牙髓卟啉单胞菌

牙髓卟啉单胞菌（共5篇）

牙髓卟啉单胞菌 篇1

牙髓卟啉单胞菌( Porphyromonas endodontalis,P.endodontalis) 是一种革兰氏阴性厌氧菌,是根尖周病损中检出率最高的致病菌之一。研究已证实,牙髓卟啉单胞菌是引发根尖周炎感染的优势细菌[1]。根尖周溶骨性破坏是慢性根尖周炎的典型病理变化。在生理条件下,根尖周骨组织不断进行骨代谢,骨吸收与骨形成保持动态平衡。成骨细胞是分泌骨基质,参与新骨形成和进行骨修复的主要效应细胞。成骨细胞分裂增殖能力的改变直接影响骨组织的成骨能力。本实验通过牙髓卟啉单胞菌超声提取物对成骨细胞增殖、周期以及凋亡影响的研究,阐述牙髓卟啉单胞菌在根尖周骨缺损机制中的可能作用,为临床上控制和减少根尖周炎病损区骨破坏的发生提供新的理论依据。

1 材料和方法

1. 1 主要试剂与仪器

P. endodontalis标准菌株ATCC35406 ( 上海复祥生物科技有限公司) ; h FOB1. 19细胞株( 中国科学院上海细胞所) ; BHI、DMEM、F12培养基( Gibco,美国) ;DMSO、MTT ( Sigma,美国) ; 超声破碎仪Sonifier 250D( Branson,美国) ; 酶标仪( Bio-Rad,美国) ; 流式细胞仪( Becton Dickinson,美国) 。

1. 2 P. endodontalis 培养及其超声提取物的制备

将冻存P. endodontalis复苏,接种在添加5% 脱纤维羊血、5 mg /L氯化血红素、1 mg /L维生素K的BHI培养基上,37℃厌氧培养3 d。经生化鉴定后,挑取P. endodontalis单克隆菌落转种于BHI液体培养基中增菌48 h,菌液离心后收集细胞。用PBS( p H 7. 0)清洗细菌的细胞团块,并将其重新悬浮在少量无菌去离子水中,利用超声仪破碎细菌。功率200 W,超声3s,间歇6 s,持续60 min。然后4℃、10 000 r / min离心30 min,收集上清液并冻干。采用BCA法测定P. end-odontalis超声提取物蛋白浓度,使用时用细胞培养液稀释使其终浓度分别为1、10、100μg /ml。0. 22μm滤膜过滤除菌。

1. 3 人成骨细胞( h FOB 1. 19) 的体外培养

h FOB 1. 19细胞培养条件参照郭吕华实验[2],即用含终浓度10% 胎牛血清和0. 3‰G418的DMEM∶F12 =1∶1培养基,将细胞培养在5% CO2、37℃饱和湿度的灭菌培养箱。每3 d换液1次,取生长良好的第4代细胞用于实验。

1. 4 MTT 法检测 h FOB 1. 19 细胞增殖能力

细胞以每孔3×103个接种于3块96孔培养板中。待细胞贴壁后,吸去各孔上清液。每孔加入100μl含不同浓度P. endodontalis提取物的细胞培养液。每组设6个复孔,继续培养12、24、48 h。分别在不同培养时间结束后,取出1块培养板,每孔加入MTT( 5mg / ml) 20μl,于培养箱中继续培养4 h后吸去各孔上清,加入150μl DMSO,震荡10 min。选择490 nm波长,在酶标仪上测定每孔吸光度值( A值) 。计算细胞增殖抑制率,计算公式为: ( 1 - 实验组A值/对照组A值) ×100% 。

1. 5 流式细胞仪检测 h FOB 1. 19 细胞周期改变

细胞以每孔1×105个接种于6孔培养板中。待细胞贴壁后,吸去各孔上清液。每孔加入1 ml含不同浓度P. endodontalis提取物的细胞培养液。每组设3个复孔,继续培养24 h。收集各组细胞1×106个悬于1 ml预冷PBS,1 000 r / min离心3 min,弃上清。1 ml预冷70% 乙醇重悬细胞,4℃固定过夜。细胞再重悬于1 ml预冷PBS,1 000 r/min离心3 min,弃上清。用含50μg /ml PI和100μg /ml RNase A预冷PBS 500μl重悬细胞,37℃避光30 min,上机检测。

1. 6 流式细胞仪检测 h FOB 1. 19 细胞凋亡改变

细胞处理方法及分组同实验1. 5。培养48 h后,分别收集空白对照组和不同浓度组各孔细胞,重悬于500μl Binding Buffer中,加入10μl Annexin V-FITC和5μl PI双标记后,避光室温反应15 min,上机检测。

1. 7 统计学分析

采用SPSS 13. 0统计学软件进行数据分析,所用数据均以x珋±s表示。采用单因素方差分析( one-wayANOVA) 进行组间比较,检验水准α = 0. 05。

2 结 果

2. 1 P. endodontalis 提取物对 h FOB 1. 19 细胞增殖的影响

如表1所示,不同浓度的P. endodontalis超声提取物作用h FOB 1. 19细胞12 h时,细胞增殖活性呈现降低的趋势,但不具有统计学差异( P > 0. 05) ; 在作用24 h时,10、100μg /ml P. endodontalis提取物显著抑制h FOB 1. 19细胞增殖 ( P < 0. 05 ) ; 1μg /mlP. endodontalis提取物在刺激h FOB 1. 19细胞48 h时亦表现出抑制细胞增殖的作用( P < 0. 05) 。

2. 2 P. endodontalis 提取物对 h FOB 1. 19 细胞周期的影响

以1、10、100μg /ml P. endodontalis超声提取物作用h FOB 1. 19细胞24 h后,G1期细胞百分比逐渐增加。10、100μg /ml浓度组G1期细胞与对照组相比,具有统计学差异( P < 0. 05) 。与此同时,S期细胞百分比逐渐减少,而G2期细胞百分比基本保持不变( 图1) 。提示P. endodontalis使h FOB 1. 19细胞周期阻滞在G1期,这种阻滞具有浓度依赖性。

