枯草杆菌纳豆激酶基因在大肠杆菌中的优化高效表达

枯草杆菌纳豆激酶基因在大肠杆菌中的优化高效表达（共6篇）

枯草杆菌纳豆激酶基因在大肠杆菌中的优化高效表达 篇1

pfl-act基因在大肠杆菌中的高效表达及其纯化

丙酮酸甲酸裂解酶是肠道细菌在厌氧代谢中十分关键的酶,丙酮酸甲酸裂解酶激活因子(pyruvate formate lyase activator,PFL-A)在功能上具有重要的作用.为进一步研究PFL-A的`激活机理,以大肠杆菌K-12的基因组为模板,通过GenBank上公布的序列设计引物,扩增出目的基因,克隆到pMD18-T载体,经测序,所扩增出的基因与pfl-act基因具有99%的同源性.将pfl-act连接到高效表达载体pET-22b(+)中,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导,结果发现,pfl-act以包涵体形式表达.改变诱导剂、诱导剂量或培养温度,对包涵体的形成均没有明显的影响.

作 者：杨登峰 韦宇拓 黄志明 周兴 黄日波 YANG Deng-feng WEI Yu-tuo HUANG Zhi-ming ZHOU Xing HUANG Ri-bo 作者单位：杨登峰,黄志明,周兴,YANG Deng-feng,HUANG Zhi-ming,ZHOU Xing(广西科学院,广西,南宁,530003)

韦宇拓,黄日波,WEI Yu-tuo,HUANG Ri-bo(广西大学,生命科学与技术学院,广西,南宁,530005;广西亚热带生物资源保护利用重点实验室,广西,南宁,530005)

刊 名：广西农业生物科学 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF GUANGXI AGRICULTURAL AND BIOLOGICAL SCIENCE年，卷(期)：25(4)分类号：Q782关键词：丙酮酸甲酸裂解酶激活因子 包涵体 高效表达

枯草杆菌纳豆激酶基因在大肠杆菌中的优化高效表达 篇2

疏棉状嗜热丝孢菌是一种嗜热真菌,产生的木聚糖酶在高温和碱性条件稳定,降解产物中单糖含量很少[3]。该酶在原产菌中的表达需要木糖等诱导剂,但是嗜热真菌培养比较困难,产酶周期长且酶系复杂。在原核系统中重组表达的产量很低,不能满足应用要求[4]。该试验尝试采用大肠杆菌中的优势密码子,以引物拼接的方式合成基因,利用p ET-20b载体在16℃下实现木聚糖酶在大肠杆菌中高效表达。

1 材料和方法

1.1 引物设计

根据Genebank中疏棉状嗜热丝孢菌DSM 5826木聚糖酶A基因序列,在不改变氨基酸的前提下使用优势密码子,设计14条引物合成基因xyn A,相邻引物末端有互补区域以利于引物退火延伸(图1)。

1.2 引物片断的拼接

参照美国Promega公司的Altered SitesⅡProtocol的方法,将14条引物混合磷酸化,产物75℃变性后,以大约1℃/min的速度缓慢降温至45℃退火,再迅速降至22℃终止退火。加入DNA聚合酶和连接酶,37℃下延伸和补平。

1.3 目的基因xyn A的克隆

设计上下游引物C1和C2,Eco RⅠ和HindⅢ酶切位点分别为黑体所示:C1:CCCGAATTCATG CAGACCACCCCGA AC;C2:CCCAAGCTTTTAGCCAACGTCAGCAACAG[2]。以拼接产物为模板,Ex-taq DNA聚合酶巢式PCR扩增基因。反应条件:95℃5 min;94℃30 s,57℃30 s,72℃60 s,循环29次;72℃10 min。产物回收后双酶切插入质粒p UC19位点。

