差异表达基因检测

差异表达基因检测（精选10篇）

差异表达基因检测 篇1

蔗糖是人类食用较多的碳水化合物之一, 是牙菌斑细菌 (最主要是变形链球菌, 以下简称变链菌) 合成胞外多糖的主要底物。产生的多糖包括水溶性细胞外多糖和水不溶性细胞外多糖, 前者作为能源储存形式, 后者对细菌黏附起很重要的作用。因此, 环境中蔗糖的量对变链菌将产生重要影响。

基因表达谱芯片能够快速高效、大规模、高通量及平行性获取相关生物信息, 已广泛应用于各项科学研究中[1,2,3,4]。本实验拟利用基因芯片快速、高效地筛选出0.5%蔗糖和1%蔗糖2 种实验条件下变链菌中差异表达的基因, 以探讨蔗糖的量对变链菌基因表达的影响。芯片的制备及检测在上海生物芯片有限公司完成。

1 材料和方法

1.1 芯片制备

1.1.1 靶基因的选择和扩增

根据GeneBank、Oralgen数据库信息选择变链菌134个基因, 主要参与能量代谢、糖转运、糖代谢、脂肪酸和磷脂代谢、氨基酸蛋白质代谢、细菌表面多糖和脂多糖代谢、胞膜代谢, 信号传递与调控, 细菌黏附等毒力、适应性、耐药性, DNA代谢、复制、重组、修复及转化等。提取变链菌DNA, 设计引物进行PCR扩增靶基因, PCR产物长度为500 bp左右。

1.1.2 点样

样品浓度为250 ng/μl, 片基选择进口cDNA 基片。

1.2 细菌培养

复苏、鉴定后的变链菌临床株3403[5], 接种于0.5%及1.0%蔗糖的TPY液体培养基中, 37 ℃孵箱中微需氧培养至指数中后期。

1.3 细菌总RNA提取和纯化

变链菌菌液离心收集菌细胞并悬浮于300 μl TE缓冲液中, 然后加入200 mg/ml溶菌酶 50 μl、37 ℃水浴孵育2 h, 并按TRIzol Reagent 说明书抽提总RNA。使用RNeasy Kit (Cat.No. 74106) 按说明书纯化总RNA。以紫外分光光度计检测A260为1 时, 样本中RNA含量为40 μg/ml, 以此计算实验样本中的RNA含量。并根据260 nm和280 nm的吸光度之比来确定其纯度。用Rnase- free DNase Ⅰ (Promega) 按说明书处理总RNA。

1.4 探针标记

探针标记采用逆转录标记法。实验组RNA, 编号为7号样本, 是0.5%蔗糖组, 采用Cy3 荧光标记, 对照组RNA, 编号为8 号样本, 是1.0%蔗糖组, 采用荧光Cy5 标记。

1.5 芯片杂交和洗涤

取等量的Cy3 和Cy5 标记的探针, 加入杂交缓冲液中充分混匀。取杂交液滴加于芯片上, 42 ℃杂交箱中避光杂交16 h。为保证结果的可靠性, 实验重复2 次, 芯片编号分别为74897A和74897B。杂交结束后, 洗涤、干片。

1.6 数据分析

芯片结果采用Axon 扫描仪进行扫描, 软件读取数据, 将图像导入图像分析软件Imagene, 提取得到基因表达的荧光信号强度值, 最后以列表形式输出。数据导入分析软件Genespring进行处理分析。最后ratio值为Cy3/Cy5, 即处理组/对照组。ratio≥2 为上调基因, ratio≤0.5 为下调基因 (P<0.05) 。

1.7 TaqMan RT- PCR

采用TaqMan RT- PCR方法对差异基因进行验证。选择表达下调的基因gbpC基因, 内参基因选择16S rRNA基因, 其引物和探针的设计见表 1, RNA的提取及逆转录方法同上。反应体系包括:样本5 μl、10×buffer (Mg2+ free) 3 μl、MgCl2 (25 mmol/L) 3 μl、dNTP (25 mmol/L) 0.36 μl、上游引物 (10 μmol/L) 1 μl、下游引物 (10 μmol/L) 1 μl、探针 (10 μmol/L) 0.6 μl、Taq酶 (5 U/μl) 0.3 μl、ddH2O 15.74 μl, 总体积是30 μl。扩增条件:变性94 ℃ 2 min、预变性94 ℃ 20 s、退火57 ℃ 20 s、延伸60 ℃ 30 s, 循环数45。

2 结 果

2.1 总RNA的提取

RNA凝胶电泳见图 1, 可见23S、16S、5S 3 条亮度依次递减的清晰条带, 泳道上无明显弥散痕迹, 说明总RNA提取完整无降解。Agilent 2100 Bioanalyzer 分析见图 2, 也显示提取的总RNA满足后续实验要求。

2.2 芯片杂交结果

如图 3所示, 芯片信号强度高, 信号均一。两片间的相关性系数为0.992 3, 说明芯片杂交结果可重复性好。图 4显示表达基因的分布情况, 其中每个点代表一个基因, 45°线上方的点为表达上调的基因, 共有17 个, 45°线下方的点为表达下调的基因, 共有23 个。差异表达基因具体情况见表 2、3。

2.3 TaqMan RT- PCR结果

gbpC基因经TaqMan RT- PCR验证, 其表达情况与芯片检测结果一致。在0.5%和1.0%蔗糖条件下其△Ct值分别为1和-1.5, 其基因相对表达量2-△△Ct值分别为0.5和2.828, 0.5%蔗糖条件相对于1.0%蔗糖条件gbpC基因表达明显下调。

1、2号泳道: 0.5%蔗糖组变链菌RNA; 3号泳道: 1.0%蔗糖组变链菌RNA

1, 2:RNA of S.mutans of 0.5% sucrose group; 3: RNA of S.mutans of 1.0% sucrose group

3 讨 论

基因芯片是伴随着人类基因组计划发展起来的一项高通量筛选技术, 一次实验可同时检测数百乃至数千个基因, 具有快速、准确、低消耗、高灵敏度的特点, 目前已广泛应用于各领域研究中[1,2,3,4]。本研究选择134 种与变链菌毒力、应激反应、细菌代谢等相关的基因, 设计制备了变链菌基因表达谱检测芯片用于检测不同环境条件下变链菌基因的表达情况。结果证实本研究中构建的变链菌基因表达谱检测芯片能够准确有效地检测变链菌基因的表达变化, 能够筛选出不同环境条件下变链菌表达发生变化的基因, 从而可观察环境因素对变链菌基因表达的调控作用。

环境对基因表达的调控作用已受到许多学者关注。Browngardt 等[6]发现碳水化合物和pH对于变链菌主要毒力因子基因ftf和gtfBC的表达起到重要调控作用。基因芯片技术具有其他方法不可比拟的优势, 本研究应用基因芯片筛查了0.5% 蔗糖环境中相对于1.0% 蔗糖环境显著差异表达的基因有40种。表达明显上调的基因有17 种, 主要参与能量代谢与糖代谢、参与糖转运及蛋白间相互作用。变链菌可能正是通过增强转运能力来尽可能多地从外界摄取蔗糖, 以抵抗外界蔗糖减少的影响。糖转运过程是一个耗能的过程, 因而此时参与能量代谢成分的基因表达也上调。表达明显下调的基因有23 种, 首先与变链菌毒力、致病性相关的基因表达下调。例如与变链菌黏附密切相关的gbpC基因表达明显下调。GbpC蛋白在变链菌黏附中起重要作用, 有研究证实gbpC突变株葡聚糖结合能力和蔗糖依赖性/非依赖性黏附都下降[7,8,9]。已知蔗糖可促进变链菌黏附, 因此, 环境中蔗糖减少时gbpC表达减弱可能是此时黏附降低的原因之一。其次参与信号传递与调控、脂肪酸和磷脂代谢、胞膜代谢、DNA代谢、细菌表面多糖、脂多糖合成等的基因表达下调。0.5%蔗糖环境相对于1.0% 蔗糖环境, 众多基因表达发生改变的内在机制及基因间可能的相关关系是今后研究的方向。

本研究检出众多基因的改变表明基因芯片是一种高效的分析工具, 能有效筛选出不同环境中变链菌差异表达的基因。该技术将为变链菌研究提供一个重要的研究和应用平台。同时本研究结果也说明蔗糖浓度等环境因素对变链菌调控的过程非常复杂, 是多因素、多基因共同作用的结果。本研究为今后进一步研究证实环境对变链菌调控的具体分子机制、基因表达变化与表型变化的关系提供良好的实验基础。

参考文献

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差异表达基因检测 篇2

抑制性消减杂交(SSH)、DNA芯片和基因表达系列分析(SAGE)技术都是高效鉴别不同细胞群之间差异表达基因的方法.作者对这3种方法在动物发育与繁殖领域中的.最新应用进展作了简要阐述.