2. 3 P. endodontalis 提取物对 h FOB 1. 19 细胞凋亡的影响

与对照组相比,h FOB 1. 19细胞经P. endodontalis超声提取物作用48 h后,凋亡细胞显著增多( P <0. 05) 。如图2所示,对照组细胞的 早期凋亡 率为1. 62% ,晚期凋亡 率为1. 15% ,细胞总凋 亡率为2. 77%[3],而在1、10、100μg/ml浓度作用组的总细胞凋亡率分别达到16. 73% ( 早期凋亡12. 84% ,晚期凋亡3. 89% ) 、26. 75% ( 早期凋亡16. 96% ,晚期凋亡9. 79% ) 和54. 82% ( 早期凋亡41. 33% ,晚期凋亡13. 49% ) 。表明P. endodontalis促h FOB 1. 19细胞凋亡具有浓度依赖性。

A: 对照组; B: 1 μg / ml 提取物处理组; C: 10 μg / ml 提取物处理组; D: 100 μg / ml 提取物处理组 1 牙髓卟啉单胞菌提取物对 h FOB 1. 19 细胞周期的影响 A: Control group; B: 1 μg / ml extract-treatment group; C: 10 μg / ml extract-treatment group; D: 100 μg / ml extract-treatment group Fig 1 The effect of sonicated extract of P. endodontalis on the cell cycle distribution of h FOB 1. 19 cells

A: 对照组; B: 1 μg / ml 提取物处理组; C: 10 μg / ml 提取物处理组; D: 100 μg / ml 提取物处理组 2 牙髓卟啉单胞菌提取物对 h FOB 1. 19 细胞凋亡的影响 A: Control group; B: 1 μg / ml extract-treatment group; C: 10 μg / ml extract-treatment group; D: 100 μg / ml extract-treatmeat group Fig 2 The effect of sonicated extract of P. endodontalis on the apoptosis of h FOB 1. 19 cells

3 讨 论

细菌及其毒性产物由根管系统侵入根尖周骨组织引起溶骨性病损,究其原因是成骨因素与破骨因素间的平衡丧失,破骨因素占据优势地位引起[4]。然而,尽管破骨因素是骨丢失的最终决定因素,破骨因素本身要受到来自局部微环境的调控,并且与破骨因素有密切联系的成骨因素的改变也对最终的骨丢失产生影响[5]。成骨细胞是骨组织中的一种重要细胞类型,细胞数量的改变影响其生物学功能,进而影响成骨因素。研究表明,牙周炎重要致病菌牙龈卟啉单胞菌的毒力因子牙龈素,可以通过抑制成骨细胞增殖,削弱骨修复能力,导致骨吸收加重[6]。据此推测,成骨细胞增殖抑制可能在根尖周溶骨性破坏机制中发挥作用。

本研究以根尖周炎的重要致病菌牙髓卟啉单胞菌超声提取物作为人成骨细胞的刺激因子,与采用单一牙髓卟啉单胞菌提纯毒力因子如脂多糖作为刺激物的方法相比较,超声提取物能更好模拟机体环境下细菌的致病性; 与采用活菌作为刺激物的方法相比较,超声提取物能更精确控制刺激物的量,且操作简便。实验结果显示: 牙髓卟啉单胞菌超声提取物以浓度和时间依赖方式抑制成骨细胞增殖。由于细胞周期是决定细胞增殖快慢的决定性因素,本研究利用流式细胞仪进一步检测了牙髓卟啉单胞菌超声提取物对成骨细胞周期的影响。流式细胞仪分析结果表明: 牙髓卟啉单胞菌超声提取物是通过阻滞成骨细胞于G1期,抑制细胞增殖活性。

研究认为,处于周期阻滞的细胞仍具有DNA合成和细胞分裂的潜力,在受到某种适宜刺激时可以重新进入细胞周期,因此细胞周期阻滞引起的细胞增殖抑制具有可逆性[7]。Liu等[8]在褪黑激素对成骨细胞增殖影响的研究中就发现,该激素只是阻滞成骨细胞周期进程使成骨细胞增殖延迟发生,对细胞活性无任何影响。为探讨牙髓卟啉单胞菌超声提取物阻滞成骨细胞周期后是否进一步影响细胞活性,本实验采用An-nexin V / PI双染色流式细胞仪测量法对细胞凋亡进行了定量分析。检测结果显示,牙髓卟啉单胞菌超声提取物以浓度依赖方式使成骨细胞凋亡率增加。

综上,我们证实牙髓卟啉单胞菌通过阻滞细胞周期抑制成骨细胞增殖,并诱导细胞凋亡的发生,致使成骨因素缺陷,从而有利于溶骨病损的形成。这不仅与Lin[9]的研究结果相似,而且近年对辛伐他汀药物的研究也从另一方面支持了我们的研究结论。Lai等[10]发现辛伐他汀可以通过减弱成骨细胞凋亡的发生,改善细菌引起的根尖周溶骨性病损。因此可以设想,口腔临床使用的各种充填材料或抗菌制剂,如果能够阻碍成骨细胞凋亡的发生,将有助于成骨能力的提高,防止或减轻与牙髓卟啉单胞菌感染有关的骨丢失的发生。

摘要：目的:观察牙髓卟啉单胞菌超声提取物对成骨细胞周期和凋亡的影响。方法:用不同浓度牙髓卟啉单胞菌超声提取物(1、10、100μg/ml)作用成骨细胞,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞仪分析细胞周期分布和凋亡变化。结果:牙髓卟啉单胞菌超声提取物显著抑制成骨细胞的增殖。且在一定时间和浓度范围内具有浓度和时间依赖性。10μg/ml和100μg/ml提取物作用24 h时,处于G1期的成骨细胞明显增多;在作用48 h时,牙髓卟啉单胞菌提取物以浓度依赖方式促进成骨细胞凋亡。结论:牙髓卟啉单胞菌超声提取物可阻滞细胞于G1期,并诱导细胞凋亡,抑制成骨细胞增殖。