1.4 重组表达质粒的构建和表达

以测序正确的质粒p UC19-xyn A为模板,设计合成引物C3和C4(黑体所示分别为NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点):C3:CCCCATATGCAGACCACCCCGAAC;C4:CCCCTCGAGTTA GCCAACGTCAGCA ACAG,以Probest DNA聚合酶进行扩增,条件同1.3。产物回收后双酶切插入质粒p ET-20b相应位点。将重组质粒p ET-20b-xyn A转入大肠杆菌JM109,接种于含100μg/m L氨苄青霉素的LB培养液中,37℃振荡过夜后转接培养至OD600达0.6,加入IPTG至终浓度0.8 mol/L,分别在37、16℃下继续培养12 h,每隔2 h收集菌液。

1.5 酶活测定

木聚糖酶活性的测定是以燕麦木聚糖为底物,利用对羟基苯甲酸酰肼(PAHBAH)与水解反应产生的还原糖的显色反应进行比色[2,5]。

2 结果与分析

2.1 基因的合成及重组表达质粒的构建

巢氏PCR法扩增出588 bp的片断(图2a),与设计基因序列一致。以p UC19-xyn A为模板PCR获得目的基因,构建重组表达质粒p ET-20b-xyn A,酶切结果与预期一致(图2b)。

2.2 木聚糖酶在大肠杆菌中的重组表达

重组表达质粒转化大肠杆菌JM109,37℃诱导2 h酶活达到最大值3.99 U/m L,其后逐渐下降,菌液浓度在诱导4 h时达到最大值;16℃诱导10 h酶活性达到最大值42.05 U/m L,菌液浓度缓慢增大,12 h达到最大值(图3)。

注:a为巢氏PCR结果,1为DL2000标样,2为PCR产物;b为重组质粒结果,1为DL2000标样,2为NdeⅠ和XhoⅠ酶切产物,3为单酶切产物,4为λ-Eco T14Ⅰdigest DNA marker。

注:重组菌诱导后分别在37℃和16℃下振荡培养12 h,每隔2 h取样,检测酶活和细胞浓度。

收集诱导10 h时菌液破碎细胞,SDS-PAGE结果表明,重组菌产生约23 k Da的特异条带,与预期蛋白相对分子量一致[2]。16℃诱导产生的重组酶在全细胞总蛋白中占比47%,比例比37℃诱导时高,但多数重组酶以不溶性的形式存在,复性处理可以重新检测到木聚糖酶活性(图4)。

2.3 重组木聚糖酶的酶活性质

粗酶在60℃稳定性很高,温育6 h后仍有80%的相对活性,70℃下失活很快。在60℃下温育30 min,粗酶在p H值5.0~8.0的范围内均比较稳定,相对活性均保持在80%以上,在p H值4.5以下的环境很不稳定[2]。水解木聚糖的产物主要为木二糖、木三糖、木四糖以及其他聚合度的低聚糖[2],没有木糖,说明酶的水解方式没有变化。

3 讨论

外源基因在大肠杆菌中表达水平受多因素影响,如启动子、载体、基因的高级结构及密码子偏好等。产自疏棉状嗜热丝孢菌的木聚糖酶A的成熟蛋白共有196个氨基酸,其中31个氨基酸是由大肠杆菌中稀有密码子编码,前10个氨基酸中4个由稀有密码子编码,此外,R58是由最稀有的密码子AGA编码,AGA已经被证明会阻碍蛋白正常表达[2,6];L105和R117分别由CUA和CGA编码,是大肠杆菌中第二稀有密码子对[2]。为避免密码子偏好影响木聚糖酶重组表达,该研究通过基因合成改造木聚糖酶A基因序列。

注:1为蛋白分子量标准;2为JM109(p ET-20b)诱导总蛋白;3为重组菌(p ET-20b-xyn A)37℃诱导上清蛋白;4为重组菌37℃诱导总蛋白;5为重组菌16℃诱导上清蛋白;6为重组菌16℃诱导总蛋白。

