药理作用分子作用机制（通用11篇）
药理作用分子作用机制 篇1
姜黄素(curcumin)是从姜科姜黄属植物姜黄(curcuma longa L)根茎中提取的一种酚性色素,是有效的药物单体。姜黄是一种常用中药,主产于日本、美国、非洲、中国等地。《本草拾遗》[1]里专门描述其性热不冷,具有行气散风、活血、通经止痛的作用,运用姜黄来治疗肝病、散风活血、通经止痛等。姜黄素是姜黄发挥药理作用的主要活性成分,由于其色泽稳定且低毒性,目前已广泛应用于食品添加剂和染料中,现在亦有临床实验在研究姜黄素治疗癌症的生物有效剂量。药理学研究表明,姜黄素具有抗炎、抗氧化、抗凝、降血脂、清除自由基、抗动脉粥样硬化及抑制肿瘤生长等多方面的作用,对心血管系统疾病亦具有一定的作用。本文拟就姜黄素的药理作用及其临床应用作一简要综述。
1 概述
姜黄属植物主要含精油(4.2%~14%)、脂肪油(4.4%~12.7%)等挥发油及姜黄素类成分,此外还有树脂类、糖类、甾醇类、脂肪酸、多肽类、生物碱及微量元素,其中类姜黄素类(curcuminoids)是二苯基炔类成分,有酚性和非酚性成分,现已分离并鉴定出20多个类姜黄素化合物。姜黄的黄色物质为略带酸性的酚性物质,是姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素的混合体,称之为姜黄色素,是姜黄发挥药理作用的主要成分,而姜黄素是其中最重要的活性成分。姜黄素为橙黄色结晶粉末,味稍苦。其分子式为C21H20O6,其主链为不饱和脂族及芳香族基团,不溶于水及乙醚,溶于乙醇、碱、醋酸、丙酮和氯仿等有机溶剂,受可见光和紫外线影响,会发生光降解。
2 姜黄素的药理作用
2.1 抗氧化作用及清除自由基
作为一种细胞抗氧化剂,姜黄素对脑、心、肝、肾等重要脏器均能起到保护作用。姜黄素可使异丙肾上腺素诱导的大鼠心电图缺血性改变减轻,抑制血清肌酸磷酸激酶、乳酸脱氢酶、谷草转氨酶活性的升高以及血清游离脂肪酸升高,同时还可以降低缺血心肌丙二醛的含量。此外,姜黄素还可提高大鼠心肌耐缺氧能力,对大鼠心肌的缺血性损伤具有一定的保护作用[2]。姜黄素还可抑制缺血再灌注大鼠脑组织丙二醛和亚稍酸盐的产生,提高超氧化物歧化酶活性,有效清除超氧化物,从而对缺血再灌注损伤具有保护作用。研究表明,姜黄素具有体内体外抗氧化活性。血管内皮细胞在姜黄素溶液中,其HO-1m RNA蛋白表达及血红素氧化活性都显著增加,并呈剂量依赖性。低氧状态下研究亦表明可显著性提高血红素的氧化活性。提示姜黄素是一种潜在的血管内皮细胞Ho-1诱导剂,可增加血红素氧化酶活性,具有抗氧化作用[3]。此外,姜黄素对羟自由基(OH)也具有较强的清除作用,其作用甚至超过OH的特异性清除剂甘露醇;姜黄素能有效地抑制由2-偶氮(2-眯基丙烷)二盐酸盐(AAPH)诱发的红细胞氧化性溶血,显示了较强的防御脂质过氧化的能力[4]。
2.2 抗炎作用
姜黄素对急性、亚急性和慢性炎症均具有抗炎作用。实验发现,姜黄素可以从组织学、血清学指标、中性粒细胞浸润等方面改善酒精性和非酒精性实验性胰腺炎的病变程度[5]。对于由三稍基苯磺酸(TNBS)诱导的实验性结肠炎,姜黄素也具有明显的杭炎效果,可以起到改善腹泻症状、保护肠黏膜的作用[6,7]。体外研究表明,姜黄素还可抑制肺脏炎性细胞前炎症细胞因子(肿瘤坏死因子TNF-α、白介素-lβ和白介素-8)的产生,可对未成熟儿慢性肺疾病起治疗作用[8]。姜黄素作为有效的非甾体消炎药进入Ⅱ期临床试验阶段,对18个风湿性关节炎和骨关节炎病人做短期、双盲、交叉试验,显示了令人满意的结果。
2.3 抗凝、降血脂和抗动脉粥样硬化
姜黄素能降低高脂患者血中总胆固醇(TC)、甘油三醋(TG)水平,提高载脂蛋白A水平,促进肝和肾上腺对低密度脂蛋白(LDL)和脂蛋白(a)的代谢,增加胆囊对LDL排泄,抑制脾对LDL的摄取,使血中LDL和脂蛋白(a)的含量降低。经姜黄素干预后的代谢综合征(MS)大鼠其血糖、血清胰岛素、空腹血脂(TC,TG,LDL)水平均较模型组明显降低[9]。姜黄素能够降低高脂肪和高胆固醇膳食小鼠血清和肝脏胆固醇和甘油三酯的含量,尤以降低甘油三酯的作用更为显著。姜黄素可能是通过促进脂肪向糖转化和抑制胆固醇合成而具有降血脂的作用。
同时,姜黄素还具有NSAIDS的特点,能抑制巨噬细胞分泌溶酶体酶和花生四烯酸的代谢,减少前列素E2的释放,同时对胶原酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶也具有较强的抑制作用。对姜黄素的抗凝作用研究显示,姜黄素可减弱纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)、增强组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)的活性,通过抗凝、降血脂以及抗脂质过氧化起到抗动脉粥样硬化的作用。
2.4 抗肿瘤作用
姜黄素的抗肿瘤作用已成为近年来国内外研究的热点,可抑制多种肿瘤细胞的生长,如头颈部鳞状细胞癌[10]等。它的抗肿瘤机制是多方面的,不仅具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用,而且还具有抗血管生成的间接抗肿瘤作用。近年的研究表明,姜黄素通过调控抑癌基因、癌基因及其蛋白表达,诱导细胞周期阻滞及调控细胞凋亡信号来实现其抗肿瘤作用。研究发现姜黄素可通过抑制MMP活性来抑制血管生成。姜黄素还可以拮杭多种理化因素对DNA的损伤,增加体内超氧化物歧化酶水平,清除超氧阴离子。体内外试验表明,姜黄素对头颈部鳞状细胞癌细胞具有抑制作用,其机制可能与其抑制核因子(NF)-KB有关[11]。姜黄素还通过依赖于原癌基因c-jun氨基末端激酶激活,在人类结肠癌细胞中发挥抗癌作用[12]。已有研究表明,姜黄素对肿瘤具有有效预防和治疗作用,姜黄素可显著抑制K562细胞生长,且姜黄素在抑制K562细胞增殖过程中自噬和凋亡先后被激活[13]。ANUCHAPREEDA等[14]发现用姜黄素可以降低耐药肿瘤细胞中的Pgp的含量,增加化疗药物对肿瘤细胞作用的敏感性。
2.5 其他作用
姜黄素除上述药理作用外,尚有对肝脏保护作用的广泛报道,NANJI等研究发现姜黄素通过抑制NF-κB基因的表达对酒精性肝疾病起到保护作用。PARK等研究姜黄素对CCl4造成的大鼠急性或亚急性肝损伤的保护作用时发现其能显著降低血清中丙氨酸转氨酶和天门冬氨酸转氨酶含量。SONI等研究报道了姜黄素对黄曲霉毒素诱导的肝损伤具有保护作用。
此外,姜黄素还具有保护肾脏、抗纤维化、抑制细胞增殖及抗真菌等作用。
3 姜黄素的作用机制
3.1 干扰和抑制酶的作用
姜黄素可抑制多种酶的活性,从而阻止代谢反应进行,发挥抗炎、抗癌等作用。实验表明,姜黄素是一种很好的环氧酶和5(12)-脂氧酶的双重抑制剂,也可直接抑制前列腺素酶,从而阻断了前列腺素(PGs)和白三烯(LTs)等炎症介质的生物合成。姜黄素还可通过在分子水平上的直接灭活作用,降低小鼠MH3T3细胞中的黄漂吟氧化酶(XO)活性,而XO被认为是PMA促使肿瘤发展的重要因素。姜黄素对不同的蛋白激酶都有不同程度的抑制作用,尤其对磷酸激酶,是一种选择性非常强的抑制剂,而激酶抑制剂已被证实有抗肿瘤及杭细胞增生的作用,因此姜黄素也就具有了抗肿瘤细胞增生的活性。G蛋白介导的磷醋酶D(PLD)在炎症和肿瘤的发展过程中起着重要的作用,姜黄素对PLD有很强的抑制作用,且具剂量依赖性,从而起到抗炎、抗肿瘤的作用。
3.2 抑制核转录因子表达
许多人类疾病的发生机制,包括肿瘤,都与真核转录因子,NF-ΚB和激活蛋白(AP)-1有关,高水平活化的NF-κB能介导肿瘤细胞存活,而在分化较好的肿瘤和正常组织中,NF-κB表达水平较低,其活化则能促进细胞凋亡,如人纤维肉瘤HT1080细胞。姜黄素可通过阻断抑制性KB(IKB)-α的降解及P65亚单位的易位来抑制TPA诱导的NF-ΚB激活,同时也抑制其诱导的AP-1的DNA结合活性[15]。姜黄素还能抑制IKB激酶(IKB kinase,IKK)复合物和Akt激活,从而抑制了由TNF诱导的NF-κB激活,达到下调一系列基因如细胞增殖、抗凋亡、转移基因表达的目的[16]。姜黄素的抗肿瘤作用还与其诱导多药耐药的肿瘤细胞死亡以及对药物的敏感性,下调NF-ΚB调节的产物(IKB-α、bcl-2、Bcl-x L、cyclin DI),抑制细胞增殖,使细胞阻滞于G1/S期有关[17]。
3.3 抗脂质过氧化作用和抗自由基作用
对高脂模型大鼠,姜黄素具有降低血清、肝脂质过氧化(TBArs),提高总抗氧化能力(T-AOS),增强超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-PX)活性,进而减轻脂质过氧化对心血管系统的损伤。
在炎症、肿瘤等发展过程中,一些自由基的活动起到了不可忽视的加速作用,且自由基数目越多这种作用越趋明显。氧自由基对炎症发展的促进作用在体内外均已得到证实,在血液中嗜中性白细胞能刺激氧自由基的聚集、生成。姜黄素可依靠Ca2+抑制嗜中性白细胞的应答功能,并可抑制黄嘌呤脱氢酶向黄嘌呤氧化酶的转化,从而阻断氧自由基的生成,发挥抗炎作用。姜黄素还可以提高肝内环氧化物水解酶、谷胱甘肽S转移酶、谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶的活性。
3.4 其他
姜黄素还有其他作用,如诱导肿瘤细胞分化;抑制癌基因表达,诱导肿瘤细胞凋亡;通过抑制金属蛋白酶和肿瘤血管形成,从而抑制肿瘤的侵袭与转移等;还有促进Bax m RNA表达诱导MCF-7细胞凋亡,并有效抑制其增殖;抑制A375细胞增殖和诱导其凋亡;还可以抑制鹅脱氧胆酸盐(CD)或佛波醇酯(PMA)诱导的胃肠细胞系CSKGT-4,SCC450,IEC-18,HCA-7的COX-2蛋白合成和前列腺素E2(PGE2)的合成,同时也抑制COX-2 m RNA的表达;另外还具有抑制血小板聚集和抑制NO合酶活性等作用。
4 结语
姜黄素所具有的包括抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗动脉粥样硬化等多种药理作用,实际上是直接或间接地保护正常细胞免受各种不良因素的损害,维持细胞正常的代谢和生理功能,从而实现对机体的保护作用。由于其药理活性广泛、安全、药源充足,几乎无任何毒副作用,作为一种食用色素和调味剂被广泛食用,同时也用于治疗各种炎症和其它疾病,是一种具有广泛应用前景的新药,美国国立肿瘤所已将其列为第三代癌化学预防药。但姜黄素的作用机制复杂,有待进一步深入研究。由于姜黄素本身不溶于水,体内吸收差,易代谢,因此在进一步的研究中,需要研制开发姜黄素新的剂型,以提高其溶解度,增强其药理作用及方便给药途径,随着对其药理作用的深入研究及对其作用机制的进一步阐明,姜黄素这一传统的中药必将为人类疾病的治疗方面发挥更大的作用。
药理作用分子作用机制 篇2
4.1 Raf/MEK/MAPK信号通路相关抑制剂 丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase, MAPK) 途径, 是将细胞外刺激信号传递到细胞核, 介导细胞产生反应的最为重要通路之一。当配体与相应受体激酶 (如EGFR) 结合后可以激活Ras-MAPK通路, 而活化后的MAPK进入细胞核, 调节与细胞增殖或分化相关基因的转录, 引起相应的生物学效应。在多种恶性肿瘤细胞中普遍存在MAPK通路的持续激活, 目前已被批准的该类抗肿瘤药主要集中在Raf和MEK两个位点上。
RAF基因家族包括ARAF、BRAF和CRAF, 在多数肿瘤中, BRAF的表达率和突变率[绝大部分为BRAF (V600) 突变] 比ARAF和CRAF更高, 其中黑色素瘤约有40%～68%发生这种突变, 使得BRAF成
