及转归方面发挥重要的作用。巨噬细胞可以将对代谢产物或细胞碎片的清除能力及免疫耐受力维持在稳定的状态, 在启动和维持炎症反应中起重要作用。

在慢性肝损伤时, 肝星形细胞受到激活, 促进肝纤维化的形成, 通过细胞外机制的降解及抗炎性细胞因子的释放促进炎症或纤维化的消退。近几年来研究发现, 造成慢性肝炎的免疫耐受的持续存在, 是由于肝脏巨噬细胞的抗原呈递功能缺陷所致。后者不能及时将抗原信号呈递给吞噬细胞, 使细胞凋亡降解的产物———凋亡小体大量不能及时被吞噬, 导致凋亡小体大量积累、破裂, 释放自身抗原, 启动免疫反应[1,2], 本文参考国内外文献, 对肝脏巨噬细胞异质性及其抗原呈递功能的研究进展做一综述。

1 肝脏巨噬细胞的异质性

1.1 肝脏巨噬细胞的起源

肝脏巨噬细胞分为肝脏固有巨噬细胞, 即k u p ffe r细胞;及由骨髓分化而来起源于循环系统的单核细胞[3]。早在1 9 9 7年, N a ito及其同事提供的实验数据表明, 大部分的巨噬细胞起源于胚胎卵黄囊细胞, 在成年后依赖于M-C S F增生信号的自我更新[4,5]。朗格汉细胞 (L y-6 C) 相关单核细胞起源的巨噬细胞与慢性炎症及纤维化有关。在纤维化恢复的过程中, 单核细胞起源的细胞分化成L y-6 C低表达的“恢复期”巨噬细胞及促进损伤修复的巨噬细胞。

1.2 巨噬细胞的异质性

巨噬细胞的异质性主要表现在其所释放的细胞因子的多样性。为了能准确表达巨噬细胞功能和表型的多样性, 将其分为“具有促炎性作用的”M 1巨噬细胞和“具有免疫调节作用的”M 2型巨噬细胞[6]。M 1巨噬细胞主要与T h 1细胞结合的C D 4+T细胞接触, 而M 2巨噬细胞主要与T h 2细胞结合的C D 4 T细胞接触。当发生急性应激反应时, M 1巨噬细胞通常由I L-2, I N F-γ及脂多糖激活, M 2巨噬细胞通常是由I L-3、I L-4激活[7]。“传统巨噬细胞” (M 1) 的主要功能有清除细菌, 抗病毒, 促进炎症因子释放 (如T N F、I L-1 b, I L-1 2, 活性氧) ;“具有选择性活性的巨噬细胞” (M 2) , 主要是防御寄生虫的感染, 参与组织修复, 及调节免疫调节因子 (如I L-1 0、T G F-b、I L-4, I L-1 3) [4]。然而, 在疾病状态下, 如急性细菌性腹膜炎或慢性寄生虫感染时很难区分巨噬细胞是向传统型或向具有选择活性的巨噬细胞转化。

实际上, 肝脏巨噬细胞同时表达M 1, M 2两种亚型标记[7], 表明这种二分法不能完全适用于肝脏疾病。肝损伤小鼠动物模型实验表明, 肝脏巨噬细胞亚型的功能取决于他们的起源[8]。

1.3 肝脏巨噬细胞在调控肝脏免疫微环境中的作用

肝脏巨噬细胞最基本的功能是平衡持续不断的免疫刺激及产生免疫耐受[8]。缘于肝脏特殊的血液供应系统, 肝脏巨噬细胞持续暴露于高浓度的外源性抗原及来自肠道共生的细菌中。通过其细胞膜表面存在的大量清除因子及膜识别受体, 清除免疫调节物质, 参与最基本的炎症反应, 构建肝脏固有免疫反应。

在机体稳态环境下, 肝脏具有全身最丰富的巨噬细胞, 肝脏巨噬细胞池在炎症期间扩大。当机体遭遇重创时, 肝脏固有巨噬细胞迅速分泌促炎性细胞因子及炎症趋化因子如I L-1 b, T N F, C C L 2, C C L 5等, 导致细胞旁途径的激活, 或是启动肝细胞凋亡途径, 或是导致促进肝细胞损伤的免疫细胞的聚集[9]。另外, 炎症刺激、代谢物质也均可以激活肝脏巨噬细胞。脂肪性肝病及脂肪性肝炎中巨噬细胞模型中, 观察到的过量脂类或胆固醇聚集证明了这一点[10,11]。

肝脏窦状隙中巨噬细胞与肝脏中的间质细胞也会发生反应。一方面, 肝脏中的巨噬细胞与其他的免疫细胞相互作用:例如, 巨噬细胞分泌的C X C L趋化因子可以引起N K T细胞的聚集, N K T细胞可以促进巨噬细胞促炎性因子的释放[12]。另一方面, 巨噬细胞可促进肝形状细胞转化为肌纤维母细胞, 后者是肝纤维化过程中胶原纤维的主要来源[13,14]。

在慢性肝损伤中巨噬细胞的促炎性作用具有适应性, 而外周循环中单核细胞由于趋化因子C C L 2的作用, 促炎性作用反而降低了[15]。早期浸润的单核细胞引起器官损害, 反之, 肝脏固有细胞完成分化后, 这些细胞即获得了永久定植的能力。最近, 在小鼠实验中的数据表明, 表达L y-6 C肝脏巨噬细胞能分解纤维。其在组织受损后恢复期出现聚集, 具体机制有待进一步研究[7]。

转录序列分析表明表达L y-6 C肝脏巨噬细胞的功能并不能用传统的M 1、M 2的分类方法来表述。这些巨噬细胞一个显著地特点是它们具有强大的吞噬功能, 因为当细胞吞噬脂质体后可以加速细胞外机制的降解[7]。有趣的是, 即使在肝损伤终止后, 表达L y-6 C的巨噬细胞仍有物质流入细胞内, 通过生成T N F等促炎性细胞因子来减缓纤维化的进程。在纤维降解的过程中, 阻止C C L-2依赖物质的流入, 甚至是促进纤维瘢痕的清除[16]。以上研究表明循环中的巨噬细胞可以加速肝损伤, 而肝脏固有的巨噬细胞可以促进损伤的修复。

在人的肝脏中存在不同数量的巨噬细胞, 包括“经典的”C D 1 4++C D 1 6-及“非经典的”C D 1 4+C D 1 6+单核-巨噬细胞[17]。从慢性肝炎进展到肝纤维化并最终发展为肝硬化都与“非经典的”C D 1 4+C D 1 6+细胞有关, 这种细胞起源于肝病病人循环中的单核细胞[18]。这种巨噬细胞的聚集可能存在以下两种机制:通过窦状隙内皮细胞炎症募集及局部C D 1 4++C D 1 6-细胞的转化[17]。在小鼠肝损伤中, 巨噬细胞由L y-6 C+向L y-6 C l o转变[19]。