该研究实现了重组酶的高水平表达,但多数以包涵体的形式表达,仅有部分有活性。已有多种方法解决蛋白过量表达时出现的包涵体问题,包括共表达分子伴侣、降低表达温度、分泌到胞外培养基或周质空间等[7]。研究发现,16℃下酶蛋白表达水平和酶活性均有较大提高,可能是较低温度下酶稳定性更好,仍有多数酶蛋白以包涵体形式存在。研究认为包涵体形成可能是该木聚糖酶自身氨基酸序列的缘故,折叠时不能迅速被大肠杆菌识别,导致翻译的多肽链集聚形成包涵体。有研究报道,氨基酸突变能增加重组蛋白的可溶性[8],后续研究可在这方面进行尝试。

参考文献

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枯草杆菌纳豆激酶基因在大肠杆菌中的优化高效表达 篇3

采用大肠杆菌与枯草杆菌的穿梭质粒pMK4作为载体,构建了含有果聚糖酶基因(sacB)启动子和vgb基因的重组质粒pMK-SV.通过原生质体和电转化,将pMK-SV转入苏云金杆菌中,经影印筛选得到转化子Bt4.对Bt4诱导表达,与原菌株相比Bt4的生长量增加了20.2%.

作 者：周艳芬 赵晓瑜 张玉 冯书亮 王容燕 ZHOU Yan-fen ZHAO Xiao-yu ZHANG Yu FENG Shu-liang WANG Rong-yan 作者单位：周艳芬,ZHOU Yan-fen(河北农业大学,生命科学学院,河北,保定,071001;河北大学,生命科学学院,河北,保定,071002)

赵晓瑜,张玉,ZHAO Xiao-yu,ZHANG Yu(河北大学,生命科学学院,河北,保定,071002)

冯书亮,王容燕,FENG Shu-liang,WANG Rong-yan(河北省农林科学院,植物保护研究所,河北,保定,071000)

枯草杆菌纳豆激酶基因在大肠杆菌中的优化高效表达 篇4

以大肠杆菌BL21染色体DNA为模板,根据glgC基因的全序列设计了1对引物,在优化的.PCR反应条件下扩增出了glgC基因片段,测序结果显示该片段大小为1 296 bp,编码432个氨基酸残基.将该基因克隆到原核表达载体pET-28a-c(+)中,重组载体pET-glgC转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳鉴定,得到了与理论推算的glgC基因表达产物分子质量(约53 kD)相符的特异蛋白条带.

作 者：贾笑英 张金文 王蒂 JIA Xiao-ying ZHANG Jin-wen WANG Di 作者单位：贾笑英,JIA Xiao-ying(甘肃农业大学,农学院,兰州,730070)

张金文,王蒂,ZHANG Jin-wen,WANG Di(甘肃农业大学,农学院,兰州,730070;甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室,兰州,730070)

枯草杆菌纳豆激酶基因在大肠杆菌中的优化高效表达 篇5

水稻作为我国最主要的粮食作物之一，在我国的粮食生产方面长期占据着不可替代的重要作用。现代社会，随着科学技术水平的不断发展，农杆菌介导遗传转化的技术手段在水稻基因工程育种方面已经取得了显著的成效，并对多抗、高产的高品质水稻植株的培育有着十分积极的促进作用，因此有着十分良好的实用前景。

一、农杆菌介导遗传转化的概述

1.农杆菌介导遗传转化的原理

通过对农杆菌分离遗传物质转入植株细胞并再生出相应植株的特性利用，科学性的对农杆菌分离转入遗传物质进行精确的控制，从而达到控制水稻基因表达，提升水稻植株品质的基因工程目的。

2.农杆菌介导遗传转化的影响因素

(1)农杆菌菌株。不同种类的农杆菌菌株对于水稻基因工程育种的试验结果有着不同的影响，通过大量试验研究l现，农杆菌菌株LBA4404的基因转化效率最高，而农杆菌菌株EHA105则对提升水稻愈伤转化能力最好，通过对不同农杆菌菌株的合理化选择，可以有效的改良水稻植株的品质，提高水稻产品的产量。