为最有吸引力的治疗黑色素瘤的靶标。目前除了前面提到的多靶点小分子抑制剂索拉非尼和瑞格非尼可以部分抑制B-Raf活性外, 已批准上市的、主要针对该靶点的药物有维罗非尼 (vemurafenib, Zelboraf?, 2011) 和达拉非尼 (dabrafenib, Tafinlar?, 2013)。维罗非尼被批准用于BRAF (V600) 变异体阳性的黑色素瘤, 其优异的效果使之成为黑色素瘤治疗上的里程碑式药物[18]。与维罗非尼的研发策略和路径不同, 达拉非尼不是维罗非尼的模拟物, 两者结构类型不同, 药代性质更是差别明显[19]。MEK家族 (MEK1和MEK2) 由于其催化底物的特异性MAPK1和MAPK2, 也成为肿瘤靶向治疗的理想靶点。尽管有许多MEK抑制剂进行了临床试验, 但只有曲美替尼 (trametinib, Mekinist?, 2013) 被批准用于黑色素瘤的治疗[20]。由于单一给药效果不佳, 被批准与达拉非尼 (作用靶点不同) 联合用药。
4.2 PI3K/Akt/mTOR信号通路相关抑制剂 与
Raf/MEK/MAPK一样, PI3K/Akt/mTOR信号传导通路也和肿瘤的发生发展密切相关。多种生长因子和细胞因子与受体结合后引起受体酪氨酸磷酸化, PI3K通过调节亚基与这些分子结合而被募集到质膜, 并由催化亚基催化PI生成PIP3。PIP3进一步激活Akt和mTOR, 促进癌细胞的生长、增殖和血管生成等。整个通路中, 以PI3K和mTOR为靶的抗癌药物研究成为近年研究的热点。
吉利德 (idelalisib, Zydelig?, 2014) 是第1个批准上市的PI3Kδ抑制剂, 高度选择性作用于δ亚基, 可以抑制恶性B细胞的趋化和黏附, 促进凋亡, 现已被批准用于CLL和滤泡型B细胞非霍奇金淋巴瘤等肿瘤的治疗[21]。针对mTOR位点的药物有西罗莫司 (temsirolimus, Torisel?, 2007) 和依维莫司 (everolimus, Afinitor?, 2009)。PI3K/Akt/mTOR通路的持续活化可以导致乳腺癌对于激素产生耐药性, 因此西罗莫司被批准可与依西美坦联合治疗激素受体阳性、HER2阴性的乳腺癌。此外这类药物还可以降低缺氧诱导 因子和VEGF的产生, 从而具有抑制肿瘤新生血管的作用。因此西罗莫司和依维莫司分别在和被批准用于晚期肾癌的治疗。
4.3 Bcr-Abl激酶抑制剂 90%以上的慢性髓性白
血病 (chronic myelognous leukemia, CML) 患者表现为费城染色体阳性, 其编码形成的Bcr-Abl蛋白具 有持续酪氨酸激酶活性, 在CML的发展中扮演着十分重要的角色[22]。20世纪末, 一类针对Bcr-Abl蛋 白的酪氨酸激酶抑制剂的研究广泛开展, 其中伊马替尼 (imatinib mesylate, Gleevec?, ) 首先脱颖而出, 开启了CML治疗的新纪元[23]。随后上市的同类药物主要针对伊马替尼的耐药性进行优化, 包括第二代的达沙替尼 (dasatinib, Sprycel?, 2006)、尼洛替尼 (nilotinib, Tasigna?, 2007) 和博舒替尼 (bosutinib,
Bosulif?, 2012) 及第三代的ponatinib (Iclusig?, 2012)。新型药物的产生主要通过增强结合力, 扩大结合位点等方法增强其抗耐药性, 第三代的ponatinib结构进一步优化 (碳碳三键的引入), 使得ponatinib可以规避T315I突变体上异亮氨酸的位阻效应, 在对dasatinib和nilotinib均耐药的CML患者身上有明显的反应[24]。 4.4 组蛋白脱乙酰酶抑制剂 (histone deacetylase inhibitor, HDACI) 组蛋白脱乙酰酶抑制剂可以抑制HDAC的酶活性, 增强组蛋白的乙酰化, 使得染色质松弛, 基因转录被激活。这种结果可以引起肿瘤抑制因子p21WAF1/CIP1的表达增强, 其作为细胞周期依赖性蛋白激酶 (cyclin-dependent protein kinases,
・ 1236 ・ 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica , 50 (10): 1232?1239
CDKs) 的天然抑制剂, 可以抑制CDKs的活性导致细胞周期G1/S期的停滞。目前FDA批准的上市药物有伏立诺他 (vorinostat, Zolinza?, 2006)、romidepsin (Istodax?, 2009)、belinostat (Beleodaq?, 2014) 和panobinostat (Farydak?, 2015)。其中belinostat属于环肽类, 与其他3个药物的结构类型 (异羟肟酸类) 有所不同。研究表明, 与正常细胞相比, HDACIs对肿瘤细胞的毒性更强, 目前多应用在多发性骨髓瘤, T细胞淋巴瘤的治疗上[25, 26]。
4.5 蛋白酶体抑制剂 (proteasome inhibitor, PSI) 蛋白酶体与泛素化信号构成的泛素?蛋白酶体是哺 乳动物细胞内主要的蛋白水解酶体系, 可降解大多数胞内蛋白, 包括p21、p53、c-myc和NF-κb等众 多调节细胞周期和凋亡的关键蛋白。PSI通过抑制蛋白酶体活性而干扰和影响细胞原有的功能, 尤其是对肿瘤细胞的生长有明显的抑制作用。这类药物有 硼替佐米 (bortezomib, Velcade?, 2003) 和卡非佐米 (carfilzomib, Kyprolis?, 2012)。硼替佐米是一种蛋白酶体可逆抑制剂, 针对26S蛋白酶体中糜蛋白酶样活性位点, 成为美国近十年来第1个批准用于多发性骨髓瘤的药物。卡非佐米为第二代蛋白酶体不可逆抑制剂, 与硼替佐米相比, 选择性更强, 疗效更好且周围神经毒性低[27, 28]。
4.6 已批准上市的其他靶向抑制剂 在异常复杂的细胞信号通路中, 还有其他一些信号分子作为治疗靶点应用于临床, 但由于其研究时间较短, 所上市的药物品种不多, 现对其进行简单介绍。
Palbociclib (Ibrance?, 2015) 作为CDK4和6的抑制剂,近期刚被FDA批准上市, 成为这类抑制剂的代表[29]。CDKs和细胞周期蛋白对细胞周期的调控起到重要的作用, 当细胞受到生长信号的刺激时, 细胞周期蛋白表达上调, 激活相应的CDKs, 导致Rb蛋白磷酸化, 释放出重要的核转录因子E2F, 从而引起一系列与S期有关的靶分子表达, 促使细胞完成DNA复制。体内外实验表明, palbociclib与来曲唑联用, 可以增强乳腺癌的敏感性, 抑制Rb磷酸化水平以及下游信号的传导, 因此比单个药物的抗肿瘤效果明显。
依鲁替尼 (ibrutinib, Imbruvica?, 2013) 是布鲁顿酪氨酸激酶 (Bruton’s tyrosine kinase, BTK) 的小分子抑制剂, 通过与BTK活性位点的半胱氨酸残基共价结合, 抑制BTK酶的活性。BTK在B细胞的生长成熟中扮演着重要的作用, 依鲁替尼被批准用于治疗套细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病的治疗[30]。
奥拉帕尼 (olaparib, Lynparza?, 2014) 是第一
个上市的多聚ADP核糖聚合酶 (poly ADP-ribose polymerase, PARP) 抑制剂, 批准单药治疗BRCA基因突变的卵巢癌患者。奥拉帕尼利用DNA修复途径的缺陷, 优先杀死肿瘤细胞[31]。
克唑替尼 (crizotinib, Xalkori?, 2011) 和ceritinib (Zykadia?, 2014) 是间变型淋巴瘤激酶 (anaplastic lymphoma kinase, ALK) 抑制剂, 属于受体酪氨酸激酶抑制剂家族, 20被批准用于ALK阳性的NSCLC患者的治疗。Ceritinib的作用机制及适用范围与克唑替尼相似, 其抑制ALK的活性更强, 可用
于既往接受过克唑替尼并产生耐药性的患者[32, 33]。 Vismodegib (Erivedge?, 2012) 是hedgehog (Hh) 信号 通路的抑制剂, 通过与平滑跨膜蛋白发生作用,
阻断Hh下游信号产生效应。Hh信号通路的异常激活可以促进下游靶基因如c-Myc, VEGF等表达, 引 起细胞过度增殖, 导致肿瘤发生。研究表明, 在皮肤
基底细胞癌中存在着Hh信号通路异常激活的现象, vismodegib也成为第一个被批准用于治疗基底细胞癌的药物[34]。 5 展望
绝大多数被FDA批准的抗肿瘤药物和分子靶向药物见图1, 从而不难看出抗肿瘤药物的总体发展呈现逐年递增的趋势。自分子靶向药物发现以来 , 后期新上市的抗肿瘤药物中, 分子靶向药物占了很大部分, 后, 分子靶向药物的研发更是进入快速发展阶段。毋庸置疑, 分子靶向药物的发现是传统抗肿瘤化疗药的一次飞跃, 对于肿瘤治疗也是一次重大的进展。由EvaluatePharma公司统计的、20销售前10位抗肿瘤药物中, 至少6个是典型的分子靶向药物, 而销售最好的前3种均为单克隆抗体药 (rituximab、bevacizumab和trastuzumab)。这表明分子靶向药物已经得到了市场的认可, 肿瘤内科治疗的理念正朝着新的方向迈进。虽然目前传统的化疗药依然是多种肿瘤治疗的主力军, 但分子靶向药物的加入无疑对其是一种极大的补充, 随着人们对肿瘤发展分子机制的`逐渐深入, 分子靶向药物将扮演着更加重要的作用, 其针对的靶点也会愈加趋于多样化。本文所涉及的分子靶向药物见表1, 从中也不难发现, 药物的治疗靶点已不再局限于表面生长因子受体或血管抑制等, 更多潜在的靶点正不断被发掘出来, 可以说这种寻找肿瘤分子特异性靶点的策略给现代抗肿瘤药物的研发提供了源源不断的活力。当然分子靶向药物也存在着自身的局限性, 通过
特异性的抑制肿瘤细胞的某种信号分子或单一通路
・ 1236 ・ 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2015, 50 (10): 1232?1239
CDKs) 的天然抑制剂, 可以抑制CDKs的活性导致细胞周期G1/S期的停滞。目前FDA批准的上市药物有伏立诺他 (vorinostat, Zolinza?, 2006)、romidepsin (Istodax?, 2009)、belinostat (Beleodaq?, 2014) 和panobinostat (Farydak?, 2015)。其中belinostat属于环肽类, 与其他3个药物的结构类型 (异羟肟酸类) 有所不同。研究表明, 与正常细胞相比, HDACIs对肿瘤细胞的毒性更强, 目前多应用在多发性骨髓瘤, T细胞淋巴瘤的治疗上[25, 26]。
4.5 蛋白酶体抑制剂 (proteasome inhibitor, PSI) 蛋白酶体与泛素化信号构成的泛素?蛋白酶体是哺 乳动物细胞内主要的蛋白水解酶体系, 可降解大多数胞内蛋白, 包括p21、p53、c-myc和NF-κb等众 多调节细胞周期和凋亡的关键蛋白。PSI通过抑制蛋白酶体活性而干扰和影响细胞原有的功能,
尤其是对肿瘤细胞的生长有明显的抑制作用。这类药物有 硼替佐米 (bortezomib, Velcade?, 2003) 和卡非佐米 (carfilzomib, Kyprolis?, 2012)。硼替佐米是一种蛋白酶体可逆抑制剂, 针对26S蛋白酶体中糜蛋白酶样活性位点, 成为美国近十年来第1个批准用于多发性骨髓瘤的药物。卡非佐米为第二代蛋白酶体不可逆抑制剂, 与硼替佐米相比, 选择性更强, 疗效更好且周围神经毒性低[27, 28]。
4.6 已批准上市的其他靶向抑制剂 在异常复杂的细胞信号通路中, 还有其他一些信号分子作为治疗靶点应用于临床, 但由于其研究时间较短, 所上市的药物品种不多, 现对其进行简单介绍。