机体血液循环中CD14+CD16+单核细胞与Ly-6Clo具有相同的表型[20]。但在肝脏中CD14+CD16+巨噬细胞与小鼠中单核细胞起源的巨噬细胞具有相似的功能, 即释放促炎性因子及纤维调节因子[17]。另一方面, 人肝脏中的CD14+CD16+巨噬细胞具有强大吞噬细菌的能力, 这是小鼠肝脏"固有"的巨噬细胞 (Ly-6Clo) 的特点[7]。在人及小鼠巨噬细胞亚型之间功能上是相互重叠还是相互抑制, 这需要进一步研究。很有可能, 我们目前定义的不同肝脏巨噬细胞, 各个细胞亚群中在功能上存在重叠, 这些细胞亚型在分化标记及基因表型方面有待研究。

2 肝脏巨噬细胞呈递功能在慢性肝损伤的作用

肝脏kuppfer细胞是抗原呈递细胞之一, 可将抗原摄取、加工, 经处理后呈递给T淋巴细胞和B淋巴细胞[21]。多种抗原呈递分子均可在肝脏巨噬细胞表达, 如CD40、CD80、HLA-DR等。

2.1 CD40与肝脏疾病

CD40的分子质量为48~50K D, 属I型跨膜糖蛋白, 是肿瘤坏死因子受体超家族成员之一[22]。主要表达于不同分化阶段的B细胞、T细胞、单核-巨噬细胞、树突状细胞 (D C) 等[23,24]。C D 4 0与其配体 (CD40L) 相互作用, 广泛参与免疫应答调节和炎症反应, 包括细胞增殖、成熟、凋亡, 以及调节包括细胞因子、趋化因子和黏附分子在内的炎症介质的表达。CD40-CD40L共刺激途径是指在首先未活化的抗原提呈细胞处理抗原, 形成M H C-抗原肽复合物, 再以M H C-抗原肽复合物的形式向幼稚的T淋巴细胞传递信号 (第一信号) , 上调T淋巴细胞表面CD40L分子的水平;其次T淋巴细胞表面的C D 4 0 L分子与抗原呈递细胞CD40相结合, 经活化的抗原呈递细胞可以上调B 7-1、B 7-2等共刺激分子, 增强了共刺激的活性, 传递第二信号, 进一步以活化T淋巴细胞[25]。

Schmilovitz的研究发现慢性病毒性肝炎、爆发性肝炎和肝细胞癌患者血清sCD40的浓度较健康人显著增高 (P<0.001) [26]。研究发现血清sCD40的浓度与丙氨酸氨基转移酶 (ALT) 和天门冬酸氨基转移酶 (AST) 明显正相关, 提示血清sCD40可作为肝损伤的评价指标[26]。

2.2 H L A-D R与肝脏疾病

T淋巴细胞识别外来抗原执行免疫功能受组织相容性复合体-Ⅱ类分子的限制, 其中以H L A-D R抗原分子最具有代表性。H L A-D R是一种M H C-I I类分子, 含有2个分子量分别为3 6 k D和2 7 k D的亚基 (α亚基和β亚基) 。H L A-D R表达于B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、活化T淋巴细胞、活化N K淋巴细胞等。H L A-D R分子参与抗原呈递过程, 促进抗体产生及细胞毒性T淋巴细胞活化[18]。B o o t h等人证明了抗原-抗体表现能力与H L A-D R、C D 8 0的表达水平密切相关。P o d h o r z e r等研究发现H L A-D R和1型的儿童自身免疫性肝炎之间的强关联性。

2.3 C D 8 0与肝脏疾病

C D 8 0是免疫球蛋白超家族之一, 其配体是C D 2 8和C D 1 5 2 (C T L A-4) 。C D 8 0分子量为6 0 k D, 表达于活化的B淋巴细胞、T淋巴细胞、单核-巨噬细胞及树突状细胞等, 而非活化B淋巴细胞、红细胞、粒细胞及核细胞上不表达。活化T淋巴细胞时, C D 8 0是C D 8 6的协同刺激因子, 可起到监控自身免疫、调节体液免疫应答及调控移植反应的重要作用是T淋巴细胞活化时必需的膜抗原。T淋巴细胞活化时, T淋巴细胞的T C R/C D 3和抗原呈递细胞 (A n tig e n p r e s e n tin g c e ll, A P C) 的M H C结合。C D 8 0单克隆抗体遏制C D 8 0的辅助刺激作用, 阻止B淋巴细胞向浆细胞 (抗体产生细胞) 的分化及T淋巴细胞对同种抗原的反应。

王鹏等[27]应用变形杆菌对H B V患者和健康人群的D C细胞表面表达的C D 8 0、C D 8 6共刺激分子进行了研究, 结果表明H B V患者树突细胞 (D e n d r itic c e l l s, D C) 细胞表达的共刺激分子C D 8 0和C D 8 6在变形杆菌作用下显著增加.可能与慢性乙型肝炎感染者存在D C免疫缺陷, 在抗原刺激后由不成熟D C转化为成熟D C, D C细胞表面标志表达增加, 有利于抗原提呈和诱导免疫应答反应。翟守恒等[28]人研究发现在肝恶性肿瘤中C D 8 0表达下降率下降, 可能是肝细胞癌免疫逃逸的机制之一。

综上所述, 单核-巨噬细胞功能异常与慢性肝损伤的发病密切相关。肝脏巨噬细胞可表达多种抗原呈递分子, 抗原呈递分子的变化可导致免疫功能的改变。今后仍需进一步研究肝脏巨噬细胞抗原呈递分子的表达变化对肝脏免疫功能的影响。

巨噬细胞/药理作用 篇2

1 资料与方法

1.1一般资料

选取2012年1～12月进入我院治疗的结核患者30例, 其中男16例, 女14例;年龄24～66 (平均43) 岁。健康人为本院体检中心健康体检者。

1.2 试剂与仪器 人淋巴细胞分离液为上海华晶生物高科技有限公司RPMI-1640培养液, 小牛血清为杭州四季青公司产品, FITC-CD14抗体购自日本BECKMAN-COULTE公司。所有试剂均在有效期内使用, 完全按照说明书进行操作。