(2)受体材料因素。水稻稻种受体材料的来源、发育情况等方面对农杆菌菌株的介导敏感性都有着一定的影响。试验结果表明，粳稻品种的稻种在试验过程中的转化成功率及转化频率较籼稻品种的稻种更高，而籼稻品种的稻种则在愈伤组织的形成、分化、成苗等方面的转化都很困难，因此不适用于基因工程的育种。

(3)培养基成分因素。培养基成分对于水稻稻种对农杆菌菌株敏感程度的提高有着十分重要的促进作用。实验研究表明，乙酰丁香酮、枪击乙酰丁香酮等成分对于水稻稻种基因工程转化的促进作用较强。另一方面，一些小分子的糖类对水稻作物的基因转化也有着一定的促进作用，因此在培养基内适当的添加进一些小分子糖类对于提升农杆菌菌株对水稻稻种的转化也有着一定的积极作用。

3.农杆菌介导遗传转化的优势

与其它遗传转化技术手段相比，农杆菌介导遗传转化的技术手段在水稻基因工程育种的研究中具有成功率高、经济可行、转化机理清楚稳定、转化质量明显、可人为控制等多方面的优点，因而在水稻基因工程育种中得到了较为广泛的应用。通过农杆菌介导遗传转化在水稻基因工程育种中的`应用，不仅有效的改良了水稻植株的品质，提高了水稻产品的产量，同时提高了水稻种植的环境效益，对农田生态系统的生态环境起到了一定的保护作用。

二、农杆菌介导遗传转化在水稻基因工程育种中的应用

1.抗虫基因工程育种。长期以来，由于受到水稻的物种限制，因而难以通过简单的杂交方式培育出新型的抗虫水稻品种，从而导致水稻种植只能采用喷洒农药的方式进行防虫，长此以往，不仅对农田生态系统的生态平衡造成了一定损害，同时也在一定程度上提升了水稻种植的成本。通过对农杆菌介导遗传转化在水稻抗虫基因工程育种中的科学性运用，则成功的获得了水稻抗虫植株，提升了水稻种植的经济效益和环境效益。

2.抗病基因工程育种。在水稻的种植过程中，常常会出现白叶枯病、稻瘟病以及纹枯病等危害较为显著的细菌性病害。而通过对农杆菌介导遗传转化技术的应用，则是直接将各类抗病基因直接导入到水稻种苗中去，不断提升水稻植株本身的抗病性，从而达到减少或延迟水稻植株染病发病的最终目的，得到具有良好抗病性且能够稳定遗传的水稻植株，不断提升水稻植株的生态品质。

3.抗逆基因工程育种。当今时代随着现代化科学技术手段的迅猛发展，一些抗非生物胁迫基因已经成功的被奋力克隆，并逐渐应用于水稻品种的抗逆性基因工程改良中去。通过对水稻品种抗逆性的基因改良，不仅在一定程度上增加了水稻植株对于干旱、寒冷以及盐碱土壤的适应性，同时增强了水稻植株对土壤内微量元素的吸收利用能力，有效的提升了水稻的产量。

4.优质基因工程育种。现如今，随着社会经济的不断发展，人们对于水稻品质的要求越来越高，为了满足人们日益增长的物质生活需求，科学家逐渐提出了水稻的优质基因工程育种研究。通过优质基因育种，不仅能够有效的改良水稻植株内直链淀粉与支链淀粉的含量比例，改善水稻的食用品质，同时还能够将其它物种中优良的基因排列整合到水稻基因中去，改善水稻植株内各类鹰眼含量的不足，有效提升水稻植株的整体品质。

5.耐除草剂基因工程育种。水稻的耐除草剂基因工程研究是水稻基因工程研究中设计较早的一个研究领域。通过对水稻耐除草剂基因工程的研究，不仅能够有效的解决稻田内的杂草侵害问题，减轻农民的劳动强度，同时还能在一定程度上提升稻种的基因纯度，开发稻种的杂交潜力。另一方面，对于水稻耐除草剂基因工程育种的研究，还可以增强水稻植株的品质，有利于稻田机械化作业的普及。

