白血病细胞/药物作用（共3篇）
白血病细胞/药物作用 篇1
白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病。该细胞因分化障碍、增殖失控、凋亡受阻等机制在一些造血组织和骨髓中大量的生长、增殖, 并对其他的组织和器官浸润, 从而引发其他组织、器官的病变, 影响正常的造血功能, 使正常的造血功能受到抑制, 导致严重的后果[1]。
细胞周期 (cell cycle) 是指能持续分裂的真核细胞从一次有丝分裂结束后生长, 直至下一次分裂完成结束的循环过程。细胞周期阻滞是指真核细胞的细胞周期在形成的过程中需要大量的细胞内外的信号相互配合, 如果在这个过程中相应的信号有缺失, 细胞就不能继续从当前阶段向下一个阶段发展的现象, 这种现象称为G1/S, G2/M期阻滞。
1 将白血病细胞阻滞在G1期的调控基因
p16、p21以及p53基因使白血病K562细胞停滞在G1期的研究已经非常透彻。P16是1994年由美国冷泉实验室发现的新抗癌基因, 该基因又被称为p16/CDKN2基因或MTS1基因, 该基因可以直接参与细胞周期的调控, CDK4与该基因的产物p16蛋白特异性结合, 会导致CDK4失活, 对细胞的增殖和分裂负调节, 是可以直接作用于细胞周期的抑制癌细胞的因子[2]。p21基因是依靠性激酶抑制剂家族中的细胞周期蛋白。既能通过抑制CDKs复合物的生物活性, 影响DNA复制和修复、协调细胞周期, 又与肿瘤抑制作用有关系, 因此通过该基因影响细胞周期, 从而抑制肿瘤的形成。p53是人体抑癌基因, p53基因的失活在肿瘤的形成过程中起重要作用。
细胞周期被组织在G0/G1期还有可能是与Cyclin D1和Cyclin E有关。细胞周期蛋白 (cyclins) 为细胞周期正常运作中的一类重要调节因子, cyclins的作用发挥是由于在功能上要结合特定的细胞周期素依赖激酶 (CDKs) , 形成的复合物cycline-CDKs通过对特异性底物磷酸化的机制, 以细胞周期以来的方式促进细胞增殖作用[3]。Cyclin D1是G1期周期蛋白, 由定位于人染色体11q13的Cyclin D1基因编码, 含259个氨基酸, 相对分子量为34000。将抗Cyclin D1抗体向正常的G1期纤维母细胞内微量注入, 能有效组织细胞进入S期, 从而导致细胞生长失去控制。Cyclin E由定位于人染色体19q12-13的Cyclin E基因编码, 其表达总是在G1期高表达, 直至G1晚期的G1期、S期交界处达到最高峰, 随着细胞进入S期表达下降, 到G2/M期降为零。Cyclin D1和Cyclin E均在G1期与相应的CDKs结合, 促进细胞在G1期加速通过, 即细胞在G1期成正反馈, 因此又称G1期为正性调控因子。Cyclin D1和Cyclin E的表达过量可加速G1期进程缩短G1期时间, 甚至可以让细胞逃脱监测点的监控, 直接进入S期阶段, 导致细胞在生长过程中失控。
2 将白血病细胞阻滞在G2/M期的调控基因
随着时代的发展, 近几年营养因素也成为肿瘤形成的最重要因素之一, 饮食上也会促进肿瘤的生长, 像一些被分离出的碳水化合物, 则可能降低肿瘤继续生长的风险。一些苷元, 例如芹菜苷元7-葡糖苷, 会降低人早幼粒细胞性白血病的形成, 会诱导白血病HL-60细胞G2/M期增多, 并使细胞阻滞在G2/M期, 从而也使得白血病细胞发生细胞周期阻滞。
研究表明, CDKS是周期阻滞中的重要因子, Solomon等发现, 只要有足够的Cyclin B1存在, CDK1才能被激活, 允许肿瘤从G2期过渡到M期。Cyclin B1和Cyclin D1是周期阻滞中的两个重要的调节点, 所以通过调节Cyclin家族而调节CDKS家族可以使细胞周期阻滞在G2/M期, 从而也使得白血病细胞发生细胞周期阻滞。