1.2 方法

1.3.1 巨噬细胞分离培养鉴定 取健康人肝素锂抗凝静脉血30ml, 混合分装到10个离心管, 用RPMI-1640液稀释1倍进行充分混匀, 缓慢加入等比例淋巴细胞分离液于离心管中, 2000转/min, 离心20min, 吸取中间环状云雾状淋巴细胞层, 再以3ml PBS液混匀, 1500转/min离心洗涤2次, 用含10%小牛血清的RPMI-1640各5ml将细胞吹开混匀, 取细胞悬液至培养瓶, 每瓶4ml, 于37℃ 5%CO2培养箱中培养, 培养至4代后于细胞指数生长期进行诱导转化, 诱导转化后, 待细胞转化为巨噬细胞后继续培养48h台盼蓝染色确定巨噬细胞存活率, 用特异性荧光素标记的CD14细胞表面抗体行流式细胞术进行单核细胞源性巨噬细胞鉴定。

1.3.2 培养方法 取在罗氏培养基生长良好的结核分枝杆菌以及由中国药物生物制品鉴定所提供的卡介苗菌株 (BCG) 分别取2～3w的培养物, 用生理盐水配置成菌悬液 (1mg/ml) 。

1.3.3 结核分枝杆菌感染巨噬细胞模型的建立 取细胞培养板, 在培养板上加细胞悬液, 置37℃ 5%CO2细胞培养箱中孵育24h;移去培养液, 用预温的不含血清的DMEM培养液洗涤细胞培养板2次, 去除非贴壁细胞;每孔加2ml细菌悬液, 使细菌与巨噬细胞的比例为10:1。培养板置37℃5%CO2培养箱中孵育。分别于感染1、3、6及12h后收集细胞, 检测凋亡率。流式细胞仪Annexia V+/PI双染法检测结果, 以Annexia V+/PI-判断为早期凋亡, 以Annexia V+/PI+判断为晚期凋亡, 两种凋亡率之和为总凋亡率。分别做好病人结核分支杆菌组与BCG组相应的记录。

1.4统计学处理

采用SPSS 17.0软件进行统计, 组间比较采用方差分析, P<0.05具有统计学意义。

2 结果

巨噬细胞感染结核分枝杆菌后凋亡率升高, 病人结核杆菌感染组和BCG感染组比较, 差异具有统计学意义 (P<0.05) 。病人结核杆菌组和BCG结核杆菌组细胞凋亡情况见附表。

注:两组数据差别有统计学意义, P<0.05

3 讨论

结核分枝杆菌是典型的胞内致病菌, 主要在巨噬细胞等宿主免疫系统的细胞内存活和繁殖。结核分枝杆菌会诱发一种名为一氧化氮合酶的物质, 这种物质对巨噬细胞的吞噬有着很强的抵抗作用, 从而减轻巨噬细胞对于结核杆菌的杀伤[3]。因此, 这种物质的存在, 以进一步的减轻了巨噬细胞对于结核杆菌的吞噬作用, 保护了结核分枝杆菌在巨噬细胞中的寄生和繁殖。巨噬细胞将吞噬进去的结核分枝杆菌的蛋白降解为一种能够具有免疫作用的小分子肽段。这些小分子肽段能够形成不同的抗原表位, 与原表位分子结合后, 呈递到巨噬细胞表面, 与T细胞相互作用, 从而产生对T细胞的活化, 随即产生结核分枝杆菌的抗原特异性T细胞, 进一步促进巨噬细胞对结核分枝杆菌的吞噬和杀伤。从本实验可以看出, 结核杆菌可以诱发巨噬细胞的凋亡, 通过以上两组数据分析发现, 从病人痰培养出来的结核菌比BCG结核菌的毒力要强一些, 因此引起巨噬细胞凋亡率也要高一些。

通过上述对结核分枝杆菌与巨噬细胞之间的作用关系的分析, 我们认识到, 结核分枝杆菌在巨噬细胞内大量寄生与繁殖是诱发结核病的一个重要的原因。结核病的大量蔓延与传染给人类带来了巨大的伤害, 结核分枝杆菌寄存在巨噬细胞中, 并通过与巨噬细胞的相互作用诱发结核病。目前对结核病研究发现了巨噬细胞与结核分枝杆菌的一些相互作用的关系, 但是, 由于巨噬细胞与结核分枝杆菌作用关系的复杂性, 在目前的临床医学水平上, 还无法真正地完全破译巨噬细胞与结核分枝杆菌复杂的关系, 有待医学水平的进一步提高, 从而进行更深一步的研究。相信, 随着医疗水平的不断提高, 对结核分枝杆菌与巨噬细胞之间关系的进一步研究, 一定能够破译两者之间的关系, 从而寻找到有效治疗结核病的方法, 为结核病患者解除病痛的折磨, 减少传染性疾病对于大众的危害。

参考文献

[1]Brousseau P, Pellerin J, Morin Y, et al.Flow cytometry as a tool to-monitor the disturbance of phagocytosis in the clam Mya arenariahe-mocytes following in vitro exposure to heavy metals[J].Toxicology, 2000, 142 (2) :145-156.

[2]赵修春, 姚春艳, 李柏青, 等.流式细胞术检测小鼠中性粒细胞吞噬功能的方法学探讨[J].蚌埠医学院学报, 2004, 29 (5) :388-390.

巨噬细胞/药理作用 篇3

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药材

川赤芍、赤芍、白芍均为自购,经北京中医药大学刘春生教授鉴定:川赤芍为毛茛科植物川赤芍Peaonia Veitchii Lynch的干燥根,赤芍、白芍分别为毛茛科植物芍药Peaonia lactiflora Pall.未去皮和经去皮水煮后的干燥根。

1.1.2 细胞

大鼠肺泡巨噬细胞系(NR8383)购于中国科学院细胞库,由本室传代后使用。

1.1.3 试剂

LPS(sigma, D127:B8,L3129-10 m g,LOT N O.:020M4062);F12 K培养基(GIBCO,500 m L,LOTNO.:979454),双抗(Hyclone,100m L,LOT NO.:J110981)和胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司,100m L,LOT NO.:100419);四甲基偶氮唑蓝(MTT)(Amresco,50mg);DMSO(Amresco,500m L,LOT#0640C354)

1.2 方法

1.2.1 川赤芍、赤芍、白芍醇提物的制备:

将川赤芍、赤芍、白芍的干燥根粉碎,精密称取25 g粉碎后的药材,分别用8倍量70%乙醇加热回流提取2次,每次2h,合并药液,减压浓缩干燥。精密称取各提取物干粉100mg置10m L容量瓶中,加PBS稀释至刻度,配成10mg/m L的原药浓度,4℃保存备用,即得川赤芍醇提物、赤芍醇提物、白芍醇提物。

1.2.2 细胞培养:

