牙髓细胞（共5篇）
牙髓细胞 篇1
利用组织工程技术实现牙齿的再生是人类解决牙齿缺失问题的终极目标。传统的组织工程技术的基本原理是将体外培养扩增的种子细胞复合到支架材料上,构成细胞-支架复合体,再进行体外培养或植入体内相应的病损部位[1]。支架材料内部细胞分布难以控制。生物打印是一种新型的组织工程手段,是快速成型技术在生物医学中的应用,即:在计算机辅助下,按照预先设计的特定的三维结构,对活细胞、生物活性组织及相关生物材料等基本构件的逐层堆积的生物制造技术[2,3,4,5]。与传统的组织工程技术相比,生物打印技术可以个性化控制细胞分布以及精确控制支架成型。人牙髓细胞(human dental pulp cells, hDPCs)的生物打印研究可为牙齿组织工程提供新的思路和方法,相关工作未见报道。
1材料和方法
1.1主要试剂和仪器
1.1.1 主要试剂
Ⅰ型胶原酶(Worthington Biochem,美国);碘化丙啶(propidium iodide,PI)、dispase酶、胰酶、海藻酸钠、明胶(Sigma-Aldrich,美国);胎牛血清(HyClone,美国);α-最低必需培养基(α-minimum essential medium,α-MEM)(Gibco,美国);钙黄绿素-AM(calcein-AM,CAM)(Invitrogen,美国)。
1.1.2 仪器
生物打印机Cell Assembler Ⅱ(清华大学,中国);激光共聚焦显微镜LSM 5 Excitor(Carl Zeiss,德国)。
1.2实验方法与步骤
1.2.1 hDPCs的培养
临床收集(18～25)岁因阻生拔除的人第三磨牙,无菌条件下取出牙髓,剪碎,用3 mg/mL的Ⅰ型胶原酶和4 mg/mL的dispase酶在37 ℃消化1 h。加入含20%胎牛血清的α-MEM培养基终止消化,台式离心机以1 000 r/min离心5 min后收集细胞。加入20%胎牛血清的α-MEM培养基,转入培养瓶后置于37 ℃,5%CO2孵箱内培养。隔天更换培养基。传代后改用含10%胎牛血清的培养基培养,取状态良好的第4代细胞用于实验。
1.2.2 细胞-基质共混物的制备
将明胶干粉溶于α-MEM培养液中,获得14%(w/v)的明胶溶液,高压灭菌消毒。海藻酸钠干粉,高压灭菌消毒后,在无菌的超净台内用α-MEM培养液溶解,获得6%(w/v)的海藻酸钠溶液。将明胶溶液与海藻酸钠溶液按体积比1∶1混合,于70 ℃磁力搅拌达到均匀共混,调节pH值在7.2～7.4,得到10%的海藻酸钠-明胶透明胶状液体,记为SG。胰酶消化第4代hDPCs制成细胞悬液。用台盼蓝染色检验细胞的存活率大于90%后,将SG与hDPCs轻柔混匀,细胞终密度为2×106/mL。
1.2 3 细胞-基质共混物的三维生物打印
生物打印过程采用生物打印机Cell Assembler Ⅱ(图1)进行。首先,将细胞-基质共混物置入1 mL一次性无菌注射器,注射器的前端与金属喷嘴连接,固定在密闭的温控成形室内。然后,采用步进电机驱动柱塞挤出的成形方法,将共混物喷出到低温成形腔,在载有无菌培养皿的三维微动平台处拉成线状。挤出的共混物因明胶的温度敏感性发生交联,由溶胶转变为凝胶。在具有层片信息的预设计算机辅助设计模型(图2)数控驱动下,逐层挤出/沉积形成不同的层面。不同的打印层面之间依次交错叠加,最终形成三维结构体。主要成形参数见表1。
为维持三维结构体的稳定性,使未完全交联的结构体进一步交联,将成形的结构体在4°C的1%的无菌氯化钙溶液中浸泡5 min,然后用生理盐水反复冲洗,获得含有hDPCs的三维结构体。将结构体转移到α-MEM培养液中,在37°C,5 % CO2培养箱中培养。
1.2.4 三维结构体的观察
肉眼观察结构体外形,然后用倒置相差显微镜观察结构体。
1.2.5 打印后细胞活性分析
取培养24 h的结构体,用生理盐水漂洗,用含5 μmol/L的CAM和3 μmol/L的PI的α-MEM无血清培养液孵育45 min,生理盐水反复漂洗,用激光共聚焦显微镜分别在488 nm(CAM激发波长)和543 nm(PI激发波长)的激发光下在Z轴每隔20 μm扫描观察结构体内细胞的活性,保存所获图像。
2结果
2.1三维结构体的观察
通过生物打印技术,获得大小约为5 mm×5 mm×1.5 mm的半透明的网格状三维结构体(图3)。该结构体符合预先计算机辅助设计的结构。倒置显微镜下可见三维结构体中微丝直径约350 μm,孔隙的尺寸在350 μm左右,结构体中hDPCs的密度高,细胞在结构体中呈圆球形均匀分布(图4)。
2.2细胞活性分析
图5(a)和图5(b)分别为不同层面细胞在结构体中的情况。图5(a)为Z轴高度255 μm平面,图5(b)为Z轴高度340 μm平面。激光共聚焦显微镜在不同层面上可见细胞均匀分布,大部分细胞呈绿色荧光,少量被染成红色荧光的死细胞零散分布。
3讨论
生物打印是在快速成型技术发展的基础上,结合细胞生物学、计算机辅助设计和生物材料学等多个领域发展而来的一种新型的组织工程技术,其最终目标是实现器官打印[2]。与传统的组织工程技术相比,生物打印技术有诸多优势: (1)通过对生物打印喷头的三维协同控制、精确定位,在构建形态、结构复杂的组织工程结构体的同时可实现多种细胞在三维空间的同时精确定位[2]。(2)所构建出的组织内部细胞密度较高[6]。(3)可以在打印组织结构的同时在组织内部打印血管网,因而可解决较厚的组织结构的血管化问题[7]。(4)该技术自动化程度高,可升级而且重复性好,有利于进行大规模的工业化组织工程生产[2]。(5)细胞打印是完全由计算机控制的高通量细胞排列技术,可发展成为直接在生物体内进行的原位操作技术[8]。将生物打印技术运用于牙齿的再生,有望解决传统组织工程手段所难以解决的一些问题。