3 将白血病细胞阻滞在G1期或G2/M期的调控基因
泛素-蛋白酶体通路 (Ubiquitin-proteasome Path-way, 简称UP通路) 是生物体内进行蛋白质选择性降解的重要途径之一, UP通路参与了例如细胞内信号的传递、细胞周期的运转、以及相关遗传基因DNA的修复等重要的生理生化过程。研究表明, 特异性蛋白酶体抑制剂也在凋亡调控中发挥重要的作用, 它可以可诱导多种人白血病细胞发生凋亡。理论上讲, UP通路主要降解与细胞生长、增殖有关的一些调节蛋白和转录因子, 例如G1期和S期的c-Jun以及Cyclins等调节蛋白的表达, 因此蛋白酶体抑制剂对细胞周期调控是导致细胞凋亡的重要原因之一。目前为止, 蛋白酶体抑制剂诱导细胞凋亡的机制目前正受到广泛的研究, 鉴于UP通路在细胞周期调控的重要性, 蛋白酶体抑制剂对细胞周期的影响可以作为研究药物的依据。
4 引起白血病细胞阻滞的其他调控基因
一些调节酶与相关作用产生的信号, 例如NO、缺氧及药物, 则成为了影响细胞周期阻滞的重要外因。所以, 随着科技的发展进步, 通过影响白血病细胞周期的阻滞来治疗白血病也成为了一个行之有效的方法。
结束语
综上所述, 使白血病细胞周期发生阻滞的因素多种多样, 既有内因, 也有外因。大量文献报道的细胞凋亡的三大通路可诱导多种人白血病细胞发生凋亡, 其诱因可能与细胞周期阻滞有关, 阻滞可能发生在G1期, 也可能在G2/M期发生阻滞。一些诱导细胞发生凋亡的凋亡促进或凋亡抑制家族可以引起细胞周期的变化, 进而引起细胞阻滞。因此, 多路径与多靶点是我们研究药物与白血病细胞周期阻滞关系的新思路。通过药物对肿瘤细胞周期的影响, 可以通过联合用药来放大相同剂量药物的作用效果。也就是说通过一种药物使肿瘤细胞全部处于G1期或某一个周期, 使针对某一周期的药物的受试群体得到进一步放大, 进而达到更好的治疗效果。这也将成为药物联合应用的又一里程碑。
摘要：细胞周期的循环过程是由许多基因共同协作而成的, 这是一个细胞物质积累与细胞分裂的循环过程。癌变的细胞以及特定阶段的胚胎细胞常常有异常的分裂周期。外源性基因, 例如p16、p21、p53、Cyclins等, 使白血病K562细胞周期停滞在G1期;CDKS因子会使细胞阻滞在G2/M期;UP介导通路可能使白血病细胞细胞阻滞在G2/M期, 也可能在G1期发生阻滞。不同的影响因子会使白血病细胞周期阻滞在不同时期, 能为治疗白血病提供更广阔的研究前景。多路径与多靶点是我们研究药物与白血病细胞周期阻滞关系的新思路。
关键词：细胞周期,细胞周期阻滞,白血病细胞,K562
参考文献
[1]Yan Sun, Hui-Juan Xu, Yan-Xia Zhao, et al.Crocin Exhibits Antitumor Effects on Human Leukemia HL-60 Cell In Vitro and In Vivo[J].Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2013, 10 (2) , 1-7.
[2]沈杰芳, 芮红兵, 苏津自等.转染p16与dll4阻滞白血病细胞株K562细胞周期[J].中国实验血液学杂志2010, 18 (3) :588-592.
[3]兰雨, 张学敏, 杨平地等.蛋白酶体抑制剂对白血病细胞系细胞周期的影响[J].基础医学与临床2002, 22 (1) :40-44.