NR8383细胞培养于含15%胎牛血清、青霉素(1×105U/L)、链霉素(100mg/L)、L-谷胺酰胺(2 mmol/L)、Na HCO3(1.5g/L)的Ham’s F12K培养基中,置于37℃,5%CO2培养箱中。1.2.3 LPS对NR8383细胞活性分析:待NR8383细胞生长状态良好时,吹打消化细胞,用培养液调整细胞浓度至1×105个/m L,将该细胞液加入96孔板中,200μL/孔,每组设6个复孔。培养24h后给予LPS溶液(LPS溶于PBS,终浓度分别为1μg/m L),正常细胞对照组加PBS。作用1h、3h、6h、12h、24h、36h后,每孔加入MTT 20μL,继续培养4h,吸尽液体后每孔再加入DMSO溶解液150μL,震摇5min,待紫色结晶全部溶解后,酶联免疫检测仪测A570值,计算LPS对NR8383的抑制率。

1.2.4 川赤芍、赤芍、白芍醇提物对LPS致NR8383细胞活性作用分析:

细胞铺板同1.2.3所示。实验设川赤芍、赤芍、白芍醇提物(终浓度为10μg/m L)组,孵育1h,再加入LPS(1μg/m L)。同时设正常细胞对照(不用LPS刺激)组、LPS对照(LPS刺激后加入PBS)组。培养1h、3h、24h后,MTT法检测A570值,计算各给药组及LPS组对NR8383的抑制率。各组实验均重复3次。

1.2.5 统计学方法:

实验数据采用SPSS16.0统计软件进行统计学分析,多组间差异采用单因素方差分析(One-way ANOVA),组间比较采用S-N-K检验分析,结果用表示,P<0.05为有显著性差异,细胞抑制率(%)=1-药物组/正常细胞对照组,设正常对照组抑制率为0%。

2 结果

2.1 LPS对NR8383细胞活性作用分析结果

MTT法检测的结果显示,1μg/m LLPS刺激NR8383细胞后,在不同时间段呈现出截然相反的作用。即6h之前起到诱导NR8383细胞持续过度激活的作用,而6h之后却又显著地抑制其增殖,LPS对NR8383的抑制率24h达到最大值,之后有所降低,这与LPS对其损伤是可逆的相一致。LPS对NR8383抑制率结果见图1。

2.2 赤芍、白芍醇提取物对LPS所致NR8383细胞增殖作用结果

MTT法检测的结果显示,川赤芍醇提物、赤芍醇提物、白芍醇提物组作用1h时,三组均不能拮抗LPS诱导NR8383过度活化,与对照组比较均无显著差异(P>0.05);随着作用时间的延长,至3h时川赤芍醇提物、赤芍醇提物、白芍醇提物组都表现出拮抗作用,与LPS对照组比较均有显著差异(P<0.05),但三组之间无显著差异(P>0.05),这说明三者的作用效果相近;24 h时川赤芍醇提物、赤芍醇提物、白芍醇提物组能够拮抗LPS诱导NR8383过度凋亡,与LPS对照组比较均有显著差异(P<0.05)。同时,川赤芍组、赤芍组与白芍组之间也存在差异(P<0.05),这说明白芍组作用效果较川赤芍、赤芍稍弱。而川赤芍组与赤芍组之间无差异(P>0.05)。结果见图2。

3 讨论

赤芍、白芍均具有活血化瘀的作用,但是“白补而赤泻,白收而赤散”的理论使得二者在临床上各自为药,不可混用。然而从药材基源看,明清之前,医药学家多以花和根的颜色来加以区别—花、根色白者谓之白芍,赤者谓之赤芍,可谓基源不清。当代药典中二者的基源也有相互交叉的部分,而且目前质量标准不足以体现二者在功效上的差异。需药效实验补捉到功效成分的差异后,通过进一步研究确定功效成分组,进而有区别的制定质量标准,保证临床与生产用药的质量。赤芍长于凉血,白芍长于补血,故二者的功效差异主要体现在凉血和补血两个方面。其中赤芍、白芍补血作用的比较研究已另文发表[2,3]。本课题则从凉血方面入手。

根据温病卫气营血的理论体系,温病血分证是指温邪深入血分,引起耗血动血,瘀热互结所出现的证候[4],其多发生于多种急性感染性和传染性疾病的危重阶段,而急性肺损伤(ALI)是此阶段最易出现的一种并发症。ALI发病机制复杂,至今尚未完全阐明。但是,诸多组织学及病理学研究表明,早期过度的宿主应答反应和后期免疫细胞的异常凋亡是介导ALI病理损伤的关键原因[5,6]。中医对此则认为热毒深入血分,迫血妄行是导致进一步血分证其它病变的原始动因,治疗应首当立足于清热凉血。由此可见,中医凉血的治法应当与机体的免疫异常密切相关。

肺泡巨噬细胞在ALI的发生、发展及转归的免疫反应中占有重要地位[7]。鉴于此本课题选择大鼠肺泡巨噬细胞NR8383细胞炎性损伤模型,观察LPS对大鼠肺泡巨噬细胞NR8383细胞活性的影响及赤芍、白芍对LPS致NR8383细胞活性改变的作用。实验结果表明,肺泡巨噬细胞受LPS刺激后,首先过度持续活化表现在抑制率为负值,3h达到峰值,而后逐渐减缓6h后逐渐转为快速凋亡,这与介导ALI病理损伤的过程是一致的,进一步表明了肺泡巨噬细胞早期过度的应答以及后期异常的凋亡是导致肺组织细胞损伤的关键。在这一过程中,赤芍、川赤芍与白芍早期能够抑制LPS诱导的肺泡巨噬细胞的过度激活,防止引起呼吸爆发;后期又能够减少肺泡巨噬细胞的凋亡,起到保护肺损伤的作用。说明三者均对LPS诱导NR8383细胞活性的变化起到双向调节免疫反应、维持稳态的作用。但是,在LPS诱导后期,川赤芍、赤芍的作用明显优于白芍,这说明二者在凉血方面确有差异,是在共同具有凉血功效的前提下有所偏重。由此可见,今虽已有“白补赤泻”的择药趋向,但二者在凉血方面是具有共同的物质基础的,在临床上应可以交叉互换,这可通过以后的“功效成分组”的研究加以进一步验证。

摘要：目的 观察赤芍、白芍各醇提物对脂多糖(LPS)致大鼠肺泡巨噬细胞(NR8383)不同时间段活性的影响,比较赤芍、白芍各醇提物的凉血作用的异同。方法 采用四甲基偶氮唑盐比色(MTT)法检测LPS(1μg/mL)对NR8383细胞不同时间点的抑制率及赤芍、白芍(10μg/mL)对LPS诱导NR8383活性的调节作用。结果 1μg/mLLPS刺激NR8383 6h之前抑制率为负值之后逐渐转为正值,即先诱导其过度激活后促进其凋亡;观察到川赤芍、赤芍、白芍给药组能够在3h时显著抑制NR8383的过度活化,与LPS对照组比较具有显著差异(P<0.05);24h时各药物组均能够显著抑制NR8383的异常凋亡,与LPS对照组比较具有显著差异(P<0.05);24h时川赤芍、赤芍组与白芍组之间有显著差异(P<0.05)。结论 赤芍、白芍是在共同具有凉血功效的前提下有所偏重。

关键词：赤芍,白芍,脂多糖,大鼠肺泡巨噬细胞,细胞抑制率

参考文献

[1]中国国家药典委员会.中国药典(一部)[S].北京:中国医药科技出版社,2010:96.