本研究所采用的生物打印技术的基本原理是结合离散-堆积快速成形原理和溶胶-凝胶相变机理,在计算机控制下,根据预先设计的三维数字模型,构建含活细胞的三维结构体,从而实现细胞打印[9]。本研究以明胶-海藻酸钠水溶胶为载体,在打印前将2×106/mL的hDPCs与水溶胶均匀混合,实现了细胞在三维结构体里的均匀分布(图4)。在4 °C的低温成形室内,以容积驱动挤出成形的方式,通过精确的三维定位系统,按照计算机软件预先设计的结构体外形、大小和内部孔径,将水溶胶以微丝形式精确挤出,不同层面的微丝逐层交错堆积,相邻层面的微丝相互粘接,构建出了含有hDPCs的网格状三维结构体(图3)。该结构体符合预先设计的尺寸和外形,结构体内部具有互相连通的孔隙,有利于组织形成及材料内部的hDPCs新陈代谢。打印过程中,微丝中的明胶水溶胶在低温环境下转变为凝胶,使结构体得以成形。经氯化钙溶液浸泡,结构体中的海藻酸钠与氯化钙溶液中的钙离子发生化学交联,转变为海藻酸钙凝胶,使结构体的稳定性得以维持。
细胞活性是评价细胞打印效果的重要指标。细胞打印过程容易对细胞造成损伤,如果不能使细胞所受损伤降至最低或零损伤,形成的三维结构体随着细胞的大量死亡也失去了意义。CAM和PI是用于细胞活性检测的典型荧光指示性染料[10]。CAM扩散进入活细胞,被胞内非特异性酯酶所水解,产物在波长为488 nm的激发光激发下发射明亮的绿色荧光;PI扩散进入丧失膜完整性的细胞(死细胞),与胞内DNA结合形成复合物,该复合物在波长为543 nm的激发光激发下发射红色荧光。激光共聚焦显微镜观察双荧光染色三维结构体的结果(图5)提示,本研究所采用的打印方法对hDPCs的损伤很小,hDPCs经三维生物打印存活率高。
综上,本实验将hDPCs和海藻酸盐-明胶水凝胶形成的共混物在生物打印设备上按照一定参数打印,构建出了具有自定义形状、尺寸,可控细胞密度,高细胞存活率的具有活细胞的三维结构体。这为生物打印技术进一步应用于牙齿组织工程奠定了基础,有望为牙齿再生提供了一种新的手段。尽管本研究利用生物打印技术构建的结构体尺寸较小、结构较简单,但现有研究工作已经验证了生物打印技术在牙齿组织工程中应用的可行性。
摘要：通过生物打印方法构建含人牙髓细胞(human dental pulp cells,hDPCs)的组织工程三维结构体。探讨对hDPCs进行三维生物打印的可行性。用常规体外培养hDPCs至第4代。将细胞悬液与海藻酸钠-明胶水溶胶混合,制备hDPCs-海藻酸钠-明胶水溶胶共混物。细胞终密度为2×106/mL。用生物打印机根据预先设计的参数进行生物打印,构建组织工程三维结构体。对结构体进行肉眼观察和倒置相差显微镜观察。用钙黄绿素-AM和碘化丙啶双荧光染料对结构体进行染色,激光共聚焦显微镜观察分析结构体中hDPCs的活性。通过生物打印技术的结果可按照预先设计的参数打印出含有hDPCs的网格状的水凝胶结构体,该结构体的大小约为5 mm×5 mm×1.5 mm。倒置相差显微镜下可见结构体内微丝的直径约300μm,微丝间的孔隙相互通连,孔隙大小约350μm×350μm,hDPCs在结构体中呈球形均匀分布。激光共聚焦显微镜观察证实结构体中大部分细胞存活。初步证明hDPCs可耐受生物打印过程。通过研究说明三维生物打印技术构建出了含人牙髓细胞的组织工程三维结构体,实现了hDPCs的生物打印,为生物打印技术应用于牙组织工程奠定了基础。
关键词：生物打印,组织工程,牙髓细胞
参考文献
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牙髓细胞 篇2
1 材料与方法
1. 1 主要试剂和仪器
骨桥蛋白( R&D Systems公司,美国) ; DMEM高糖型培养基( Gibco公司,美国) ; 胎牛血清( Hyclone公司,美国) ; 胰蛋白酶、Ⅰ型胶原 酶、茜素红 ( Sigmaaldrich公司,美国) ; 抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、L-谷氨酰胺( Sigma公司,美国) ; 逆转录试剂盒( Roche公司,瑞士) ; PCR Master Mix ( Tiangen公司) ; CO2孵箱( Heraeus公司,德国) ; YJ-875型超净2工作台( 苏州净化设备厂) ; 倒置相差显微镜( Olympus公司,日本) ;台式低温高速离心机 ( Hettich公司,德国) ; PCR仪( 杭州博日科技有限公司) ; 精密酸度计( 上海虹益仪器仪表有限公司) 。
1. 2 方法
1. 2. 1牙髓干细胞的分离和培养[8]收集临床14 ~29岁因阻生或正畸拔除的正常健康的第三磨牙或前磨牙,劈开牙体,用镊子与探针挑出牙髓,含双抗PBS充分冲洗,在体积分数为0. 3% 的Ⅰ型胶原酶中用37℃水浴振荡器消化1 h,200目尼龙筛过滤悬液至10ml离心管中,1 000 r / min离心5 min,弃上清,加入含20% FBS培养基,吹打混匀,血细胞计数板计数以1×105个/ml细胞接种至50 ml的培养瓶,37℃、5% CO2恒温培养箱中培养。每周换液2 ~ 3次,细胞融合达80% 后,0. 25% 胰蛋白酶消化,1∶2比例传代。
1. 2. 2牙髓干细胞的纯化和鉴定[9,10]克隆团分选技术将牙髓细胞悬液进行纯化分离,流式细胞技术鉴定DPSCs,倒置相差显微镜观察细胞形态,细胞常规传代至2 ~ 3代用于后续实验。
1. 2. 3茜素红矿化结节染色( Alizarin red S staining)将第3代人DPSCs以1×105个/ 孔接种于6孔板中。12 h后,随机分为2组: 矿化液组( DMEM F/12培养基、胎牛血清、青链霉素、100μmol/L抗坏血酸,10mmol / Lβ-甘油磷酸 钠, 2 mmol / L L-谷氨酰胺[11,12]) ; OPN组( DMEM F/12培养基、胎牛血清、青链霉素、0. 01μg /ml OPN[13]) 。每组设3个复孔。继续培养28 d后进行茜素红染色,培养板PBS缓冲液冲洗3遍,95% 无水乙醇固定15 min,蒸馏水冲洗3次,0. 1% 茜素红-Tris-HCl ( p H = 8. 3 ) 37℃孵育30 min,蒸馏水轻轻冲洗2次,干燥。