Palbociclib (Ibrance?, 2015) 作为CDK4和6的抑制剂,近期刚被FDA批准上市, 成为这类抑制剂的代表[29]。CDKs和细胞周期蛋白对细胞周期的调控起到重要的作用, 当细胞受到生长信号的刺激时, 细胞周期蛋白表达上调, 激活相应的CDKs, 导致Rb蛋白磷酸化, 释放出重要的核转录因子E2F, 从而引起一系列与S期有关的靶分子表达, 促使细胞完成DNA复制。体内外实验表明, palbociclib与来曲唑联用, 可以增强乳腺癌的敏感性, 抑制Rb磷酸化水平以及下游信号的传导, 因此比单个药物的抗肿瘤效果明显。
依鲁替尼 (ibrutinib, Imbruvica?, 2013) 是布鲁顿酪氨酸激酶 (Bruton’s tyrosine kinase, BTK) 的小分子抑制剂, 通过与BTK活性位点的半胱氨酸残基共价结合, 抑制BTK酶的活性。BTK在B细胞的生长成熟中扮演着重要的作用, 20依鲁替尼被批准用于治疗套细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病的治疗[30]。
奥拉帕尼 (olaparib, Lynparza?, 2014) 是第一
个上市的多聚ADP核糖聚合酶 (poly ADP-ribose polymerase, PARP) 抑制剂, 批准单药治疗BRCA基因突变的卵巢癌患者。奥拉帕尼利用DNA修复途径的缺陷, 优先杀死肿瘤细胞[31]。
克唑替尼 (crizotinib, Xalkori?, 2011) 和ceritinib (Zykadia?, 2014) 是间变型淋巴瘤激酶 (anaplastic lymphoma kinase, ALK) 抑制剂, 属于受体酪氨酸激酶抑制剂家族, 2011年被批准用于ALK阳性的NSCLC患者的治疗。Ceritinib的作用机制及适用范围与克唑替尼相似, 其抑制ALK的活性更强, 可用
于既往接受过克唑替尼并产生耐药性的患者[32, 33]。 Vismodegib (Erivedge?, 2012) 是hedgehog (Hh) 信号 通路的抑制剂, 通过与平滑跨膜蛋白发生作用,
阻断Hh下游信号产生效应。Hh信号通路的异常激活可以促进下游靶基因如c-Myc, VEGF等表达, 引 起细胞过度增殖, 导致肿瘤发生。研究表明, 在皮肤
基底细胞癌中存在着Hh信号通路异常激活的现象, vismodegib也成为第一个被批准用于治疗基底细胞癌的药物[34]。 5 展望
绝大多数被FDA批准的抗肿瘤药物和分子靶向药物见图1, 从而不难看出抗肿瘤药物的总体发展呈现逐年递增的趋势。自分子靶向药物发现以来 (19), 后期新上市的抗肿瘤药物中, 分子靶向药物占了很大部分, 20后, 分子靶向药物的研发更是进入快速发展阶段。毋庸置疑, 分子靶向药物的发现是传统抗肿瘤化疗药的一次飞跃, 对于肿瘤治疗也是一次重大的进展。由EvaluatePharma公司统计的、2014年销售前10位抗肿瘤药物中, 至少6个是典型的分子靶向药物, 而销售最好的前3种均为单克隆抗体药 (rituximab、bevacizumab和trastuzumab)。这表明分子靶向药物已经得到了市场的认可, 肿瘤内科治疗的理念正朝着新的方向迈进。虽然目前传统的化疗药依然是多种肿瘤治疗的主力军, 但分子靶向药物的加入无疑对其是一种极大的补充, 随着人们对肿瘤发展分子机制的逐渐深入, 分子靶向药物将扮演着更加重要的作用, 其针对的靶点也会愈加趋于多样化。本文所涉及的分子靶向药物见表1, 从中也不难发现, 药物的治疗靶点已不再局限于表面生长因子受体或血管抑制等, 更多潜在的靶点正不断被发掘出来, 可以说这种寻找肿瘤分子特异性靶点的策略给现代抗肿瘤药物的研发提供了源源不断的活力。当然分子靶向药物也存在着自身的局限性, 通过
药理作用分子作用机制 篇3
关键词:次生代谢;信号分子;活性氧;茉莉酸;水杨酸
中图分类号:S5-3文献标识码:A
文章编号:1674-0432(2010)-05-0023-2
植物次生代谢产物合成的多代谢途径性使得人们不得不通过不同的方法来刺激代谢途径以增加目标次生产物的合成量。其中利用诱导子对目的次生代谢产物的生物合成途径进行调控,目前已被看作是大幅度提高培养物中代谢产物含量的重要方法之一。但目前关于诱导子在培养的植物细胞中具体的作用机制尚未形成一套详尽的理论体系,随着人类对于植物次生代谢产物需求量的不断增加,及植物组织/细胞培养技术的不断进步,诱导子详尽的机制越来越受到关注。
一、胞内信号分子的来源与应用
(一)活性氧(ROS)
活性氧是正常细胞新陈代谢过程中通过光合作用产生的超氧化阴离子自由基、过氧化氢、羟自由基。在植物细胞培养生产次生代谢物的过程中也发现诱导物与受体结合可引发胞内活性氧的爆发。研究发现植物体内活性氧(ROS)的反应链为O2→(H)O2"→H2O2→OH+H2O→2H2O,其中O2"和OH的半衰期(分别为2-4s、<1s)很短,H2O2的半衰期为1ms,相对较长,可以从产生位点扩散一定的距离,因此有关ROS信号的研究多集中于H2O2。在红豆杉培养中,通过茉莉酸甲酯类似物(DHPJA)的诱导可以产生活性氧的爆发。金爪炭细胞壁激发子(Cle)激发人参悬浮细胞可通过促进氧进发,进而激活NAD(P)H氧化酶活性,导致H2O2产生,H2O2作为第二信使,激活苯丙氨酸途径,诱发人参皂苷的合成及hrgp防御基因的表达。以下激发子诱导下次生代谢物质的积累同样受到H2O2的介导,如大豆中异黄酮的积累、长春花中吲哚生物碱的积累、人参中皂苷的积累、水稻细胞培养中植保素momilactones的积累等。
(二)钙(Ca2+)
钙是植物体内重要的第二信使,它介导了由包括诱导子在内的许多刺激因子所引发的细胞进程。次生代谢过程中,诱导子或生理性刺激使细胞质膜去极化、超极化或由于机械敏感性,膜上的钙离子通道打开,Ca2+内流;同时,IP3(Inositol trisphosphate)、cADPR等与配体结合,使液泡膜上的Ca2+通道开放,液泡中Ca2+释放,胞质中Ca2+浓度升高。此类诱导子包括:外源ROS、IP3、以及寡聚糖、蛋白质等能够诱导胞内Ca2+浓度的升高,且不同刺激所触发的钙信号在幅度、频率、持续时间和细胞内定位等方面都存在差异。钙峰的形成主要依赖于植物细胞质膜上存在的电压依赖型和牵张激活型两类钙离子通道,进而引起钙离子内流。液泡膜上钙离子通道可分为两类:电压依赖型和膜脂代谢产物IP3及环腺苷二磷酸核糖(cADPR)等配体激活型Ca2+通道。诱导的Ca2+峰直接激活或通过Ca2+传感器(钙调素,CaM)激活Ca2+/CaM依赖的蛋白激酶、蛋白磷酸酶、膜结合酶或转录因子,进而影响细胞内生命活动。岳才军等报道,钙通过激活人参细胞体内葡萄糖转移酶的活性影响人参皂苷的生物合成及其异质性。总而言之,由激发子诱导的钙离子通量对激发子诱导的次生代谢物质的积累是非常重要的,具体的作用机制见下文。
(三)茉莉酸(JA)
JA、MeJA及其他衍生物统称为茉莉酸类(jasmonates,JAs),是通过硬脂酸途径产生的脂肪酸衍生物,是环戊酮衍生物之一。拟南芥中至少存在两条合成茉莉酸族成员的途径,即从亚麻酸开始的十八烷途径和从十六碳三烯酸开始的十六烷途径。多条合成途径的存在为茉莉酸在植物响应生物与非生物胁迫起重要作用奠定了基础。植物体内的茉莉酸及其衍生物是植物受外界刺激后反应最快的信号分子,利用JA生物合成突变体spr-2及JA反应突变体jai-1的研究表明,JA及其衍生物可作为长距离传输的信号分子发挥作用。依赖于茉莉酸类作为调节信号的重要的防御应答也是植物次生代谢物积累的前提,茉莉酸类通过开启一系列生物合成基因的协调表达从而在转录水平上影响植物次生代谢,进而参与调节萜类和吲哚类化学信息分子的合成,如紫杉烷的生物合成基因GGPPS和TS及人参皂苷的合成基因SQS和SE。
(四)水杨酸(SA)
水杨酸是植物体内普遍存在的一类酚类物质,化学名称为邻羟基苯甲酸,在植物的许多生理活动中发挥重要作用。自然条件下,SA可由植物体自身合成,含量较低,于韧皮部运输。除作为生理调节物质在植物的开花、侧芽萌发、性别分化等生长发育过程中发挥作用外,作为植物抗病反应的重要信号分子,它可以激活多种与抗病相关的植物防御机制,涉及并参与植物过敏反应和系统获得抗性(SAR)反应,在植物的抗病反应中起重要作用。
在真菌诱导子诱导红豆杉细胞时加入一定量的水杨酸促进紫杉醇的合成。如在红豆杉细胞培养生产紫杉醇的实验中,SA的类似物三氟水杨酸也可以发挥诱导子的功能。应用毛状根培养Brugmansia candida生产东莨菪碱和莨菪时,SA能够刺激两种药物在培养物中的释放。Krinke et al认为在SA所诱导的信号通路中,有磷脂酶D(PLD)的参与,PLD作为它的下游分子诱导基因表达。
二、胞内信号分子的作用机制
(一)活性氧
一般情况下,胞内H2O2浓度水平保持稳定,但在胁迫条件下,H2O2浓度升高且作为第二信使引发胞内一系列抗性反应,防卫基因和次生代谢物合成基因的表达,它可专一性地诱导谷胱甘肽转移酶以及谷胱甘肽过氧化物酶的表达,外源H2O2处理菜豆悬浮培养细胞可诱导PAL、查尔酮合成酶等的表达。外源H2O2处理后拟南芥悬浮细胞中PAL的mRNA丰度增加。胞内超量的H2O2可以通过NADPH氧化酶和脂氧合酶途径启动茉莉酸生物合成,进而激活下游防御基因的表达。
在Fe2+压力下培养柏细胞时,同样产生大量的活性氧,进而提高乙烯量及β-thujaplicin 的产量。这一结果证实,对于β-thujaplicin的产生,H2O2是积极的信号,而超氧阴离子自由基负面影响β-thujaplicin感应并强烈诱导细胞死亡。
适量的活性氧可以提高植物次生代谢物的产量,但过多的活性氧对细胞是有害的,自由基具有很强的氧化能力,很不稳定,能持续进行连锁反应,对许多功能分子有破坏作用。水杨酸作为一种过氧化物酶可有效地消除H2O2等自由基,从而有利于降低膜脂的过氧化程度,因而在诱导子应用中应考虑互作。
(二)钙离子
Ca2+通过两种方式发挥其调节作用,直接激活Ca2+依赖的蛋白激酶或通过激活Ca2+调节蛋白(如CaM) 的活性传递Ca2+信号,响应各种环境刺激。负责茉莉酸或其它信使如IP3、磷脂酸(PA)和甘油二酯(DAG)生物合成的磷酸酶是受Ca2+调节的一类主要酶。另外,伤害及MeJA 均可诱导番茄植株中CaM mRNA 的积累。Ca2+峰的另一个重要的作用是不同转录因子的激活,而转录因子则直接调节所有防卫基因的表达。JA也可促进水稻悬浮细胞中钙调蛋白基因osMLo的表达。在拟南芥依赖JA 的伤害信号转导通路中,CaM可能作用于JA 的下游。
钙诱导的钙释放是作用的第二种机制:即PLC对磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP2)(一个重要的磷酸肌醇)水解产生2个第二信使IP3和甘油二酯(DAG)。PLC需要Ca2+峰的形成来激活IP3能动员植物细胞内Ca2+库(内质网、高尔基体或液泡)中的Ca2+。因此IP3、Ca2+信号通路与激发子诱导的植物抗毒素的产生有关。
(三)茉莉酸
茉莉酸类可作为细胞内或细胞间的信号分子,通过与转录因子相互作用而调节防御基因的表达及次生代谢物质的合成。其中作为诱导子诱导植物细胞生产更多的次生代谢产物的报道很多,如前所述,具体的作用机制目前认为:茉莉酸类诱导与次生代谢物合成有关的关键酶基因的表达。茉莉酸进一步诱导转录因子进入细胞核,活化蛋白酶抑制剂基因表达。但是有关JA在植物体内信号转导的分子机制及JA信号通路与其他信号通路间的相互关系尚不清楚。再有如对JA的受体缺乏了解。利用茉莉酸类对植物次生代谢途径进行诱导,结合功能基因组学等相关技术,进行转录物分析,能进一步阐明许多尚不清晰的次生代谢途径.