[2]李强,周荣,杨伟鹏,等.赤芍、白芍补血作用比较研究(Ⅰ)[J].中医药信息,2010,27(6):11-13.

[3]李强,周荣,杨伟鹏,等.赤芍、白芍对环磷酰胺所致的血虚证小鼠补血作用比较研究[J].中医药信息,2011,28(1):19-21.

[4]林培政.温病学[M].北京:中国中医药出版社,2003:21.

[5]吕进,王希良.流感病毒感染介导的免疫病理损伤研究进展[J].生物化学与生物物理进展,2009,36(8):961-967.

[6]Kitsmura Y,Hashimoto S,Mizuta N,et al.FasPFasL-dependent apoptosis of alveolar cells after lipopolysaccharide-induced lung injury in mice[J].Am J Respir Crit Care Med,2001,163(3Pt1):762-769.

巨噬细胞/药理作用 篇4

关键词：TSF,脂多糖,RAW264.7,炎性损伤

脑缺血是以脑循环血流量减少为特征的中枢神经系统疾病, 其发病率、致残率及病死率均较高, 严重影响人类的生活和生存质量[1,2]。炎性反应是其中一种非常常见且十分重要的基本病理过程, 探讨脑缺血炎性反应对临床防治脑损伤具有重要意义[3,4]。吡拉格雷钠 (Tetramethylpyrazine-2'-O-SodiumF erulate, TSF) 由川芎嗪和阿魏酸结构生成。大量研究表明, 川芎嗪与阿魏酸均具有扩张血管增加脑血流, 降低血小板活性等作用[5]。但川芎嗪代谢快半衰期短, 阿魏酸治疗疗效并未理想。本实验受试药TSF, 在川芎嗪的结构基础上引入阿魏酸, 增强了结构的稳定性, 阻滞药物失活代谢, 是为脑缺血中风疾病领域内一新型而有效的药物, 同时以药效明确的奥扎格雷为阳性药作参考。前期结果显示TSF有很好的抗血小板聚集作用及对脑缺血的保护作用[6], 但对TSF炎性作用研究较少, 本实验从炎性反应角度对TSF展开研究, 建立LPS致小鼠巨噬细胞系RAW264.7炎性反应模型, 初步探讨TSF的抗炎效果, 为减轻脑中风患者炎性反应提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料RAW264.7小鼠单核/巨噬细胞系 (购自A-merican Type Culture Collection) , TSF (合肥医工医药有限责任公司) ;DMEM高糖培养液 (Gibco公司) , 胰酶 (Gibco公司) , 特级胎牛血清 (杭州四季青公司) , 100青霉素—链霉素溶液 (Biosharp公司) , 乳酸脱氢酶 (LDH) 试剂盒 (南京建成生物工程研究所) , 一氧化氮 (NO) 测试盒 (南京建成生物工程研究所) , 噻唑兰 (MTT) (Biosharp公司) , 脂多糖 (LPS) (Sigma公司) 。

1.2 实验仪器微孔板分光光度计 (Biotek Eon公司) , 倒置荧光显微镜 (BioT ek Leica公司) , 高压灭菌锅 (上海博迅实业有限公司医疗服务厂) , 电热恒温鼓风干燥箱 (上海新苗医疗器械公司) , 80-2型电动离心机 (江苏金坛市金城国胜实验仪器厂) , JA1203精密电子天平 (上海良平一起仪表有限公司) 。

1.3 实验方法

1.3.1 TSF组及奥扎格雷钠对RAW264.7巨噬细胞存活率的影响 (MTT法) :取对数生长期的RAW264.7细胞, 经0.25%胰蛋白酶消化, 用DMEM完全培养基制成密度为2×1 04个/ml的细胞悬液, 接种于96孔培养板, 1 0 0μl/孔, 待24h贴壁后用于实验, 实验分为空白对照组, TSF 1 0-6、1 0-5、1 0-4mol/L组, 奥扎格雷钠组, 在37℃, 5%CO2条件下孵育24h, 弃去培养基, 加入MTT液 (PBS配置成终浓度为0.5mg/ml) 。继续培养4h后, 吸去上清液, 每孔加入150μlD MSO, 震荡均匀, 酶标仪 (波长为490nm处) 测定OD值, 以正常对照组细胞存活率为1 0 0%。计算各组细胞存活率。细胞存活率=A490 (样品组) /A490 (空白对照组) ×1 0 0%。

1.3.2 TSF对LPS诱导RAW264.7细胞存活率的影响:细胞培养及分组同1. 3.1, 待24h贴壁后除空白对照组及LPS组其他各组分别加入等体积的TSF及奥扎格雷钠, 使TSF终浓度为1 0-6、1 0-5、1 0-4mol/L每组, 阳性药奥扎格雷组终浓度为1 0-5mol/L, 每组4个复孔预处理1h, 之后除空白对照组不加LPS, 其余各组加入LPS, 作用浓度为1mg/ml, 继续培养24h后, MTT法 (同1. 3.1) 测定细胞存活率。

1.3.3 TSF对LPS致RAW264.7巨噬细胞损伤的细胞形态的影响与观察:采用导致显微镜在10物镜下观察LPS致RAW264.7巨噬细胞损伤及TSF对损伤细胞的修复作用。

1.3.4 LDH释放量的测定:取对数生长期的RAW264.7细胞, 用DMEM完全培养基制成密度为1×1 05个/ml的细胞悬液, 加入6孔培养板, 每孔2ml。设置空白组, LPS组, 1 0-6、1 0-5、1 0-4mol/LTSF组及1 0-5mol/L奥扎格雷组。待24h贴壁后除空白及LPS组其他各组分别加入等体积的TSF及奥扎格雷钠, 使TSF终浓度为1 0-6、1 0-5、1 0-4mol/L每组, 阳性药奥扎格雷组终浓度为1 0-5mol/L, 每组4个复孔预处理1h, 之后除空白对照组不加LPS, 其余各组加入LPS, 作用浓度为1mg/ml, 继续培养24h取上清液。按LDH测定试剂盒说明书操作, 测定细胞培养液中LDH含量。