1. 2. 4逆转录聚合酶链反应( reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR ) 检测将第3代人DPSCs以1×105个/孔接种于6孔板中。12 h后,随机分为2组: 矿化液组( DMEM F/12培养基、胎牛血清、青链霉素、100μmol/L抗坏血酸,10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠,2 mmol/L L-谷氨酰胺) ; OPN组( DMEM F/12培养基、胎牛血清、青链霉素、0. 01μg /ml OPN) 。每组设3个复孔 ( 实验重复3次) 。继续培养7 d后进行RT-PCR实验检测各组骨涎蛋白 ( bone sialoprotein,BSP) 、Runx-2转录因子、骨钙蛋白 ( osteocalcin,OCN) 、Ⅰ型胶原蛋白( collagen-1,Col-1) 表达情况。依据操作手册使用Trizol试剂裂解细胞,提取总mRNA。参照RT-PCR逆转录试剂盒操作说明书将总mRNA依次按25℃10 min、50℃1 h、85℃5 min逆转录为c DNA。PCR反应条件为: 94℃3 min预变性后,94℃30 s、48. 2 ~ 60. 1℃30 s、72℃1 min,30个循环,72℃5 min延伸,4℃保存。RT-PCR引物序列见表1。
1. 3 统计学处理
计量资料采用x珋±s形式进行描述,统计分析采用方差分析( ANOVA) 比较矿化液组和OPN组之间的差异( P < 0. 05) 认为2组之间存在统计学意义,所有统计数据均采用SPSS 15. 0 ( SPSS Inc,Chicago,IL) 统计分析软件进行分析。
2 结 果
2. 1 DPSCs 在光学显微镜下细胞形态学变化
DPSCs原代培养24 h内细胞贴壁缓慢,可见细胞呈梭形,形态较小,未完全伸展,且有少量悬浮未贴壁细胞。48 h,细胞为梭形,贴壁较多,少量细胞呈克隆团状生长。7 d后可见DPSCs大量扩增,呈伸展长梭形,克隆团状聚集生长,细胞融合率可达80% ( 图1) 。
2. 2 茜素红矿化结节染色
取克隆化培养第3代的DPSCs分组培养28 d,OPN组和矿化液组经茜素红染色后光学显微镜下可见红色团状矿化结节( 图2) 。用Image Pro Plus 6. 0软件完成图像分析,OPN组与矿化液组矿化面积百分比分别为( 13. 42±1. 96) % 和( 12. 81±1. 24) % ,结节数量分别为128±15、132±11,结节平均面积( μm2)分别为( 1 287. 94±96. 25) 、( 1 192. 26±78. 26) ,各组均无明显差别( P >0. 05) 。
2. 3 RT-PCR 检测
OPN和矿化液诱导培养后DPSCs骨源性基因表达均呈阳性。OPN组BSP基因表达水平高于矿化液组( 分别为0. 864±0. 112和0. 514±0. 068,P <节数量分别为128±15、132±11,结节平均面积( μm2)分别为( 1 287. 94±96. 25) 、( 1 192. 26±78. 26) ,各组均无明显差别( P >0. 05) 。0. 05) ,Runx-2基因表达水平低于矿化液组 ( 分别为0. 186±0. 017和0. 324±0. 058,P < 0. 05) ; Col-1及OCN基因表达水平相近 ( 1. 346±0. 175和1. 276±0. 146; 0. 115±0. 015和0. 118±0. 015) ( 表2) 。
注: 1与矿化液组比较,P < 0. 05
3 讨 论
如今,干细胞的应用为人类多种疾病的治疗带来了新的希望,应用组织工程修复口腔牙槽骨组织缺损是近年来研究的热点。牙髓干细胞来源广泛,取材方便,具有自我更新和多向分化的能力,体内体外实验均已证实其具有很强的成骨能力。科学家们也因此认为这类成体干细胞将可替代骨髓来 源的间充质干细胞,成为骨组织工程研究理想的种子细胞[12]。
为提高DPSCs修复骨组织缺损的能力,研究者们长期致力于探索各种有效的诱导方法使DPSCs转化为成骨细胞。现已证实牙髓干细胞在成骨细胞的旁分泌蛋白作用下可实现向成骨细胞分化[14]。骨桥蛋白( OPN) 属成骨细胞旁分泌因子的一种,是小整合素结合配体N端联结糖蛋白家族( SIBLING家族) 成员,含有在骨基质的形成、矿化以及在介导细胞 - 细胞、细胞- 基质的相互作用中发挥关键作用的RGD蛋白,是矿化过程中发挥重要作用的涎蛋白之一,可迁移趋化干细胞到受损组织中,发挥干细胞修复作用[5,6,15]。本实验用OPN诱导培养DPSCs,比较其与目前应用较广的矿化液的诱导效果。
通过倒置相差显微镜观察,OPN诱导后的DPSCs形态近似成骨细胞的多角形或椎 体形态,能多层重叠生长而不出现接触抑制现象,具有与成骨细胞相似的形态和生长特点[16],说明DPSCs开始进入到分化过程中,同时推测这种不完全的成骨细胞形态是由于DPSCs首先分化为骨祖细胞和 前成骨细胞而 形成的。
牙髓细胞 篇3
1材料与方法
1.1主要实验材料
水溶性固体蜂胶:上海辰蜂生物技术公司提供, 氢氧化钙粉:上海二医张江生物材料有限公司生产。
1.2主要试剂与仪器
DMEM细胞培养基(Hyclone)、澳洲胎牛血清(普飞)、0.5 g/L胰蛋白酶(Hyclone)和96孔细胞培养板均由诺贝生物科技有限公司提供。MTS(普洛麦格生物技术有限公司),二氧化碳培养箱(美国Therm- Fisher Forma 3111),超净工作台(SW-CJ-1D型,苏州净化设备有限公司),高速低温离心机(日本HI- TACHI集团CR22G),小鼠抗人波形丝蛋白单克隆抗体(福州迈新公司),小鼠抗人角蛋白单克隆抗体(福州迈新公司),酶标仪(ST360,上海科化实验系统有限公司)。
1.3人牙髓成纤维细胞的培养及传代
牙髓标本取自昆明医学院附属口腔医院颌面外科门诊,取临床青少年因正畸减数需要拔除的健康恒前磨牙4~5颗,立即置入含有3%双抗的DMEM培养液中带回。在科室用碘酊、乙醇依次消毒牙冠, 无菌高速涡轮机头除去表面牙周组织,裂钻环形切割牙颈部至近髓后立即置入培养液中带到实验室。 在超净工作台内,骨凿劈开牙冠,用无菌的K锉谨慎从根管中抽出牙髓迅速剪去根尖1/3,置入浸有培养液的培养皿中,用无菌眼科剪剪成0.5 mm3组织块,然后用DMEM培养液冲洗3次,探针将组织块挑入培养瓶底部,以0.5 mm的间距均匀铺置,对侧壁滴入培养液,瓶底向上置入二氧化碳培养箱中,静置4 h贴壁后翻转,再加入适量培养液静置于培养箱中培养,组织块未游出细胞前每周换液一次,细胞游出后每3天换液一次,在倒置显微镜下观察细胞游出及生长情况,待细胞达到汇合点时,用0.5 g/L的胰酶消化,按1∶2传代,原代培养的人牙髓细胞传至第4代后,免疫组织化学染色鉴定细胞的组织来源。 细胞继续传代至第5代,取生长良好的第5代牙髓细胞进行细胞接种备用。