关键词：牙髓卟啉单胞菌,超声提取物,细胞周期,凋亡

牙髓卟啉单胞菌 篇2

关键词：牙龈卟啉单胞菌,血管内皮细胞,单核细胞,黏附

牙周炎是成人牙齿早失最主要的原因。牙龈卟啉单胞菌 (Porphyromonas gingivalis, Pg) 的感染与其发病关系密切, 是牙周炎的最主要致病菌之一[1]。

心血管疾病 (cardiovascular disease, CVD) 已成为威胁人类健康的主要杀手。动脉粥样硬化 (atherosclerosis, AS) 作为CVD的共同病理基础, 一直是人们研究CVD发病机制的突破口[2]。血管内皮细胞 (vascular endothelial cells) 黏附功能紊乱导致其与单核细胞发生聚集黏附是AS病变早期的关键性事件之一。尽管AS的许多传统危险因素业已明确, 然而并不能完全解释其发病情况, 应进一步寻找潜在危险因素[3]。

近年来有越来越多的证据表明牙周炎除了造成牙齿的松动脱落, 还是CVD的危险因素之一[4,5], 但具体生物学机制了解甚少。现已明确牙周炎时Pg可入血并侵入到血管壁中直接参与AS的发生发展[6,7,8,9,10,11]。那么Pg感染后是否对VEC与单核细胞的黏附产生影响则尚不清楚。本文通过建立Pg感染人脐静脉内皮细胞 (human umbilical vein endothelial cells, HUVEC) 的体外模型, 研究Pg感染HUVEC后对其与THP-1单核细胞黏附的影响, 为探讨Pg在牙周炎与CVD相关性中可能的生物学作用和机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

脑心浸液 (brain heart infusion, BHI) 培养基 (Bio Merieux, 美国) ;胎牛血清 (Gbico, 美国) ;高糖DMEM培养基和RPMI 1640培养基 (Hyclone, 美国) ;虎红 (Sigma, 美国) ;其他试剂均为国产或进口分析纯。

1.2 主要仪器

超净工作台 (苏州安泰) , 细胞培养瓶和细胞培养板、Crystal Spec比浊仪 (BD, 美国) , 细胞培养箱 (Sanyo, 日本) , 厌氧培养箱 (义乌冷冻机总厂) , HTS7000 Plus多孔板高效分析仪 (PE, 美国) 。

1.3 细菌培养

Pg381和Pg33277菌株由四川大学口腔疾病研究国家重点实验室提供。将脱脂牛奶中冻存的以上菌株接种于BHI血琼脂平板 (含5 ml/100 ml脱纤维羊血、1 mg/100 ml维生素K1和1 mg/100 ml氯化血红素) 于37℃、80%N2、10%H2、10%CO2的专性厌氧条件下复苏和培养。取对数生长期的细菌接种于新鲜BHI液体培养基中培养48 h, 离心 (1 500 g, 5 min) , PBS洗涤2次后以DMEM培养基重新悬浮, Crystal Spec比浊仪调整菌悬液浓度。

1.4 细胞培养

HUVEC细胞株EA.hy926和人单核细胞株THP-1均由四川大学生物治疗国家重点实验室提供。EA.hy926于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中在37℃、5%CO2细胞培养箱中常规培养。THP-1于含10%FBS的RPMI 1640培养基中在37℃、5%CO2细胞培养箱中常规培养。

1.5 虎红染色法直接观察Pg对HUVEC与单核细胞黏附的影响

取生长旺盛的HUVEC制备细胞悬液 (2×108个/L) 按0.1 ml接种于96孔板, 待细胞汇合后以PBS洗涤2次, 分为实验组和对照组, 实验组分别加入浓度为2×1010CFU/L的Pg381和Pg33277菌悬液0.1 ml, 对照组加入空白细胞培养基0.1 ml, 孵育1.5 h后弃上清, PBS洗脱未黏附的细菌, 加入空白细胞培养基继续培养4.5 h和22.5 h, 当总的培养时间分别达到6 h和24 h时, 弃上清, 再次分为加THP-1细胞组与加空白RPMI 1640培养基组:加THP-1细胞组每孔加入THP-1细胞悬液0.2 ml (1×109个/L) , 孵育40 min后轻轻吸弃未黏附的细胞, 并用PBS洗涤3次, 每孔加入0.25%虎红溶液0.1 ml, 室温放置5 min, 吸弃游离虎红, 再以PBS洗涤3次后每孔加入50%乙醇溶液0.2ml, 室温放置1 h使单核细胞所吸收的虎红染料充分释放, 多孔板高效分析仪测定各孔A570nm值, 各实验组单核细胞黏附量相对值=A实验组- (A空白对照加THP-1组-A空白对照未加THP-1组) -A实验组未加THP-1组。实验采用复孔设计, 重复3次。

1.6 统计学分析

应用SPSS 13.0软件完成统计学处理。所有数据均代表3次实验的结果, 以±s表示。多个样本的比较采用单因素方差分析, P<0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞的培养