白血病细胞/药物作用 篇2
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
厚朴酚 (购于美国Sigma公司) ;K562细胞 (中国科学院血液学研究所) ;RPMI-1640培养基及MTT试剂盒均购于美国Sigma公司;免疫印迹试验 (Western blot) 使用的所有单克隆抗体 (如:小鼠抗BCL-2, 兔抗Bax等) 均购于美国Cell signaling公司;HRP-二抗 (武汉博士德生物工程有限公司) ;Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测剂盒 (南京凯基生物科技发展有限公司) ;酶标仪 (美国Thermo公司) ;CO2培养箱 (山东博科QP-80) ;超净工作台 (山东博科BBS-SDS) ;高速台式离心机 (白洋离心机G20型) ;高速冷冻离心机 (白洋离心机R20型) ;流式细胞仪 (美国BD公司) 。
1.2 细胞培养
K562细胞 (中国科学院血液学研究所) 培养于含有10%胎牛血清 (大连生物试剂公司) 的RPMI 1640培养基中 (加入青霉素100 u/ml、链霉素100μg/ml) , 置于37℃5%CO2培养箱, 饱和湿度环境下进行培养, 2~3 d换液一次, 待长满80%~90%后传代一次。实验选用对数生长期细胞。
1.3 MTT实验
分别取对数生长期培养细胞接种于96孔培养板中。设计6个系列浓度, 即分别依次加入厚朴酚 (终浓度0.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0μmol/L) , 置于37℃, CO2培养箱中。分别在24、48 h每孔加入20μl MTT (Sigma, 5 mg/ml) 混匀, 37℃继续培养4 h。离心后小心弃去上清, 每孔加入150μl DMSO吹打混匀, 然后, 酶标仪 (Thermo公司, 美国) 570 nm处进行检测各孔吸光度, 计算并制作增值率-浓度曲线图 (空白组为0只加培养液、MTT、DMSO) 。
细胞增值率 (%) = (实验组OD-空白组OD) / (对照组OD-空白组OD) =×100%。
1.4 Western blot检测相关蛋白
取对数生长期培养细胞接种于6孔板中, 各实验组分别加入终浓度为0、7.5、15μmol/L的厚朴酚作用24 h后收获细胞, 冰上超声波细胞粉碎器裂解细胞。BCA蛋白测定法测定测定蛋白浓度, 将各样本调整至等浓度, 分装, -80℃保存, 以β-actin为内参照进行变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳 (SDS-PAGE) , 并转移至PVDF膜上, 膜在5%脱脂奶粉溶液中室温孵育1 h以封闭膜上的非特异结合。封闭过的膜加入一抗 (加入BCL-2、Bax、细胞色素C及活化的caspase-3、caspase-9等抗体) 抗原抗体结合。PVDF膜按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层, 30 m A恒流条件下, 4℃孵育过夜, 与相应的辣根酶标记 (HRP) 二抗室温孵育2 h。将杂交后的PVDF膜加入发光液检测。
1.5 Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测
取对数生长期的K562细胞接种于含无菌RPMI 1640培养的6孔板中分别加入0、5、10、15μmol/L的厚朴酚作用24 h后, 用冷PBS洗涤3次, 离心收集细胞, 进行荧光显微镜下观察细胞凋亡;取 (5-10) ×104细胞悬液离心去上清, 加入200μl V-FITC荧光染料, 常温避光染色15 min, 加入10μl碘化丙锭 (PI) 染色液, 轻轻混匀, 避光冷浴放置, 流式细胞仪进行荧光检测。
1.6 统计学处理
实验数据均采用SPSS19.0统计软件进行分析处理, 处理结果以±s表示, 多个样本均数的比较采用单因素方差分析, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 厚朴酚对K562细胞有增殖抑制作用
MTT比色法检测显示, 厚朴酚能够明显抑制K562的增殖, 呈剂量-时间依赖性。对K562作用24 h的存活率分别为75.58%、42.81%、14.34%、6.72%、1.63%;作用48 h的存活率分别为53.50%、7.21%、1.61%、1.20%、1.11%。其 (IC50) 分别为9.05、5.62μmol/L。见图1。
2.2 厚朴酚对K562细胞凋亡影响