6.提升水稻植株光合效率，延缓植株衰老。现如今，随着全球粮食问题的日益严峻，有效提高粮食亩产量已经逐渐成为了现代农业研究的重中之重，而培育出亩产量更高的新品种水稻植株的一条有效途径便是基因工程的技术手段。通过农杆菌介导遗传转化的方式，不仅能够有效提升水稻植株的光合作用能力及效率，同时还可以在一定程度上延缓水稻植株的衰老，为大幅度提升水稻植株亩产量带来了希望。

三、结语

综上所述，农杆菌介遗传导转化在水稻基因工程中的有效应用，不仅实现了传统杂交育种方式所无法达到的优质基因重组，提升了水稻育种的整体水平，同时还在一定程度上改良了水稻作物的品质，提升了水稻植株的亩产量，保证了水稻种植的经济效益与环境效益。因此，从农业发展的角度来看，农杆菌介导遗传转化技术必然会成为今后水稻基因工程育种的主要技术，并在水稻基因工程研究中发挥出越来越大的效用。

参考文献：

[1]于洪兰，肖艳云，魏立军，谢辉，曲丽君，华泽田，关峰，东丽，蔡卓，王成.浅析我国水稻育种的发展趋势[J].园艺与种苗.，08：55-58，62.

[2]马海涛，朱红彩，马朝阳.国内外水稻育种概况及发展趋势[J].种子世界.2014，04：28-30.

枯草杆菌纳豆激酶基因在大肠杆菌中的优化高效表达 篇6

关键词：幽门螺杆菌,融合基因vacA-hpaA,双歧杆菌,大肠杆菌,表达

幽门螺杆菌(helicobacter pylori,Hp)能够引起慢性、活动性胃炎和消化性溃疡,同时它也是胃肿瘤的危险因素,并已被世界卫生组织列为胃癌等肿瘤发生的相关致病菌[1]。Hp在我国普通人群的感染率约为50.0%～80.0%,并仍以每年1.0%～2.0%速度增加[2]。Hp在胃内定植的关键环节是黏附,是感染的先决条件和致病的关键。Hp黏附素基因hpaA(helicobacter pylori adhesin A,hpaA)较保守,为Hp所特有,其编码的蛋白HpaA具有黏膜结合特性[3],并有良好的抗原性和免疫原性[4,5,6]。空泡毒素(vacuolaring cytotoxin A,vac A)可诱导胃上皮细胞发生凋亡,凋亡在Hp致病过程中起着重要作用[7,8]。而且vac A在菌株中的表达率与临床发病率非常相符。因此,构建hpaA-vacA融合基因疫苗对于Hp的防治具有重要意义。

双歧杆菌(bifidobacterium bifidium,Bb)是一种常见的益生菌,该菌具有生物屏障、免疫增强、改善胃肠功能等多种益生功能,利用该菌作为基因工程受体前景不容忽视。与大肠杆菌等宿主相比,双岐杆菌等益生菌作为基因工程受体菌具有特殊的意义:其除能发挥原有的益生功能外,还能发挥外源重组特殊基因的功能。质粒pGEX-1λT同时含有双歧杆菌和大肠杆菌复制起点,作为双歧杆菌-大肠杆菌穿梭质粒,在二者中均可表达。因此,笔者的研究构建了融合基因vac A-hpaA的重组表达质粒pGEXvacA-hpaA,在大肠杆菌中诱导表达,并观察其在双歧杆菌中的表达情况,为Hp活载体疫苗的研制提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种与质粒

两歧双歧杆菌购自武汉大学菌种保存中心;大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT由李文桂教授惠赠;质粒pGE-hpaA-vac A、大肠杆菌BL21由笔者所在实验室保存。

