大肠杆菌疫苗（共10篇）
大肠杆菌疫苗 篇1
鸡致病性大肠杆菌的血清型很多[1], 不同地区和鸡场的血清型不尽相同, 往往造成单价灭活苗免疫失败, 而各地区最常见的血清型只有几个, 称之为地区优势血清型[2], 因此选用当地或本场有代表性的优势血清型菌株, 制备多价大肠杆菌病的灭活苗成为近年来研究的热点[3]。常见疫苗包括用20%氢氧化铝胶作为佐剂的铝胶灭活苗、用蜂胶作为佐剂的蜂胶灭活疫苗和用矿物油作为佐剂的油乳剂灭活疫苗[4]。在我国已有多种具有代表意义的多价大肠杆菌病的灭活苗获得理想效果, 张国安等[5]利用地方优势血清型O111、O89、O78、O80、O30 中抗原性良好菌株研制出多价油乳灭活苗, 获得的免疫期长达6个月, 对大剂量强毒攻击的保护率平均达91.67% 。梁国芳等[6]将本地5 个代表菌株和引进的3个标准菌株混合, 以蜂胶为佐剂, 经甲醛灭活 (蜂胶用乙醇纯化) 制成 E.coli 多价蜂胶灭活苗, 3个月攻毒保护率为100%, 6个月为70%。即使如此, 这些菌体灭活苗还远不能抵抗我国复杂的鸡大肠杆菌病发生。为了解决生产实践中出现的难题, 寻求解决许昌地区防治鸡大肠杆菌病的有效方法, 试验以许昌地区流行的具有致病性的O5、O54和O78 3种优势血清型菌株为制苗菌株, 以蜂胶为佐剂, 研制出现地多价蜂胶灭活疫苗, 经实验室检测和田间试验收到了较为满意的效果, 现报道如下。.
1 材料
1.1 菌种
从许昌地区市郊、魏都区、许昌县等地的商品肉鸡场、蛋鸡场送检的材料中分离得到20株大肠杆菌。经致病性试验和抗原性测定[7], 筛选出3株毒力强、抗原性良好、具有优势血清型的致病性大肠杆菌菌株O5、O54、O78, 将其混合作为制苗种子。
1.2 培养基及蜂胶
种子用培养基为麦康凯琼脂及马丁肉汤, 扩大培养基为普通营养琼脂, 均按照参考文献[7]中的方法配制。
蜂胶, 购自中国农业科学院蜜蜂研究所, 于4 ℃以下冰箱中保存, 用前在4～8 ℃条件下粉碎, 过筛, 按1∶4的比例加入95%乙醇, 室温浸泡24～48 h, 冷却, 过滤或离心取上清液, 即得粟色纯净蜂胶。除去干渣计算出浸液中的蜂胶, 浸液置于4 ℃以下冰箱保存, 备用。
1.3 试验鸡
非免疫鸡, 由安阳工学院生物与食品工程学院动物医学兽医预防实验室的非免疫种蛋自行孵化, 根据试验需要饲养至所需日龄。
1.4 主要仪器
高压灭菌锅 (型号为LD-ZX-30KBS) , 上海仕元科学器材有限公司生产;生化培养箱 (型号为SPX-5) , 上海基玮试验仪器设备有限公司生产;双人双面净化工作台 (型号为SW-CJ-2F) , 由苏州净化设备有限公司生产。
2 方法
2.1 菌液的制备
将各菌株分别接种于马丁肉汤中, 37 ℃培养24 h;然后划线接种于麦康凯琼脂培养基, 选择呈粉红色、隆起、表面光滑的10个典型菌落, 再接种于马丁肉汤中;37 ℃培养18～24 h, 纯粹检验后作为种子;将种子液接种于普通营养琼脂培养基, 37 ℃培养18 h后置室温条件下用灭菌生理盐水浸泡5～8 min;刮下菌苔, 再用灭菌纱布过滤至灭菌瓶中[8]。
2.2 纯粹检验
取上述各菌株的细菌悬液少许, 分别接种于麦康凯琼脂培养基, 取菌落涂片、染色后镜检, 进行细菌纯度检验, 应纯粹无杂菌。
2.3 活菌计数
在无菌条件下操作, 分别取上述各菌悬液1 mL, 进行10倍递增稀释, 按常规方法进行活菌计数, 使各菌株菌悬液活菌含量不低于100亿cfu/mL[9]。
2.4 灭活及其检验
在活菌计数的基础上, 将O78、O54、O5按4∶3∶2的比例混合, 加入0.3%甲醛, 于37 ℃灭活24 h, 其间每隔4 h振摇1次。将灭活24 h的菌液接种于普通琼脂及厌气肉肝汤中, 37 ℃培养48 h, 观察有无细菌生长。