1.3.5 NO含量的测定:方法同1. 3.4, 采用硝酸还原酶法。测定NO, 结合说明书操作, 测定细胞培养液中NO含量。

1.4 统计学方法计量资料以±s表示, 多组间两两比较采用q检验, 多组均数间的比较采用单因素方差分析 (one-way ANOVA) 。P<0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 TSF及奥扎格雷钠对RAW264.7巨噬细胞存活率的影响

TSF低中高剂量及奥扎格雷预作用对RAW264.7巨噬细胞存活率无显著影响 (P>0.05) 。见表1。

2.2 TSF对LPS诱导RAW264.7细胞存活率、LDH、NO的影响与正常组相比, LPS刺激诱导RAW264.7细胞后, 细胞存活率显著下降。给予TSF中高剂量后, 存活率显著升高, 其中以高剂量效果较为明显。相对于阳性药奥扎格雷, TSF中剂量效果优于其效果, 高剂量同样优于奥扎格雷, 但TSF低剂量与LPS组相比未表现出明显差异性。TSF对LDH与NO的影响, 与空白组相比, 模型组LDH、NO含量显著高于空白组, 给予TSF低中高剂量后, LDH含量明显降低。其中中高剂量效果显著, 优于奥扎格雷。见表2。

2.3 TSF对LPS致RAW264.7巨噬细胞损伤的细胞形态的影响与观察未经模型刺激的RAW264.7细胞体积小, 成球形, 少部分成棱形, 造模刺激后细胞形态向成树突状改变, 具体表现为胞体增大, 形态不规则, 伪足伸长。经TSF1 0-6、1 0-5、1 0-4mol/L组干预后可明显抑制模型导致的细胞形态学变化, TSF1 0-4、1 0-5mol/L干预组的抑制作用更为显著, 优于奥扎格雷组, 但最大剂量组仍达不到LPS刺激前细胞形态。见图1。

3 讨论

脑缺血再灌注 (I/R) 损伤是常见的病理生理过程, 现阶段各研究领域经常要利用I/R在其体外模型—培养细胞缺氧复氧 (H/R) 模型进行相关研究。研究证实巨噬细胞在脑缺血的发生发展中起到关键角色, 活化的巨噬细胞可通过分泌多种炎性介质介导炎性反应及组织修复[7]。为此, 本实验以巨噬细胞RAW264.7为对象, 建立了炎性细胞H/R模型, 并对其生物学意义做了初步探讨。本实验建立LPS诱导刺激RAW264.7巨噬细胞炎性模型。

MTT测定可以测定细胞存活程度, 用酶联免疫检测仪法490nm波长处测定其光吸收度, 间接反映活细胞数量[8]。TSF10-6、10-5、10-4mol/L各剂量组对RAW264.7细胞存活率无明显影响。LPS诱导RAW264.7巨噬细胞炎性反应的存活率实验中, TSF低剂量未表现出显著差异, 中剂量对细胞存活率的升高作用63.01%大于奥扎格雷54.62%, 高剂量显著优于奥扎格雷。

LDH广泛存在于脑细胞中, 当脑组织缺血缺氧时, 受损脑细胞释放出LDH经受损血脑屏障进入血液循环中, LDH活性越强。LDH是脑缺血脑组织受损时最敏感的酶, 因此测定细胞液LDH含量也就具有重要的生物意义[9]。NO是具有生物活性的气体分子, 是细胞间信息传递的重要调节因子, 并有介导细胞免疫和炎性反应毒性的功能。NO是巨噬细胞分泌的炎性因子, 参与免疫系统激活、诱导或调节基因活化等一系列生物学功能[10]。实验结果显示, TSF低中高10-6、10-5、10-4mol/L剂量均表现出显著降低模型组LDH, NO含量水平, 但其中中高剂量效果显著, 与阳性药比较, TSF中剂量对LDH, NO抑制作用略优于奥扎格雷, 高剂量明显优于奥扎格雷, 显示出TSF对LPS刺激RAW264.7炎性反应作用明显的保护作用。

LPS模型组细胞形态明显不规则, 细胞形态向成树突状改变, 胞体增大, 伪足伸长。折光性减弱。不同浓度的TSF干预, 细胞损伤明显减轻, 折光性增强, 伪足变短, 细胞体积减小, 呈现一定的形态保护作用。表明TSF对RAW264.7细胞形态有明显的改善作用。

综上所述, TSF可显著提高LPS所致RAW264.7巨噬细胞损伤状态下的存活率, 降低LDH水平, 减少NO释放量。对脑缺血炎性反应有显著改善作用, 同时希望TSF可以为广大脑中风患者带来福音。

参考文献

[2]朱晓莺, 邱有波, 杨拯.奥扎格雷钠联合依达拉奉治疗脑梗死的系统评价[J].中国循证医学杂志, 2011, 11 (8) :932-939.

[3]王蕾, 吴玉林.吡拉格雷钠对局灶性脑缺血再灌注大鼠微循环和内皮功能的影响[J].临床合理用药杂志, 2014, 7 (17) :1-2.

[4]许淑红, 尹茂山, 吴玉林.吡拉格雷钠对氧糖剥夺/复氧后星形胶质细胞水肿及AQP4表达的影响[J].中国药理学通报, 2015, 31 (12) :1661-1667.

[5]Lin YL, Wang GJ, Huang CL, et al.Ligusticum chuanxiong as a potential neuroprotectant for preventing serum deprivation-induced apoptosis in rat pheochromocytoma cells:Functional roles of mitogen-activated protein kinases[J].Journal of Ethnopharmacology, 2009, 122 (3) :417-423.

[6]徐永幸, 吴玉林.吡拉格雷钠与阿司匹林联用对脑缺血再灌注损伤的保护研究[J].安徽医药, 2014, 18 (6) :1024-1027.

[7]邓奕, 汪宁, 朱荃, 等.神经细胞损伤的细胞模型研究概况[J].中华中医药学刊, 2009, 27 (2) :374-376.

[8]张艳美, 廖晗, 郑付春, 等.巨噬细胞缺氧复氧模型的制作方法及其生物学意义[J].汕头大学医学院学报, 2013, 26 (1) :13-15, 65.