1.4蜂胶水溶剂的配制
取国产水溶蜂胶用三蒸水将其配成1 g/10 ml的蜂胶溶液,0.2μm的无菌过滤器滤后再用含有10%胎牛血清的DMEM培养液稀释成4、2、1、0.6和0.2 g/L 5个浓度备用。对照的氢氧化钙溶液配制: 将200 mg氢氧化钙干粉剂溶于50 ml的三蒸水中, 3 000 r/min条件下离心10 min,取上清液,0.2μm的无菌过滤器滤后用含有10%胎牛血清的DMEM培养液稀释成10%、8%、4%、1% 4个浓度备用。
1.5人牙髓细胞相对增殖率的测定
Cell Titer 96 @ A Queous One Solution Cell Proliferation Assay(a)是一种用比色法来检测细胞增殖和细胞毒实验中的活细胞数量的新的检测试剂, 此试剂含有一个新型的四唑化合物MTS和一种电子偶联剂PES。PES具有增强的化学稳定性,这使它可与MTS混合形成稳定的溶液,是方便的单溶液模式。MTS被细胞生物还原成为一种有色的甲臜产物,可直接溶解于培养基中,这种转换是由代谢活跃的细胞中的脱氢酶产生的还原型烟酰胺腺嘌呤二核甘酸磷酸(NADPH)或烟酰胺腺嘌呤二核甘酸磷酸(NADH)的作用下完成的。检测时,只需将少量的Cell Titer 96 @ AQueous One Solution Reagent试剂直接加入培养板孔的培养基中,孵育1~4 h,然后用酶标仪读取490 nm的吸光度值,操作步骤比MTT更少,更方便快捷。在490 nm处检测到的甲臜产物的量与培养中的活细胞数成正比。
本实验采用MTS比色法,检测不同浓度的蜂胶水溶剂和氢氧化钙溶液作用于人牙髓细胞后的吸光度(OD值),计算细胞相对增殖率(relative growth rate,RGR):RGR= 实验组OD值/ 阴性对照组OD值×100%,根据RGR换算细胞毒性的级别。
具体方法如下:取生长良好的第5代牙髓细胞, 0.5 g/L胰蛋白酶消化,离心后用含有10%胎牛血清的DMEM培养液吹打成单细胞悬液,用细胞计数板调整细胞浓度至2×104/ml,接种于96孔板,每孔100μl。放置到37℃、5%二氧化碳培养箱中培养48h, 倒置显微镜下观察大多数细胞贴壁并生长。弃去孔内液体及不贴壁的细胞,将各稀释药液加入96孔板中,每种加5孔,每孔100μl;阴性对照组加含有10% 胎牛血清的DMEM培养液,每孔100μl。在预实验中,笔者发现蜂胶的颜色也对吸光度产生一定的影响,因此在每组蜂胶实验组的上方还设一组不含细胞的蜂胶液对比孔,在该对照孔中加对应浓度的蜂胶液100μl。用该蜂胶组的OD值减去该孔的OD值以排除蜂胶色度对实验组吸光度的影响,96孔板置37℃,体积分数5%二氧化碳条件下培养48 h后, 每孔加入20μl配好的MTS试剂,再放回培养箱中放置4 h取出,在酶标仪上振荡30 s,于490 mm波长下测OD值,每种浓度孔的OD值取平均值。计算细胞RGR,根据细胞毒性评级标准(见表1),用RGR值换算细胞毒性级。
1.6统计学方法
采用SPSS 11.0统计软件进行数据分析,对实验结果组间进行方差分析,对蜂胶与氢氧化钙总体细胞毒性进行两独立样本t检验,P <0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1细胞的培养和形态学观察
本研究用传统的组织块培养法,12~15 d内可见有的组织块周边有少量梭形细胞长出,2~3 d后细胞迅速扩增,约18~20 d左右细胞长满瓶底。按1∶2传代,2~3 d可传一代。原代及传代培养的细胞胞体呈长梭形,星形胞体细长,胞浆丰富,核位于中央,排列紧密多呈近于平行的束状,细胞界限清楚, 呈“漩涡状”。见图1。
2.2细胞来源鉴定
取第4代对数生长期人牙髓细胞爬片,按试剂盒说明书进行波形丝蛋白,角蛋白免疫组织化学染色, 光镜下观察。牙髓成纤维细胞呈典型的成纤维样细胞,细胞浆内波形丝蛋白染色为阳性,角蛋白染色呈阴性。波形丝蛋白是成纤维细胞的特征性蛋白, 而角蛋白是上皮细胞的特征性蛋白,因此证实培养的是中胚层来源的人牙髓成纤维细胞。见图2、3。
2.3细胞相对增殖率结果及毒性分级
第5代人牙髓成纤维细胞以2×104/ml,接种于96孔板,培养48 h后,各孔细胞密度均匀。细胞贴壁生长,形态正常,胞体呈长梭形。加样48 h后,阴性对照组细胞密度增加,形态正常;加药物的实验组和对照组,低浓度的各孔中细胞形态基本正常,随着浓度的增加,培养孔中出现变性死亡细胞,部分细胞漂浮起来。各孔加入MTS试剂后,放回培养箱中孵育4 h,取出后用酶标仪测定各孔的吸光度。不同浓度蜂胶水溶液与氢氧化钙溶液对人牙髓成纤维细胞作用48 h后的吸光度值、换算的细胞相对增殖率及毒性级别如下,见表2。
对蜂胶组各浓度OD值进行方差分析,F =30.618, P <0.05,差异有统计学意义,认为不同浓度下的蜂胶OD值不同。对氢氧化钙组各浓度OD值进行方差分析,F =44.275,P <0.05,差异有统计学意义,认为不同浓度下的氢氧化钙OD值不同。对蜂胶和氢氧化钙总体细胞毒性进行两独立样本t检验,t =0.882, P <0.386,差异无统计学意义,表明蜂胶和氢氧化钙总体细胞毒性无差异。
3讨论
由于牙髓组织具有形成牙本质和营养硬组织的功能,对外来刺激能产生一系列防御性反应,因此保存活髓具有十分重要的意义。理想的盖髓材料要有良好的封闭性,能有效地隔绝外界刺激,杀灭细菌,消除牙髓炎症,保护牙髓。诱导牙髓细胞分化成成牙本质细胞形成修复性牙本质桥,并能提供牙髓修复,牙本质生物矿化所需要的微量元素及适宜的微环境[1]。