作 者：肖朝庭 储明星 傅衍 XIAO Chao-ting CHU Ming-xing FU yan 作者单位：肖朝庭,傅衍,XIAO Chao-ting,FU yan(浙江大学动物科学学院,杭州,310029)

储明星,CHU Ming-xing(中国农业科学院畜牧研究所,北京,100094)

差异表达基因检测 篇3

关键词：海南猪；能量水平；IGFBP6基因；基因表达

中图分类号： S828.5 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）07-0035-03

猪生长性状是复杂的数量性状，而营养是除遗传因素外影响生长的另一个重要因素，它虽然无法改变动物的遗传性状，但可通过营养学途径，调控猪生长等数量性状基因的表达，从而在表型上改善胴体品质和肉质。IGFBPs在GH/IGFs生长轴的调节中起着重要作用，这些结合蛋白的作用受营养、生理条件、其他激素等诸多因素的影响。IGFBP6基因作为IGFs超家族中的一员，在成年动物体内广泛表达，因其与 IGF-2 结合的特异性而受到研究者们关注。近几年研究表明，IGF2基因在胎儿生长发育、肌肉生长等方面具有重要调控作用，与猪的生长速度、背膘厚等产肉性状相关[1-4]，是影响动物生长发育的主要候选基因。在IGF依赖型作用途径中，IGFBP6通过与IGF-2的结合对动物的生长发育调节产生重要影响。海南猪是我国地方猪的一个品系，适应性和抗逆性极强，具有肉质细嫩、胴体瘦肉率高、肌纤维特细、肌间脂肪多等优点。迄今，关于IGFBP6对动物生长发育影响的研究尚较少，且主要集中于不同品种猪IGFBP6基因mRNA在不同组织间表达量的研究[5-7]，而关于不同能量水平对猪 IGFBP6 基因mRNA表达量的影响，以及IGFBP6基因mRNA表达量与生产性能相关性的研究尚未见报道。本研究利用RT-PCR技术并结合生长性状，探讨不同能量水平对海南猪IGFBP6基因表达量的影响，以及IGFBP6基因表达量与生长的相关性，以期从分子水平解释营养对生长产生影响的机理。

1 材料与方法

1.1 试验设计

采用单因子试验设计，将36头质量为（61.70±1.00） kg的海南猪随机分为2个处理组，分别饲喂高、低能量水平的日粮，每个处理组设3个重复，每个重复6头猪。高能量水平日粮参照NRC（1998）《猪营养需要》配制，确定消化能（DE）为14.21 MJ/kg；低能量水平日粮参照NY/T 65—2004《猪饲养标准》配制，确定DE为12.95 MJ/kg，蛋白质含量均为1300%（表1）。

1.2 饲养管理

按照海南省农业科学院畜牧兽医研究所猪场饲养管理办法进行饲养管理，在7 d预饲期后，对2个处理组分别饲喂高、低营养水平的饲料。试验期用湿拌料，每日喂2次，自由饮水，保持圈舍清洁并定期消毒，正式试验期为40 d。

1.3 测定指标

1.3.1 生长性能指标 分别于试验开始、结束时空腹称质量，以圈为单位计算日采食量、日增质量、料肉比。

1.3.2 样本采集 试验结束时，选取12头质量接近于平均质量的海南猪进行屠宰取样（每重复选2头，每处理组选6头），肉样采集位置为个体的最后肋骨、最后腰椎间的单侧背最长肌，采集后立即置于液氮中速冻并于-70 ℃保存，用于提取肌肉组织总RNA。

1.3.3 IGFBP6基因实时定量表达量的测定 取最后肋背最长肌样本约30 mg，加入液氮并研磨成粉，转入1.5 mL Eppendorf管中，采用RNA Simple Total RNA Kit总RNA提取试剂盒提取样本总RNA，按说明书进行操作。通过琼脂糖凝胶电泳检测所提取总RNA的完整性，并通过D260 nm/D280 nm检测样本纯度。采用FastQuant cDNA第一链合成试剂盒（天根公司产品）对总RNA进行反转录（reverse transcription，RT），配制反应体系、设置反应条件、合成cDNA均按说明书进行操作，反转录产物于-20 ℃保存备用。

采用Primer primer 5.0软件设计引物，由上海生工有限公司进行合成（表2）。

使用实时荧光定量PCR仪，反应体系为20μL：模板

1.4 统计与分析

采用2-ΔΔCT计算方法分析目的基因的相对表达量。采用SPSS 13.0统计软件对海南猪组织IGFBP6基因相对表达量进行t检验及相关性分析，试验结果用平均数±标准差（x±s）表示。采用LSD法进行平均数之间的多重比较。

2 结果与分析

2.1 日粮能量水平对海南猪生长性能的影响

由表3可知，日粮能量水平对海南猪平均日增质量、料肉比的影响均达显著水平（P<0.05），而对末质量、平均采食量的影响则不显著（P>0.05）。初始质量差异不显著的海南猪经40 d的饲养，其试验期末质量虽未达显著水平，但各能量水平组的平均日增质量均达到显著水平。可见，提高生长后期日粮的能量水平，可显著提高海南猪的平均日增质量，降低料肉比。

2.2 能量水平对IGFBP6基因表达量的影响

由图1可知，在低能量水平条件下，IGFBP6基因表达量为1.09，高能量水平条件下为0.82，两者差异不显著（P>0.05）。

2.3 IGFBP6基因表达量与生长性能的相关性分析

由表4可知，IGFBP6基因表达量与料肉比呈显著负相关（P<0.05），与平均日增质量、平均日采食量均呈不显著正相关（P>0.05）。

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3 结论与讨论

能量是动物生长发育、繁殖所必需的营养物质之一，能量过量或缺乏均可引起猪生长速度的变化或质量的增减。马书林在研究不同能量水平对奶牛生产性能、繁殖性能的影响时指出，将哺乳奶牛日粮的能量水平提高10%～20%，对其产奶量的影响虽与对照组差异不显著（P>0.05），但添加能量可减缓奶牛质量的下降[8]。贾金凤研究发现，适当提高猪育肥期日粮的能量水平，可提升猪的日增质量和经济效益[9]。刘秋研究发现，不同能量水平对豪猪全期平均日采食量、日增质量、料肉比的影响均达显著水平（P<0.05）[10]。本试验结果表明，提高日粮能量水平对海南猪试验末质量、采食量的影响虽不显著，但可显著提高海南猪的平均日增质量，并降低料肉比（P<0.05），这与刘秋在豪猪上的研究结果相一致。

营养物质可通过各种途径对基因表达进行多层次、多水平的调控，从而影响动物机体的生长发育和物质代谢。关于能量水平对IGFBP6基因表达量的影响尚未见报道。Towle等研究发现，日粮中的主要营养物质可显著影响动物体内许多基因的表达，其中包括一些控制机体代谢关键酶的基因，从而影响机体的代谢过程[11-12]。Marinaro等研究发现，由IGFBP6基因引起的细胞间相互作用似乎受碳水化合物的抑制[13]。Osgerby等在对马的研究中发现，不同营养水平会影响胎儿的大小，并随IGFBPs的浓度而改变，营养水平越低则母体的IGFBP6基因mRNA越低（妊娠45～90 d），随后开始上升，可见IGFBP6基因的水平受营养水平的影响，且其表达量具有时空效应[14]。本研究中营养水平对IGFBP6基因表达量有一定的影响，即低能量水平的饲粮可使IGFBP6基因表达量升高，但与高能量组差异不显著。可能的原因为高、低营养水平之间差别不大，尚未达到显著调控IGFBP6基因表达量的程度；虽然能量水平可影响IGFBP6基因的表达，但未必是调控IGFBP6基因表达量的最佳途径。

Mei所构建的IGFBP6基因敲除小鼠在生长、繁殖性状上与野生小鼠没有显著差异[15]。Bienvenu等研究发现，高表达人源IGFBP6基因的转基因小鼠质量减轻，雌性小鼠生育能力显著下降；过表达IGFBP6基因的转基因小鼠十二指肠质量显著减轻，其他器官与对照组无显著差异[16]。上述研究并不能完全证明IGFBP6基因对小鼠生长和繁殖的作用，IGFBPs家族蛋白代谢过程中的一系列代偿作用也可能导致敲除小鼠与野生小鼠在表型上无显著差异。万斯妮对猪IGFBP6基因第4外显子Taal-RFLP（T-C）位点的多态性进行检测，发现该基因第4外显子突变位点与猪胸腰椎膘厚、肌肉失水率、促甲状腺素的含量均显著相关（P<0.05）[5]。王文君采用PCR-SSCP技术在IGFBP6、G3079A、T4069G处检测到2个SNP，相关性分析表明，AT单体型猪的生长发育性状、产肉性状均高于GG单体型猪，而板油质量的指标却恰恰相反，可见 IGFBP6 基因是猪生长发育性状的一个候选基因[6]。