Goossens研究组以烟草为实验材料,采用cDNA扩增片段多态性分析技术(cDNA-AFLP),以茉莉酮酸甲酯作为诱导子,鉴定出近600个茉莉酮酸甲酯诱导的烟碱合成相关基因,更加明确了烟草中烟碱的生物合成途径。此小组还利用CDNA-AFLP技术,结合代谢组学方法,发现了长春花生物碱代谢途径中417个基因标签的转录图谱,和178个峰的代谢物图谱,进一步深入研究了长春花中生物碱的代谢途径。Choi等利用EST数据库,通过研究茉莉酮酸甲酯诱导的人参毛状根系鉴定出了与人参皂甙生物合成有关的基因,进一步阐释了人参皂甙的合成途径。目前已经利用微阵列技术与功能基因组等研究方法筛选了一些茉莉酸类应答基因,今后还要对这些基因的应答机制进行深入研究,以便进一步了解其信号转导机制及植物次生代谢途径。
(四)水杨酸
水杨酸发挥作用没有特异性。能够诱导与次生代谢物质合成有关的基因的表达。植物细胞对于SA信号的反应目前已取得重大进展。然而当SA信号通路未能揭开之前,主要工作侧重于相关转录调节因子的确定与识别。如SA处理后一个迅速发生的事件就是磷脂酰肌醇的水平的剧烈变化取决于PI4K的活力。应用拟南芥细胞悬浮培养研究发现,激活磷脂酶D(PLD)是水杨酸信号通路中的一个早期信号。在系统获得性抗性中,生物体内的SA同外源SA都能够诱导相同的信号通路,最终导致发病机理相关(PR)基因的表达及防御蛋白的产生。如在烟草细胞中水杨酸触发的蛋白磷酸化级联反应涉及到MAP激酶,特别是伤口诱导的蛋白激酶和SA诱导的蛋白激酶。另据报道,表达发光蛋白的烟草BY-2细胞经SA处理后,其胞内的钙离子浓度升高。由此看来,SA的另一个作用机制与生物体内的钙信号有所相关,具体相关机制有待进一步研究。
通过多个信号通路进行交谈是植物转导网络的重要机制。本文综述了当前应用诱导子对植物次生代谢进行调节过程中,胞内信号分子如Ca2+、ROS、JA、SA等介导的植物次生代谢信号转导在实际生产中的应用及其作用机制。文中部分环节是在前人实验基础上的推测、假设,许多环节的机理还不清楚,需要进一步研究证明。植物次生代谢信号转导过程中,有关ROS是否直接参与JA合成的调节,JA和SA相互影响的机理,活性氧、Ca2+与胞内SA、JA等植物激素如何沟通进而通过与次生代谢相关的代谢途径如苯丙烷代谢途径、异戊二烯途径以及含氮次生物质合成途径的调控提高次生代谢物质的产量等问题急需早日解决,以为实际生产提供理论依据。
参考文献
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药理作用分子作用机制 篇4
1 氧自由基对机体的作用
氧自由基是需氧生物体内在代谢过程中产生的一系列活性氧簇 (reactive oxygen species, ROS) , 具有高度的氧化活性, 主要包括超氧阴离子 (O2+·) 、羟基自由基 (OH·) 和脂自由基 (ROO·) 等。线粒体是细胞内产生ROS的主要部位, 线粒体呼吸链中的酶复合体Ⅰ和Ⅲ漏出的电子 (电子漏) 能与O2+结合生成ROS。另外, 还原型辅酶Ⅱ (NAPDH) 氧化酶的同源物NOX蛋白家族正常状态下制造部分ROS, 作为信号分子调节细胞行为。其他外部因素 (如紫外线、金属离子等) 也可能导致细胞内ROS含量升高。理论上, 任何涉及电子传递的蛋白质和酶系都能导致“副产物”ROS生成。
生物体内有一套完整的抗氧化体系, 正常条件下可维持细胞内氧自由基代谢平衡, 将细胞内氧自由基控制在低浓度范围。正常情况下, 氧自由基可作为重要的信号分子参与细胞信号转导, 促进细胞的增殖、分化, 并在抗菌、消炎和抑制肿瘤等方面发挥重要作用。研究表明, ROS对正常细胞和肿瘤细胞都有促进增殖的作用, 且该种作用存在剂量-效应关系[2]。但在疾病或某些外源性药物或毒物侵入人体后, 造成自由基过多或清除过慢, 导致氧化应激和抗氧化间平衡被打破, 自由基便会攻击并损坏大分子, 对细胞膜、线粒体、核酸及机体蛋白质等造成损伤。
2 胡黄连苷抗氧化药理学研究
胡黄连的主要化学成分是环烯醚萜苷类化合物, 目前从西藏胡黄连中分离得到3种该类化合物 (picrosideⅠ-Ⅲ) , 其中胡黄连苷Ⅱ含量最高, 为主要有效成分。环烯醚萜类化合物均具有广泛的生物活性, 如抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、抗炎、增强免疫等, 在神经系统、消化系统和心脑血管系统方面发挥了积极的预防及治疗作用。胡黄连苷对多种疾病的治疗作用与其抗氧化作用有着密切联系。
2.1 胡黄连苷抗氧化保肝作用
体内过量氧自由基蓄积可引发自由基链式反应, 将生物体内蛋白质、DNA和不饱和脂肪酸等变成自由基, 从而引起脂质过氧化。由于大部分反应都在由膜结构提供的平台上进行, 因此, 脂质过氧化作用对膜的损伤是生物体氧化损伤的主要组成部分。肝细胞在自由基的氧化应激作用下, 细胞膜性结构包括线粒体膜受到直接或间接的破坏, 膜通透性增加, 造成钙超载, 甚至膨胀消失, 最终引起氧化应激损伤。线粒体是细胞内的“能量工厂”, 其破坏可引起肝细胞结构及功能改变, 这也是临床多种肝脏疾病的共同病理学特征。Gao H等[3]研究表明, 胡黄连苷Ⅱ通过抗脂质过氧化反应, 保护线粒体膜完整性以及上调线粒体中ATP酶活性, 对四氯化碳 (CCl4) 、D-氨基半乳糖联合脂多糖 (D-GalN) 以及对乙酰氨基酚 (AP) 诱导的小鼠肝损伤起到保护作用。顾伟等[4]通过体外实验证实, 胡黄连苷Ⅱ能降低细胞内ROS含量和线粒体膜电位差, 从而抑制由H2O2诱导的氧化应激引起的肝细胞线粒体损伤和细胞凋亡。
2.2 胡黄连苷抗氧化神经保护作用
线粒体功能失调以及由线粒体介导的神经细胞凋亡在神经系统疾病发生、发展中起到重要作用[5], 其中氧化应激反应可导致线粒体代谢失调, 膜蛋白的氧化可导致线粒体内酶活性下降甚至失活[6], 诱导线粒体通透性转换孔 (mitochondrial pemeability transtition pore, mtPTP) 的开放, 导致细胞色素C (Cytc) 从线粒体内膜脱落并流失到细胞质中, 进而活化caspase, 启动细胞凋亡[7]。程序过度氧化应激反应还可造成线粒体DNA损伤, 最终引起神经细胞的进行性损伤和功能紊乱。赵多明等[8]研究证实, 胡黄连苷Ⅱ可显著降低模型大鼠脑组织脂质过氧化物丙二醛 (MDA) 的水平, 提高SOD活力和GSH含量, 其通过增强细胞自身抗氧化能力发挥神经细胞保护作用。这一研究与Cao Y等[9]和郭明川等[10]相继证实的胡黄连苷Ⅱ对H2O2和谷氨酸诱导的体外PC12神经细胞氧化损伤的保护作用一致。线粒体作为ROS的主要来源, 更容易受到ROS的影响, 氧自由基蓄积可导致线粒体膜的通透性增加、呼吸链功能抑制及线粒体DNA (mtDNA) 的损伤, 促进细胞凋亡。胡黄连苷通过直接或间接地清除氧自由基, 提高细胞自身抗氧化应激能力, 减少线粒体受到的攻击, 最终减少神经细胞凋亡, 发挥神经细胞保护作用。
与其他器官相比, 脑组织更易产生自由基和脂质过氧化。现已证实氧化应激反应是大脑缺血性损伤的重要原因[11], 抗氧化治疗也是卒中治疗中保护神经细胞损伤的重要策略之一[12]。在脑缺血再灌注的病理情况下, 组织重新获得O2供应, 自由基生成增多且自由基清除酶活性降低, 动态平衡破坏, 启动自由基连锁反应, 造成缺血脑组织细胞损伤甚至凋亡。李琴等[13]研究发现胡黄连苷Ⅱ通过下调胱天蛋白酶-3 (Caspase-3) 和聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶 (PARP) 表达, 抑制脑缺血/再灌注损伤诱导的细胞凋亡。另有研究发现[14], 胡黄连苷Ⅱ能降低炎症反应中基质金属蛋白酶-9 (MMP-9) 含量, 减少细胞凋亡数量, 抑制大鼠脑缺血再灌注损伤后炎症反应, 对大鼠脑缺血再灌注损伤起到保护作用。在脑卒中早期脑缺血受损部位即有大量白细胞浸润、聚集, 多种细胞因子参与了炎症反应和神经元的损伤过程, 而激活的中性粒细胞耗氧量显著增加, 可产生大量氧自由基, 引起体内氧化与抗氧化失衡, 因此炎症过程中必然发生氧化应激反应。另一方面, 炎症细胞也会产生一些可溶性介质, 如花生四烯酸、细胞因子和趋化因子, 这一系列物质将进一步加强炎症细胞损伤和活性氧的产生。胡黄连苷可通过抑制大鼠脑缺血再灌注损伤后炎症反应, 对大鼠脑缺血再灌注损伤起到保护作用, 这与抗氧化作用存在着必然的联系。
2.3 胡黄连苷其他药理作用与抗氧化作用关系
何薇等[15]研究证实胡黄连苷Ⅱ可减轻气道炎症反应, 抑制支气管收缩, 对哮喘大鼠有抗炎平喘作用。哮喘患者体内炎症细胞及免疫细胞或体外香烟烟雾、大气污染物及颗粒物质产生的ROS及活性氮自由基 (reactive nitrogen species, RNS) 可导致体内氧化应激水平升高, 且ROS本身即可诱导机体产生很多哮喘的病理生理体征, 包括平滑肌收缩、气道反应性高、黏液分泌增多、血管通透性增加和趋化分子合成增多。哮喘是一种伴随氧化应激反应的进行性气道炎症疾病, 提高机体抗氧化能力也成为目前哮喘干预治疗的措施之一。
周俊华等[16]研究发现胡黄连苷Ⅱ可拮抗下丘脑-垂体-肾上腺轴 (hypothalanmic-pituitary-adrenocortical, HPA) 功能亢进, 从而改善抑郁症状, 发挥一定的抗抑郁作用。近年来, 已有研究显示[17], 与人的抑郁症发生和表现相似的CUMS大鼠抑郁模型的产生机制可能涉及机体氧化-抗氧化应激反应系统失衡, 可能与自由基增加, HPA轴功能异常有关。采用能清除自由基的一些黄酮类中药能改善实验性动物抑郁症状也是正是该假说的有利证据。
3 结语
丹参的药理作用研究进展 篇5
【文献标识码】B
【文章编号】1004-4949（2014）09-0755-01
丹参为中国的传统中药，最早见于《神农本草经》，并被列为上品。丹参以唇型科鼠尾属多年生草本植物丹参（SaiviamiItiorrhizaBunge）的干燥根及根莖入药。为临床之常用药物，已被现代临床实验和药理实验研究所证实活血化瘀等多方面的药理活性。丹参中提取的化学成分，有脂溶性的二萜醌类和水溶性酚酸类，脂溶性成分有丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅱa、丹参酮Ⅱb、隐丹参酮等；水溶性成分有原儿茶醛、丹参素（丹参酸甲）、丹参酸乙、镁-丹参酚性酸B（LSA-R）等。近来对丹参的作用研究主要集中在改善心、肝、肺、脑等脏器的缺血再灌注损伤；对肝细胞的损伤；肝纤维化、肝硬变、肝癌的作用；调节免疫应答；抗感染和抗肿瘤等方面，现综述如下。
1对肝细胞损伤、肝纤维化、：肝硬变、肝癌的保护作用：c， 百拇医药 在治疗小儿病毒性肝炎方面，有报道在治疗小儿病毒性肝炎50例，并设肌苷治疗对照组50例。复方丹参注射液的用法为2～5岁用6 ml，5岁以上用10～20 ml，加入5%葡萄糖液500 ml静脉滴注，每日1次，10天为1个疗程。一般需1～2个疗程。结果：治疗组、对照组分别临床治愈24例、6例；好转17例、26例；无效9例、8例；总有效率分别为82%、64%。丹参中主要的水溶性成分—丹参酸乙对原代培养大鼠肝细胞采用体外四氯化碳熏蒸直接造成的肝细胞损伤具有明显的保护作用。可能与该成分直接保护细胞膜，影响花生四烯酸级联过程及抗氧化作用有关。丹参单体IH7643可显著减轻大鼠四氯化碳肝纤维化程度，能明显降低肝羟脯氨酸和、型前胶原mRNA含量，降低血清透明质酸（HA）、层粘连素（LN）水平，改善肝功能。组织学检查也显示IH7643具有抗肝纤维化作用.