氢氧化钙是目前应用最广泛的盖髓材料,它能有效地促进牙髓细胞分化,形成修复性牙本质封闭露髓孔,并且其强碱性也具有一定的抑菌和杀菌作用。 但临床应用也发现它有明显的缺陷,例如它会引起接触部位牙髓炎症坏死;会发生牙髓退行性改变,出现根管内营养不良性钙化,钙化蔓延到整个根管,出现堵塞或牙内吸收等[2]。为进一步改善性能,有研究试图用氢氧化钙复合其他材料或激光处理的方法提高治疗效果[3,4]。也有学者在探索新的盖髓材料,目前有矿化三氧化物凝聚体(MTA);牙本质粘接剂;磷酸钙类材料(羟基磷灰石、磷酸钙骨水泥,陶瓷化骨粉等);生物活性材料(骨形成蛋白、表皮生长因子、 牙本质胶原蛋白、富血小板血浆等);抑菌类材料(各类抗生素);中药类(黄芩苷等)[5,6,7,8,9,10,11]。但各种材料各有优缺点:如磷酸钙类材料无抗菌性;生物活性材料易被破坏;粘接剂密封性好,但有刺激性等等,单一的材料均不能达到理想的盖髓材料应具备的性能。进一步探索具有生物诱导活性,良好的生物相容性, 消炎杀菌及物理机械性能都良好的复合盖髓材料, 提高活髓保存的成功率是该领域的研究方向。由于盖髓治疗常因微渗漏或牙本质深层藏存的细菌感染而失败,因此盖髓剂能否杀灭露髓孔内残余细菌,消除牙髓炎症有重要的意义。因此有研究者试图复合几种材料的性能,如束红蕾[12]等把甲硝唑,红霉素,克林霉素加入到磷酸钙骨水泥,陶瓷化骨粉中用于实验动物的盖髓,实验研究也取得了较好的效果。
近年来,人们越来越热衷于绿色天然药物的开发和应用,蜂胶含有多种生理活性物质,具有广泛的生理和药理作用,临床上多用于治疗溃疡、烧伤、 糖尿病及心血管病等[13]。最重要的是蜂胶的强抗菌功能是其他天然物质无可比拟的,由于蜂胶含有大量的黄酮类及芳香酸、脂肪酸及烯类等多种化合物, 它具有广谱抗菌作用,能抑制多种细菌和病毒,有研究证实1%~10%的蜂胶对真菌和霉菌都有抑制作用[14]。在口腔领域关于蜂胶的研究也很广泛,国内已有研究表明,蜂胶的生物安全性很好[15]。蜂胶对龋病、牙周病和感染根管的致病菌有明显的杀灭及抑制作用,已有研究将其引入龋病、牙周病及感染根管消毒治疗领域[16,17]。国外有研究还发现,蜂胶能有效杀灭对氢氧化钙消毒耐受的细菌,能有效杀灭难治性根尖周炎根管内的粪肠球菌[18,19]。蜂胶的消炎镇痛、表面麻醉、促进增生、改善微循环的作用使其对复发性口疮、扁平苔藓等口腔黏膜病也有较好的疗效[20],已有蜂胶的牙膏,漱口水、口腔溃疡贴膜生产用于口腔临床。对于牙髓治疗领域,由于蜂胶含醛, 有凝固蛋白的作用,国内有学者报道用蜂胶复合普鲁卡因等制成的复方蜂胶失和剂可以失和牙髓[21]。国外学者研究报道,较低浓度的蜂胶醇溶剂在保持有效的杀菌效力的同时对人牙髓、牙周及牙龈成纤维细胞的细胞毒性远低于氢氧化钙,生物安全性好,用于盖髓治疗能诱导修复性牙本质形成[22,23,24],但尚无进一步深入的研究报道。国内目前尚无水溶蜂胶对人牙髓细胞的细胞毒性及蜂胶用于盖髓治疗的实验报告。
为进一步明确蜂胶在盖髓治疗中的性能,研究能否利用蜂胶的天然强抗菌性,丰富的物质含量和改善微循环、促进增生等多种生物活性消除暴露牙髓的炎症,从而诱导牙髓—牙本质复合体反应形成修复性牙本质,笔者采用国产水溶蜂胶做人牙髓细胞的细胞毒性实验。由于以前多数研究为蜂胶乙醇提取液,对蜂胶水提取液的研究非常少。在本实验中,为降低对牙髓的刺激,并填补蜂胶水溶剂用于盖髓治疗的研究空白,采用国产水溶蜂胶制备不同浓度的蜂胶水溶剂。采用体外细胞培养技术培养人牙髓细胞,用MTS比色法检测不同浓度的蜂胶水溶剂作用于人牙髓细胞后的OD值。计算细胞RGR,根据RGR换算细胞毒性的级别。观察不同浓度的蜂胶水溶剂对人牙髓细胞增殖的影响,并对其细胞毒性进行评级。
实验结果表明,水溶蜂胶及氢氧化钙对人牙髓细胞的细胞毒性各浓度组间差异有统计学意义(P < 0.05);对蜂胶与氢氧化钙总体细胞毒性进行两独立样本t检验,差异无统计学意义(P >0.05),表明蜂胶和氢氧化钙总体细胞毒性无差异。1 g/L及以下国产水溶蜂胶溶液对人牙髓细胞的毒性在2以下,具有低毒性,可考虑用于临床治疗。
摘要：目的 探讨水溶性蜂胶对人牙髓成纤维细胞的毒性作用,为蜂胶的临床应用提供理论依据。方法 用一种新的四唑类化合物MTS比色法检测人牙髓细胞在不同浓度的蜂胶、氢氧化钙溶液中体外培养48 h后细胞的相对增殖率(RGR),用5级毒性分类法评级。结果 1 g/L及以下浓度的水溶蜂胶组对人牙髓成纤维细胞的毒性级别在2以下。结论 1 g/L及以下浓度的水溶蜂胶液对人牙髓成纤维细胞的毒性作用较小,是治疗牙髓疾病的安全药物。
牙髓细胞 篇4
关键词：犬,乳牙牙髓干细胞(DPSCs),多向分化
牙源性干细胞是一类来源丰富的间充质干细胞,已广泛应用于口腔再生医学的研究中。其中乳牙牙髓干细胞与其他的牙源性干细胞相比,具有相对较高的增殖率和细胞倍增能力,并可形成成牙本质细胞样细胞和牙本质样结构,因而备受青睐[1]。目前国内外鲜见大型哺乳动物乳牙牙髓干细胞的体内外研究。本实验旨在对比格犬乳牙牙髓干细胞体外分离培养,并对其生物学性能进行初步研究,为后续的实验奠定基础。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及设备
DMEM/F12培养基(Hyclone公司,美国)。胎牛血清(FBS)(浙江天杭生物科技有限公司)。波形丝蛋白、角蛋白鼠来源单克隆抗体(上海生工生物工程技术服务有限公司)、STRO-1、CD14、CD45、CD86、CD146鼠来源单克隆抗体(商品编号依次为:SC47733、BD Pharmingen-561712、560976、560958、560846)。牙本质涎磷蛋白鼠来源单克隆抗体(Santa公司,美国)。实验在西安交通大学口腔医院实验中心完成。
1.2 实验动物
6周龄雄性驯化纯种比格犬,西安迪乐普生物技术有限公司提供。实验犬为乳牙列(图1)。
1.3 犬乳牙牙髓细胞培养
1.3.1 原代细胞培养
全麻后拔除犬第三乳切牙并转移至超净台,于釉牙骨质界处劈开,取牙髓并剪去根尖处1.0 mm,将剩余牙髓组织剪至约1~1.5 mm3大小的组织块,3%I型胶原酶37℃孵育60 min,加20%FBS的DMEM/F12培养基终止消化,转移至60 mm培养皿常规条件培养,原代细胞长出后进行首次换液,之后2~3 d换液1次。
1.3.2 细胞纯化及传代培养
原代细胞培养皿的细胞克隆扩增汇合至约60%时,标记细胞克隆,用浸泡0.25%胰蛋白酶的无菌滤纸片将所标记部位的细胞克隆消化后扩大培养。
1.4 犬乳牙牙髓细胞克隆形成实验