流式细胞仪检测结果显示, 与对照组相比, 不同浓度 (5、10μmol/L) 的厚朴酚作用于K562细胞24 h后, 其凋亡率明显增加, 分别为1.15%对46.42%、68.25%, 差异具有统计学意义 (P<0.05) 。通过荧光显微镜下观察其细胞核形态的变化, 结果随着药物浓度的增加细胞核出现固缩、凝集呈亮蓝色或核呈分叶, 碎片状, 且有凋亡小体的出现 (荧光染色正常细胞核的着色的形态呈圆形, 淡蓝色) 。见图2。
2.3 厚朴酚对K562相关蛋白的影响
免疫印迹试验 (Western blot) 显示, 随着厚朴酚浓度的增加, Bcl-2表达量逐渐减少, 而Bax、细胞色素C及活化的caspase-3、caspase-9表达量逐渐升高, 并呈现浓度依赖性, Bax/Bcl-2的比值显著增大。厚朴酚能够明显抑制BCL-2的表达、上调Bax、细胞色素C及活化的caspase-3、caspase-9的表达。见图3。
3 讨论
近年来国内外相关报道均证实厚朴酚抗肿瘤、抗癌、治疗白血病等作用[4]。但是, 厚朴酚的药理作用及其机制、药动学还有待进一步研究。
本研究结果显示, 通过运用MTT法检测厚朴酚对白血病细胞K562细胞的增殖有明显的抑制作用, 其作用随时间延长和浓度提高而增强。其对K562细胞24 h (IC50) 为9.05μmol/L。在低浓度下, 能明显有效地抑制生长, 具有较强的敏感性, 且已有相关报道显示厚朴酚可明显抑制胰腺癌Miapaca及PANC-1细胞的生长[5]。荧光染色显微镜下观察有凋亡小体的出现, 细胞核出现固缩、凝集呈亮蓝色或核呈分叶, 碎片状, 凋亡的显著特征是细胞内出现凋亡小体[6]。通过流式细胞仪检测进一步研究表明, 随着药物浓度的增高, 细胞的凋亡率也逐步增加, 药物浓度越高, 凋亡率越高 (5μmol/L和10μmol/L分别为46.42%、68.25%) 。无论从流式细胞学还是形态学结果显示厚朴酚对白血病K562细胞具有诱导细胞凋亡效应。
1.未加药对照组;2、3分别为7.5、15μmol/L厚朴酚处理组图蛋白印迹法检测厚朴酚对
细胞凋亡是有机体为维持内环境稳定平衡, 由基因控制细胞自主, 有序的死亡过程[7]。如果机体内凋亡发生紊乱, 则可能导致各种疾病的发生。细胞凋亡与细胞坏死不同, 细胞凋亡不是被动的过程, 而是主动过程, 它涉及到许多基因的表达和调控, 其中Bcl-2家族在参与细胞凋亡的过程中, 扮演着重要的角色。Bcl-2家族由抑凋亡因子 (Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w等) 和促凋亡因子 (Bax、Bak、Bad等) 组成, 依赖于促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白之间的平衡, 二者的比例决定着细胞的生死存亡[8]。还有细胞凋亡进程中重要的执行者caspase家族, 通过介导和执行死亡指令在凋亡过程中发挥重要作用[9]。细胞凋亡途径主要有3种通路:线粒体通路、内质网通路和死亡受体通路, 线粒体凋亡是细胞凋亡的主要途径之一[10]。Bcl-2家族对线粒体凋亡途径的调控作用主要表现在其对线粒体膜通透性、膜电位的影响, 以及它对caspase家族蛋白的调节作用[11]。当Bax/Bcl-2比例增加时, 线粒体其膜的通透性会升高, 导致各种凋亡因子从线粒体膜间隙释放入胞质, 其中细胞色素C与Apaf-1结合激活caspase-9前体, 后者接着激活下游caspase-3等成员, Bcl-xl可与Apaf-1结合抑制Apaf-1与caspase-9前体的结合进而抑制caspase-9的活化[12], 使得线粒体内膜原有两侧质子和离子的不对称分布消失, 从而导致线粒体膜电位的降低或消失, 至线粒体的功能发生紊乱, 进而导致线粒体乃至细胞凋亡的发生。白血病细胞同其他肿瘤细胞一样, 诱导白血病细胞凋亡是目前治疗的主要机制, 用药物诱导白血病细胞发生凋亡也已成为治疗肿瘤的有效途径。本实验中, Western blot检测结果显示, 随着作用浓度的增高, 厚朴酚能够明显抑制BCL-2的表达、上调Bax、细胞色素C及活化的caspase-3、caspase-9的表达, 从而证实厚朴酚诱导K562细胞死亡可能是通过线粒体凋亡途径实现的。
众所周知, 治疗白血病关键之一就是能找到疗效较好而且毒副作用低的化疗药物, 所以利用相对廉价的中草药有效成分提取物做成制剂来治疗白血病, 并配合其他化疗药物联合治疗, 已日益受到广泛重视。本研究证实了传统中草药有效成分厚朴酚对白血病细胞增殖具有体外抑制作用, 为以后的进一步深入研究提供实验依据, 未来有希望成为一类新型的无毒无副作用的抗癌药物。
参考文献
[1]单卿卿, 龚玉萍, 郭勇, 等.六种中药提取物对白血病细胞株的体外抑制作用研究[J].四川大学学报 (医学版) , 2012, 03:362-366.
[2]林琳, 丁一.和厚朴酚最新药理学研究进展与评述[J].中药药理与临床, 2011, 01:110-113.