2抗肿瘤作用
2.1 RyuSY等从丹参根部提取物中分离出18种活性成分，均含有丹参酮色素，用这18种活性成分处理上述细胞48h后，每种肿瘤细胞系的增殖均显著受到抑制。丹参酮类有着广泛的菲醌结构是其细胞毒作用的基础，其中菲环结构与DNA分子相结合，而呋喃环、醌类结构可产生自由基引起DNA损伤，抑制肿瘤细胞DNA合成。
2.2 诱导肿瘤细胞分化：诱导分化治疗恶性肿瘤是癌肿治疗研究的新途径，它是诱导肿瘤细胞分化成为正常或接近正常细胞，而对正常细胞无杀伤作用。LiangY等在体外细胞培养的基础上，观察了丹参酮A对早幼粒细胞白血病细胞（NB4细胞株）的诱导分化作用，并以全反式维甲酸（ATRA）作对照，结果无显著性差异（P>0.05），推测Tan A促进NB4细胞分化的分子机制可能在于其对细胞增殖、分化相关基因表达的调控。
2.3 诱导肿瘤细胞凋亡：凋亡是在基因调控下的“自杀死亡”，又称细胞程序化死亡，即一定的生理或病理条件下，细胞按照自身既定程序主动结束生命的死亡形式。用无毒剂量Tan A（0.5μg/mL）作用于人肺癌细胞株（SPCA1），观察Tan对其凋亡的诱导作用，并以全反式维甲酸（ATRA）、顺铂（DDP）为对照。结果发现，丹参酮组SPCA1细胞凋亡指数显著高于DDP组，而与ATRA组比较无明显差异，且由流式细胞分析可见：丹参酮组促凋亡基因p53、Fas、Bax表达水平明显升高，而凋亡抑制基因Bcl2的表达水平则显著降低。
3 改善心、肝、肺、脑等脏器的缺血再灌注损伤
丹参素是超氧阴离子清除剂，其作用优于超氧化物歧化酶（SOD）。丹参注射液对H2O2-Fe2+体系中的羟自由基的清除率为65%，对黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶体系中的超氧阴离子的清除率为100%。丹参水溶性提取物可显著抑制Fe2+-半胱氨酸引起的大鼠心、肝、脑、肾、睾丸组织中线粒体和微粒体的脂质过氧化，还可以明显地抑制由Fe2+-Vit C体系和TritonX-100引起的大鼠心、肝、脑、肾脏线粒体肿胀，推测其保护作用与抗氧化作用有关。从丹参水溶性部分分离出的7种酚酸类化合物：丹酚酸A、丹酚酸B、原儿茶醛、原儿茶酸、丹参素、咖啡酸及迷迭香酸，对生物膜的过氧化损伤均有很强的保护作用，其中以丹酚酸A的抗氧化活性尤为显著。丹酚酸A、B和丹罗酚酸，对Vit C-NADPH或由Fe2+-半胱氨酸诱发的大鼠脑、肝、肾微粒体的脂质过氧化都有很强抑制效应，其作用比抗氧化剂Vit E的作用强百倍至千倍。丹参注射液能显著提高老龄小鼠红细胞及肝中的SOD活性，显著降低血清及肝中过氧化脂质的含量，与Vit E相比作用更强。丹参酮Ⅱa有类异搏停样L-型钙通道阻断作用，可用于心肌缺血再灌注损伤和心律失常的防治缺血再灌注损伤和脂质过氧化作用中，丹参素能清除黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶体系产生的超氧阴离子，其效果与SOD相近，丹参酮能清除心肌线粒体膜脂质过氧化作用产生的脂质自由基。清除氧自由基 氧自由基具有强烈引发脂质过氧化作用，在缺血再灌注条件下，可引发链式脂质过氧化反应损伤细胞膜，使细胞死亡，导致器官或组织缺血再灌注损伤，丹参素是超氧阴离子清除剂，其作用优于超氧化物歧化酶（SOD）。
4对皮肤的保护作用
丹参乙醇提取物在高、中、低3个浓度均对蘑菇酪氨酸酶活性和黑色素生成量呈剂量依赖性激活和上调，表明丹参可提高白癜风疗效。丹参酮对痤疮丙酸杆菌高度敏感，且是一种缓和的雌激素样物质，起着抗雄激素的作用，还具有类似氢化可的松的抗炎作用。
药理作用分子作用机制 篇6
1 河豚毒素的致毒分子机制
钠离子通道在可兴奋组织中如神经、心脏及肌肉组织中分布广泛,钠离子通道由电压依赖性的跨膜蛋白组成,随着钠离子的渗透性的增加而启动动作电位。钠离子通道是由1个α亚基及β1、β2、β3 3个辅助亚基构成,其中α亚基由4个同源区域(Ⅰ～Ⅳ)构成(图1),每个同源区域又由6次跨膜片段(S1～S6)及1个凹进片段构成,其中S4带有正电荷,起着电压传感器的作用,在电场(膜电位)的作用下,电压依赖性钠离子通道可以打开或关闭,在S5与S6之间凹进片段(P-loops)组成通道的外部结构,起离子选择的作用[4]。
河豚毒素是个刚性杂环分子,含有6个羟基与1个胍基,其中胍基是活性基团,碳-11羟基是河豚毒素与钠离子通道结合必需的,它们位于河豚毒素分子相对的两端,在生理pH下带正电荷(图2)。有研究表明河豚毒素分子中的碳-4、碳-6、碳-8、碳-9、碳-10和碳-11(C-4、C-6、C-8、C-9、C-10和C-11)上的羟基可以与钠离子通道相互作用,促进河豚毒素与钠离子通道的结合。研究表明河豚毒素的C-11羟基可以与Ⅳ区域的1 532位的天氡氨酸形成氢键结合,胍基可以与P-loops结合(图3)。
河豚毒素除了与钠离子通道结合之外,河豚毒素还可以与人心肌细胞中的L-型钙离子通道结合[6]。由于L-型钙离子通道与钠离子通道蛋白序列具有很高的同源性,结构十分相近,钙离子通道与钠离子通道的孔径蛋白都含有4个重复的线性序列,每个重复序列有6个跨膜结构,其中第4个跨膜结构带有正电荷,起电压传感器的作用,在第5到第6个跨膜结构之间有1个凹进的片段,起离子筛选的作用[7](图1)。
上述研究显示河豚毒素的致毒作用主要是与一些离子通道特异性的结合,从而阻止钠离子或钙离子的正常跨膜运输,进而影响到动物的神经兴奋与传导,中枢神经系统的调控功能,心脏搏动,平滑肌蠕动,骨骼肌收缩,激素分泌等一系列的生理功能。
2 河豚毒素的耐受机制
2.1携毒动物钠离子通道特定位点氨基酸发生突变
携带河豚毒素的动物可以耐受很高浓度的河豚毒素,这与这些动物体内特有的河豚毒素耐受机制有关。钠离子通道关键性氨基酸的改变对动物耐受河豚毒素起重要的作用。YOTSU-YAMASHITA等[8]从河豚脑组织细胞膜及肌肉细胞膜上分离出钠离子通道蛋白,对该蛋白α亚基(fMNa1)的1 880个氨基酸进行序列分析,发现通道I区的SS2片段的芳香族氨基酸(Phe/Tyr)被天冬酰胺(Asn)所代替。GEFFENEY等[9]对含有河豚毒素蝾螈的天敌,美州花纹蛇(Thamnophis sirtalis)的钠离子通道氨基酸组成进行分析,发现第1 561位的异亮氨酸(Ile)被缬氨酸(Val)所取代。由于麻痹性贝毒(STX)与河豚毒素的作用机制类似,因此对含有麻痹性贝类毒素动物的钠离子通道进行研究也发现部分氨基酸发生突变[10]。
为进一步确定钠离子通道氨基酸的变化对河豚毒素作用敏感性的影响,VENKATESH等[5]对小鼠细胞钠离子通道进行定点突变,使其与河豚具有相一致的氨基酸结构,利用电生理学方法研究发现河豚毒素与小鼠细胞的钠离子通道蛋白结合能力明显下降,细胞对河豚毒素的抵抗耐受能力提高。MEBS等[11]利用免疫荧光技术研究河豚毒素在东美螈(Notophthalmus viridescens)体内分布,研究发现河豚毒素在东美螈的皮下,肌肉层、肝脏、肠上皮细胞都有分布。推测东美螈耐受高浓度河豚毒素的原因可能也是由于体内钠离子通道关键性氨基酸发生了改变。钠离子通道的氨基酸序列比较保守,而河豚毒素携带动物的钠离子通道部分氨基酸的突变对动物耐受河豚毒素起重要的作用。
2.2毒素结合蛋白(PSTBP)及毒素体内的运输
河豚毒素携带动物可以抵抗高浓度的河豚毒素还与河豚毒素在动物体内的运输机制有关。对人工培养的无毒红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)进行河豚毒素肌肉注射,研究发现河豚毒素迅速通过血液传播到鱼的肝脏等其他部位,最终约89%的河豚毒素被贮存在河豚的皮下基层细胞内[12,13]。通过单克隆抗体免疫荧光技术分析河豚毒素在河豚体内分布,研究发现河豚毒素主要分布在雄鱼的皮肤和肝脏中,而雌鱼则分布在皮肤及卵巢中。河豚皮肤中的河豚毒素主要是在皮下基层组织及粘液细胞内[14]。这些研究表明河豚毒素在携带动物体内分布有一定的规律性,河豚摄入河豚毒素后被迅速输送到相关部位,进而减少河豚毒素的致毒作用,这与河豚毒素的特殊运输机制有关。
从河豚体内分离出河豚毒素结合蛋白(PSTBP)之后[15,16],在红脐大玉螺(Polinices didamy)、细纹玉螺(Natica lineata)、橙口榧螺(Oliva miniacea)、台湾榧螺(O.mustelina)和平濑榧螺(O.hirasei)体内也分离出能与河豚毒素结合的高分子量蛋白质(HMWS)[17]。对人工培养的无毒红鳍东方鲀蛋白质表达研究,通过飞行质谱鉴定发现Tr1和Tr2基因表达的C端蛋白质区域与PSTBP有很高的同源性,它们都是编码脂质运载蛋白的基因[18]。PSTBP是一种可溶性的蛋白,首先在河豚的肝脏内合成,通过血液被运输到河豚的皮肤、胆液等部位。PSTBP在河豚毒素含量最高的肝脏及卵巢部位中的浓度不是特别高,说明PSTBP与河豚毒素的富集没有关系。在肝脏中富集河豚毒素可能与其他的蛋白质有关,但目前还不清楚。河豚的皮肤存在分泌河豚毒素的分泌腺或类似腺状组织。河豚血液中的河豚毒素含量很低,而在河豚的特定部位毒素含量很高。这些说明PSTBP可能与河豚体内河豚毒素的运输有关[19]。
MATSUMOTO等[20]对红鳍东方鲀的肝脏组织切片后研究,发现肝脏组织切片可以富集河豚毒素,河豚毒素的富集呈温度依赖性和钠离子依赖性,研究还发现在培养液中河豚毒素浓度低时(类似天然条件),肝脏组织可以富集大量的河豚毒素,而培养液中河豚毒素浓度很高时,肝脏则积累较少的河豚毒素。由于人工体外培养,溶液中没有PSTBP存在,因此推测在河豚中存在跨膜的载体运输蛋白系统负责对河豚毒素进行跨膜运输。目前虽然有许多关于河豚毒素分子机制的研究,但是动物对河豚毒素的耐受机制还有许多没有阐明,如动物体内河豚毒素的贮存、运输相关的蛋白,河豚毒素体内代谢机制等还不清楚。河豚毒素在动物体内的分子机制复杂,涉及动物的生长、代谢等许多生命活动。如MATSUMOTOT等[21]对红鳍东方鲀进行肌肉注射后,用抑制消减杂交法研究河豚毒素对河豚肝脏基因表达的影响。研究发现河豚毒素可以影响河豚肝脏肝杀菌肽前体、血清铁传递蛋白、载脂蛋白、原纤维蛋白β链及热激蛋白等多个基因的表达。因此动物对河豚毒素的耐受机制还有待进一步的研究。
3 河豚毒素在动物体内的作用
3.1防御作用
从河豚毒素在动物体内的分布,可以看出河豚毒素对动物防御起重要的作用。河豚、两栖动物、蓝环章鱼(H.lunulata)及虾虎鱼的皮肤部位均检测出含有河豚毒素。免疫标签技术研究表明河豚毒素分布在虫纹东方鲀(Takifugu vermicularis)的皮肤内腺状组、凹鼻鲀(Chelonodon patoca)的皮肤汁液细胞、四齿鲀(Tetraodon steindachneri)的皮下基质细胞及汁液细胞中[22,23,24]。豹纹东方鲀(Takifugu pardalis)、星点东方鲀(T.niphobles)、异被东方鲀(T.poecilonotus)、环辐东方鲀(T.vermiculare radiatum)、紫色东方鲀(T.vermiculare porphyreum)把河豚毒素贮存在皮肤外分泌腺中[25,26]。SAITO等[2]研究发现星点东方鲀、虫纹东方鲀、豹纹东方鲀在外界刺激时皮肤会分泌大量的河豚毒素。肌肉注射过量的河豚毒素后,红鳍东方鲀在12 h内能把河豚毒素积累到皮肤部位[25]。在有危险的情况下河豚通常会鼓起肚子,同时伴随河豚毒素的分泌[26,27]。河豚的塑料模型可以吓退其他鱼类,甚至支持贝茨氏拟态效应[28,29],这可能就是与河豚含有河豚毒素有关。研究表明产卵后的河豚更容易受到攻击,相比野生幼鱼具有更高的死亡率,这可能与河豚产卵后体内河豚毒素浓度下降有关[30]。线纹玉螺(Natica lineate)在受到外界刺激时肌肉会分泌河豚毒素[31,32]。纽虫(Cephalothrix linearis)把河豚毒素贮存在上皮细胞的杆状细胞内,当受到外界刺激时也会分泌河豚毒素[33]。蓝纹章鱼(Hapaloclaena fasciata)、蓝环章鱼、圈章鱼(H.maculosa)、云斑裸颊虾虎鱼(Yongeichthyscriniger)及陆生河豚毒素携带动物也是把河豚毒素贮存在皮肤组织内[34,35,36]。河豚毒素存在于这些动物的皮肤组织特别是在分泌颗粒腺体内,受到危险时通过皮肤分泌河豚毒素,避免被其他动物捕食,因此河豚毒素在这些动物体内具有重要的防御性功能。
河豚毒素还大量存在河豚毒素携带动物的卵巢及卵母细胞内,如在河豚、鲎、蓝环章鱼等的卵母细胞都含有河豚毒素[37,38,39],这些河豚毒素可以传递给幼鱼。有研究表明河豚幼体可以阻止礁石鱼类的捕食,从而提高它们的成活率[40]。河豚毒素引发的电反应可以降低褐鳟(Salmo gairdneri)及红点鲑(Salvelinus alpinus)的味觉效果,许多鱼类会避开食用含有河豚毒素的食物[41]。这些研究进一步验证了河豚毒素对其携带动物的生存及繁殖起重要的保护作用。
3.2攻击作用