IGFBP6基因是IGFs超家族中的一员，其细胞层面的研究表明，IGFBP6基因通过与IGF2结合阻断其与细胞表面受体的结合，从而可抑制由IGF2所介导的生长、发育、细胞粘连等[17]。Zhao等指出IGFBP6基因在胚胎时期的肌肉组织中表达量较高，可能与肌肉的分化有关[18]。虞德兵研究发现IGFIⅡ在猪肌肉组织中的表达水平随日龄的增加呈下降趋势[19]。房希碧等研究发现，猪肌肉组织中IGFBP6基因的表达量随月龄的增加呈上升趋势，可见肌肉组织中的IGFBP6基因可能通过依赖IGF的途径发挥对生长发育的调节作用，但此调节作用并非影响猪体型大小的关键因素[7]。上述研究进一步揭示了IGFBP6基因对动物生长、繁殖的作用，以及IGFBP6基因表达量对动物生长发育性状的影响。

本试验首次研究了IGFBP6基因相对表达量与肥育猪生产性能的关系，结果表明IGFBP6基因表达量与料肉比呈显著负相关（P<0.05），与平均日增质量、平均日采食量均呈不显著正相关（P>0.05）。

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差异表达基因检测 篇4

Microarray技术, 亦称生物芯片技术。作为一种高通量检测技术, 它可以同时检测几十万个大分子生物表达水平, 大规模的提高了检测效率, 是生物信息学领域具有里程碑式意义的一项重大技术革新。生物信息学研究的一项重要课题就是对芯片上成千上万个基因点的杂交信息进行解读, 从而揭示生命特征及规律[1]。差异表达基因识别是一项重要的基因芯片数据的分析方法。通过该技术可以找到疾病中表达水平发生显著变化的基因, 进而对疾病的预后有着极为重要的意义。

2 差异表达基因分析算法

在研究中, 我们需要在两种完全不同的实验条件下 (例如癌症与非癌症患者) 处理生物样本, 主要目的就是要得到不同条件下的基因表达值。其中, 处理后的样本被称为实验组样本;未被处理的样本被称为对照组样本。下面我们简述SAM、t-test和RSDM三种不同类型的差异表达基因识别算法。

2.1 SAM算法

2001年由Tusher提出的基因芯片显著性分析算法SAM是一种基于统计分析理论的差异表达基因识别算法。

检验统计量如公式2.1所示:

估算di的期望, 如公式2.2所示:

SAM算法流程如下:构造检验统计量并排序;计算期望值;识别差异表达基因 (统计量与其期望的差别超过门限值) ;计算错误发现率FDR (即在多重检验中, 错误的拒绝原假设数与拒绝原假设总数的比值的期望) 。

2.2 T-test算法

T-test算法主要用于计算样本量小的正态分布数据。该算法是一种简单的、基于统计分析理论的差异表达基因识别方法。

Global T检验统计量如公式2.3所示:

Gene-specifi c T检验统计量如公式2.4所示:

上式中, Rg代表基因表达值平均对数比, SE代表合并数据集的标准误差, SEg代表标准误差对数比。Gene-specifi c方法的主要特点是不受异质性数据的影响。

2.3 RSDM算法

RSDM是一种具备标准差过滤技术的元分析差异表达基因识别算法。该算法可以处理异质性数据集, 通过对多组同质芯片数据进行整合分析, 计算差异表达基因, 并通过标准差分析, 滤除计算结果中存在的部分伪差异表达基因[3]。

算法流程如下:计算实验组与对照组数据的差异度量值;形成差异度矩阵, 并对矩阵数据排序;使用统计量判断差异表达基因;计算每个基因的标准差, 进行B次随机扰动, 计算P-value。

3 差异表达基因识别系统

为了比较三种算法的性能, 我们采用Jav语言设计并实现了一款集成了三种差异基因识别算法的软件系统。软件主要具备数据导入、算法选择、差异表达基因识别以及结果读取等主要功能。软件功能流程如图3.1所示。

4 实验与分析

采用上述系统对包含3000个基因的模拟数据集进行实验与分析。模拟数据中预置了30个差异表达基因, 其中上调基因20个, 下调基因10个。对原始数据进行标准化处理, 然后分别采用三种差异表达基因识别算法SAM、T-test和RSDM进行计算, 最终得到三组不同的数据, 我们对其进行比较与分析, 结果如表4.1所示。

上表中, 伪差异表达基因代表算法所识别的结果中所包含的非差异表达基因个数, 识别率代表算法发现的正确的差异表达基因占总差异表达基因数量的比率。

SAM算法共发现24个差异表达基因, 其中伪差异表达基因5个, 识别率为63%;T-tes算法共发现26个差异表达基因, 其中伪差异表达基因3个, 识别率为77%;RSDM算法共发现了全部30个差异表达基因, 其中伪差异表达基因为0, 识别率为100%。通过实验结果可以发现, RSDM算法的准确度最高, 其次是T-test, SAM的准确度相对最低;对于算法运算处理速度, SAM最快, 其次是T-test, RSDM相对较慢。

5 结论

差异表达基因的识别是微阵列基因表达谱数据分析的一项重要任务。通过比较正常和非正常状态下基因表达的差异, 对于生物疾病的发生机理及预后预测都有极为重要意义。我们对SAM、T-test、RSDM三种不同类型的差异表达基因识别算法进行了简要的描述, 并结合实验数据对三种算法计算准确度和运算速度进行比较与分析。希望本文的工作能为从事生物数据分析的科研工作者提供一定的帮助。

参考文献

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差异表达基因检测 篇5

sTNFR Ⅱ和VIP融合蛋白的基因克隆表达、纯化及活性检测

可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ(sTNFRⅡ)和血管活性肠肽(VIP)对类风湿性关节炎(RA)均有治疗作用,但两者的作用机制不同.制备两者融合蛋白,可能具有更好的防治类风湿关节炎的`作用.用含有VIP基因序列的上游引物和sTNFRⅡ的下游引物,用PCR扩增出由连接序列将VIP和sTNFRⅡ基因连接的片段,再亚克隆到原核表达载体pET32a,在大肠杆菌DH5α内诱导表达.表达的产物经离子交换、疏水层析纯化,并用体外中和试验检测其抑制TNF细胞毒及肝细胞膜特异性脂蛋白(Lsp)诱导的细胞毒生物活性.结果显示构建的pET32a-VIP-sTNFRⅡ表达载体在大肠杆菌DH5α内以包涵体形式表达,疏水层析结合离子交换层析纯化后,融合蛋白具有较好的抑制炎症分子诱导的炎症反应生物活性,为将来应用打下基础.

作 者：王虹 曾位森 陈金华 王珊珊 刘丹 杨艳妮 陈百宏 李玲 WANG Hong ZENG Wei-sen CHEN Jin-hua WANG Shan-shan LIU Dan YANG Yan-ni CHEN Bai-hong Li Ling 作者单位：广州蓝星生物科技开发有限公司,广州,510663刊 名：中国生物工程杂志 ISTIC PKU英文刊名：CHINA BIOTECHNOLOGY年，卷(期)：200626(5)分类号：Q78关键词：sTNFRⅡ VIP 融合蛋白 表达 纯化

差异表达基因检测 篇6

1 材料与方法

1.1 试验动物及试剂

试验用泸宁鸡, 来自四川省凉山州冕宁县原生农业有限公司, 屠宰后迅速采集其组织样置于液氮中, 备用。

扩增用的Taq酶、转化载体p MD19-T及反转录试剂盒, 由Ta KaRa公司提供;TRIzol试剂, 由Invitrogen公司提供;胶回收试剂盒, 由北京博大泰克生物基因技术有限责任公司提供;大肠杆菌DH5α感受态细胞, 购于天根生化科技 (北京) 有限公司。

1.2 引物的设计与合成

依据Gen Benk中原鸡的Myo G基因序列 (登录号为NP 989515.1) , 用Primer Premier 5.0软件设计扩增引物, 包括完整的开放阅读框 (ORF) , 引物序列:上游引物5'-TCCCATGGAGCTCTTTGAGACC-3', 下游引物5'-ATCACCATCCCACCCCGTTT-3', 送上海生工生物工程技术服务有限公司合成, 产物长度为741 bp。

1.3 泸宁鸡Myo G基因克隆

采用TRIzol法提取泸宁鸡组织样中的总RNA, 用分光光度仪检测总RNA的浓度, 根据反转录试剂盒说明书对总RNA进行反转录, 以反转录产物c D-NA为模板进行PCR, PCR反应体系 (25μL) :灭菌去离子水9.5μL, 上、下游引物各1μL, c DNA 1μL, Taq酶12.5μL。PCR反应条件:94℃预变性5 min;94℃变性30 s, 60℃退火30 s, 72℃延伸45 s, 共35个循环, 72℃再延伸5 min。取PCR产物5μL, 用1%琼脂糖凝胶对扩增产物进行检测, 用胶回收试剂盒回收目的条带, 连接p MD-19T载体, 16℃连接45 min, 转入大肠杆菌DH5α感受态细胞, 筛选阳性克隆, 提取质粒, 送上海英骏生物技术有限公司测序。