EA.hy926细胞每3~4 d传代1次, 细胞生长状态好, 可见突起、伪足, 呈铺路石样分布 (图1A) 。单核细胞呈圆球形悬浮状生长 (图1B) 。

2.2 Pg感染后HUVEC与单核细胞黏附的影响

6 h时Pg381感染组的THP-1细胞黏附量相对值为0.210±0.025, 高于Pg33277感染组 (0.078±0.024, P<0.05) 和空白对照组 (0.062±0.022, P<0.05) , Pg33277侵入组较阴性对照组略高, 但差异无统计学意义 (P=0.183) ;24 h时Pg381感染组、Pg33277感染组和空白对照组的THP-1细胞黏附量相对值分别为0.075±0.017、0.073±0.017和0.062±0.022, 3组间无显著差异 (P=0.309) 。表明Pg381侵入HUVEC后显著地增强其黏附功能, 促进其与THP-1细胞的黏附, 但Pg33277此作用则不明显 (图2) 。

3讨论

尽管CVD的许多传统危险因素, 如高胆固醇血症、高血压和肥胖等业已明确, 但这只能解释50%~75%的CVD发病原因, 仍有25%~50%CVD的发病原因不明[3]。近年来, 越来越多的证据表明牙周炎与CVD密切相关, 是其独立危险因素之一。本课题组[4]、Nesse等[5]经过大样本的追踪调查, 在校正了各种偏倚后发现牙周炎患者冠心病的发病率显著升高, 牙周炎与冠心病之间呈现中等强度的相关。这一结论也得到了众多临床干预研究的证实[12,13,14]。

目前研究已提示, 牙周炎时原本定植于人类口腔的Pg可通过牙周袋软组织壁溃疡面入血而直接侵入血管壁, 参与AS的发生发展。Marcelino[6]、Figuero[7]、Toyofuku[8]和Nakano等[9]在CVD患者的AS斑块中检出Pg DNA, 检出率从26%到100%不等。Li[10]和Pereira[11]证实Pg感染均可加速AS动物模型-Apo E基因敲除小鼠主动脉的AS病变发展, 且在其主动脉AS斑块内均有Pg DNA检出。在另外的前瞻性研究中还发现循环血液中Pg抗体水平与未来发生CVD的风险呈正相关[15]。此外本人前期研究已证实, Pg具有较强黏附和侵入HUVEC的能力[16]。

CVD的共同病理基础-AS的发病机制极其复杂, 现已证明循环血液中的单核细胞黏附聚集于VEC表面, 并迁入动脉内膜下吞噬脂质而成为泡沫细胞, 最终导致AS的形成。其中, 血管内皮细胞黏附功能的紊乱导致单核细胞与其发生黏附在AS早期病变中发挥重要作用, 有众多黏附分子参与介导VEC与单核细胞的黏附[3]。此前Hirose[17]研究发现Pg381菌毛蛋白促进HUVEC与人单核细胞株U937的黏附, 较空白对照组增加约3倍。然而目前对于Pg感染血管内皮细胞后对其黏附功能是否产生影响则仍不甚清楚。

本文采用了虎红染色法进行研究。虎红染色法是Gamble根据白细胞对虎红染料的吸收特性而建立的一种用于定量测定内皮细胞与单核细胞黏附的方法[18]。由于虎红可被单核细胞吸收, 且不受其活化与否的影响, 而VEC对虎红的吸收则很少。用虎红溶液与单核细胞孵育一定时间后用乙醇溶液将单核细胞所吸收的虎红释放出来, 通过测定溶液的A值, 即可间接反映所黏附单核细胞的数量。

本研究发现Pg381与HUVEC共孵育6 h后, 能够显著增强HUVEC与单核细胞的黏附, 较空白对照组增加了约2.4倍, 而Pg33277的作用则很微弱。镜下观察也进一步证实:Pg381感染组较空白对照组的THP-1细胞黏附明显增加, 而Pg33277感染组则与空白对照组类似。

本研究还发现, 不同的Pg菌株诱导HUVEC黏附功能变化的能力不同, Pg381较Pg33277显著促进HUVEC与单核细胞的黏附。虽然本人的前期研究已证实Pg33277可以侵入HUVEC, 然而并未对HUVEC的黏附功能产生影响。提示Pg感染上调血管内皮细胞黏附功能的能力与Pg的菌株和毒力有关。Gibson[19]的研究也得出类似的结论:通过口腔将Pg菌毛缺陷株DPG接种于apo E基因敲除小鼠, 发现DPG能侵入小鼠主动脉壁, 但其主动脉AS病变程度与空白对照组间无差异。

牙髓卟啉单胞菌 篇3

1 牙龈素致病涉及的信号通路

1.1 丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinases, MAPKs) 信号通路

MAPKs是多条细胞内信号途径的中心环节。现在已知的MAPKs信号传导通路包括3条:细胞外信号调节激酶 (ERK1/2) 、c-jun N末端蛋白激酶 (JN K) 以及p 38 M AP激酶通路。P g与牙龈上皮细胞共同孵育可引起JNK被活化, ERK1/2下调, 而核因子-κB (NF-κB) 活化受阻;若添加MAPK抑制剂可以遏制Pg侵入GEC, 提示JNK的活化与Pg侵入GEC有关, 而ERK1/2下调则与NF-κB传导途径抑制有关。Pg侵入GEC过程中使一些重要的炎症转录调节因子如NF-κB下调, 从而抑制宿主免疫防御系统, 可能是Pg能成功定植于牙周环境并开始后续增殖生长的重要原因。Okahashi等[2]在Pg感染成骨细胞实验中发现, Pg表面的gingipains可能通过JNK途径诱导成骨细胞产生破骨细胞分化因子, 后者是目前发现的惟一能直接诱导破骨细胞分化发育并调节破骨细胞功能的因子。Choi等证明, Pg在感染脐静脉内皮细胞过程中可通过激活转录激活蛋白-l (AP-l) 上调单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1) 的表达, 从而趋化单核细胞至炎症部位, 参与局部慢性炎症反应。