1.1.2 培养基及试剂

质粒提取试剂盒(DP103)、PCR MasterMix试剂盒(KT201)、纯化试剂盒(DP204)、胶回收试剂盒(DP209)、PGM-T连接试剂盒(VT202-01)、DNA分子量标准Marker D2000(MD114)与D15000(MD110)均购自北京天根公司;限制性内切酶BamHⅠ、SalⅠ购自Ta KaRa公司;中分子量蛋白标准购自Fermentas公司;NC膜及HRP标记羊抗兔IgG购自北方同正生物技术公司;幽门螺杆菌兔抗vac A免疫血清和兔抗hpaA免疫血清由笔者所在实验室制备并保存。

1.2 方法

1.2.1 pGEX-hpaA-vacA重组表达质粒的构建与鉴定

以质粒pGE-hpaA-vacA为模板扩增hpaA-vac A基因。(1)引物设计如下:P1为5'-GCGGATCC ATGCATTATTGGGTCAAAG-3',P2:5'-CGGAATTC TTCTTATGCGTTATTTG-3'。P1引入了BamHⅠ的酶切位点,P2引入了SalⅠ的酶切位点。(2)扩增条件:95℃预变性4 min;94℃变性60 s;56℃退火60 s;72℃延伸60 s;30个循环;最后72℃延伸8 min。

1%琼脂糖凝胶电泳观察大小正确后进行胶回收,回收的目的基因片段和质粒pGEX-1λT经BamHⅠ和SalⅠ双酶切,回收酶切片段,T4连接酶试剂盒作用下16℃连接4 h,电转化宿主菌BL21。(1)具体方法:将20μL重组质粒pGEX-vacA-hpaA和80μL BL21感受态细菌混匀,冰浴1 min后转移至电击杯中进行转化。(2)转化参数设置:电压2.5kV,转化时间5 ms;转化次数2次。电击完毕后,在电击杯中迅速加入1 m L LB液体培养基,停留5min。将电击杯中的液体转至1.5 m L Ep管中,37℃、50 r/min培养1 h,涂菌LA(含Amp 100 mg/L)固体培养基。通过LA培养基筛选,双酶切和PCR鉴定获得阳性克隆。挑取阳性克隆接种于LA液体培养基中,大量增菌后,送往上海生工测序。

1.2.2 pGEX-hpaA-vacA在大肠杆菌中的表达及Western blotting分析

挑取阳性克隆接种于LA液体培养基中,在37℃振摇至A600=0.4～0.6。分别在不同的菌浓度起始,以不同浓度的IPTG诱导(不同的时间),收集菌液2 m L进行全菌蛋白的SDS-PAGE和考马斯亮兰染色,通过诱导前后全菌蛋白染色条带的对照,可检出相应分子质量的外源蛋白表达条带并确定最佳诱导条件。将按上述进行的蛋白质表达和SDS-PAGE电泳的凝胶移至硝酸纤维膜上,用5%的脱脂奶粉封闭2 h,PBST震洗3次,分别加入一抗兔抗VcaA血清和兔抗HpaA抗血清作用2 h,震洗3次,再加入二抗羊抗兔IgG作用2 h,震洗后显色。