1.4 泸宁鸡Myo G基因氨基酸序列分析

将克隆测序所得的序列用DNAMAN软件拼接并将其翻译成氨基酸序列, 用DNAMAN软件将泸宁鸡与其他物种的同源性进行比对, 制作进化树。根据编码的氨基酸序列用在线软件www.expasy.org分析该氨基酸序列的等电点及其分子质量, 在线分析其信号肽序列 (www.cbs.dut.dk/servcs/Signal P/) 。

1.5 泸宁鸡Myo G基因的组织表达差异

按照上述方法从81日龄泸宁鸡的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑组织中提取总RNA, 并进行反转录。根据已克隆获得的泸宁鸡Myo G基因序列, 利用Primer Premier 5.0软件设计PCR引物, 引物序列:F5'-TGACCCTGTGCCCTGAAAGC-3', R 5'-TCGT-TCACCTTCTTCAGCCTCC-3', 产物长度为178 bp。同时根据泸宁鸡β-actin基因设计引物, 引物序列:S 5'-TGTTGACAATGGCTCCGCTAT-3', A 5'-GC-CCATACCAACCATCACACC-3', 产物长度为118 bp。Myo G基因和β-actin基因的PCR反应体系与上述克隆体系相同, PCR反应条件:94℃预变性5 min;94℃变性30 s, 64℃退火30 s, 72℃延伸45 s, 共33个循环, 72℃再延伸5 min。取PCR产物5μL用1%琼脂糖凝胶电泳分离, 用Bio-Rad凝胶成像系统拍照, 对比分析Myo G基因组织的表达差异。

2 结果与分析

2.1 泸宁鸡总RNA的提取

利用TRIzol法提取组织中的总RNA, 提取的腿肌与胸肌的总RNA, 见图1。可分辨出28S、18S较清晰, 5S较浅, 符合RNA完整性的特性。利用分光光度仪测得OD260/280值在1.8~2.0之间, 纯度较高可用于后续试验。

28S表示rRNA;18S表示tRNA;5S表示mRNA。

2.2 泸宁鸡Myo G基因c DNA的克隆

采用RT-PCR技术对泸宁鸡Myo G基因进行扩增, 获得的1条长度为741 bp左右的特异性条带, 通过测序后得到的核苷酸序列提交NCBI, 获得登录号为FJ882411, 得到的核苷酸及推测出的氨基酸序列, 见图2。

2.3 泸宁鸡Myo G氨基酸序列分析

泸宁鸡Myo G基因经测序获得长度为741 bp的序列, 用DNAMAN软件处理得到227个编码氨基酸, 有碱性螺旋环结构域, 见287页彩图3。

经软件分析得到等电点和分子质量分别为5.46和25.84 ku。经分析获得的泸宁鸡Myo G氨基酸组成, 见287页彩图4。丙氨酸 (Ala) 、谷氨酸 (Glu) 、亮氨酸 (Leu) 、脯氨酸 (Pro) 、精氨酸 (Arg) 、丝氨酸 (Ser) 的使用频率分别为7.93%、11.89%、10.57%、7.49%、9.25%、9.25%, 使用频率较高, 而蛋氨酸 (Met) 、色氨酸 (Trp) 的使用频率分别为0.44%、0.88%, 使用频率较低, 其他氨基酸的使用频率则在1.32%~5.73%之间。推测得到的泸宁鸡Myo G基因氨基酸序列与在Gen Bank上登录的禽类及其他动物的氨基酸同源性, 见表1。同时构建了系统进化树, 见图5。泸宁鸡的Myo G基因和禽类的同源性较高, 与人、小鼠、猪、牛的同源性较低。

2.4 泸宁鸡Myo G基因的组织表达差异

试验利用RT-PCR方法对Myo G基因在泸宁鸡各组织中的表达进行分析, 见图6。在泸宁鸡腿肌、胸肌、肝脏、肾脏、脑、脾脏、心脏中均检测到Myo G基因的表达, 在腿肌、胸肌、心脏、脾脏中的表达水平较高, 但在肝脏、肾脏和脑中的表达水平较低。

*表示终止密码子;下画线1~82为碱性氨基酸区域;80~138为螺旋-环-螺旋结构 (b HLH) 域。

%

3 讨论

Myo G基因是W.E.Wright等[3]利用序列同源性筛选的方法从成肌细胞特异性的c DNA文库中分离得到的, 在肌肉生成中起关键作用[11], 因此对泸宁鸡Myo G基因进行研究, 可在泸宁鸡的育种工作中为改善泸宁鸡生长速度和肉质品质研究奠定基础。

研究克隆得到泸宁鸡Myo G基因片段长度为741 bp, 包括684 bp的完整开放阅读框, 共编码227个氨基酸序列, 具有碱性螺旋结构, 该结构为b HLH结构 (2~138位, 其中第2~82位的氨基酸为碱性结构, 第81~138位的氨基酸为螺旋-环-螺旋结构形成的位置, 等电点为5.46, 小于7.0, 为酸性蛋白) 。泸宁鸡Myo G基因编码的氨基酸序列与猪、牛、人、小鼠、原鸡、火鸡、绿头鸭、游隼的同源性为70%~99%。根据进化树分析结果表明, 泸宁鸡与原鸡亲缘关系最近, 与小鼠、人、猪、牛的亲缘关系较远, 这与传统的形态学和生化特征分类的进化地位基本一致, 说明Myo G基因在用于物种间的系统进化关系分析中具有一定的实际意义。同时分析了Myo G基因的氨基酸组成, Ala、Glu、Leu、Pro、Arg、Ser的使用频率较高, 而Met和Trp的使用频率较低, 这与宋兴超等[12]在原鸡中的分析结果相似。信号肽由氨基酸组成, 指导蛋白质的跨膜转移, 经Signal P4.0软件在线分析结果表明, 该基因编码的蛋白质没有信号肽, 说明Myo G基因编码的蛋白质为非分泌型蛋白质。

1.腿肌;2.胸肌;3.肝脏;4.肾脏;5.脑;6.脾脏;7.心脏。

为了进一步研究Myo G基因在泸宁鸡中的功能, 试验利用半定量RT-PCR的方法对其组织表达规律进行检测, 结果表明, Myo G基因在泸宁鸡的腿肌、胸肌、肝脏、肾脏、脑、脾脏、心脏中均有表达, 在肝脏、肾脏和脑中表达水平较低, 但在腿肌、胸肌、心脏中表达水平较高。林亚秋等[13]研究表明, 该基因仅在九龙牦牛的背最长肌中有表达, 在其他组织中均没有检测到表达。D.G.Edmondson等[14]研究表明, Myo G基因在成年小鼠中除了在肌肉组织中表达外, 在其他组织中均不表达 (包括心肌和平滑肌等) 。马海明等[15]研究表明, Myo G基因在脑中没有检测到表达。有研究表明, Myo G基因在鸭胚14天的心脏中有高表达[16]。由此可见, Myo G基因的表达主要集中在肌肉组织中, 同时不同年龄段在各组织中的表达也有差异, 泸宁鸡Myo G基因的表达也具有相似结果。

摘要：为了研究MyoG基因在鸡生长发育与肉质形成中的作用, 试验以泸宁鸡为研究对象, 采用RT-PCR技术克隆MyoG基因序列, 并利用生物信息学的方法对其理化性质、氨基酸同源性等进行预测和分析, 同时采用半定量方法检测MyoG基因在泸宁鸡不同组织中的表达水平。结果表明:泸宁鸡MyoG基因序列长度为741bp, 其中开放阅读框 (ORF) 长度为684 bp, 编码227个氨基酸, 具有碱性螺旋-环-螺旋结构 (bHLH) , 与哺乳动物的同源性为70%71%, 与原鸡、火鸡、绿头鸭、游隼的同源性为91%99%。组织表达谱结果表明, MyoG基因在泸宁鸡腿肌、胸肌、肝脏、肾脏、脑、脾脏、心脏中均有表达, 在腿肌、胸肌、心脏中表达水平较高, 在肝脏、肾脏和脑中表达水平较低, 说明Myo G基因的表达主要集中于肌肉组织。

差异表达基因检测 篇7

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本

野生型虫草菌菌丝体 (Y) :实验室保藏蛹虫草菌种

突变型虫草菌菌丝体 (T) :使用基因移码诱变剂吖啶橙对野生型虫草菌进行诱变、经传代检测而得

1.1.2 主要试剂

RNA提取试剂为GIBCOL公司的Trizol提取试剂, Poly ATtraet@m RNA Isolation SystemsⅢ购自Promega公司, Clontech PCR—Select TM c DNA Subtraction Kit和Adawantage e DNA polymerase购自CLONTECH公司, Dig High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II购自Roche公司, Reverse Transcriptase XL (AMV~XL) 购自大连宝生物公司。PCR扩增片段的回收、克隆分别采用大连宝生物公司的Ta Ka Ra Taq TM、上海生工公司的UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒、p MD18-T Vector进行。PCR引物合成和克隆的测序上海联众生物工程服务有限公司进行。其它生化试剂为进口或国产的分析纯级以上试剂。