1.2 蛋白酶活化受体 (protease activated receptor, PAR) 信号通路

正常的上皮组织在自然免疫防御中同时起到机械屏障作用和生物屏障作用, 而牙龈组织局部产生的一种抗菌肽-人防卫素 (h BD) 在上述上皮组织自然免疫防御过程中起一定作用。在Pg的刺激下, 牙龈组织h BD表达上调。PAR是一种G蛋白偶联受体, 介导细胞对胞外蛋白酶的反应。Chung等研究发现, Pg蛋白酶Rgp与Kgp可通过PAR-2介导的信号传导通路, 直接刺激人GEC产生h BD-2, 提示PAR-2在牙龈上皮细胞对抗Pg侵袭的自然免疫中有重要作用。另外, 有研究表明, PAR可以介导Rgp诱导口腔上皮细胞释放IL-6的过程, 证实PAR信号通路参与人GEC对抗Pg侵袭的免疫反应过程。

2 讨论

综上所述, 近年来国内外对于Pg致病机制的研究业已引起相关学术界广泛关注。通过明确Pg牙龈素和脂多糖的结构, 进一步探讨其相应的致病机制, 如所涉及的信号分子通路, 将会对明确牙周病发生发展的分子基础及探索临床牙周新的靶向治疗方式提供充分的实验室依据, 对牙周病的临床防治工作具有重要意义。

摘要：牙周炎是口腔临床实践中最为常见的疾病之一。革兰阴性厌氧菌牙龈卟啉单胞菌与牙周炎密切相关, 牙龈卟啉单胞菌表面的牙龈素 (gingipains) 和脂多糖被认为是其最重要的毒力因子, 是近年来牙周炎机制研究热点, 引起研究者的广泛关注。本文结合近年来的研究进展, 就牙龈卟啉单胞菌牙龈素引起牙周炎症的机制和所涉及的信号通路作一综述。

关键词：牙龈卟啉单胞菌,牙龈素,脂多糖,牙周炎

参考文献

[1]Andrian E, Grenier D, Rouabhia M.Porphyromonas gingivalis-epi-thelial cell interactions in periodontitis[J].J Dent Res, 2006, 85 (5) :392～403.

[2]Choi EK, Park SA, Oh WM, et al.Mechanisms of Porphyromonas gingivalis-induced monocyte chemoattractant protein-1expres-sion in endothelial cells[J].FEMS Immunol Med Microbiol, 2005, 44 (1) :51～58.

牙髓卟啉单胞菌 篇4

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

聚二甲基硅氧烷(polydimethylsilicone,PDMS)单体和固化剂 Sylgard 184(Dow Corning, USA);SU-8 2025 光刻胶和显影液(MicroChem Corp., USA);Protein A microbeads (50nm in diameter, Miltenyi Biotec, Germany);P.gingivalis ATCC33277 gingipain K 抗血清由北京口腔医院牙周科张凤秋副教授赠予;新生牛血清(Gibco, USA);去离子水(Milli-Q SP system, USA);KCl等生化试剂来自北京大学化学院。国产等离子清洗器(PDC-M), 阻抗分析仪(Agilent Technologies Inc., USA);电动注射泵(Harvard, USA)。

1.2 细菌培养

牙龈卟啉单胞菌Porphyromonas gingivalis ATCC33277用含5%羊血的CDC固体培养基复苏,37 ℃厌氧培养(80%N2-10%CO2-10%H2)4 d。增菌2 d后获得109 cells/ml浓度的菌液。

1.3 电化学测菌法特异检测牙龈卟啉单胞菌

1.3.1 牙龈卟啉单胞菌的特异性免疫磁分离 Protein A microbeads

(50nm in diameter, Miltenyi Biotec, Germany )、P.gingivalis ATCC33277 gingipain K 抗血清用于P.gingivalis的磁分离。具体步骤按照磁珠应用说明书进行,最后将Protein A 纳米磁珠-抗体-细菌复合物用0.1 mol/L甘露醇洗2 遍后,在去离子水中室温平衡20 min待测。

1.3.2 阻抗测量

芯片制作和电阻抗测量设备和方法同前期研究[5,6]。建立系统标准化电阻抗值(Normalized impedance change,NIC)与细菌浓度之间的线性关系。

NIC =(Zsample-Zcontrol)/Zcontrol×100,去离子水为对照。

1.4 唾液对细菌电阻抗测量的影响

采集非刺激性唾液,1 000 g,离心10 min,去除大块食物残渣后-20 ℃保存备用。P. gingivalis浓度选择2.13×103 ～2.13×109cells/ml。用细菌培养显示为黑色菌落阴性的非刺激性唾液重悬菌液,细菌经免疫磁分离后进行电阻抗测量。

1.5 血清对细菌电阻抗测量的影响

P. gingivalis浓度选择2.13×103～2.13×109cells/ml。用新生牛血清重悬菌液,然后用Protein A microbeads-抗体复合物捕获分离细菌进行细菌电阻抗测量。

1.6 脓液对细菌电阻抗测量的影响

P. gingivalis浓度选择2.13×103～2.13×109cells/ml。 收集牙周脓肿患者的脓液,0.1 mol/L PBS稀释(1∶10)后,重悬细菌,然后用Protein A microbeads-抗体复合物捕获分离细菌进行细菌电阻抗测量。

1.7 数据处理

实验数据应用软件OriginLab 8.0处理分析。

2 结 果

2.1 唾液、血清和脓液的电化学阻抗谱

测量唾液、血清和脓液的电阻抗,结果显示唾液、血清和脓液与去离子水的电化学阻抗谱特征相同,但是与去离子水相比,3 种样本的阻抗值显著减小即3 种样本具有高导电率 (图 1～3)。

2.2 唾液对电化学测菌法检测牙龈卟啉单胞菌的影响

用细菌培养显示为黑色菌落阴性的非刺激性唾液重悬菌液,细菌经免疫磁分离后进行电阻抗测量,结果显示与纯菌液相比,唾液对系统灵敏度存在一定的影响即拟合公式的斜率绝对值减小,但是检测限仍在106 cells/ml,细菌浓度在106～109 cells/ml时, NIC与初始细菌浓度的对数存在良好线性关系(R2=0.92),NIC=-7.95 logC(cells/ml)+45.05(图 4)。