虽然有大部分研究表明河豚毒素对其携带动物有保护作用,但也有研究表明河豚毒素在某些动物捕食时也起着重要的作用。研究发现一种扁形虫(Planocerid flatworm)在捕食后体内的河豚毒素降低,但在1周后又恢复了正常水平[42]。含有河豚毒素的箭虫把河豚毒素贮存在头部附近,通过毒素来麻痹它们的食物[43]。蓝环章鱼把河豚毒素贮存在后唾液腺,遇到猎物时可以释放河豚毒素[44]。上述研究表明某些动物可以利用河豚毒素作为攻击其他生物的工具。
3.3生物信号作用
河豚毒素在一些生物内起着生物信号的作用。雌星点东方鲀体内河豚毒素浓度超过15 pmol·L-1时就对雄河豚有性诱导作用[45]。性成熟时期的雌河豚含有较高浓度的河豚毒素,可以吸引雄性河豚进行受精。还有研究表明河豚毒素对带有河豚毒素的螺[广大扁玉螺(Polinices didyma)、线纹玉螺(Natica lineata)、玉螺(N.vitellus)、素面织纹螺(Zeuxis sufflatus),方格织纹螺(Niotha clathrata)、红口榧螺(Oliva miniacea)、陷顶伶鼬榧螺(O.mustelina)及平濑榧螺(O.hirasei)]有诱食作用,而无毒的福寿螺(Pomacea canaliculata)和淡水蜗(Satsuma bairdi)没有诱食作用,说明带有河豚毒素的螺更倾向于觅食含有河豚毒素的食物[46]。通过在鱼食中添加河豚毒素标准品研究其对河豚的诱食作用,发现星点东方鲀也有类似功能,它们都更倾向于食用含有河豚毒素的食物[47]。因此河豚毒素对动物的性诱导及摄食诱导起重要的生物信号作用。
4 小结与展望
河豚毒素携带动物在自然选择长期的进化过程中,形成积累、富集、耐受河豚毒素的复杂机制,同时河豚毒素在动物体内的富集对动物及其幼鱼又起保护作用,某些动物在捕食及性诱导方面,河豚毒素也发挥着重要的作用,因此河豚毒素对其携带动物物种的生存延续有重要的存在意义。由于河豚毒素是一种小分子,是生物的二级代谢产物,研究表明微生物中二级代谢产物的产生受到微生物种间的相互协调作用的影响,如细菌产生的含有GcnE蛋白及AdaB蛋白的saga/ada复合物是细菌诱导构巢曲霉产生二级代谢产物所必需的[48],目前从河豚中分离的生产河豚毒素细菌经传代后产毒量极大的降低,这说明河豚毒素的产生可能还与微生物种间或微生物与机体的相互协调作用有关,并且这种作用是在携带河豚毒素生物长期进化中形成的。河豚毒素的产生涉及多种蛋白酶的参与,这些蛋白酶可能是由一串基因簇表达的,也可能由多个基因簇共同表达作用的结果,因此对河豚毒素的分子机制进行彻底的研究具有很大的难度。
药理作用分子作用机制 篇7
随着后基因组时代的到来,蛋白质组的研究手段渗入生命科学及医药卫生的各个学科研究领域。蛋白质组(proteome)是指细胞或组织基因组所表达的全部蛋白质。同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同,即使是同一细胞,在不同的发育阶段、不同的生理条件甚至不同的环境影响下,其蛋白质的存在状态也不尽相同。
疾病和药物改变基因组表达的调控,并通过基因组表达出来的蛋白质来执行各种生命功能。利用疾病发病前后[1]、疾病组织用药前后或正常组织干扰前后蛋白质组的变化情况[2],从蛋白质这个更深入本质的层面来探讨在各种外界干扰因素作用下机体的生理反应变化情况,可认识疾病的发生机制和药物的作用机制。
蛋白质组在药学研究领域的主要应用有以下几个方面:(1)随着利用蛋白质组分析方法疾病发病的分子机制的阐明,新药研发领域药物作用新靶标将确立[3]。(2)利用疾病组织用药前后蛋白质组表达谱的变化,研究药物作用后的药效分子机制和毒性分子机制,并根据其建立药物筛选的药理毒理分子模型。(3)通过敏感株和耐药株的蛋白质组的变化差异,研究细菌的耐药性机制[4]。本文对药物作用的药效机制和毒理机制分别予以综述。
1 蛋白质组学研究的主要技术平台
1.1 双向凝胶电泳技术
双向凝胶电泳技术(Two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)原理是在相互垂直的两个方向上,分别基于蛋白质不同的等电点和分子量,运用等电聚焦电泳(Isoelectric focusing,IEF)和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)把复杂的蛋白质成分分离和展现在二维平面上。该技术主要用于分离细胞或组织蛋白质提取物,构建特定细胞或组织蛋白质的二维电泳图谱,分析特定条件下蛋白质的表达状况,进行差异蛋白质组比较。高分辨率的2-DE技术,它将电荷分离过程即等电聚集(IEF)与质量分离过程(SD PAGE)结合到一起,以期获得细胞内的全部基因产物。其完整步骤应包括样品制备、等电聚焦、平衡转移、SD PAGE、斑点染色、图像捕获和图谱分析等。
1.2 质谱技术
质谱鉴定技术(Mass spectrometry,MS)可以精确测定由蛋白酶(通常用胰蛋白酶)水解多肽斑点后得到的几个肽段的质量,然后用这些肽段的质量查询数据库,如Genbank、PIR蛋白数据库、SWISS PROT数据库和EMBL[5]。蛋白质根据质量的精确度,一个未知的多肽一般可由5条肽段加以鉴定。虽然,用少量的肽段不能完全清楚地鉴定一个蛋白质,但用串联质谱仪则可得到更为确切的肽序列信息,一个肽的序列通常代表一个蛋白质。
1.3 生物信息学
生物信息学是是蛋白质组研究的一个不可缺少的部分,生物信息学在蛋白质组研究中有两个重要作用:一是分析和构建双向凝胶电泳图谱,二是搜索与构建数据库。各种不同类型的蛋白质组和基因组数据库既是实现已知蛋白质分析鉴定和未知蛋白质发展的前提,也是分析蛋白质结构、性质和功能,实现模拟和预测的基础。用于蛋白质鉴定的数据库主要有以下几类:蛋白质氨基酸序列数据库,蛋白质结构域与家族数据库,蛋白质高级结构及分类数据库,蛋白质2-DE图谱数据库,蛋白质相互作用数据库。蛋白质组研究中使用的软件主要有以下几类:蛋白质双向电泳图谱分析软件,蛋白质鉴定软件,蛋白质结构和功能预测软件[6]。
近年来,蛋白质芯片(或蛋白微阵列)技术[7]、噬菌体展示文库技术逐渐趋于成熟,可以预计,这些技术将广泛用于蛋白质组学的研究。
2 药物药效机制研究
目前的研究结果表明,蛋白质基因表达的调控构成了真正的药物作用机理。蛋白质组学可以发现在活性化合物作用下数千种蛋白质中表达异常的蛋白质,进一步推断这种化合物的目标靶蛋白质,可以将这些目标靶蛋白质作为药物筛选的作用靶点。例如在黄曲霉素诱发的肝癌细胞中加入dithioethione(一种治疗黄曲霉素诱发的肝癌的药物),通过与对照组的蛋白质图谱比较,可发现,一种名为黄曲霉素B,还原酶的蛋白质得以表达,这种蛋白质具有使黄曲霉素失去毒性的作用,从而表明蛋白质组学在这方面具有明显的优势。Graves[8]研究了喹琳作用后的蛋白质双向电泳图谱,发现醛脱氢酶(ALDH)和喹啉还原酶2(QR2)在人和小鼠红细胞裂解液中有表达,而在恶性疟原虫内则没有。提示喹啉类药物的作用可能与抑制疟原虫这两种酶的作用有关,这两种酶可能是喹啉类药物的作用靶点,而体外的一些研究也表明,喹琳类药物可以抑制这两种酶的活性,说明喹啉类药物的作用机制可能与这些酶的抑制有关。
应用蛋白质组学,高通量地对比分析药物作用前后蛋白质表达谱或蛋白质表达丰度的改变,可以提示药物的作用机制。如Steiner等[9]通过分析抑制素类降胆固醇化合物对小鼠肝脏蛋白质组的影响,从药物治疗前后表达变化的蛋白质中鉴定出HMG.CoA合成酶(胆固醇合成途径的关键酶之一)。国内有人研究雷米普利延迟相药理性预适应心脏保护作用,及其对心肌组织蛋白表达的影响[10]。用雄性Wistar大鼠分为2组,分别用生理盐水(NS组)和雷米普利(lmg/kg)(RAM组)灌胃,24h后冠脉左前降支行30min缺血/2h再灌注。每组各2只大鼠于预处理后24h取心室肌组织进行蛋白质组学研究。双向电泳及凝胶染色后,对表达有显著性变化的12个蛋白点进行质谱分析,初步鉴定RAM组一种未命名蛋白表达增加。结论:雷米普利在大鼠整体模型诱导延迟相心脏保护作用,此作用可能与一种未命名蛋白的表达增加有关。Mdluli K等[11]用低浓度异烟肼(1mmol/ml,该浓度诱导积累hexacosanoic acid)处理结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB),双向电泳分析MTB的蛋白质表达谱。s甲硫氨酸脉冲标记发现分子量分别为12 000和80 000的蛋白质明显上调。同样条件下用C醋酸标记发现积累的分子量为12 000蛋白质与脂类结合。Ⅱ型FAS系统合成枝菌酸,50个碳原子的脂类的载体是KcpM;AasA可望作为药物开发靶标,因为抑制其功能将导致细菌死亡;伴随着抑制枝菌酸合成,AcpM和KasA被上调,这提示存在某种对枝菌酸的水平作出反应的调控机制。该调控系统可以被用来构建报道菌株,筛选MTB细胞壁关键元件合成的抑制药。
3 药物毒理机制研究
毒理蛋白质组学的应用主要分为两大部分:(1)在临床前、临床中发现毒性标志物(单一物质或表达谱)以预测或早期发现药物毒性;(2)药物毒理机制的研究。与传统方法相结合,蛋白质组学在鉴定药物毒理机制上具有广阔的应用前景,能更准确地预测药物在人体中所发生的毒性[12]。
通过筛选的先导药物到药物开发的阶段,这一过程包括药物的药效学、药代动力学、毒理学研究、安全性评价及临床试验等步骤。这一过程耗时、又耗资,且常常是有价值的药物寥寥无几。传统毒理学研究通常是将病理与生化技术结合,利用动物实验来评价一个新药的安全性。然而,随着新药开发速度的加快,毒理学家需要借助一些新技术来理解一些药物毒理现象和临床前实验预测。蛋白质组学则可快速通过对药物作用后蛋白质的变化情况,对毒理机制加以认识,从而有效地弥补传统方法中的一些缺陷。Charlwood[13]等研究了庆大霉素作用后的肾脏双向电泳图谱,发现涉及柠檬酸循环,葡糖异生及脂肪酸合成的蛋白质发生了改变,从而有力地支持了庆大霉素毒性是由于能量产生受阻和线粒体损伤而导致肾脏毒性。蛋白质组学应用于毒理学研究比较经典的例子是Steiner等[14]对环孢菌素A(CsA)肾毒性机理的研究。比较CsA处理后的鼠肾细胞蛋白质组图谱,发现CsA处理后的图谱中,参与钙结合和转运的钙结合蛋白(calbindin)明显消失,从而解释了使用该药后肾小管钙化的毒性作用。蛋白质组学应用于毒理学研究比传统的动物实验更为简洁,也更具有说服力。
海马是一个调节学习记忆功能的重要脑组织,近年来研究表明,它在阿片等毒品成瘾机理中也有重要作用[15]。研究海马组织蛋白表达改变与阿片类物质成瘾的关系,对认识阿片类物质成瘾的机理和发现药物作用的靶标的重要意义。应用蛋白质组学方法,我们观察到慢性吗啡处理能引起小鼠海马中与能量代谢密切相关的呼吸链中的NADH脱氢酶的辅基Fe-s蛋白,三羧酸循环中丙酮酸脱氢酶复合物中二氢硫辛酰转乙酰基酶和糖酵解关键酶乳酸脱氢酶表达显著地降低。荧光实时定量PCR(RT-PCR)分析表明,编码这三个蛋白质表达的mRNA含量相应地降低。吗啡慢性处理小鼠海马组织中的ATP水平显著地低于正常小鼠海马组织中ATP水平,进一步证实慢性吗啡依赖小鼠海马中三个与能量代谢相关的酶表达降低。
4 结语
药理作用分子作用机制 篇8
1材料与方法
1.1试剂与仪器共纳入39只健康雄性SD大鼠, 体质量 (250~300) g, 根据处理方式不同分为假手术组、损伤组及七氟醚组。主要试剂:七氟醚 (美国Abbott公司生产) 、TNF-α与IL-1β试剂盒采用美国Biosource公司生产;主要仪器:英国Penlon生产的麻醉机、美国Thermo Scientific生产的离心机、荷兰Philips生产的监护仪和G5-M1019A气体检测仪等;主要器材:组织钳、线剪、眼科镊、中弯止血钳、动脉夹、持针器、系结镊、眼科剪、缝皮针等。
1.2方法39只健康雄性SD大鼠根据处理方式的不同分为假手术组、损伤组及七氟醚组, 损伤组和七氟醚组大鼠行大脑中动脉阻闭模型 (MCAO) 处理, 采用右颈内动脉尼龙线线栓法;七氟醚组在制定MCAO模型前24h吸入2.5%的七氟醚和97.5%的氧气, 共60min。假手术组大鼠只进行分离右侧颈总动脉和颈外动脉结扎处理, 不进入颅内放置线栓;大鼠缺血2h后再灌注24h。七氟醚预处理方法:将实验健康大鼠放置于密闭容器中, 容器与麻醉气体挥发罐相连接, 留置进气孔、出气孔, 从进气孔输入2.5%的七氟醚和97.5%的氧气, 出气孔与气体检测仪相连接, 测量容器内七氟醚、氧气的浓度, 保持大鼠自主呼吸60min后给予纯氧洗脱15min。MCAO模型处理方法:39只大鼠术前给予禁食12h, 经直肠连接监护仪, 使用烤灯保持大鼠的温度为 (37.0±0.3) ℃, 给予10%的水合氯醛 (300~350) mg/kg麻醉后, 于颈部正中处切开, 分离出右侧颈总动脉、颈外动脉, 结扎近心端的颈总动脉、颈外动脉分支, 使用血管夹夹闭颈总动脉远端, 并于颈总动脉分叉处剪开个口, 放置18mm的尼龙线, 直至受到阻力后停止;2h后拔出尼龙线栓, 恢复灌注。