1.2 方法

1.2.1 样本处理

诱变:使用哑啶橙对蛹虫草菌丝体进行诱变, 诱变剂的浓度为0.01mg/ml, 处理时间为90s, 致死率在95~98%之间, 依上述条件对虫草菌孢子进行诱变, 得到的诱变株挑到试管斜面保存, 然后进行摇瓶发酵检测发酵液中的虫草素含量。培养条件:改良后的pda培养基, 5%接种量, 温度22摄氏度, 转速150r/min, 时间为7天。使用日本岛津公司的高效液相色谱仪, 大连依利特的Hypersil C18分析柱, SIGMA公司的虫草素标品对诱变株发酵液进行虫草素含量分析, 对高表达虫草素的突变株进行转代培养, 以突变株为原种, 将孢子接种于改良的PDA试管, 待其长出菌丝、产生孢子定为一代, 周期约14天, 连续转代8次, 测定其虫草素表达量。

1.2.2 样本总RNA提取和纯化

采用Trizol试剂提取野生型 (Y) 和突变型 (T) 虫草菌丝体, 具体操作按照Trizol说明书进行。所得总RNA加入400ul Milli-Q水, 至完全溶解, 进行紫外分析测定, 并进行电泳检测。采用QIA-GEN公司的Oligotex m RNA Kits来分离纯化m RNA。

1.2.3 抑制消减杂交 (SSH)

采用PCR-Select c DNA Subtraction Kit (Clontech公司) 试剂盒, 具体方法按照说明书指引进行。分别制备野生型 (Y) 和突变型 (T) 菌丝体的Driver c DNA和Tester c DNA。Driver c DNA的制备, 是将纯化后的m RNA反转录为双链c DNA, 然后用限制性内切酶Rsa I在37℃酶切1.5h, 将双链c DNA酶切大小不等的平末端双链片断;Tester c DNA的制备, 是将由T菌丝体提取纯化的m RNA反转录为双链c DNA, 然后用限制性内切酶Rsa I在37℃酶切1.5h, 将双链c DNA酶切大小不等的平末端双链片断, 然后分成两份, 分别与接头1和接头2链接后制成Tester-1 c DNA和Tester-2 c DNA.2次杂交:第一次杂交用过量酶切后的Driver c DNA分别和连接有接头1和接头2的Driver c DNA进行杂交, 然后将两者混合, 同时再加入新变性的的Driber c DNA进行第二次杂交。2轮抑制性扩增:第一次PCR以第2次杂交产物纯化稀释后作为模板, 用2个接头中的共有序列作为因为进行26个循环;第2次PCR用纯化并稀释后的第一次PCR产物为模板, 用nested primer 1和nested primer 2R进行16个循环, 使差异表达基因得到指数扩增。

1.2.4 消减文库的构建

2次PCR扩增差减文库:将消减杂交实验中第2次PCR产物纯化并溶解, 使用T载体克隆, 具体步骤参照Promega的产品使用说明书。载体用Promega公司的p GEM?-T easy vector, 宿主菌用DH5α。经蓝白斑筛选培养基筛选, 每个文库随机挑取384个白斑克隆;300 rpm, 37℃摇菌过夜;用80%甘油至终浓度为10%, 备份于-70℃.PCR鉴定差减文库的克隆插入片断大小:各取0.2μl菌液作为扩增模板;如下表加入PCR试剂, 混匀:

按以下热循环条件进行扩增:

各取5μl扩增产物用2%的胶电泳检测。

1.2.5 斑点杂交

根据克隆的数目来设计方阵, 根据设计好的方阵点膜, 每个点各取0.6μl PCR产物 (插入片断鉴定PCR产物) 点膜探针的标记与预杂交、杂交及洗膜和放射性自显影均按Dig High Prime DNA Labeling and Detection Starter kit II的说明书进行。

1.2.6 DNA测序及同源序列的比较分析

在正调控c DNA文库里, 根据Ration (W/D指均一化后每个克隆forward probe信号值和reserve probe信号值的比值) 挑选比值由高到低前15个克隆进行测序, 并通过网络提交NCBA进行BLASTN分析。

2 结果与分析

2.1 样本诱变结果与分析

共分析了约1000株突变株, 从三个突变系中中挑选虫草素表达量高的菌株进行保种及稳定性试验。实验数据表明, 这些突变株高表达虫草素是稳定的、可遗传的, 是由于基因的移码突变所产生的变异。

2.2 R N A提取结果与分析

应用紫外分光光度计检测野生型 (Y) 和突变型 (T) 虫草菌丝体总RNA, 结果如下表所示, 两样板的A260/A280均处于1.8~2.0之间。电泳检测结果如图2所示, 28S条带亮度高于18S, 前者约为后者的1.5倍, 表明样品质量符合后继试验的要求。

2.3 c DN A酶切结果与分析

对样品进行酶切的目的是将双链c DNA消化成短的平端c DNA片断, 便于下一步的差减和接头连接。以1%的Agarose电泳检测酶切消化是否彻底, 上样量:第二链c DNA 2.5μl和5μl消化产物, 加φx 174/Hae III-digest marker作对照。结果 (图3) 所示, 样品T和样品Y在1078bp处的c DNA已经被彻底消化, 符合下一步接头连接的需要。

2.4 二次PCR (套式PCR) 结果

如图4所示, 差减组1是以样品T为tester, 样品Y为driver的正调控消减组;消减组2是以样品Y为tester, 样品T为driver的负调控消减组。以差减组1和差减组2的产物作为模板的PCR产物在凝胶电泳上显示的条带, 明显弱于分别以样品T、Y和双接头作为模板的PCR产物, 说明连接效果较好, 抑制差减杂交效率较高。

2.5 斑点杂交结果

将不同的克隆片断分别与Tester和Driver的反转录c DNA探针杂交, 经洗膜、免疫检测、压片、显影与定影后, 将样品T (Tester) 与样品Y (Driver) 的杂交信号进行比较分析, 根据Ration比值的大小, 挑选克隆进行测序, 如图5所示。结果表明, 有的克隆与Tester的c D-NA显示杂交信号, 有的与Driver的c D-NA显示杂交信号说明这些克隆可能来自高丰度表达的基因。

2.6 测序及序列分析

在正调控c DNA文库里, 根据Ration (W/D指均一化后每个克隆forward probe信号值和reserve probe信号值的比值) 挑选比值由高到低前15个克隆进行测序, 得到了6个有意义的序列:

Chc1

chcs2

chcs3

chcs4

chcs5

chcs6

并通过网络提交NCBA进行BLASTN分析, 从结果来看是真菌的里的特有基因, 并且在公共数据库 (genbank) 上尚未发现有类似公开。

3 讨论

抑制性差减杂交 (suppression subtractive hybridization, SSH) 技术是近年来兴起的一种检测差异表达基因的方法, 是1996年Diatchenk等提出的一种新的克隆基因技术, 其基本原理是:先将T (Terest, 检测子) 与D (Driber, 驱逐子) 方c DNA用限制酶切割为小片段, 将T平均分为两份, 分别连接不同的接头, 然后与过量的D方c DNA进行不充分杂交。根据复性动力学原理, 浓度高的单链分子迅速复发, 而浓度低的单链分子仍以单链形式存在。然后混合两份杂交样品, 同时加入新的变性D方c DNA进行第二次扣除杂交, 杂交完全后补平末端, 加入合适引物接头 (接头1与接头2引物) 进行PCR扩增。当DNA两条链含相同接头时, 其PCR扩增受到抑制, 而含不同接头的双链DNA分子才可进行指数扩增, 其产物即为目的片段。此技术避免了消减杂交过程中分离单双链DNA的步骤, 可成千倍地扩增目的片段, 能分离出T方上调表达的基因0。0应该SSH方法可利用个体不同发育阶段的性状, 通过检测其差异表达, 来鉴定一系列与某种功能相关的基因。近年来, SSH技术在分析同种微生物基因组差异中也得到了广泛的应用。

罗智勇等根据4年生人参药用价值高, 而1年生人参无药用价值这个特点, 采用SSHPCR技术, 构建4年和1年生人参根组织m RNA群体间正向消减c DNA文库, 分离出人参皂苷生物合成相关基因。Jang等阳将大麦授粉后5天和14天的果实分别作为驱动子和检测子进行SSHPCR杂交构建c DNA消减文库, 继而在该文库中寻找到钙调蛋白相关基因HvCa BP1。

本研究根据虫草素是一种核苷类抗生素, 是虫草菌次生代谢产物的特性, 通过使用移码诱变剂对北虫草菌株进行诱变, 使得菌株基因产生移码诱变, 从中挑选虫草素表达高的菌株进行稳定性评估。通过转代培养, 确定该菌株高表达虫草素是稳定的、可遗传的, 是由于基因的移码突变所产生的变异。采用抑制消减杂交 (SSH) 技术, 对虫草素表达产生的差异进行基因水平的分析, 以突变型 (高表达虫草素的菌株) 作为检测子, 以野生型 (未作移码诱变处理的出发菌株) 作为驱动子, 经过消减杂交后得到一组正调控基因片段的克隆, 并对该组克隆进行了序列测定。对该组序列进行blast分析, 从结果来看是真菌的里的特有基因, 并且在公共数据库 (genbank) 上尚未发现有类似公开。