将第2代细胞以1 000个/皿接种于100 mm培养皿常规培养。10 d后终止培养,4%多聚甲醛固定后1%甲苯胺蓝染色15 min。镜下观察计数形成的细胞克隆数,细胞数≥50个为一个克隆集落,克隆形成率=形成克隆数/接种细胞数×100%。
1.5 犬乳牙牙髓细胞生长曲线测定
取第2代细胞以2 000个/孔接种于96孔板,每组设5个复孔,常规培养24 h后弃液,PBS漂洗3遍,每孔加10μl CCK-8,37℃孵育2 h后酶标仪检测450nm波长处吸光度(A值),取平均值,绘制细胞生长曲线图。
1.6 犬乳牙牙髓细胞鉴定
1.6.1 细胞来源鉴定
取第3代细胞以1×104个/ml接种于12孔板,待细胞扩增融合至80%时终止培养。按照说明书进行波形丝蛋白、角蛋白SABC免疫组化染色,DAB显色试剂盒显色后上镜观察。空白对照使用PBS液代替一抗。
1.6.2 流式细胞仪检测细胞表面标记物
取第3代细胞,调整细胞密度为5×105个/ml,向每个流式管中加细胞悬液1 ml。分别加入鼠抗人STRO-1、CD45、CD86、CD146以及CD14抗体20μl,4℃避光孵育30min,1 200 r/min离心5 min,弃上清。最终每个流式管中加入500μl PBS重悬,上机检测。
1.7 犬乳牙牙髓干细胞多向分化能力检测
取第3代细胞接种于12孔培养板,待细胞生长融合至80%时更换为相应诱导液;相应对照组使用普通培养基。
1.7.1 成骨、成脂诱导
成骨诱导液成分:基础培养基中加入终浓度为10 nmol/L地塞米松,50 mg/L的L-抗坏血酸2-磷酸盐,10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠。成脂诱导液成分:基础培养基中加入终浓度为0.5 mol/L的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤,0.25μmol/L地塞米松,10μmol/L吲哚美辛,100μmol/L的L-抗坏血酸2-磷酸盐。经诱导液连续培养28 d后,分别进行0.5%油红O染色和茜素红染色,镜下观察。
1.7.2 成牙本质诱导及检测
1.7.2. 1 碱性磷酸酶(ALP)活性检测
细胞内ALP染色:在使用成骨诱导液诱导21 d后,按照ALP染色试剂盒说明书进行固定、染色,镜下观察。
细胞内ALP活性测定:以使用成骨诱导液诱导0、3、6、9、12、15、18、21 d为节点,进行活性测定。PBS液漂洗细胞后加入0.2%Triton-X 100细胞裂解液,37℃孵育2 h,按照试剂盒的使用说明依次按比例加入适量的缓冲液、基质液,再加入显色剂后将其混匀。以空白孔调零,酶联检测仪波长520 nm检测A值。使用SPSS13.0软件,重复测量的方差分析对其结果进行统计检验。每一时间节点设立3个平行孔。
1.7.2. 2 牙本质涎磷蛋白(DSPP)染色
使用成骨诱导液诱导21 d,SABC法进行DSPP染色,空白对照组使用PBS代替一抗。
2 结果
2.1 细胞原代培养及形态学观察
犬乳牙牙髓组织经培养3d左右细胞由组织块四周爬出(图2A),7 d左右形成细胞集落(图2B),细胞呈短梭、多角或不规则形。经细胞纯化、传代后,呈长梭形成纤维细胞样形态。
2.2 细胞克隆形成率
细胞培养10 d镜下可见呈集落状生长,甲苯胺蓝染色后如图3。细胞克隆形成率为32%。
2.3 细胞生长曲线
细胞接种后前3 d生长缓慢,第4天起生长速度增快,第10天进入平台期且出现缓慢下降趋势,呈现滞缓期-对数生长期-平台期的生长模式(图4)。
2.4 细胞鉴定
SABC法结果显示细胞抗波形丝蛋白呈胞质棕染的阳性表达(图5A),抗角蛋白(图5B)及空白对照组(图5C)均为阴性表达。
流式细胞仪结果显示,犬乳牙牙髓细胞STRO-1、CD146阳性表达,表达率分别为27.3%及43%,而CD14、CD45及CD86阴性表达,表达率分别为1.3%、0.62%及0.4%(图6)。
2.5 细胞多向分化能力检测
成骨诱导28 d后经茜素红染色发现实验组细胞红染,细胞间可见边界不清的红色矿化结节(图7A)。对照组未见明显矿化结节(图7B)。
A:波形丝蛋白表达;B:角蛋白表达;C:空白对照A:Filament expression;B:Keratin expression;C:Blank control
成脂诱导28 d后经油红O染色发现实验组有许多边界清楚的小圆球状橘红色脂肪颗粒,部分细胞密集区颗粒可连接成串珠状(图8A)。对照组未见明显脂肪颗粒(图8B)。与常规培养基相比,使用成骨诱导液诱导9 d后实验组细胞内ALP活性明显增强,15d左右达到最高,并在9 d后的各节点处细胞内ALP活性均高于对照组(图9)。
经矿化诱导液培养21 d后进行ALP染色发现,诱导组细胞质出现棕黄色条索状或团块状阳性着色(图10A),对照组呈阴性表达(图10B)。
矿化诱导液培养21 d后的细胞DSPP呈胞质棕染的阳性表达(图11A),对照组呈阴性表达(图11B)。
A:成骨诱导组;B:对照组A:Osteogenic induction group;B:Control group
A:成脂诱导组;B:对照组A:Lipogenic induction group;B:Control group
与0 d比较,*:P<0.05;**:P<0.01;##:组间比较,P<0.01vs 0 d,*:P<0.05;**:P<0.01;##:Between groups,P<0.01
3讨论
自骨髓间充质干细胞发现以来,对于其他组织来源的多潜能间充质干细胞的探索就一直是再生医学领域的热点[2]。2003年,Miura等[3]首次在人乳牙牙髓细胞中发现了多潜能干细胞,之后越来越多的研究者承认其在干细胞介导的牙髓牙本质复合体再生以及生物牙根组织工程的研究中广阔的应用前景[4]。由于伦理学限制,人源性细胞用于自体移植尚无法开展;而啮齿类动物的牙体结构及生理功能与哺乳类动物有较大的差距。我们首次对培养的比格犬乳牙牙髓细胞进行相关干细胞特性的实验研究,为进一步回植于母体的临床前研究奠定相关实验基础。
A:矿化诱导组;B:对照组A:Mineralization induction group;B:Control group