2.3 血清对电化学测菌法特异量化牙龈卟啉单胞菌的影响

用新生牛血清重悬菌液,细菌经免疫磁分离后进行电阻抗测量,结果显示与纯菌液相比,血清对系统阻抗检测没有明显影响,拟合公式的斜率绝对值差别不明显(10.76和10.33),检测限为106cells/ml。细菌浓度在106～109cells/ml时,电阻抗值的相对变化值NIC与初始细菌浓度的对数存在良好线性关系(R2=0.96),NIC=-10.33 logC(cells/ml) + 58.72(图 5)。

2.4 脓液对电化学测菌法特异量化牙龈卟啉单胞菌的影响

用稀释后的脓液重悬菌液,细菌经免疫磁分离后进行电阻抗测量,结果显示与纯菌液相比,脓液对系统阻抗检测有明显影响,细菌只有在高浓度时(109cells/ml),系统阻抗值才发生了微弱变化(图 6)。

3 讨 论

本课题组前期提出的电化学测菌法主要是基于细菌胞膜及胞内离子的电学性质,细菌内部的离子会穿过细胞膜扩散到外界溶液中,从而改变外界溶液的电导率,然后根据阻抗分析仪测量的细菌水溶液的阻抗值来判断细菌的数量,阻抗值越小,溶液导电率越高,即细菌浓度越高。但是如果细菌细胞外溶液自身的离子浓度过高,由于背景噪音过大,不能将不同浓度的细菌区别开。

唾液是牙周组织的大环境,唾液中含有丰富的蛋白、无机成分以及带电荷的离子等,通过唾液的电化学阻抗谱也进一步表明唾液自身的导电率很高,其中含有大量导电物质,这些成分均有可能吸附到免疫磁珠表面,或者扩散到细菌溶液中,增大背景噪音,进而影响系统的阻抗测量。本实验将混入唾液后的牙龈卟啉单胞菌进行免疫磁分离,然后与细菌水溶液免疫磁分离后的阻抗测量比较,结果显示细菌唾液溶液的阻抗改变小于细菌纯水溶液,拟合公式的斜率减小,进一步表明唾液可在一定程度上降低电化学测菌法的灵敏度,原因可能是非刺激性唾液中的蛋白、脂类或其他成分影响了磁珠表面抗体对细菌的捕获,或者是背景噪音导致阻抗变化减少,再者由于唾液流动性较纯水差,从而导致部分细菌在免疫磁分离过滤过程中部分丢失,导致系统阻抗变化减小。但是唾液并没有影响电化学测菌法的检测限。因此,尽管唾液诊断因具有无创性、易实施等优势[7,8],但是直接应用电化学测菌法进行唾液样本中的牙龈卟啉单胞菌值得进一步探讨,也许进一步优化唾液样本的处理、或者优化免疫磁分离效率可以将电化学测菌法更好地应用于临床并推广应用。

龈沟液含糖、氨基酸、无机盐等丰富的营养,是滋生细菌的很好培养基,集中生长着许多不同种类的细菌,并且龈沟和牙周袋的形态使其中的细菌不易受唾液冲洗、食物摩擦及口腔卫生措施等影响。龈沟液的变化能够很好的反映牙周病的发展变化,由于龈沟液的成分类似于血清,因此本实验探讨血清对牙周细菌电化学特异性量化分析的影响,为电化学测菌法直接用于龈沟液样本检测提供了实验依据。本实验结果表明血清对电化学测菌法的检测限和检测灵敏度均无明显影响,这为电化学测菌法用于龈沟液样本的直接检测提供给了有利的数据支持,为研发能够用于牙周炎椅旁诊断的新设备提供了新途径。

牙周炎发展到一定程度时,深层牙周组织感染,牙周袋内则会有脓性分泌物溢出。脓液主要由组织分解产物、炎症渗出物、白细胞及死亡的细菌等组成,脓液中的成分是否会对电化学测菌法检测有影响尚不清楚。实验结果表明脓液可对电化学测菌法的实际应用产生显著不良影响,不能够区分出细菌不同浓度,原因可能与脓液中的非导电或导电率很小的物质阻断了磁珠表面抗体与细菌的免疫结合,或者堵塞部分μ column柱,使得通过免疫磁分离获得的细菌的量很少,从而表现为细菌在103～108cells/ml时系统阻抗测量值无明显改变。也或者是细菌表面被脓液包裹,阻止或者减少了细胞内离子的释放。而当细菌浓度为109cells/ml时,系统阻抗值产生微弱变化,可能主要与菌体的自带电荷有关。因此,实验结果目前电化学测菌法检测样本时应避免脓液的污染样本。

参考文献

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[7]Seoane Lestón J,Diz Dios P.Diagnostic clinical aids in oralcancer[J].Oral Oncol,2010,46(6):418-422.