差异表达基因检测 篇8

1材料

1. 1试验动物

随机选择吉林省农业科学院畜牧科学分院提供的具有相同遗传背景的6只杜泊 × 小尾羊杂交羊,采集不同组织( 心脏、脾脏、肺脏、肝脏、肾脏、十二指肠、背最长肌、腿部半腱肌) ,液氮急速冷冻, 于-80 ℃冰箱中保存,备用。

1. 2主要试剂

TRIzol、Bio - RT cDNA第1链合成试剂盒、 pMD - 18T载体、SYBR GreenⅠMaster,均购自长春宝泰克生物科技公司。

1. 3主要仪器

Roche Lightcycler 480荧光定量PCR仪,由吉林省农业科学院提供。

2方法

2. 1总RNA的提取

采用TRIzol法提取不同组织中的RNA,并对其完整性和浓度进行检测。

2. 2 cDNA的合成

按照Bio - RT cDNA第1链合成试剂盒说明书进行操作,将RNA转录为cDNA。反应体系( 10 μL) : 5 × RNA逆转录缓冲液2 μL,10 mmol/L dNTP 0. 5 μL,Oligo - dT primer 1 μL,40 U / μL RNase inhibitor 0. 5 μL,AMV Reverse Transcriptase 0. 5 μL, 加RNA、RNase free H2O至总反应体系为10 μL。反转录条件: 42 ℃ 45 min,95 ℃ 5 min,冰浴5 min。 于-20 ℃条件下保存,备用。

2. 3引物的设计与合成

根据已知的绵羊H - FABP基因( GenBank登录号为NM_001267884) 及 β - actin基因( GenBank登录号为NM_001009784) 序列,采用Oligo7. 0软件进行引物设计,引物由上海英骏生物技术有限公司合成,设计的引物和内参序列,见表1。

2. 4 H - FABP基因的标准曲线及熔解曲线

以cDNA为模板进行PCR反应,反应条件: 95 ℃ 5 min; 95 ℃ 30 s,57 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共35个循环; 72 ℃ 7 min。PCR反应产物经1% 琼脂糖凝胶电泳检测后进行胶回收,回收产物连接T载体转化大肠杆菌感受态细胞,并进行质粒提取,作为标准品重组质粒。用超纯水将质粒溶液先稀释10倍,再进行1 × 51,1 ×52,1 × 53,1 × 54,1 × 55的梯度稀释,然后以稀释的不同梯度标准品为模板,与待测样品同时进行实时荧光定量PCR扩增。用Roche Lightcycler 480荧光定量PCR仪自带软件建立双标准曲线。为排除形成引物二聚体及非特异性扩增产物对SYBR Green Ⅰ Real - time PCR结果造成的影响,在PCR反应后进行熔解曲线分析,以确定得到的产物是否为目的产物,95 ℃ 5 s,65 ℃ 1 min,然后温度以5 ℃ /s的速率从65 ℃递增到97 ℃,最后温度降到50 ℃,连续测定样品的荧光强度以获取熔解曲线; 计算各样品的表达量。

2. 5实时荧光定量PCR的反应体系及条件

反应体系(20μL):2×Master Mix(包括Mg2+、dNTP、Buffer、Taq)10μL,10μmol/L上、下游引物各1μL,cDNA模板1μL,加ddH2O补充体积至20μL。

PCR反应条件: 95 ℃ 5 min; 95 ℃ 10 s,57 ℃ 30 s,72 ℃ 20 s,共45个循环。95 ℃ 5 s,65 ℃ 1 min,温度以5 ℃ / s的速率从65 ℃ 递增到97 ℃ ,最后降到50 ℃。

2. 6数据的统计分析

根据荧光定量检测结果,采用Roche Lightcycler 480的相关软件对所得数据进行差异表达分析。

3结果与分析

3. 1总RNA的提取与检测

采用TRIzol法提取不同组织总RNA,经1%琼脂糖凝胶电泳检测,4个样本均可以看到3条清晰的条带,从上到下依次为28S、18S和5S,条带边界清晰, 见图1。经紫外可见分光光度计测定OD260/ OD280值均在1. 8 ~2. 0之间,说明RNA质量完好,无蛋白质和其他杂质污染,可用于下一步试验。

1~4.组织RNA。

3. 2标准曲线的建立

从5个不同浓度的标准品中获得扩增曲线,见图2。在检测的5个数量梯度上,Ct值和起始模板稀释数的相关性良好,H - FABP基因和 β - actin基因标准曲线的斜率分别为- 2. 802,- 3. 195,Error值( 错误值) 均小于0. 2,扩增效率均在2左右,具有很好的线性关系。

3. 3熔解曲线分析

各组样本进行实时荧光定量PCR反应前,绘制熔解曲线,以熔解曲线峰值是否一致来检测引物的特异性,见210页彩图3。

由210页彩图3可知,各样本峰值基本一致,没有杂峰信号出现,扩增产物Tm值非常均一,说明PCR参数选择适当,无非特异性扩增引物,引物特异性较好。

3. 4循环数与荧光强度的关系曲线

应用Roche Lightcycler 480荧光定量PCR仪检测H - FABP基因和 β - actin基因荧光定量扩增结果,并利用相关软件分析结果。H - FABP基因和β - actin基因的扩增曲线,总体看指数期明显,在此期间PCR循环数与起始模板拷贝数成对数关系。相邻浓度标准品的扩增曲线之间的间距比较接近,说明扩增效率高,见210页彩图4。

3. 5 H - FABP基因在不同组织表达量的荧光定量PCR检测

用Roche Lightcycler 480的相关软件对所得数据进行分析,可以直接得出目的基因和内参基因相对表达量的比值,见图5。H - FABP基因在不同组织中表达量不同,从高到低依次为腿部半腱肌、背最长肌、 心脏、肾脏、脾脏、十二指肠、肝脏、肺脏。

4讨论

H - FABP基因可以在许多组织中表达,如心肌组织、骨骼肌、平滑肌、主动脉、肾远端小管、肾脏、肺脏、大脑、胎盘、睾丸、卵巢及泌乳的乳腺细胞等[1]; 但主要是在对脂肪酸有高度需求的组织,如骨骼肌、 心肌和泌乳的乳腺中表达[2 -3]。

乔海云[8]利用荧光定量PCR法检测绵羊H - FABP基因mRNA在不同组织中的相对表达量,结果发现,H - FABP基因在心脏和肌肉中表达量较高,在肝脏、脾脏、肾脏等的表达量次之,肺脏中的表达量最低。本试验结果与乔海云[8]的研究结果基本一致, 但是心脏和肌肉的表达量与乔海云的结果不同,这可能与羊的品种和检测方法有关。 郝称莉等[9]用实时荧光定量PCR法检测湖羊不同部位肌肉H - FABP基因表达水平,结果表明,随着月龄的增加,背最长肌和腰大肌H - FABP基因mRNA的表达模式基本相同,2月龄达最高( P < 0. 01) ,总体呈现上升- 下降- 上升的趋势,而股二头肌H - FABP基因mRNA的表达量无明显变化,同月龄H - FABP基因mRNA的表达量在湖羊不同部位肌肉中有明显差异。

5结论

利用实时荧光定量PCR法检测绵羊H - FABP基因mRNA在不同组织中的相对表达量,结果表明, H - FABP基因在不同组织中表达量不同,在腿部半腱肌中表达量最高,背最长肌和心脏次之,其次为肾脏、脾脏、十二指肠、肝脏、肺脏。

摘要：为了检测心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因在绵羊不同组织的表达差异,试验采用实时荧光定量PCR法检测绵羊H-FABP基因在不同组织中的表达情况。结果表明:H-FABP基因在不同的组织中表达量不同,由高到低依次为腿部半腱肌、背最长肌、心脏、肾脏、脾脏、十二指肠、肝脏、肺脏。

差异表达基因检测 篇9

1 材料与方法

1.1 实验动物

8～10周近交系小鼠,BALB/c 27只,C57BL/69只(广州南方医科大学试验动物中心),体重20～22 g,均为雄性。将动物随机分为2组,同系移植组(n=9)供、受者均为BALB/c小鼠,同种异体移植组(n=9)以BALB/c小鼠为供者,C57BL/6小鼠为受者。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠异位气道移植OB模型的制备

供体BALB/c小鼠水合氯醛腹腔麻醉,切取喉以下至隆突水平气道,立即放于冰盐水纱块内。在相同麻醉条件下,将其异位移植到受者BALB/c或C57BL/6右背部皮下[2]。所有操作均15 min内完成。术后不用免疫抑制剂治疗。术前术后相同条件饲养,每天观察各组小鼠生存状况及存活率。