[9]Reddy DB, Reddanna P.Chebulagic acid (CA) attenuates LPS-induced inflammation by suppressing NF-kappa B and MAPK activation in RAW 264.7 macrophages[J].Biochemical and biophysical research communications, 2009, 381 (1) :112-117.

巨噬细胞/药理作用 篇5

1 材料和方法

1.1 实验材料

小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞株 (北京军事医学科学院) ;RANKL (Biovision, 美国) ;PGE2、l, 25- (OH) 2Vit D3、TRAP染色试剂盒 (Sigma, 美国) ;α-MEM培养基、胎牛血清 (FBS) (Hyclone, 美国) ;兔抗鼠Atp6v0d2多克隆抗体 (ABCAM, 英国) ;新生SPF级BALB/c小鼠 (北京维通利华实验动物公司) 。

1.2 共培养体系及实验分组

胰酶消化法培养小鼠颅骨OB[7];取第3代细胞制备细胞爬片, 应用试剂盒进行碱性磷酸酶 (ALP) 染色。将RAW264.7细胞用50 ng/ml RANKL处理48 h, 使之向OC前体分化。将第3代OB (4×103个/孔) 与RAW264.7细胞 (1×103个/孔) 混合接种于48孔板;每孔加入10-6mol/L PGE2和10-8mol/L, 1, 25- (OH) 2Vit D3, 并用10%FBS的α-MEM完全培养基37℃、5%CO2下培养。细胞分为2组:对照组和ZOL处理组;后者于共培养第3天加入5×10-7mol/L ZOL处理24 h;然后继续培养。

1.3 OC生成及功能检测

抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP) 染色:于共培养第7天收获细胞爬片, 按试剂盒说明进行染色, 显微镜下观察。400倍下随机选取5个视野, 计数每视野中TRAP染色阳性细胞 (细胞核≥3个) 数目, 取平均值。

吸收陷窝检测:于第7天收获牙本质磨片, 扫描电镜 (SEM) 观察。每磨片上随机选取5个视野 (500倍) , Med6.0图像分析系统测量5个视野吸收陷窝数目及陷窝面积, 取平均值。

1.4 Atp6v0d2基因表达检测

Real-time PCR:共培养第5d, Trizol提取细胞总RNA, 逆转录合成c DNA。引物为:GAPDH上游5'-AATGTGTCCGTCGTGGATCT-3', 下游5'-TCCACCAC-CCTGTTGCTGTA-3';Atp6v0d2上游5'-TAAGCAAG-AAGACAGGGAG-3', 下游5'-GACAGCGTCAAACAAAG G-3'。c DNA扩增后在Rotor-Gene 3000荧光定量PCR仪上进行检测。反应条件为:95℃, 15 s;60℃, 40 s;72℃, 15 s;共50个循环。系统自动读取Ct值, 并计算出待测基因与管家基因GAPDH比较的ΔCt值, 以及与对照组ΔCt值比较的ΔΔCt, 进而计算出样品的相对浓度。每组细胞取3孔标本进行检测。

免疫荧光化学检测:于共培养第5天检测, 方法见文献[3]。兔抗鼠Atp6v0d2多克隆抗体为一抗, FITC荧光标记的羊抗兔Ig G为二抗, Hoechst复染细胞核, 激光共聚焦显微镜 (LSCM) 下观察;每组随机选取6个细胞, 测量细胞FITC的平均荧光强度。

Western blot检测:共培养第5天, 提取细胞总蛋白, 测定蛋白浓度, 煮沸变性5 min, 凝胶电泳并转膜, 5%BSA室温封闭2 h, 兔抗鼠Atp6v0d2和GADPH多克隆一抗孵育过夜。二抗室温1 h, DAB显色1 min;GAPDH为对照。Image J分析软件检测膜上条带的灰度值。

1.5 统计学分析

原始数据用Excel 2003建立数据库, 结果用±s表示;SPSS 13.0统计软件对数据进行两独立样本的t检验;P<0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 OB-OC共培养体系

胰酶消化法所获小鼠OB以长梭形、多角形为主;ALP染色阳性。第3代OB与RAW264.7细胞共培养, 可以形成TRAP阳性、具有骨吸收功能的多核OC (图1A) 。

2.2 ZOL对OC生成及骨吸收功能的影响

细胞共培养至第7天, 2组均形成TRAP染色阳性多核破骨细胞 (图1A、B) , 但ZOL组所形成的OC数量显著少于对照组 (P<0.01) (表1) , 体积也较小;提示ZOL可显著抑制共培养体系中OC的生成。

牙本质磨片SEM检测见图1C、D, 吸收陷窝计数及面积见表1。SEM下2组牙本质磨片上均有不同程度的吸收陷窝;但2组比较, 对照组吸收陷窝数目较多, 陷窝面积较大;而ZOL组吸收陷窝数目较少, 面积较小 (P<0.01) ;提示ZOL可显著抑制共培养体系中OC骨吸收功能。

A、C:对照组;B、D:ZOL组

(n=5, ±s)

注:ZOL组与对照组比较, P<0.01

2.3 Real-time PCR检测结果

对照组和ZOL组Atp6v0d2基因mRNA平均相对浓度分别为 (1.006±0.132) 和 (0.357±0.097) ;ZOL组显著低于对照组 (P<0.01) ;提示ZOL可显著抑制Atp6v0d2 mRNA水平。

2.4 免疫荧光化学检测结果

LSCM检测见图2。Atp6v0d2在ZOL组和对照组细胞胞质及胞核内均呈阳性表达, 荧光强度分别为 (25.56±6.59) 和 (62.80±11.30) , ZOL组显著弱于对照组 (P<0.01) 。

2.5 Western-blot检测结果

2组细胞Atp6v0d2蛋白表达条带见图3。ZOL组蛋白灰度值较对照组明显下降, 经测量灰度值下降了38.35%。

3 讨论

破骨细胞 (OC) 是体内唯一具有骨吸收功能的多核巨细胞, 与成骨细胞 (OB) 一起参与骨代谢平衡。骨质疏松等许多骨吸收性疾病都与OC活性异常有关[2,3]。OC由骨髓内单核巨噬细胞谱系分化而来, 其分化成熟需经历3个阶段: (1) 单核巨噬细胞前体分化成TRAP及降钙素受体阳性的OC前体; (2) 单核OC前体相互融合, 形成多核OC;但缺乏皱褶缘, 没有骨吸收功能; (3) 非功能性OC在RANKL、TNFα、LPS等因子刺激下活化, 获得骨吸收活性[8]。上述阶段中任何干扰因素都会导致OC分化、细胞融合及骨吸收功能发生异常。

(FITC-Hoechst, ×600)