1.2.3 pGEX-hpaA-vacA在双歧杆菌中的表达和Western blotting分析

(1)Bb电转化感受态细胞的制备[9]:取生长良好的Bb 1 m L加至100 m L含0.5mol/L蔗糖的MRS液体培养基中,37℃厌氧培养24～72 h,冰浴2.5 h,期间摇晃悬浮菌体。4℃5 000r/min离心10 min,弃上清,依次用预冷的10%甘油50、25和10 m L 4℃离心进行洗涤,最后弃上清,加入预冷的10%甘油1.5 m L,充分悬浮菌体,取50μL准备电击转化,剩余感受态细胞-70℃保存。(2)重组质粒pGEX-hpaA-vacA的电转化:取50μL Bb感受态细菌加至含20μL重组质粒pGEX-hpaA-vacA的Ep管,混匀,冰浴1 min后转移至电穿孔杯中进行电转化。参数设置:电压为1.5 kV,转化时间为5ms,转化次数为3次,转化完毕后立刻加入1 m L含0.5 mol/L蔗糖的MRS液体培养基,轻轻移入10 m L培养管中,37℃、100 r/min厌氧培养2 h。将培养管中细菌培养液吸至1.5 m L Ep管,3 000 r/min离心5min,弃大部分上清,将剩余的100μL培养液悬浮,涂于含50μg/m L氨苄青霉素的MRS琼脂平板上,待吸收后置37℃倒置厌氧培养24～72 h。取出培养后的重组菌,用无菌牙签挑单菌落于LA液体培养基中增菌,37℃厌氧培养48～72 h。提取质粒后,PCR扩增hpaA-vacA基因及对重组质粒限制性酶切分析,体系及条件同大肠杆菌重组质粒的鉴定。(3)在双歧杆菌中的表达及Western blotting分析:挑取阳性转化菌单菌落接种于100 m L MRS液体培养基中,厌氧培养48 h后收获菌体,菌体破壁后进行SDS-PAGE电泳分析表达产物,观察表达条带并用Western blotting分析鉴定重组蛋白,步骤同大肠杆菌。

2 结果

2.1 p GEX-hpaA-vacA重组表达质粒的构建及酶切鉴定

hpaA-vacA片断全长1 548 bp,其PCR结果见图1。重组质粒pGEX-vacA-hpaA经PCR和双酶切鉴定结果见图2。测序结果与预计相符。

2.2 p GEX-hpaA-vacA在大肠杆菌中的表达及Western blotting分析

重组蛋白的优化条件为:IPTG终浓度为0.1mmol/L,诱导时间为4 h,其全菌蛋白的SDS-PAGE图谱见图3,在相对分子量约85 000处可见明显的外源蛋白表达带,与预计相符。经薄层扫描分析可溶性表达占全菌蛋白的20.5%。经Western blotting分析,能分别与兔抗VcaA血清和兔抗HpaA抗血清作用而免疫着色见图4,说明重组融合蛋白兼具有2种单独蛋白的免疫活性。

2.3 p GEX-hpaA-vacA

在双歧杆菌中的表达和Western blotting分析

重组质粒在双歧杆菌也能得到正确表达,但产量不高,约占细菌总蛋白的8.5%,见图5。经Western blotting分析,能与兔抗HpaA血清作用而免疫着色见图5。

3 讨论

大肠杆菌表达系统之所以成为常用的外源蛋白表达系统,主要因为大肠杆菌遗传背景清楚,能大规模发酵培养及大量可供选择利用的克隆与高效表达载体,使之成为人们克隆与表达外源基因的首选菌株。而利用双歧杆菌进行表达研究较少,双歧杆菌的结构、遗传特征等均研究的不是很透彻,虽然国内外已有一些相关研究,但仍不能像大肠杆菌一样广泛和常用。李宁军等[10]在双歧杆菌中表达报告基因乳酸脱氢酶基因(LDH),云雪霞等[11]在双歧杆菌中表达霍乱毒素B亚单位CTB,从而证明了双歧杆菌表达系统的可行性,但均显示表达产量不高。

为了将外源性DNA有效地引入双歧杆菌,需要构建大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达载体。笔者研究所采用的大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT含有双歧杆菌复制起点、大肠杆菌复制起点、一个多克隆位点和一个氨苄青霉素抗性基因。上游有一个启动子Ptac(trp操纵子启动子与lac操纵子启动子的融合启动子),在IPTG诱导下表达。这种穿梭载体可允许外源性DNA在大肠杆菌中操作,鉴定正确后再转化入双歧杆菌,通过自动复制或同源整合与基因组进行基因交换,从而在双歧杆菌中稳定表达外源性基因[9]。