1.2.2 标本采集及病理检测

分别于术后5、15和25 d随机抽取3只小鼠,切取移植气道,标本以无RNA酶生理盐水冲洗后,将其分成2部分,一部分10%中性甲醛溶液中固定,然后切片,HE染色和病理检测,光镜观察气道上皮丢失或再生,管腔阻塞以及淋巴细胞浸润情况。

1.2.3 芯片杂交与芯片数据生物学分析

标本另一部分迅速用液氮保存,应用TRIzol(Life Technologies,Inc.)抽提第15天的样本总RNA,质检合格后备用。基因表达谱芯片采用深圳微芯公司CSME-80鼠c DNA芯片,其中c DNA文库购自美国国家衰老研究院鼠类c DNA基因文库(NIA mouse c DNA library),加上部分参照基因共有8 064个基因点。分离移植后第15天的样本总RNA中的m RNA,按照同系移植组和同种异体移植组将所得的3个m RNA样本等量混合,a RNA扩增,并反转录为c DNA探针后进行纯化。应用荧光染料Cy5标记同系移植组探针,荧光染料Cy3标记同种异体移植组探针,将标记好的探针等量混匀,与经过预杂交的基因芯片进行杂交。杂交洗片后,利用扫描仪(GenerationⅢarray scanner,Amersham Pharmacia)进行扫描;扫描后将图像转化为基于荧光强度的数字信号(Imagequant 5.0;Array Vision 6.0),随后进行数据分析和处理。阴性和阳性对照用于芯片非特异性杂交信号的强度评估,以内参标准(管家基因)监控实验结果的可靠性,外参标准(酵母基因)则与探针标记过程中外加的相应基因配合,用于监控探针标记以及随后的芯片杂交过程。判定基因差异表达的标准为:大于阴性对照点的平均信号强度加上3倍的阴性对照标准偏差作为2个通道杂交信号均为有效信号的数据,Cy3/Cy5大于2或小于0.5的数据作为有表达变化的基因数据,对仅在一个通道杂交信号有效的数据,则将筛选标准调整为大于3或小于0.33,以减少低信号引起的数据不稳定性。

2 结果

2.1 病理学检查

移植后5 d,上皮轻度破坏丢失,部分与固有层分离,血管充血,黏膜水肿,淋巴细胞浸润。术后15 d呈现早期纤维增殖性变化。术后25 d,上皮完全丢失,管腔几乎被纤维组织完全阻塞,管腔内明显间质细胞浸润,淋巴细胞明显减少。第25天同系移植气道假复层纤毛柱状上皮覆盖几乎全部管腔内壁,黏膜上皮充分修复,管腔无闭塞,无明显细胞浸润。

2.2 芯片杂交分析结果

所有样品总RNA提取没有明显的降解发生,18和28 s条带清晰,样品质量检查结果(A260/A280)正常,经扩增后,符合芯片实验要求。2种样品杂交信号的相关性约为0.86,符合预期要求,见图1。芯片包括部分参照基因共8 064个基因点,结果共有5 694个基因在2个通道的杂交信号均为有效信号,见图2。在OB前期基因表达差异有显著性(上下2倍变化)的基因有1 154个,其中同系移植组相比,同种移植组表达上调的基因有422个,表达下调的基因有732个;而仅在其中1个通道中具有有效杂交信号的基因有1 602个,表达有显著性(上下3倍变化)的基因有495个,其中与同系移植组相比,表达上调的基因有349个,表达下调的基因有146个。从总体的基因表达变化模式来看,与同系移植组相比,同种移植组基因表达变化较明显,存在表达差异的基因数量约占有效数据的23%(1 649/7 296),其中下调基因约占表达差异基因总数量的53%(878/1 649),上调基因约占47%(771/1 649)。附表列出部分显著性上调表达的基因。芯片结果中表达有显著性的基因涉及多种功能类型,包括与细胞生存相关如细胞生长增殖、转录及m RNA剪切,各种物质转运、蛋白合成及蛋白分解,免疫,信号传导通路以及细胞骨架等相关基因类型。

X轴、Y轴分别以Cy3荧光强度值和Cy5荧光强度值为坐标,每一个数据点代表芯片上的一个基因杂交信号

Cy5标记同系移植气道作为对照组,Cy3标记同种异体移植气道作为实验组,分别与芯片杂交后进行双色荧光叠加,对于某一点的两种叠加荧光信号,如果Cy3信号较强,该点多显示绿色(上调);如果Cy5信号较强,该点多显示红色(下调);如果强度相似,即显示黄色

3 讨论

肺移植后OB是一种进行性并通常致命的小气道功能紊乱,临床上称为细支气管炎性闭塞综合征(BOS),表现为渐进性呼吸困难和干咳,肺功能为1秒用力呼气容积(FEV1)和呼气中段流量逐渐减少,免疫抑制只能减缓发展速度。其病理生理学改变极其复杂,可能是同种异体免疫性或非免疫性损伤导致趋化性细胞因子释放和T细胞激活,招募成纤维细胞在管腔内增生所致。研究表明小鼠气道异位移植通常经历3个阶段[3]:缺血期,术后2～3 d,上皮坏死丢失,血管充血,黏膜水肿;淋巴细胞浸润期,发生在7 d左右,主要集中在再生上皮,属于典型的淋巴细胞性支气管炎性排斥;纤维性阻塞期,14 d上皮完全丢失,28 d气道近乎完全闭塞,纤维组织阻塞管腔,称为闭塞性气道疾病(OAD)。这些过程不是单个基因突变及调控所致,而是多个基因在不同时空背景下相互作用、相互影响的结果。采用基因芯片的方法对肺移植后慢性排斥反应的相关基因进行高通量研究,在国内外鲜见报道。

本结果显示,小鼠异位气道移植OB病变形成前期移植气道的基因差异表达,存在多个功能类型的基因表达。其中涉及免疫相关基因,如下调NF-κB表达、抑制细胞凋亡的保护性基因血红素加氧酶-1,增强白细胞介素促进淋巴细胞前体细胞增殖、分化的前B淋巴细胞集落增强因子、γ干扰素诱导GTP酶基因2、CCR4等;泛素蛋白酶体通路相关基因,如泛素C、泛素特异性蛋白酶42;细胞信号转导通路相关基因,如高迁移率族蛋白20等;而表达差异的基因主要涉及到与细胞生存相关的各类基因,包括细胞生长增殖、转录及m RNA剪切、各种物质转运、蛋白合成及蛋白分解等相关基因,如转化生长因子β1,胰岛素样生长因子2,整合素α5(纤连蛋白受体α),通过重组细胞骨架肌动蛋白来调控细胞的形状及其粘附、迁移、增殖的RhoGTP酶Cdc42等。这些基因分类与心脏、肾移植慢性移植物血管病基因芯片研究的结果大致相同。

进一步分析术后15d表达差异的基因,笔者发现,显著差异表达基因主要与细胞生存相关,免疫性因素相对较少,也进一步证实OB中T细胞的激活是少见的,同时验证临床肺移植单纯通过强化免疫抑制方案控制OB进展是非常困难的现实。因此推测:肺移植OB的治疗策略应该由加强免疫抑制和抗炎治疗为主转变为抑制肌纤维母细胞分化和组织重构为主,其中的主要效应细胞不再是淋巴细胞或巨噬细胞,而应是肌纤维母细胞。本实验中,TGF-β1表达明显上调。在实体器官移植的慢性排斥反应中,TGF-β1对纤维母细胞有趋化吸附、增殖效能并刺激胶原生成,与组织重构关系密切。大量肺移植气道活检证实TGF-β1表达与BOS高度相关,能提前6～18个月预测BOS发生,可以作为预测BOS发生的早期标志物。OB模型研究证实,TGF-β靶向药物Pirfenidone在早期纤维增殖阶段明显减轻细胞外基质过度沉积和管腔闭塞。有作者研究表明,肌纤维母细胞在实验性OB病理进程中至关重要,TGF-β1主要通过激活Smad3依赖性信号传导途径以及MAPKs次要途径来促使纤维母细胞向肌纤维母细胞的转化和α-SMA蛋白的增加,最终导致OB的发展[4,5]。此外,研究发现,TGF-β激活上皮细胞产生促纤维增殖介质,还诱导上皮-基质转换(EMT)。因此阻断TGF-β信号转导途径,可能对治疗闭塞性细支气管炎有极其重要的意义。另外,其他如促进细胞迁移启动调节的关键分子RhoGTP酶显著表达[6],研究发现,抑制RhoGTP酶能显著控制心脏移植物血管病变。

本研究与LANDE的研究比较,有部分结果一致,但各自也发现大量不同的基因[7]。笔者认为,这与不同的研究方法,可能更主要与肺移植OB生物学改变的复杂性密切有关[7]。在上调表达的基因中,有促进排斥反应发生及发展的,也有保护性基因的表达。有免疫相关的,但更多的是与细胞生存相关的,说明OB是一个多阶段、动态的不平衡的过程,最终导致移植物失功。更重要的是,本实验结果提示针对肺移植OB患者肌纤维母细胞的治疗策略有望改善目前OB一旦发生难以逆转的现实。尚需进一步验证实验、更加准确反应临床肺移植慢性排斥反应的动物模型以及临床实验证实。

参考文献

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[3]BOEMER A,CHAMBERLAIN D,KESTEB S,et al.Lymphocytic airway infiltration as a precursor to fibrous obliteration in a rat model of bronchiolitis obliterans[J].Transplantation,1997,64:311-317.