[3]李海波.厚朴酚抗氧化及诱导H460肿瘤细胞自噬的机制研究[D].沈阳药科大学, 2007.
[4]孙宏伟, 李海波.厚朴酚通过自噬途径促进肺癌细胞死亡[J].中医药信息, 2010, 06:86-89.
[5]张宁.厚朴酚对胰腺癌细胞增殖和凋亡影响的研究[D].山西医科大学, 2014.
[6]黄沛东, 刘就娣, 邱斯奇, 等.中药厚朴提取物对人白血病细胞作用初探[J].汕头大学医学院学报, 2012, 3:149-151、193.
[7]张勇, 唐方.厚朴酚药理作用的最新研究进展[J].中国中药杂志, 2012, 23:3526-3530.
[8]董秀, 于丹, 王淳, 等.厚朴酚调控人小细胞肺癌H446细胞凋亡的机制研究[J].辽宁中医杂志, 2012, 08:1443-1445.
[9]夏明钰, 王敏伟, 田代真一, 等.厚朴酚通过改变Bax/BclX_L表达和激活caspase诱导人宫颈癌He La细胞凋亡[J].中国药理学通报, 2005, 3:318-322.
[10]刘丽君, 彭建新, 洪华珠, 等.线粒体在细胞凋亡中的变化与作用[J].细胞生物学杂志, 2005, 2:117-120.
[11]游龙贵.凋亡相关基因Bcl-2、Bax及Bak蛋白在喉癌组织中的表达及其临床意义[D].青岛大学, 2003.
白血病细胞/药物作用 篇3
1材料
人白血病HL-60细胞株:由兰州军区总医院药局实验室惠赠。RPMI-1640:Sigma公司产品, 用前加双抗、青霉素 (100U/ml) 、链霉素 (100μg/ml) ;小牛血清:杭州四季青生物工程公司产品, 56℃水浴, -20℃保存;0.25%胰酶、0.02%EDTA、Hanks液、3.7%NaHCO3等试剂:自行配制;碘化丙啶 (PI) :Sigma公司产品;凋亡相关基因蛋白 (P27、P16) 过氧化物酶标记的链霉卵白素染色试剂盒:购自北京中山生物技术有限公司。Coulter epics XL流式细胞仪:美国Coulter公司;CO2培养箱:NATURE, USA;倒置相差显微镜:Olympus CKX, Japan。祁连圆柏:青海大学医学院藏医系惠赠。
2方法与结果
2.1 JP提取物抗肿瘤活性部位的筛选
2.1.1 药物制备
取祁连圆柏2000g, 以50%乙醇浸渍后渗漉, 得到50%乙醇渗漉液和残渣。用50%乙醇渗漉液减压浓缩至浸膏, 得50%醇提浸膏。同上方法, 取祁连圆柏2000g, 以95%乙醇浸渍后渗漉, 得95%乙醇提总浸膏。将总浸膏分散于1000ml水中, 依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取。另取祁连圆柏2000g水煎后乙酸乙酯、正丁醇萃取。将以上提取6部分减压除去有机溶剂, 50℃真空干燥, 回收溶剂得石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、乙醇提取物、水煎乙酸乙酯提取物、水煎正丁醇提取物。取各提取物适量, 用生理盐水配成所需浓度, 脂溶物以二甲基亚砜 (DMSO) 助溶, DMSO最终浓度小于0.05%。过滤除菌, 4℃保存备用。
2.1.2 细胞复苏和培养
将冻存在离心管内的HL-60细胞用37℃水浴解冻, 吸出细胞悬液, 装入另一支离心管中, 加入含15%小牛血清的RPMI1640培养液 (PH7.2) , 吹打混匀后离心 (1000r/min, 5分钟) , 吸去冻存液。复苏细胞加入含15%小牛血清的1640培养液充分混匀, 使其浓度为2×105个/ml, 接种于培养瓶中。置孵箱内 (37℃, 5%CO2) 培养。
2.1.3 细胞传代
倒置显微镜下观察培养瓶内细胞长满单层后弃掉培养液, 加入适量0.25%胰酶液 (覆盖瓶底) , 置37° C环境中消化1～2分钟。加入适量的Hank’s液轻洗1遍后加入含15%小牛血清的RPMI 1640液5ml, 吹打制成细胞悬液, 按2×105个/ml浓度接种培养。
2.1.4 细胞增殖抑制试验