A:矿化诱导组;B:对照组A:Mineralization induction group;B:Control group
克隆化培养法可最大程度的保留来源珍贵的原代细胞,既是细胞纯化的方法,也是干细胞鉴定的手段[5]。本实验得出的克隆形成率为32%,表明所培养的细胞具有形成克隆的能力,符合干细胞最重要的特征[6]。
我们观察到犬乳牙牙髓细胞在传代后4~9 d处于对数生长期,因而选取该时间段进行细胞传代或实验。免疫组化实验证实所培养出的细胞来源于间充质组织。流式细胞术结果显示细胞对间充质细胞表面标志阳性表达,而对于造血系细胞标志阴性表达。鉴于目前尚无犬的特异性抗体,我们采用的均为鼠抗人抗体进行标记,特异性存在不足。
细胞多向分化潜能是干细胞鉴定的第三条标准[5]。我们采用文献报道的对人牙源性干细胞成骨/成牙本质诱导液[7]、成脂诱导液[8]对犬乳牙牙髓干细胞进行诱导分化,证实所培养的细胞具有非牙向的分化能力。ALP通过调节磷酸盐的转运参与牙本质、骨等钙化组织的形成和代谢,可以作为检测细胞分化成熟和矿化能力的标准之一。而DSPP是一种公认的牙本质特异性蛋白,可作为检测牙髓细胞向成牙本质细胞特异性分化的指标[9,10]。提示本实验所培养细胞有向成牙本质细胞分化的能力。
总之,通过体外分离、培养并鉴定犬乳牙牙髓干细胞,并对其细胞生物学性能进行初步研究,证实其具有较强的体外增殖及多向分化能力,可作为牙髓再生的种子细胞选择之一,为进一步的大型动物组织工程研究奠定了基础。
参考文献
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牙髓细胞 篇5
1 材料和方法
1. 1 主要试剂与仪器
P. endodontalis标准菌株ATCC35406 ( 上海复祥生物科技有限公司) ; h FOB1. 19细胞株( 中国科学院上海细胞所) ; BHI、DMEM、F12培养基( Gibco,美国) ;DMSO、MTT ( Sigma,美国) ; 超声破碎仪Sonifier 250D( Branson,美国) ; 酶标仪( Bio-Rad,美国) ; 流式细胞仪( Becton Dickinson,美国) 。
1. 2 P. endodontalis 培养及其超声提取物的制备
将冻存P. endodontalis复苏,接种在添加5% 脱纤维羊血、5 mg /L氯化血红素、1 mg /L维生素K的BHI培养基上,37℃厌氧培养3 d。经生化鉴定后,挑取P. endodontalis单克隆菌落转种于BHI液体培养基中增菌48 h,菌液离心后收集细胞。用PBS( p H 7. 0)清洗细菌的细胞团块,并将其重新悬浮在少量无菌去离子水中,利用超声仪破碎细菌。功率200 W,超声3s,间歇6 s,持续60 min。然后4℃、10 000 r / min离心30 min,收集上清液并冻干。采用BCA法测定P. end-odontalis超声提取物蛋白浓度,使用时用细胞培养液稀释使其终浓度分别为1、10、100μg /ml。0. 22μm滤膜过滤除菌。
1. 3 人成骨细胞( h FOB 1. 19) 的体外培养
h FOB 1. 19细胞培养条件参照郭吕华实验[2],即用含终浓度10% 胎牛血清和0. 3‰G418的DMEM∶F12 =1∶1培养基,将细胞培养在5% CO2、37℃饱和湿度的灭菌培养箱。每3 d换液1次,取生长良好的第4代细胞用于实验。
1. 4 MTT 法检测 h FOB 1. 19 细胞增殖能力
细胞以每孔3×103个接种于3块96孔培养板中。待细胞贴壁后,吸去各孔上清液。每孔加入100μl含不同浓度P. endodontalis提取物的细胞培养液。每组设6个复孔,继续培养12、24、48 h。分别在不同培养时间结束后,取出1块培养板,每孔加入MTT( 5mg / ml) 20μl,于培养箱中继续培养4 h后吸去各孔上清,加入150μl DMSO,震荡10 min。选择490 nm波长,在酶标仪上测定每孔吸光度值( A值) 。计算细胞增殖抑制率,计算公式为: ( 1 - 实验组A值/对照组A值) ×100% 。
1. 5 流式细胞仪检测 h FOB 1. 19 细胞周期改变
细胞以每孔1×105个接种于6孔培养板中。待细胞贴壁后,吸去各孔上清液。每孔加入1 ml含不同浓度P. endodontalis提取物的细胞培养液。每组设3个复孔,继续培养24 h。收集各组细胞1×106个悬于1 ml预冷PBS,1 000 r / min离心3 min,弃上清。1 ml预冷70% 乙醇重悬细胞,4℃固定过夜。细胞再重悬于1 ml预冷PBS,1 000 r/min离心3 min,弃上清。用含50μg /ml PI和100μg /ml RNase A预冷PBS 500μl重悬细胞,37℃避光30 min,上机检测。
1. 6 流式细胞仪检测 h FOB 1. 19 细胞凋亡改变
细胞处理方法及分组同实验1. 5。培养48 h后,分别收集空白对照组和不同浓度组各孔细胞,重悬于500μl Binding Buffer中,加入10μl Annexin V-FITC和5μl PI双标记后,避光室温反应15 min,上机检测。
1. 7 统计学分析
采用SPSS 13. 0统计学软件进行数据分析,所用数据均以x珋±s表示。采用单因素方差分析( one-wayANOVA) 进行组间比较,检验水准α = 0. 05。
2 结 果
2. 1 P. endodontalis 提取物对 h FOB 1. 19 细胞增殖的影响
如表1所示,不同浓度的P. endodontalis超声提取物作用h FOB 1. 19细胞12 h时,细胞增殖活性呈现降低的趋势,但不具有统计学差异( P > 0. 05) ; 在作用24 h时,10、100μg /ml P. endodontalis提取物显著抑制h FOB 1. 19细胞增殖 ( P < 0. 05 ) ; 1μg /mlP. endodontalis提取物在刺激h FOB 1. 19细胞48 h时亦表现出抑制细胞增殖的作用( P < 0. 05) 。
2. 2 P. endodontalis 提取物对 h FOB 1. 19 细胞周期的影响