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[6]HATTORI T,SHIMOKAWA H,HIGASHI M,et al.Long-term treatment with a specific Rho-kinase inhibitor suppresses cardiac allograft vasculopathy in mice[J].Circ Res,2004,94(1):46-52.

差异表达基因检测 篇10

1 材料

选取饲养管理条件一致的12只4月龄公羊,包括萨福克羊、湖羊、哈萨克羊和中国美利奴羊(新疆军垦型)各3只,分别屠宰,采集心脏、体侧部皮肤(以下简称皮肤)、肝脏、肺脏、肾脏、小肠、脾脏、小脑组织,同时采集1.5 m L颈静脉外周血,分离白细胞,组织及白细胞快速于液氮中速冻后,再转至-70℃超低温冰箱保存,备用。

2 方法

2.1 引物的设计

以3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)作为持家基因,GAPDH引物参考杨华等[6]报道的序列设计。MBL基因引物设计参照c DNA序列(Gen Bank登录号FJ977629)用Primer Premier 5.0软件设计,GAPDH和MBL基因引物序列见表1,引物由上海立菲生物技术有限公司合成。

2.2 总RNA的提取

取-70℃保存的组织各50 mg及白细胞样品,进行总RNA的提取[操作步骤参考TRIzol(invitrogen公司)说明书进行],应用微量分光光度计测定总RNA的浓度,用1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。

2.3 c DNA的反转录合成

应用北京全式金生物技术有限公司Transcript All-in-One First-Strand c DNA Synthesis Super Mix for q PCR(One-Step g DNA Removal)反转录试剂盒,参照试剂盒说明书操作,合成c DNA第一条链,其体系为总RNA 2μL,5×Trans Script All-in-One Super Mix for q PCR 4μL,g DNA Remover 1μL,用RNase free d H2O补至20μL,轻轻混匀,42℃15 min,85℃5 s失活Trans Script RTase和g DNA Remover。

2.4 PCR产物的鉴定及测序

PCR反应体系(25μL):RNase free d H2O8.5μL,c DNA模板2μL,2×Easy Taq PCR Super Mix12.5μL,上、下游引物(10μmol/L)各1μL。PCR反应条件:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,合适的温度退火30 s,72℃延伸30 s,共35个循环;72℃延伸5 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测后,送上海立菲生物技术有限公司测序。用DNAMAN6.0软件及BLAST在线软件(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对测序结果进行同源性分析。

2.5 荧光定量PCR

以反转录产物为模板,分别用MBL和GAPDH基因的引物进行荧光定量PCR扩增。荧光定量试剂为Ta KaRa公司生产的SYBR Premix EX TaqTMⅡ(TliRNase H Plus),反应体系(20μL)为:dd H2O6.4μL,引物各0.8μL,SYBR Premix Ex TaqⅡ(TliR-Nase H plus)10μL,c DNA模板2μL,按照Roche Light Cycler480实时荧光定量PCR仪操作。反应程序为:95℃预变性10 min;95℃变性10 s,合适的温度退火10 s,72℃延伸10 s,共45个循环;72℃延伸5 min。同时进行熔解曲线分析。每个组织样品检测做3次平行试验,取其平均值进行计算,并在每批次试验中设阴性对照,记录各样品的Ct值。

2.6 数据的统计与分析

绵羊MBL基因相对表达量采用2-△△Ct方法处理数据,分析基因相对表达差异量(△Ct=Ct目的基因-Ct内参基因),用SPSS19.0(IBM)进行显著性分析。

3 结果与分析

3.1 总RNA的提取结果

取3μL总RNA进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,可见清晰的28S和18S条带(见图1)。经核酸蛋白分析仪检测,各总RNA的OD260/OD280比值均在1.8以上,证明提取的RNA完整性和纯度较好,可用于下一步c DNA的合成。

1~6.总RNA。

3.2 MBL和GAPDH基因的PCR扩增结果

以绵羊c DNA为模板,以MBL和GAPDH基因引物分别进行PCR扩增,PCR产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳检测,基因片段长度分别为198 bp和149 bp(见图2、图3),与预期结果一致。

MBL和GAPDH基因的PCR扩增产物经测序,应用DNAMAN6.0及BLAST在线分析软件对测序结果进行同源性分析,结果表明:MBL基因PCR扩增产物与绵羊MBL mRNA序列(XM-012170129.1)同源性达到99%,期望值为3e-60;GAPDH基因PCR扩增产物与绵羊GAPDH基因mRNA序列(AF030943.1)同源性达到96%,期望值为3e-43。说明PCR扩增产物分别为MBL基因和GAPDH基因。

M.p UC19 DNA/MspⅠ(HpaⅡ)Marker;1~3.MBL基因PCR产物;4.空白对照。

M.p UC19 DNA/MspⅠ(HpaⅡ)Marker;1~3.GAPDH基因PCR产物;4.空白对照。

3.3 扩增曲线和熔解曲线分析

实时荧光定量PCR扩增曲线分析结果表明,扩增产物的S型曲线都很清楚,检测到的荧光信号峰值较高,目的基因MBL和持家基因GAPDH的指数扩增期和平台期明显,线性范围广,MBL基因从25~37个循环可检测出(见图4),GAPDH基因从19~31个循环可检测出(见图5),表现为较为完整的扩增曲线。熔解曲线分析表明,熔解曲线呈单峰,说明扩增产物单一,荧光强度均来源于特异性的扩增产物,没有产生非特异性扩增及引物二聚体,扩增产物特异性良好,结果具有很好的代表性。

3.4 MBL基因在绵羊不同组织中的表达分析

见图6。

由图6可见,MBL基因在绵羊8个组织及血液白细胞中均有表达,但其表达量存在差异,其中肝脏中表达量最高,肺脏和脾脏中表达量次之,心脏和小肠中表达量最低,表明MBL基因在肝脏、脾脏和肺脏中呈高丰度表达,提示这可能与绵羊的新陈代谢以及免疫功能有关。

3.5 MBL基因在不同绵羊品种肝脏中的表达差异

MBL基因在绵羊不同组织中的表达分析结果(见图6)表明,肝脏中MBL基因表达量最高,因此,选用肝脏作为分析MBL基因在绵羊品种间表达差异的靶器官。结果表明,MBL基因在4个绵羊品种肝脏组织中均有表达,其中哈萨克羊中的表达量最高,中国美利奴羊(新疆军垦型)表达量次之,萨福克羊和湖羊中的表达量最低(见图7),提示MBL基因的表达量与绵羊的品种有关。

注:柱图肩标不同字母表示差异显著(P<0.05),含有相同字母表示差异不显著(P>0.05)。

注:柱图肩标不同字母表示差异显著(P<0.05),含有相同字母表示差异不显著(P>0.05)。

4 讨论

MBL是人和动物体内最重要的天然抗感染免疫分子,由肝脏合成后分泌到血液中,在抗原抗体发生特异性免疫反应之前,诱导、激活机体的免疫反应[7]。大多数哺乳动物有两种MBL形式,分别由MBL1编码和MBL2基因编码[8,9]。人MBL基因定位于10号染色体长臂(10q11.2~q21),人、黑猩猩和鸡的MBL1为假基因(MBLl Pl)[10],只有MBL2基因编码蛋白质产物,MBL2的蛋白质编码区是由4个外显子和3个内含子组成的,启动子序列包含几个被认为是调节绝大多数基因表达的共识因子[11]。大鼠、小鼠、兔、牛、猪和恒河猴具有2种形式的MBL,即血清型(MBL.A)和肝型(MBL.C),马只发现MBL.C型蛋白[12,13]。针对绵羊MBL基因的研究多集中在其多态性方面,MBL多态性与多种疾病存在相关性。徐燕辉[14]的研究表明,绵羊MBL基因多态性与绵羊支原体肺炎有一定相关性,而对于MBL基因表达特征研究较少。

本试验通过实时定量PCR技术分析了MBL基因在肝脏、肺脏、肾脏、脾脏、心脏、小肠、小脑、体侧部皮肤8种绵羊组织及白细胞中的相对表达情况,结果表明其在肝脏、脾脏和肺脏中呈高丰度表达,提示这可能与绵羊的新陈代谢、免疫功能及支原体肺炎易感性有关。B.N.Lillie等[15]研究表明,MBL由肝脏合成后分泌到血液中,在抗原抗体发生特异性免疫反应之前,诱导、激活机体的免疫反应。本研究结果也验证了MBL基因的功能,进一步说明MBL主要在肝脏中表达,其由肝脏合成后分泌到血液中,参与机体的免疫反应,参与绵羊的免疫功能,进而影响绵羊的抗病力。