MTT还原法。取培养细胞以2×105个/ml的密度分别接种于96孔板, 其中2孔只加RPMI1640培养液, 每孔100μl, 作空白对照;其余每孔各加细胞悬液90μl。给药组:取已配制的A液 (50%醇提浸膏) 、B液 (醇提石油醚萃取) 、C液 (醇提乙酸乙酯萃取) 、D液 (醇提正丁醇萃取) 、E液 (水煎乙酸乙酯萃取) 、F液 (水煎正丁醇萃取) , 选择20.0μg/ml剂量浓度的药液进行药理活性筛选, 每孔加药10μl;5-FU组:每孔加5-FU (10μg/ml) 10μl;每组设4个重复孔。置5%CO2孵育箱中37℃、饱和湿度条件培养48小时后, 加MTT, 每孔10μl, 孵育4小时。移入0.5ml离心管, 1000r/min离心5分钟, 弃去上清液, 每孔加DMSO100μl, 气浴恒温振荡器37℃振荡10分钟, 用酶联免疫检测仪在490nm处测其OD值, 计算细胞生长抑制率 (IR) 。抑制率= (1-试验组OD值) /对照组OD值×100%。结果见表1。
实验结果表明, JP提取物A～F液, 以C液 (醇提乙酸乙酯萃取) 对HL-60细胞的抑制作用最好, 因此选用C液做为硅胶层析法中的上样。
2.2 JP提取物C液各组分对白血病HL-60细胞增殖的抑制作用
JP提取物C液各组分分离:硅胶层析法。取200目硅胶 (70倍上样量) , 装柱, 用洗脱剂冲洗至平衡。溶剂洗脱系统利用薄层层析选择, 选用氯仿-甲醇 (1∶1) 作为洗脱系统展开, 过柱和收集分离出6个色带, 分别收集各色带, 命名为JP提取物C液组分1、2、3、4、5、6。各组分对HL-60细胞增殖的抑制实验:方法同2.1.4。给药组选择20.0μg/ml剂量浓度的药液进行药理活性筛选, 每孔加药10μl。JP提取物C液-组分1、2、3、4、5、6 (醇提乙酸乙酯萃取) , 在体外24小时可明显抑制人白血病细胞株HL-60细胞的增殖, 以10μg/ml以上浓度作用更为明显, 且呈现明显的剂量依赖性特点。以药物不同浓度的对数和抑制率作图, 按Y=ax+b方程式求出C液-组分1、2、3、4、5、6对HL-60细胞的半数抑制浓度 (IC50) 依次分别为58.94、35.88、3.07、119.7、168.21、63.84μg/ml。结果表明JP提取物C液组分-3效果最好。
2.3 不同浓度JP提取物C液-3对白血病HL-60细胞增殖的抑制作用
方法同2.1.4。5-FU组:每孔加5-FU (10μg/ml) 10μl;JP提取物C液-3:设5个浓度 (50.0、20.0、10.0、5.0、1.0μg/ml) , 每孔加药10μl, 培养48小时后测得对HL-60细胞的抑制率, 结果见表2。
t检验;与空白组比较*P<0.05, **P<0.01
2.4 JP提取物C液-3对白血病HL-60细胞的毒性作用
取HL-60细胞 (1×105个/ml) , 接种于96孔培养板, 90μl/孔, 培养24小时后, 给药组 JP提取物C液-3 ( 50.0、20.0、10.0μg/ml) 10μl/孔, 对照组加PBS液, 10μl/孔, 阳性对照组加5-FU (10μg/ml) , 10μl/孔, 各设4个重复孔。置5%CO2孵育箱中37℃、饱和湿度条件培养, 分别于培养6、12、18、24、48小时后各取1板, 加0.4%台盼蓝10μl/孔, 用血球计数板在光镜下计数活细胞。结果为活细胞数随药物浓度的增加和作用时间的延长而减少;抑制率则相反。各时间段IC50分别为35、29、0.84、2.19、2.72、1.73μg/ml, 见表3。
2.5 JP提取液C组分-3对白血病HL-60细胞形态学的影响
2.5.1 细胞形态的光镜观察