1.3观察指标对比分析3组大鼠的神经功能缺陷评分情况及大鼠脑组织内肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 和白细胞介素-1β (IL-1β) 蛋白的含量[4]。采用Zea Longa法评估大鼠的神经功能缺陷, 以5分制为主, 0分:神经功能良好;1分:大鼠不能完全伸展, 病灶对应前肢;2分:大鼠出现偏瘫, 转圈行走;3分:大鼠向偏瘫处倾倒;4分:大鼠不能自主行走, 并丧失意识[5]。
1.4统计学方法应用SPSS 20.0统计软件进行数据处理。计量资料以±s表示, 多组间两两比较采用q检验;计数资料以率 (%) 表示, 组间比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 3组大鼠再灌注24h神经功能缺损评分情况对比假手术组大鼠的神经功能损伤评分均为0分;损伤组1只 (7.7%) 大鼠为4分、7只 (53.8%) 大鼠为3分、5只 (38.5) 大鼠为2分;七氟醚组3只 (23.1%) 大鼠为3分、5只 (38.5) 大鼠为2分、5只 (38.5%) 大鼠为1分;3组比较, 差异具有统计学意义 (P<0.01) 。见表1。
注:与假手术组、损伤组比较, *P<0.01;与假手术组比较, #P<0.01
2.2 3组大鼠脑组织TNF-α和IL-1β蛋白含量情况对比损伤组大鼠的脑组织TNF-α和IL-1β蛋白水平明显高于假手术组和七氟醚组, 而七氟醚组大鼠的脑组织TNF-α和IL-1β蛋白水平略高于假手术组, 3组大鼠的TNF-α和IL-1β蛋白总含量比较, 差异具有统计学意义 (P<0.05) 。见表2。
注:与损伤组比较, *P<0.05;与假手术组比较, #P<0.05
3讨论
缺血所引起的组织损伤是致死性疾病的主要原因, 如心肌梗死、脑卒中等。在缺血性疾病的抢救和治疗中, 有学者发现, 对组织造成损伤的因素不是缺血本身, 而是恢复血液供应后, 过量的自由基攻击组织内的细胞所造成[6,7,8]。缺血再灌注损伤的主要机制是产生过度的炎性反应, 而TNF-α和IL-1β蛋白则是免疫、炎性反应过程中的促炎因子, 具有诱导细胞黏附分子的表达和聚集中性粒细胞的作用, 是脑缺血再灌注损伤中的关键性介质[9]。有研究表明, 麻醉药物对脑缺血损伤起到一定的脑保护作用。尤其是七氟醚, 其对脑缺血再灌注损伤具有早期的脑保护作用, 经过临床预处理后, 快速起效, 可持续2~3h, 同时临床预处理后12~24h还对大脑起到延迟相的保护效应, 持续3~4d。七氟醚作为临床常用的吸入麻醉药物, 可降低黏附分子ICAM-1的表达, 而该分子受到TNF-α蛋白的刺激, 能有效的增加内皮细胞ICAM-1的表达, 减轻TNF-α的炎性反应, 从而起到神经保护作用[7]。同时, 七氟醚还可抑制NF-KB的活化、核转位, 抑制TNF-α和IL-1β蛋白的释放, 间接的调节免疫应答、炎性反应、应激反应等, 在细胞凋亡、增殖、分化等方面起到了重要的作用[10]。
本次研究结果显示:假手术组大鼠的神经功能损伤评分均为0分;损伤组1例 (7.7%) 大鼠为4分、7例 (53.8%) 大鼠为3分、5例 (38.5) 大鼠为2分;七氟醚组3例 (23.1%) 大鼠为3分、5例 (38.5) 大鼠为2分、5例 (38.5%) 大鼠为1分;损伤组大鼠的脑组织TNF-α和IL-1β蛋白水平明显高于假手术组和七氟醚组, 而七氟醚组大鼠的脑组织TNF-α和IL-1β蛋白水平略高于假手术组;三组相比较, 结果具有统计学意义 (P<0.01) 。
综上所述, 局灶性脑缺血再灌注损伤采用七氟醚预处理, 起到了延迟性保护的作用, 其机制与TNF-α和IL-1β等炎性因子蛋白含量降低有关。
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药理作用分子作用机制 篇9
关键词：白藜芦醇,肝脂肪积累,抑制作用,分子机制
白藜芦醇是一种多酚类植物化合物,是普遍存在于葡萄酒中的活性成分,近期研究表明白藜芦醇具有抵抗肥胖、抗高血糖和高血脂等作用,对能量代谢疾病有潜质的治疗作用[1]。白藜芦醇在哺乳动物中主要通过激活组蛋白脱乙酰基酶沉默信息调节因子1(SIRT1)发挥作用[2]。
SIRT家族共有7个成员,其活性都依赖于细胞内NAD+/NADH的比例,提示SIRT家族可能参与能量代谢的调控[3]。已有研究表明,白藜芦醇通过激活SIRT1,进而抑制脂肪酸合成、增加脂肪降解,并能促进糖异生抑制糖酵解作用[3]。然而,白藜芦醇对SIRT家族其他成员的调控作用尚未见报道。本文采用高糖和高脂肝细胞模型,检测白藜芦醇对两种细胞模型脂肪积累的影响,并检测在两种细胞模型中白藜芦醇对SIRT家族成员表达量的影响,进一步探讨白藜芦醇抑制不同条件引起的脂肪积累的分子机制。
1 材料与方法
1.1 细胞和主要试剂
本研究采用的正常人肝细胞HL7702购自中科院上海细胞库,采用含10%胎牛血清的DMEM培养基进行培养,培养条件为37℃、5%CO2。
白藜芦醇购自Sigma;SIRT家族成员抗体以及HPR二抗均购自Santa Cruz;Protein Detector LumiGLO Western Blot Kit购自KPL公司;油红O购自Sigma公司;PVDF膜购自Roche。
1.2 细胞处理
细胞根据处理方式不同分成以下四组:HP组(高脂处理,培养基含有200μmol/L软脂酸)、HPR组(高脂+白藜芦醇组,培养基含有200μmol/L软脂酸钠和50μmol/L白藜芦醇)、HG组(高糖处理,培养基含4 500 mg/L葡萄糖)和HGR组(高糖+白藜芦醇组,培养基含4 500 mg/L葡萄糖和50μmol/L白藜芦醇);各组细胞处理24 h后收获,进行下一步的实验。
1.3 油红O染色
细胞采用4%多聚甲醛固定4 min,PBS清洗,后加入稀释过的油红O溶液,摇床染色20 min,自来水冲洗,然后进行以下实验:苏木素复染10 s,1%盐酸酒精分化,拍照;或采用异丙醇溶解溶液,收获溶解液,在510 nm波长下检测吸光值。实验均重复3次。
1.4 总蛋白提取
预冷的PBS洗涤细胞2次,按照细胞数1.0×106/20μL裂解液的比例,加入预冷的单去污裂解液[50 mmol/L Tris(pH 8.0),150 mmol/L NaCl,1%NP-40],同时按一定比例加入蛋白酶抑制剂,冰上裂解30 min,4℃下12 000 r/min离心5 min,吸取上清,紫外分光光度计定量检测蛋白浓度后-70℃分装保存。
1.5 Western blotting
每条泳道加入等量的蛋白样本(50～100μg),加入5×蛋白上样缓冲液[1 mmol/L Tris-HCl(pH 6.8),5%beta-巯基乙醇,2%SDS,0.01%溴酚蓝,10%甘油]。100℃变性5 min,后10%～12%SDS-PAGE电泳分离,后转移到PVDF膜上,5%脱脂奶粉室温封闭1 h,Protein Detector LumiGLO Western Blot Kit检测,实验均重复3次。
1.6 统计学方法
采用统计软件SPSS 13.0对实验数据进行分析,计量资料数据以均数±标准差表示,采用方差分析,两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 白藜芦醇对HL7702细胞脂肪积累的影响
图1结果显示,在高脂组,白藜芦醇处理HL7702细胞后,脂肪积累量显著下降(P<0.05);在高糖组,白藜芦醇处理后,细胞脂肪积累量变化不明显,说明在肝细胞中,白藜芦醇能有效抑制由高脂引起的脂肪积累,对高糖引起的脂肪积累抑制效果并不明显。
A.油红O处理后细胞HL7702细胞内的脂肪染色情况;B.510 nm波长下检测各组油红O的量;HP:高脂处理;HP+R:高脂+白藜芦醇处理;HG:高糖处理;HGR:高糖+白藜芦醇处理;与HP组比较,*P<0.05
2.2 白藜芦醇对SIRT家族表达量的影响
为进一步探讨白藜芦醇对不同条件引起的脂肪积累的作用机制,笔者检测了高脂处理组和高糖处理组中SIRT家族的表达量变化。Western Blotting结果显示,与HP组比较,HP+R组HL7720细胞中的SIRT1,SIRT3,SIRT4和SIRT5的表达增加,SIRT7表达降低(P<0.05)(图2);与HG组比较,高糖+白藜芦醇处理可以促使SIRT1,SIRT4,SIRT5和SIRT7的表达增加(P<0.05)(图3)。以上结果提示,在不同条件引起的脂肪积累中,白藜芦醇的作用机制是截然不同的。
HP:高脂处理;HP+R:高脂+白藜芦醇处理;与HP组比较,*P<0.05
HG:高糖处理;HG+R:高糖+白藜芦醇处理;与HG组比较,*P<0.05
3 讨论
白藜芦醇是一种多酚化合物,在葡萄皮和葡萄籽中含量丰富。白藜芦醇具有减轻高热量饮食带来的不良影响、抵抗肥胖和延长寿命等作用[4],因此,从分子水平上了解白藜芦醇的作用机制,为其作为预防和治疗能量代谢疾病、保持健康和延长寿命的关键调控因子提供重要的理论依据。本结果显示,在正常肝细胞中,白藜芦醇对于高脂引起的脂肪积累有显著的抑制作用,然而对高糖引起的脂肪积累作用并不明显,提示白藜芦醇对不同条件导致的脂肪积累的机制可能是截然不同的。目前研究表明,白藜芦醇能特异性激活SIRT1,进而调控下游p53、NF-κB、FoxO、PGC-1α、PPAR、C/EBPa和C/EBPd等重要信号通路关键分子[2,5,6,7,8],发挥其生理学和生物学功能,然而,由白藜芦醇引起的SIRT1激活涉及哪些相互蛋白的相应活化,白藜芦醇对SIRT家族其他成员是否存在调控作用,SIRT成员之间是否存在联系等问题尚不清楚。本结果显示,在高脂和高糖处理的细胞模型中,白藜芦醇除了可以激活SIRT1蛋白的表达,还能使SIRT4和SIRT5的表达增加。已有研究表明,SIRT1具有核穿梭功能,主要定位与细胞浆和细胞核[9],而SIRT4和SIRT5则主要定位于线粒体[10,11],定位的不同提示其发挥的功能截然不同,具有核穿梭能力的SIRT1更多发挥的是信号传导分子的作用,定位于线粒体的SIRT4和SIRT5则主要参与呼吸作用的能量传递,但由于他们对于NAD(+)的依赖性[12],使他们不可避免存在功能相关性,例如它们都参与能量代谢的调控,因此它们对白藜芦醇的刺激均表现活性的变化,正是其功能相关性的重要体现。
为了进一步探讨白藜芦醇的分子作用机制,需更关注在高脂和高糖处理的肝细胞模型中,表达趋势不一致的SIRT家族成员。在高脂处理的细胞模型中,SIRT3表达量增加,SIRT7表达量下降,而在高糖处理的细胞模型中,SIRT3表达量没有明显变化,SIRT7表达量升高,这些结果提示,SIRT3和SIRT7可能是白藜芦醇在高脂和高糖引起的脂肪积累中影响作用不一致的关键因素。已有研究表明,SIRT1和SIRT3均对AceCS1具有高亲和性,并且SIRT3对AceCS2的乙酰化修饰起调控作用[13],这些结果提示SIRT1和SIRT3在能量代谢中发挥协同作用,共同调控能量代谢的关键分子acetylCoA的合成。目前研究表明,SIRT7主要定位于细胞核,参与rDNA的转录,是PolⅠ转录的正调控因子,而SIRT1通过去乙酰化作用于TAFI68负调控PolⅠ[14,15],这些结果表明,SIRT1和SIRT7作用相反,是一对拮抗分子。因此,在高脂处理的细胞模型中,由于与SIRT1发挥协同作用的SIRT3表达增加而与SIRT1发挥拮抗作用的SIRT7下调表达,放大了SIRT1的作用,因此脂肪积累受到抑制;在高糖处理的细胞模型中,SIRT7表达增高而SIRT3表达不变,SIRT1的作用被抵消,因此白藜芦醇脂肪积累效果不明显。
灵芝的药理作用研究进展 篇10
灵芝，又名灵芝草、神芝、芝草、仙草、瑞草，为多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子实体，主要分布于我国华东、西南、河北（赤芝），浙江、江西、湖南（紫芝）等地，两者均有人工栽培。野生品于夏、秋季采收，栽培品多于子实体成熟孢子散出后采收，药材外形呈伞状。我国最早的药学专著《神农本草经》将灵芝列为上品，有紫、赤、青、黄、白、黑六种，被称之为：“上上之药，方中妙品”。灵芝能补气安神，止咳平喘，用于心神不宁，失眠心悸，肺虚咳喘，虚劳短气，不思饮食等症状。在我国，灵芝作为药食两用的佳品历史悠久，关于其滋补强壮、扶正固本作用的论述可见于历代本草学专著中，尤以明代《本草纲目》对灵芝的种类、产地、药性、功用等记载最为详细。由此可见，我国历代对灵芝的重视程度。灵芝对人体具有双向调节作用，所治病种，涉及心脑血管、消化、神经、内分泌、呼吸、运动等各个系统，尤其对肿瘤、肝脏病变、失眠以及衰老的防治作用最为显著。endprint