牙髓卟啉单胞菌 篇5

牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis, Pg) 是牙周炎重要致病菌, Pg及其毒力成分的刺激作用可显著影响宿主细胞IL- 8的表达,且该影响作用与细菌致病力的强弱相关[1]。近年的研究显示:Pg的致病性与其菌毛编码基因fimA的遗传多态性存在相关性[2,3]。本课题组前期研究结果表明:Ⅱ型fimA基因型Pg与我国人群牙周炎发生密切相关,并已发现不同fimA基因型Pg促进宿主细胞表达单核细胞趋化蛋白-1的能力存在差异[4]。本研究拟比较不同fimA基因型Pg对人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblast,HGF)表达IL- 8的影响,分析不同fimA基因型Pg引发的牙周组织中性粒细胞募集的差异,探讨fimA基因型与Pg致病力的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 Pg菌株和HGF细胞株

Pg菌株ATCC33277(Ⅰ型)、 WCSP115(Ⅱ型)、WCSP1.5(Ⅲ型)、W83(IV型) 和HGF细胞株均由口腔疾病研究国家重点实验室提供。菌株fimA基因型的确定和方法参见文献[2]。

1.1.2 主要材料与仪器

IL- 8 ELISA 试剂盒 (R&D,美国),Revert AidTM Frist Strand cDNA Synthesis 试剂盒(MBI,立陶宛),麦氏细菌比浊仪(BD Crystal SpecTM,美国),HTS 7000 plus 多孔板高效分析仪 (PE,美国),FTC2000型实时荧光定量基因扩增仪(Funglyn,加拿大)。

1.1.3 引物合成

IL- 8上游引物:CAAACCTTTCCACCCCAAAT;下游引物:CTCAGCCCTCTTCAAAAACT;探针:CTCTGTCTGGACCCCAAGGA,片段长度169 bp。内参照磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase, GAPDH)上游引物:TCATCATCTCTGCCCCCTCT;下游引物:ATGAGGTCCACCACCCTGTT;探针:ACCACAGTCCATGCCATCAC片段长度141 bp。均由上海生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 Pg和HGF的培养

将脱脂牛奶内冻存的Pg ATCC 33277(Ⅰ型)、WCSP115(Ⅱ 型)、WCSP1.5(Ⅲ 型)、W83(Ⅳ 型)复苏,接种在牛心脑浸液培养基上,37 ℃厌氧培养5～7 d,生化鉴定后传代。取对数生长期的菌株悬浮于新鲜配置的磷酸盐缓冲液(PBS)中分别制备成菌悬液,6 000 r/min (离心半径=16.1 cm),离心10 min,洗涤2 次,采用麦氏细菌比浊仪将菌悬液密度调至1×1011 CFU/L,6 000 r/min (离心半径=16.1 cm),离心15 min,弃上清液,用含10%小牛血清的低糖达克伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's modified eagle medium, DMEM)重悬备用。复苏HGF,置入标准条件(37 ℃、5%CO2、饱和湿度)的恒温孵箱培养。每3 d换液1次,取生长旺盛(存活率>95%)的HGF制备细胞悬液,细胞计数并调整细胞密度为1×109个/L,接种至6孔细胞培养板,每孔HGF细胞悬液2 ml,标准条件下继续培养,待细胞单层融合并铺满各孔底后备用。

1.2.2 实验分组

弃接种HGF的6孔板内原培养液,PBS洗孔2 次,将不同Pg菌株菌悬液(1×1011 CFU /L)2 ml分别加入HGF细胞培养孔中,实验组分别为:T1组:Pg ATCC 33277(Ⅰ型)、T2组:WCSP115(Ⅱ型)、T3组:WCSP1.5(Ⅲ型)、T4组:W83(Ⅵ型);对照组加入2 ml DMEM;每组3孔。细菌感染细胞的比率为100∶1(即约每100 个细菌感染1个细胞),然后分别在1、3、6及12 h吸取上清液备用,并应用Trizol法提取感染后细胞总RNA备用。

1.2.3 IL- 8 mRNA的检测

采用实时荧光定量RT- PCR法。应用RevertAidTM试剂盒(按照说明书)将细胞总RNA 逆转录为cDNA,然后行PCR反应。反应体系:RT产物 5 μl,10×PCR buffer 3 μl, 25 mmol/L MgCl2 3 μl, 4×dNTP 25 mmol/L 0.36 μl,上游引物1 μl,下游引物1 μl,Taq酶0.3 μl,加双蒸水至反应总体积为30 μl。反应条件:94 ℃ 2 min 94 ℃ 20 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,共35 个循环,再72 ℃ 5 min。以GAPDH为内参照。

1.2.4 标准曲线的制作

将PCR扩增产物按10 倍梯度进行稀释,制成标准模板系列,自每个稀释模板中取样5 μl,分别加入30 μl的反应体系中(反应体系同上),在FTC2000型荧光定量PCR仪上进行实时荧光定量RT- PCR。反应条件:94 ℃ 2 min,94 ℃ 20 s,55 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s共45 个循环。将PCR仪的荧光采集时间统一设定在扩增反应的延伸期。45 个循环的扩增反应结束后,系统将采集到的每一循环反应时的各反应管荧光强度增长指数(DRn)进行分析,绘制每一反应管的扩增动力学曲线。根据动力学曲线确定样品管中荧光强度增加到某一特定阈值时的扩增循环数(cycle threshold,Ct值),根据Ct值与标准模板初始拷贝的对数值作图,得到该样品待测基因的标准曲线。

1.2.5 HGF中IL-

8目的基因相对拷贝数的测定 将反转录得到的cDNA样品各取5 μl,加入上述反应体系中,并在同样的反应条件下行PCR扩增。收集数据,绘制动力学曲线,测定各样品的Ct值与标准曲线进行比较,得出待测样品的相对拷贝数。在PCR反应过程中,以蒸馏水作为阴性对照。以内参引物的Ct值对样本拷贝数加以校正,以排除原始样本量差异对结果的影响。

1.2.6 IL- 8 蛋白的检测

采用ELISA法。应用人IL- 8 ELISA 试剂盒,根据使用说明书绘制标准曲线。每孔加入50 μl待测样本,采用HTS 7000 plus 多孔板高效分析仪双波长485/635 nm读数并自动换算出样本含量(pg/ml)。

1.3 统计学方法

实验数据以undefined表示,使用SPSS 11.0统计软件进行统计学处理。采用方差分析(ANOVA)和最小显著差法(least significant difference, LSD)多重比较法进行组间多重比较,检验水准为双侧 α=0.05,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HGF IL- 8 mRNA表达水平的比较