OC介导的骨吸收依赖于其皱褶缘上空泡性AT-Pase质子泵 (V-ATPase) , 向吸收陷窝内输送H+, 维持较低的p H值。V-ATPases至少含13个亚基, 并且许多亚基还存在不同的异构体, 呈细胞、组织特异性表达[9]。人和小鼠体内V-ATPase V0 d亚基有d1、d2两个异构体, 且均在OC中表达;其中Atp6v0d2在OC中表达更高, 说明其对OC至关重要[10]。研究表明, OC分化早期敲除Atp6v0d2, 会严重影响OC融合;而在晚期敲除, 对OC融合无影响, 但可严重抑制细胞外基质的酸化及骨吸收;提示该基因对OC融合及骨吸收发挥着重要作用[3]。Atp6v0d2基因敲除的小鼠表现出骨量显著增加, 也是因OC融合障碍所致[11]。

本研究中, 我们首先将小鼠单核巨噬细胞RAW264.7用RANKL处理48 h, 使之向OC前体分化;然后将其与OB共培养48 h。此时, 在相差显微镜下观察, 部分细胞开始聚集, 趋于融合, 但尚无多核细胞形成;提示这些细胞处于细胞融合前期阶段。此时用ZOL处理, 将不会对OC早期分化产生影响, 而只会作用于细胞融合及成熟活化阶段。结果表明, ZOL处理使TRAP阳性多核OC的数目和体积均显著低于对照组, 骨吸收功能也受到明显抑制;同时, ZOL组Atp6v0d2基因mRNA水平较对照组下降了64.9%, 蛋白下降了38.35%。上述结果提示, Atp6v0d2表达下调抑制了OC前体的细胞融合, 阻碍了多核OC的生成;从而在ZOL诱发的OC生成抑制中发挥着重要作用。需要指出的是, ZOL处理组仍有功能性多核OC生成, 可能的原因有: (1) ZOL处理时间较短 (24 h) , 作用有限; (2) ZOL处理前及处理后部分前体细胞已经 (或再次) 启动了细胞融合过程。

细胞融合是破骨细胞多核化的重要步骤, 对破骨细胞成熟至关重要。研究表明, 除Atp6v0d2外, 树突状细胞跨膜蛋白 (DC-STAMP) 同样参与了OC前体的融合;而这2个分子均受上游分子NFATc1 (nuclear factor of activated T cell type c1) 的调节[8,12]。NFATc1是NFAT家族的转录因子, 参与许多OC分化及功能基因的表达调控。NFATc1直接结合到Atp6v0d2和DC-STAMP启动子区域, 激活基因表达。在无RANKL条件下, 基因重组NFATc1同样可以通过激活Atp6v0d2和DC-STAMP基因表达, 诱发OC细胞融合, 形成多核OC;而用环胞菌素A使NFATc1失活, 则使Atp6v0d2和DC-STAMP表达下调, OC融合受到抑制[8]。我们前期研究也显示, 阿伦膦酸盐可以显著下调NFATc1基因表达, 抑制OC生成;这可能与NFATc1介导的Atp6v0d2和DC-STAMP表达抑制有关 (待发表) 。

本研究表明, 在体外OB-OC共培养体系中, 唑来膦酸可显著抑制破骨细胞生成及骨吸收功能, 并使Atp6v0d2基因表达显著下调;唑来膦酸的上述作用可能部分与其对Atp6v0d2介导的细胞融合障碍有关。

摘要：目的:研究唑来膦酸 (ZOL) 对破骨细胞 (OC) 生成的影响, 探讨Atp6v0d2基因在其中发挥的作用。方法:应用小鼠颅骨成骨细胞 (OB) 与小鼠单核巨噬细胞RAW264.7建立共培养体系。细胞分为对照组和ZOL处理组 (ZOL处理24 h) 。在不同时间点收获细胞, 检测Atp6v0d2基因表达、OC生成和骨吸收情况。结果:ZOL组TRAP染色阳性多核OC和骨吸收陷窝显著少于对照组 (P<0.01) ;Atp6v0d2基因表达在ZOL组显著下降 (P<0.01) 。结论:ZOL可显著抑制OB与RAW264.7共培养体系中OC生成和骨吸收功能, 下调Atp6v0d2基因表达。

关键词：唑来膦酸,破骨细胞生成,空泡型质子泵ATPase V0 d2亚基,抗酒石酸酸性磷酸酶

参考文献

[1]Edwards JR, Weivoda MM.Osteoclasts:Malefactors of disease and targets for treatment[J].Discov Med, 2012, 13 (70) :201-210.

[2]Kim T, Ha HI, Kim N, et al.Adrm1 interacts with Atp6v0d2 and regulates osteoclast differentiation[J].Biochem Biophys Res Commun, 2009, 390 (3) :585-590.

[3]Wu H, Xu G, Li YP.Atp6v0d2 is an essential component of the osteoclast-specific proton pump that mediates extracellular acidification in bone resorption[J].J Bone Miner Res, 2009, 24 (5) :871-885.

[4]Piper PK Jr, Gruntmanis U.Management of osteoporosis in the aging male:Focus on zoledronic acid[J].Clin Interv Aging, 2009, 4:289-303.

[5]董伟, 戚孟春, 梁永强, 等.共培养体系中阿仑膦酸钠对破骨细胞相关基因表达的影响[J].实用口腔医学杂志, 2012, 28 (6) :682-685.

[6]刘强, 董伟, 戚孟春, 等.阿仑膦酸盐对破骨细胞生成的抑制及钙离子激动剂的拮抗效应[J].实用口腔医学杂志, 2012, 28 (2) :182-186.

[7]戚孟春, 胡静, 邹淑娟, 等.大鼠骨髓间充质干细胞和颅骨成骨细胞在张应力下细胞骨架的改变[J].华西口腔医学杂志, 2005, 23 (2) :110-112.

[8]Kim K, Lee SH, Ha Kim J, et al.NFATc1 induces osteoclast fusion via up-regulation of Atp6v0d2 and the dendritic cell-specific transmembrane protein (DC-STAMP) [J].Mol Endocrinol, 2008, 22 (1) :176-185.

[9]Zhang Z, Zheng Y, Mazon H, et al.Structure of the yeast vacuolar ATPase[J].J Biol Chem, 2008, 283 (51) :35983-35995.

[10]Cipriano DJ, Wang Y, Bond S, et al.Structure and regulation of the vacuolar ATPases[J].Biochim Biophys Acta, 2008, 1777 (7-8) :599-604.

[11]Lee SH, Rho J, Jeong D, et al.v-ATPase V0 subunit d2-deficient mice exhibit impaired osteoclast fusion and increased bone formation[J].Nat Med, 2006, 12 (12) :1403-1409.