培养瓶中接种1×105个细胞, 培养24小时, 生长良好者, 用不同浓度 (5、10、20、50μg/ml) JPC-3分别处理24、48、72小时, 每12小时用倒置显微镜观察并照相记录用药组和对照组细胞的形态变化, 结果可见对照组HL-60细胞生长良好, 细胞呈圆形, 细胞膜边缘光滑, 细胞大小形态一致;经JPC-3诱导12小时后见有少数细胞皱缩、变圆变小、胞质内出现颗粒、细胞膜完整;以20μg/ml以上浓度作用更为明显, 且呈现明显的剂量和作用时间依赖性特点;24小时后此类细胞进一步增多、部分细胞呈圆形、细胞核与胞质分辨不清、细胞间隙增大、细胞数目减少;48小时后细胞数目已显著减少, 少量细胞脱落, 细胞皱缩悬浮于培养液中, 大部分细胞裂解成圆形小体, 呈小体积、碎裂状态;另有部分细胞体积增大, 呈圆形或椭圆形, 细胞内见颗粒出现。
与空白组比较*P<0.05, **P<0.01
2.5.2 HL-60细胞超微结构的透射电镜观察
收集实验及对照组离心细胞各约1×107个, PBS清洗10分钟×2遍;2.5%戊二醛4℃前固定2小时, PBS漂洗15分钟×3遍;1%锇酸4℃后固定2小时;PBS漂洗5分钟×2遍;1%醋酸铀快染2小时;50%、70%、90%、100%丙酮4℃下逐级脱水各15分钟;丙酮与包埋剂1:1室温1.5小时, 用丙酮与包埋剂1:2室温1.5小时及纯包埋剂37℃浸渍3小时后用纯包埋剂包埋;60℃聚合36小时;LKB超薄切片机切片 (50～100nm) , 柠檬酸铅染色, 透射电镜观察。用20μg/mlJP提取物C液组分-3诱导HL-60细胞48小时后有凋亡细胞出现, 其特征是胞质浓缩, 核固缩, 染色质浓缩致密, 并凝集成块, 聚集于核膜下呈边聚的新月状态 (图2) ;某些细胞核形态不规则, 核发生碎裂, 染色质呈高度浓缩的致密核, 同时可见凋亡早期个别细胞内线粒体变大、嵴增多, 空泡化、呈基质性肿胀, 基质变淡、双层膜结构不清、嵴断裂、减少、缩短、消失。
2.6 JP提取物C液-3对白血病HL-60细胞细胞周期的影响
收集实验组和对照组细胞各约1×105个, 用PBS洗涤后离心3次。用70%冰乙醇在-20℃冰箱固定24小时, 离心去乙醇, PBS洗涤 (5分钟×2次) 、离心 (1000r/min) 3分钟, 弃上清液。加入Rnase A (50μg/ml) 37℃温育30分钟后, 加10μlPI (50μg/ml) 置4℃暗处作用20分钟。采用Coulter epics XL流式细胞仪进行细胞周期分析, 检测计算细胞亚二倍体的百分率, 计算细胞增殖指数 (PI) 。细胞增殖指数undefined。结果表明不同浓度的JP提取物C液组分-3对HL-60细胞具有显著的细胞周期阻滞作用, 药物作用48小时后, 随药物浓度的增加、细胞增殖指数 (PI) 降低, G2/M期细胞明显减少, HL-60细胞主要被阻滞在G0/G1期。HL-60细胞经不同浓度的JP提取物C液组分-3 48小时诱导后在FCM检测的含量图中, 在G1期细胞前出现亚二倍体峰, 既凋亡峰, 表明细胞DNA降解, 渗漏导致DNA染色能力下降, 凋亡峰随药物剂量增加而升高, 见表4。
2.7 JP提取物C液-3对白血病HL-60细胞P27、P16蛋白表达的影响
取对数生长期细胞, 调整细胞密度接种在置有载玻片24孔的培养皿上, 实验组加入20μg/ml JP提取物C液组分-3, 对照组加等量RPMI1640培养液, 常规培养, 于加药后48小时终止培养, 取出爬有细胞的玻片, 0.01mol/L PBS洗涤3次, 以95%乙醇固定20分钟, 染色步骤严格按SP免疫组化染色法试剂盒说明书操作, 以PBS代替一抗作阴性对照, 检测细胞周期蛋白P27及P16表达水平。染色结果判断:用NYD-1000型图像分析仪处理, 随机选取10个高倍视野的肿瘤细胞共1000个, 计算每100个细胞中的阳性细胞数, P27阳性信号位于核内, 呈棕黄色细颗粒状;P16蛋白阳性染色呈棕黄色细颗粒状, 大多弥漫分布于细胞浆中, 强阳性可呈簇状分布并覆盖细胞核。经JP提取物C液组分-3诱导后实验组与对照组相比较表达明显升高。结果见表5。
t检验;与对照组比较*P<0.05, **P<0.01
3讨论