以1、10、100μg /ml P. endodontalis超声提取物作用h FOB 1. 19细胞24 h后,G1期细胞百分比逐渐增加。10、100μg /ml浓度组G1期细胞与对照组相比,具有统计学差异( P < 0. 05) 。与此同时,S期细胞百分比逐渐减少,而G2期细胞百分比基本保持不变( 图1) 。提示P. endodontalis使h FOB 1. 19细胞周期阻滞在G1期,这种阻滞具有浓度依赖性。
2. 3 P. endodontalis 提取物对 h FOB 1. 19 细胞凋亡的影响
与对照组相比,h FOB 1. 19细胞经P. endodontalis超声提取物作用48 h后,凋亡细胞显著增多( P <0. 05) 。如图2所示,对照组细胞的 早期凋亡 率为1. 62% ,晚期凋亡 率为1. 15% ,细胞总凋 亡率为2. 77%[3],而在1、10、100μg/ml浓度作用组的总细胞凋亡率分别达到16. 73% ( 早期凋亡12. 84% ,晚期凋亡3. 89% ) 、26. 75% ( 早期凋亡16. 96% ,晚期凋亡9. 79% ) 和54. 82% ( 早期凋亡41. 33% ,晚期凋亡13. 49% ) 。表明P. endodontalis促h FOB 1. 19细胞凋亡具有浓度依赖性。
A: 对照组; B: 1 μg / ml 提取物处理组; C: 10 μg / ml 提取物处理组; D: 100 μg / ml 提取物处理组 1 牙髓卟啉单胞菌提取物对 h FOB 1. 19 细胞周期的影响 A: Control group; B: 1 μg / ml extract-treatment group; C: 10 μg / ml extract-treatment group; D: 100 μg / ml extract-treatment group Fig 1 The effect of sonicated extract of P. endodontalis on the cell cycle distribution of h FOB 1. 19 cells
A: 对照组; B: 1 μg / ml 提取物处理组; C: 10 μg / ml 提取物处理组; D: 100 μg / ml 提取物处理组 2 牙髓卟啉单胞菌提取物对 h FOB 1. 19 细胞凋亡的影响 A: Control group; B: 1 μg / ml extract-treatment group; C: 10 μg / ml extract-treatment group; D: 100 μg / ml extract-treatmeat group Fig 2 The effect of sonicated extract of P. endodontalis on the apoptosis of h FOB 1. 19 cells
3 讨 论
细菌及其毒性产物由根管系统侵入根尖周骨组织引起溶骨性病损,究其原因是成骨因素与破骨因素间的平衡丧失,破骨因素占据优势地位引起[4]。然而,尽管破骨因素是骨丢失的最终决定因素,破骨因素本身要受到来自局部微环境的调控,并且与破骨因素有密切联系的成骨因素的改变也对最终的骨丢失产生影响[5]。成骨细胞是骨组织中的一种重要细胞类型,细胞数量的改变影响其生物学功能,进而影响成骨因素。研究表明,牙周炎重要致病菌牙龈卟啉单胞菌的毒力因子牙龈素,可以通过抑制成骨细胞增殖,削弱骨修复能力,导致骨吸收加重[6]。据此推测,成骨细胞增殖抑制可能在根尖周溶骨性破坏机制中发挥作用。
本研究以根尖周炎的重要致病菌牙髓卟啉单胞菌超声提取物作为人成骨细胞的刺激因子,与采用单一牙髓卟啉单胞菌提纯毒力因子如脂多糖作为刺激物的方法相比较,超声提取物能更好模拟机体环境下细菌的致病性; 与采用活菌作为刺激物的方法相比较,超声提取物能更精确控制刺激物的量,且操作简便。实验结果显示: 牙髓卟啉单胞菌超声提取物以浓度和时间依赖方式抑制成骨细胞增殖。由于细胞周期是决定细胞增殖快慢的决定性因素,本研究利用流式细胞仪进一步检测了牙髓卟啉单胞菌超声提取物对成骨细胞周期的影响。流式细胞仪分析结果表明: 牙髓卟啉单胞菌超声提取物是通过阻滞成骨细胞于G1期,抑制细胞增殖活性。
研究认为,处于周期阻滞的细胞仍具有DNA合成和细胞分裂的潜力,在受到某种适宜刺激时可以重新进入细胞周期,因此细胞周期阻滞引起的细胞增殖抑制具有可逆性[7]。Liu等[8]在褪黑激素对成骨细胞增殖影响的研究中就发现,该激素只是阻滞成骨细胞周期进程使成骨细胞增殖延迟发生,对细胞活性无任何影响。为探讨牙髓卟啉单胞菌超声提取物阻滞成骨细胞周期后是否进一步影响细胞活性,本实验采用An-nexin V / PI双染色流式细胞仪测量法对细胞凋亡进行了定量分析。检测结果显示,牙髓卟啉单胞菌超声提取物以浓度依赖方式使成骨细胞凋亡率增加。
综上,我们证实牙髓卟啉单胞菌通过阻滞细胞周期抑制成骨细胞增殖,并诱导细胞凋亡的发生,致使成骨因素缺陷,从而有利于溶骨病损的形成。这不仅与Lin[9]的研究结果相似,而且近年对辛伐他汀药物的研究也从另一方面支持了我们的研究结论。Lai等[10]发现辛伐他汀可以通过减弱成骨细胞凋亡的发生,改善细菌引起的根尖周溶骨性病损。因此可以设想,口腔临床使用的各种充填材料或抗菌制剂,如果能够阻碍成骨细胞凋亡的发生,将有助于成骨能力的提高,防止或减轻与牙髓卟啉单胞菌感染有关的骨丢失的发生。
摘要：目的:观察牙髓卟啉单胞菌超声提取物对成骨细胞周期和凋亡的影响。方法:用不同浓度牙髓卟啉单胞菌超声提取物(1、10、100μg/ml)作用成骨细胞,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞仪分析细胞周期分布和凋亡变化。结果:牙髓卟啉单胞菌超声提取物显著抑制成骨细胞的增殖。且在一定时间和浓度范围内具有浓度和时间依赖性。10μg/ml和100μg/ml提取物作用24 h时,处于G1期的成骨细胞明显增多;在作用48 h时,牙髓卟啉单胞菌提取物以浓度依赖方式促进成骨细胞凋亡。结论:牙髓卟啉单胞菌超声提取物可阻滞细胞于G1期,并诱导细胞凋亡,抑制成骨细胞增殖。