灵芝，又名灵芝草、神芝、芝草、仙草、瑞草，为多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子实体，主要分布于我国华东、西南、河北（赤芝），浙江、江西、湖南（紫芝）等地，两者均有人工栽培。野生品于夏、秋季采收，栽培品多于子实体成熟孢子散出后采收，药材外形呈伞状。我国最早的药学专著《神农本草经》将灵芝列为上品，有紫、赤、青、黄、白、黑六种，被称之为：“上上之药，方中妙品”。灵芝能补气安神，止咳平喘，用于心神不宁，失眠心悸，肺虚咳喘，虚劳短气，不思饮食等症状。在我国，灵芝作为药食两用的佳品历史悠久，关于其滋补强壮、扶正固本作用的论述可见于历代本草学专著中，尤以明代《本草纲目》对灵芝的种类、产地、药性、功用等记载最为详细。由此可见，我国历代对灵芝的重视程度。灵芝对人体具有双向调节作用，所治病种，涉及心脑血管、消化、神经、内分泌、呼吸、运动等各个系统，尤其对肿瘤、肝脏病变、失眠以及衰老的防治作用最为显著。endprint
灵芝，又名灵芝草、神芝、芝草、仙草、瑞草，为多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子实体，主要分布于我国华东、西南、河北（赤芝），浙江、江西、湖南（紫芝）等地，两者均有人工栽培。野生品于夏、秋季采收，栽培品多于子实体成熟孢子散出后采收，药材外形呈伞状。我国最早的药学专著《神农本草经》将灵芝列为上品，有紫、赤、青、黄、白、黑六种，被称之为：“上上之药，方中妙品”。灵芝能补气安神，止咳平喘，用于心神不宁，失眠心悸，肺虚咳喘，虚劳短气，不思饮食等症状。在我国，灵芝作为药食两用的佳品历史悠久，关于其滋补强壮、扶正固本作用的论述可见于历代本草学专著中，尤以明代《本草纲目》对灵芝的种类、产地、药性、功用等记载最为详细。由此可见，我国历代对灵芝的重视程度。灵芝对人体具有双向调节作用，所治病种，涉及心脑血管、消化、神经、内分泌、呼吸、运动等各个系统，尤其对肿瘤、肝脏病变、失眠以及衰老的防治作用最为显著。endprint
药理作用分子作用机制 篇11
miR-136属于miRNA家族的成员之一。研究发现,miR136在非小细胞癌高表达,并与肿瘤的恶性程度及转移密切相关
1 资料与方法
1.1 实验仪器和试剂
普通PCR仪购自美国BIO-RAD公司,Light Cycler480荧光定量PCR仪购自瑞士Roche公司。总RNA提取试剂Trizol及SYBR premix Ex Taq TMⅡPCR Kit购自日本Takara公司,蛋白裂解液RIPA及lipofectamine2000转染试剂购自美国Life technology公司,双荧光素酶检测试剂盒购自美国Promega公司。miR-136模拟物(mimics)(5'-UGAUGGAUUCUUAUGCUCCAUCA-3')及阴性对照(mimics control)(5'-GUCCCACUUCGACCGUGCUUCCA-3')购自苏州吉马公司,DMEM培养基+胎牛血清+OptiMEM均购自美国Gibco公司,兔抗人BCL-2单抗(ab32124),BAX单抗(ab32503),CASP3单抗(ab32351)及内参GAPDH抗体(ab181602)均购自美国Abcam公司。
1.2 临床资料
本实验所用36例人原发性膝关节骨关节炎软骨组织及36例外伤性截肢后的膝关节软骨组织为2009年1月至2014年6月于新疆维吾尔自治区人民医院骨科中心收集,所用标本均经过新疆维吾尔自治区人民医院医学伦理委员会批准,并获得全部患者知情同意。36例原发性膝关节骨关节炎患者其中男22例,女14例,平均年龄52岁(38~73岁);36例外伤性截肢患者其中男26例,女10例,平均年龄43岁(25~57岁)。
1.3 总RNA提取及荧光定量PCR试验
按照Trizol说明书提取各样本总RNA,并进行逆转录试验合成c DNA。荧光定量PCR反应按照SYBR premix Ex Taq TMⅡPCR Kit试剂盒说明书,以合成的c DNA作为模版在Roche Light Cycler 480Ⅱ荧光定量PCR仪上进行。反应总体系为:模版c DNA1μL,miR-136特异性引物0.4μL,2×SYBR premix Ex Taq TMⅡPCR 8μL,10×mi Script Universal Primer 1μL,miR-136上游引物序列为5'-AGGTAGTAGTTTTGTTTACCTCA-3',下游引物序列为通用引物;以U6为作为内参,U6上游引物序列为5'-CCATGCTCTTCTACTCCT-3',下游引物序列为5'-CACT-GATGTCGGTTAGTT-3',最后加RNase-free water补充反应总体积为20μL。荧光定量PCR反应条件为:95℃20 min,随后95℃10 s,60℃30 s,72℃30 s,共45个循环。以实验所用内参U6作为标准化对照,采用ΔΔCT分析方法分析荧光定量PCR仪所得数据
1.4 细胞培养及转染
实验所用软骨细胞购自中科院上海细胞库。采用DMEM培养基+10%FBS进行培养,细胞培养条件为37℃,5%CO2。采用Lipofetamine 2000转染试剂进行细胞转染。实验均分为2组,其中试验组转染miR-136mimics,阴性对照组转染mimics control。
1.5 细胞增殖试验
将培养好的对数期生长的软骨细胞使用96孔板进行细胞铺板,每孔细胞数约为4 500个,采用lipofectamine 2000按上述分组进行细胞转染,转染细胞每孔连续4 d每天加入16μL MTT(5 g/L,Sigma-Aldrich)并室温孵育4 h后去上清,之后每孔加入130μL二甲亚砜孵育15 min予以充分溶解。测定各孔450 nm波长时的吸光度,并绘制生长曲线。
1.6 蛋白质印迹
将收集好的软骨细胞按照蛋白裂解液RIPA试剂说明书提取总蛋白,105℃加热15 min充分变性,常规制备12%SDS聚丙烯酰胺凝胶,每孔上样量15μL,按照电泳、转膜、封闭,加入抗BCL-2单抗(1︰1 000稀释),抗CASP3单抗(1︰2 000稀释),抗BAX单抗(1︰1 000稀释)及内参GAPDH抗体(1︰10 000稀释),4℃孵育过夜,第2天使用抗兔二抗(1︰10 000稀释)室温孵育1 h,TBST洗涤3次,每次5 min。ECL发光液处理后暗室内曝光胶片,于常温下自然风干,扫描结果保存。
1.7 miR-136靶基因生物信息学预测
通过miRanda[12]生物信息学数据库预测并分析miR-136的下游靶基因。
1.8 双荧光素酶报告基因试验
委托苏州吉马公司构建BCL-2的双荧光素酶报告
基因载体:以psi CHECK2为基础载体,psi CHECK2-BCL-2-WT为野生型报告载体,psi CHECK2-BCL-2-MUT为突变型报告载体。将培养好的对数期生长的软骨细胞使用24孔板进行铺板,每孔细胞数达4×105个,共同转染miR-136 mimics或mimics control与野生型及突变型报告载体至软骨细胞。24 h后,按照Dual-Luciferase○R Reporter Assay System试剂盒说明处理,验证靶基因BCL-2与miR-136结合位点。
1.9 统计学分析
统计分析采用SPSS 17.0软件。数据均以(±s)形式表示。统计分析采用Student's t或ANOVA检验。结果P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 miR-136在骨关节炎软骨及正常软骨组织的表达情况
采用荧光定量PCR分析miR-136在原发性膝关节骨关节炎软骨组织及外伤性截肢后的膝关节软骨组织的表达特征。结果发现,以外伤截肢后的膝关节软骨组织中miR-136的表达水平为1,原发性膝关节骨关节炎软骨组织中miR-136的表达水平为(0.24±0.08),两组差异有统计学意义(P=0.02)。
2.2 miR-136转染效率检测
按上述实验分组采用Lipofetamine 2000转染试剂进行细胞转染。48 h后,采用荧光定量PCR比较两组软骨细胞中miR-136的表达情况。以mimics control组软骨细胞中miR-136表达量为1,miR-136 mimics组相对表达量为(128.22±12.45),两组差异有统计学意义(P<0.001)。
2.3 miR-136对软骨细胞增殖能力的影响
采用MTT实验检测软骨细胞增殖。结果如图1所示:miR-136 mimics组软骨细胞增殖速度较mimics control组明显降低(P<0.05)。转染后1、2、3 d细胞生长抑制率[1-(miR-136 mimics/mimics control)×100%]分别为5.24%、7.63%和13.11%(见图1)。
注:*代表P<0.05
图1 miR-136对软骨细胞增殖能力的影响
2.4 miR-136对软骨细胞凋亡的影响
将培养好的软骨细胞使用6孔细胞培养板进行铺板,并转染miR-136 mimics和mimics control,48 h后抽提蛋白,使用Western blot检测凋亡相关蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cystenyl aspartate specific proteinose,CASP3)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associatal x protein,BAX)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cal CLL/Lymphone-2,BCL-2)蛋白的表达情况。结果如图2所示,过表达miR-136可明显增加软骨细胞中CASP3与BAX蛋白的表达,并抑制BCL-2蛋白表达(P<0.05,见图2)。
图2 miR-136对软骨细胞凋亡的影响
2.5 miR-136靶基因生物信息学预测
利用miRanda数据库分析miR-136的靶标基因,结果发现BCL-2可能是其靶基因。miR-136与BCL-2 mRNA 3'-UTR结合区域预测结果见图3。
图3 miR-136与BCL-2 mRNA 3'-UTR结合区域预测结果
2.6 miR-136靶基因BCL-2双荧光素酶实验验证
按照lipofectamine2000说明书,共同转染miR-136 mimics或mimics control与野生型及突变型报告基因载体至软骨细胞。24 h后利用Promega双荧光素酶报告基因检测试剂盒进行检测。结果见图4,miR-136可与BCL-2 mRNA 3'-UTR预测位点结合,并降低相对荧光比值;当结合位点突变后,miR-136结合能力消失,相对荧光比值恢复正常(见图4)。
3 讨论
OA的病因十分复杂,主要由遗传因素、机体免疫调控失衡和局部物理因素等长期作用所致,但其确切的发病机制仍不明确
注:*代表P<0.05
图4 miR-136靶基因BCL-2荧光素酶实验验证
miR-136定位于人14q 32.2号染色体上,目前已有文献报道miR-136在肺癌、胶质瘤、卵巢癌及甲状腺癌等多种疾病中起到了重要作用
细胞凋亡(apoptosis)又称为程序性细胞死亡,是由基因调控的细胞自主的消亡,该过程涉及一系列基因的激活、失活以及调控等的作用
综上所述,本研究观察到miR-136低表达于骨关节炎软骨组织,并初步揭示了miR-136可通过下调BCL-2抑制软骨细胞的增殖并诱导凋亡,miR-136有望成为OA诊断新的分子标志物及和治疗靶点。
摘要：目的 检测微小RNA-136(miR-136)在骨关节炎软骨中的表达,探究其对关节软骨细胞的作用并阐明其分子机制。方法 收集36例原发性膝关节骨关节炎软骨组织及36例外伤性截肢后的膝关节软骨组织,采用荧光定量PCR检测软骨组织中miR-136的表达情况。瞬时转染miR-136模拟物至软骨细胞,并观察其对软骨细胞增殖及凋亡能力的影响。采用生物信息学预测miR-136靶基因,并通过双荧光素酶试验予以验证。结果 miR-136在骨关节炎软骨组织的表达量明显低于正常软骨组织(P=0.02)。过表达miR-136可显著抑制软骨细胞的增殖能力,增加半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase,CASP3)及Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associatal x protein,BAX)的表达,并降低B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell CLL/Lymphone-2,BCL-2)蛋白的表达。BCL-2是miR-136的靶基因,miR-136可与BCL-2mRNA的3'-非编码区结合并抑制其翻译。结论 miR-136在骨关节炎软骨组织中呈现低表达,过表达miR-136可显著抑制软骨细胞的增殖并增加其凋亡;BCL-2是miR-136的下游直接靶基因,miR-136可能通过调控BCL-2参与骨关节炎的发生发展过程。
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