本文实验结果表明, JP提取物A～F液, 以C液 (醇提乙酸乙酯萃取) 对HL-60细胞的抑制作用最强, 因此选用C液 (醇提乙酸乙酯萃取) 做为硅胶层析法中的上样;经硅胶柱层析法分离出6个色带, 分别收集各色带, 命名为JP提取物C液组分1、2、3、4、5、6。MTT实验结果表明, JP提取物C液组分1、2、3、4、5、6在体外可明显抑制人白血病细胞株HL-60细胞的增殖, 以10μg/ml以上浓度作用更为明显, 且呈现明显的剂量与时间依赖性的特点, 以JP提取物C组分-3效果显著。JPC提取物组分-3不同浓度对HL-60细胞增殖均呈现抑制作用, 且呈剂量依赖性, 台盼蓝拒染法实验结果提示各浓度均有细胞毒性作用。电镜下可见凋亡细胞特征。
细胞周期调控与肿瘤发生发展的关系是当前抗肿瘤研究领域的热点。细胞周期是一个高度有序的运转过程、并且受多种蛋白的调节[3]。这种高度有序的运转是通过Cyelin/CDKs复合物来实现的, 其中P27与P16蛋白是两种重要的细胞周期依赖性激酶, P27蛋白细胞周期性激酶抑制剂, 其主要作用是抑制CDK的激活过程和抑制已激活的cyclin-CDK的激酶活性[4];P16蛋白的主要作用在于能够抑制CDK4/CDK6介导的Rb蛋白产物的磷酸化[5]。此二种蛋白均可通过抑制Cyclin/CDK4、CyclinE/CDK2复合物的活性, 阻断细胞由G1期转向S期, 从而抑制细胞增殖, 细胞才有可能停止增殖分裂, 启动分化或者凋亡。细胞生物学研究发现肿瘤细胞的细胞周期动力学特点是G1期→S期控制点失常, 细胞群主体分布于DNA合成期 (S期) , 而分化细胞群则主要分布于DNA静止期 (G0/G1期) 。有文献报道位于G1期的细胞数量则可作为诱导分化的判断指标[6]。因此设法诱导肿瘤细胞调亡, 抑制其增殖, 增加“死亡与增生”的比值, 成为新的综合治疗的目标, 细胞凋亡的程度则成为评估疗效的一项新指标[7]。本实验结果表明, JP提取物C液组分-3在体外对HL-60细胞具有显著的细胞周期阻滞作用, 处于G0/G1期的细胞比例在诱导后明显增加, 而处于S期的细胞比例则显著下降, 肿瘤细胞增殖指数明显降低, 并可诱导该细胞系凋亡发挥抗肿瘤作用。免疫组化结果提示JP提取物C液组分-3可明显增加HL-60细胞P27、P16蛋白的表达。提示其可能是通过上调P27及P16蛋白表达水平, 激活细胞周期蛋白激酶抑制因子及G0/G1期阻滞触发人白血病HL-60细胞凋亡的主要机制。
参考文献
[1]宗玉英, 党合群, 骆桂法.110种植物藏药进行体外筛选的实验研究.药学实践杂志, 2000, 18 (5) :290.
[2]王索安, 陈增良徐涛, 等.祁连圆柏对人胃癌细胞SGC-7901细胞周期和凋亡的实验研究.中国中医药科技, 2010, 17 (3) :208
[3]Boukes GJ, Daniels BB, AIbrecht CF, et a1.Cell survivaI or apop-tosis:rooperol’s role as anticancer agent.Oncol Res, 2010, 18 (8) :365.
[4]Wang X, Gao P, Long M, et a1.Essential role of celI cycle regula-tory genes D21and p27expression in inhibition of breast cancer cells by arsenic trioxide.Med Oncol, 2011, 28 (4) :1225.
[5]Bolanca IK, Sentija K, Simon SK, et a1.Estimating clinical out-come of HPV induced cervical lesions by combination of capsid protein L1and p16INK4a protein detection.Coll Antropol, 2010, 34 (1) :31.
[6]成娜, 刘大卫, 刘芳, 等.肝损伤组织萃取物对人肝癌细胞株BEL-7402诱导分化作用初探.中国病理生理杂志, 2010, 26 (11) :2101.