IL- 8 mRNA的检测结果见表 1。各实验组中HGF IL- 8基因和GAPDH内参基因的mRNA表达均以Ct值表示。根据样本Ct值对应标准曲线,以内参基因GAPDH Ct值对IL- 8拷贝数加以校正,计算得到样本中IL- 8 mRNA的拷贝数△Ct值[4]。经ANOVA- LSD多重比较法分析表明,不同fimA基因型Pg刺激HGFs 后,在1、3、6、12 h,实验组与对照组IL- 8的相对表达量均高于对照组(P<0.01);实验组间比较表明,各时间点T2组IL- 8 mRNA的相对表达量高于其它组(P<0.05);T4组在6、12 h时高于T3组(P<0.05);T1组在6 h时高于T3组(P<0.05)。

①与实验组比较P<0.01,②与其它实验组比较P<0.05,③与T3组比较P<0.05。各数据为3 次独立实验结果的undefined(下表同)

2.2 HGF IL- 8 蛋白表达水平的比较

经ANOVA- LSD多重比较法分析表明(表 2),在1、3、6、12 h,实验组IL- 8的分泌量显著增高,与对照组差异有统计学意义(P<0.01);实验组间比较表明, T2组在各时间点IL- 8的分泌量显著高于其它实验组(P<0.05);T4组在1、6、12 h时高于T3组(P<0.05);T1组在6、12 h时高于T3组(P<0.05)。

3 讨 论

牙周炎是一种由口腔微生物感染引发的牙周组织炎症性疾病,致病菌不仅破坏宿主牙龈上皮屏障,还可侵入深部结缔组织,引发持续的免疫反应和炎症损伤。牙龈成纤维细胞是含量最多的牙周组织固有细胞,牙周炎免疫反应早期,HGF在致病菌的刺激作用下,表达多种趋化因子参与对免疫细胞局部募集的调节,对后续炎症和免疫效应的持续放大起到了重要的始动作用。IL- 8是一种中性粒细胞趋化因子,是引发牙周组织中性粒细胞大量浸润的重要介质。研究显示[1,5]:Pg及其毒力成分可影响HGF IL- 8的表达,且这种影响作用与Pg的毒力相关。近年的研究发现[2,3]:Pg菌毛fimA基因的遗传异质性可能影响细菌的致病力。本课题组的前期研究证实[4]:ⅡfimA基因型Pg促进HGF表达单核细胞趋化蛋白-1的能力最强。本实验进一步探讨了fimA基因型对Pg刺激HGF表达IL- 8的影响,为研究fimA基因型与Pg致病性的关系提供新的实验依据。实验结果显示:各fimA基因型Pg均可促进HGF的 IL- 8 mRNA和蛋白水平的表达(P<0.01),其IL- 8 mRNA和蛋白表达量在6 h达到峰值;在各实验组间比较中,ⅡfimA基因型Pg组各时间点的IL- 8 mRNA相对表达量和IL- 8蛋白分泌量均高于其它实验组,而ⅢfimA型Pg组的表达量相对低于其它实验组,差异有统计学意义(P<0.05)。

近年来,国内外学者在对Pg调节宿主细胞表达IL- 8的研究中存在两种不同的结论和观点。第一种观点认为:Pg是IL- 8局部积聚的强烈抑制剂,能够阻止细菌感染部位中性粒细胞的募集。Nassar等[6]的研究显示:Pg的刺激作用可导致内皮细胞IL- 8 mRNA表达的上调,但细胞分泌IL- 8的水平下降。Tada等[7]则发现:Pg可能通过牙龈素- R水解宿主细胞表面的CD14,来阻止Pg- LPS诱导的成纤维细胞IL- 8 mRNA和蛋白水平的表达。持这一观点的学者们认为:Pg的刺激作用抑制了宿主细胞趋化因子的表达,使宿主无法探测入侵的细菌,不能有效启动免疫细胞的局部募集,从而有助于Pg在感染区域有效的躲避宿主防御机制。Pg的这种“局部细胞因子的化学麻痹作用(local chemokine paralysis)”[8]可能是其蛋白酶参与抑制宿主细胞转录或转录后水平表达IL- 8的结果。另一种观点则认为:Pg的感染可能引发局部牙周组织趋化因子的过表达,造成大量炎症和免疫细胞浸润,加重局部免疫反应。Kang等[9]应用Pg381、同源fimA缺陷株DPG3、同源牙龈素缺陷株MT10W刺激内皮细胞,结果显示:实验组趋化因子mRNA和蛋白水平的表达量均高于阴性对照组,且Pg刺激细胞趋化因子 mRNA和蛋白表达水平的上调与菌毛的存在与否有关,而与牙龈素无关。Takahashi等[10]的研究则发现:Pg的主要和次要菌毛参与了对宿主细胞IL- 8表达的上调作用,这种调节与菌毛激活的细胞肌动蛋白骨架的重排和核转录因子- κB的活化有关。这些研究者均强调了Pg的菌毛侵入能力在宿主细胞IL- 8表达上调中的重要作用。本研究中Pg促进HGF IL- 8 mRNA和蛋白水平过表达,且ⅡfimA基因型Pg的促进作用最强,这一实验结果与Kang和Takahashi的结论相似。ⅡfimA基因型Pg黏附和侵入多种宿主细胞的能力强于其它各fimA基因型Pg,而ⅡfimA基因的敲除显著影响Pg的侵入能力[11],提示:Pg的刺激作用可促进HGF mRNA和蛋白水平过表达趋化因子IL- 8,且这种促进作用与菌毛fimA基因型相关;ⅡfimA基因型Pg的促进作用最强,其导致的局部炎症和免疫反应程度可能强于其它fimA型Pg,造成Ⅱ型Pg携带宿主的牙周状况较差。这一结果为本课题组的前期研究结论[2]“Ⅱ型Pg与我国慢性牙周炎发生发展显著相关”提供了一定的病因学理论基础。

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