2.5 疫苗的制备
在经检验合格的灭活大肠杆菌混合菌液中, 按照适当比例加入蜂胶提取液[7], 边加边振摇, 即得棕黑色浊状疫苗。该疫苗最终含菌量为100亿cfu/mL, 蜂胶干物质含量为10 mg/mL。
2.6 安全试验
将制备好的疫苗接种于10只7日龄健康易感雏鸡, 1.5 mL/只;另外, 胸肌接种10只120日龄蛋鸡, 2.5 mL/只;观察20 d有无不良反应, 剖杀试验鸡检查注射部位有无异常。
2.7 免疫剂量试验
选50只7日龄健康雏鸡平均分为5组, 1～4组注射疫苗的剂量分别为0.2, 0.25, 0.3, 0.4 mL/只, 第5组不免疫作为对照组。另选50只120日龄非免疫蛋鸡平均分为5组, 1～4组注射疫苗的剂量分别为0.4, 0.5, 0.6, 0.7 mL/只, 第5组不免疫作为对照组。免疫21 d后口服分离菌株攻毒, 雏鸡20亿cfu/只, 蛋鸡30亿cfu/只, 观察期为20 d。
2.8 免疫力产生期与免疫期试验
取60只7日龄雏鸡, 随机均分为2组:第1组 (疫苗组) 颈部皮下疫苗注射0.3 mL/只, 第2组不免疫作为对照组。于免疫后7, 14, 42天, 疫苗组和对照组随机各抽取10只进行攻毒试验, 口服分离菌株20亿cfu/只, 观察期为20 d。另取100只120日龄非免疫蛋鸡随机均分为2组:第1组 (疫苗组) 胸肌注射疫苗0.6 mL/只, 第2组不免疫作为对照组。于免疫后7, 14, 90, 120, 150天, 疫苗组和对照组随机各抽取10只进行攻毒试验, 口服分离菌株30亿cfu/只, 观察期为20 d。
2.9 疫苗田间试验
选择许昌地区鸡饲养集中、数量大, 大肠杆菌病严重的20个鸡场, 其中肉仔鸡场8个, 蛋鸡场12个, 共28万只鸡进行疫苗田间试验。
3 结果
3.1 制苗菌液检验结果
纯粹检验发现菌液纯粹无杂菌;活菌计数各菌株菌悬液活菌含量均高于100亿cfu/mL; 灭活菌液接种培养, 无细菌生长。菌液检验结果符合制苗要求。
3.2 疫苗物理性状检验结果
疫苗为棕黑色混悬液, 黏度低;在4 ℃条件下存放1个月以上, 瓶底部有沉淀现象, 在使用前充分摇匀, 不影响免疫效果。
3.3 疫苗无菌检验结果
经检验, 均无细菌和霉菌生长, 达到了灭菌目的。
3.4 疫苗安全试验结果
注射疫苗后, 雏鸡出现精神萎顿、食欲下降等现象, 1 d后精神、食欲恢复正常;蛋鸡持续2～3 h 精神沉郁, 很快恢复正常, 注射局部无异常, 说明该疫苗使用安全、可靠。
3.5 免疫剂量试验结果
7日龄雏鸡注射0.3 mL/只, 120日龄蛋鸡注射0.6 mL/只, 可获得坚强免疫力。7日龄雏鸡注射量小于0.3 mL/只, 120日龄蛋鸡注射小于0.6 mL/只, 产生的免疫力较弱;7日龄雏鸡注射超过0.3 mL/只, 120日龄蛋鸡注射超过0.6 mL/只, 则可能造成疫苗的浪费。免疫剂量试验结果见表1。在免疫应用过程中要严格按剂量注射。
3.6 免疫力产生期与免疫期试验结果
无论是7日龄雏鸡还是120日龄蛋鸡, 接种疫苗7 d 后就可产生免疫力, 到14天保护率达100%。7日龄雏鸡、120日龄蛋鸡的免疫期均可持续 150 d 以上, 结果见表2。
3.7 疫苗田间试验结果
田间试验结果表明:疫苗注射后, 个别鸡群出现精神沉郁、采食下降等现象, 但很快恢复正常;接种部位无硬结、坏死、肿块现象;免疫过的鸡群生长状况良好, 对蛋鸡产蛋率无影响, 其他疾病的发生率也明显降低, 大肠杆菌病得到有效控制。说明本试验研制的疫苗对预防许昌地区鸡大肠杆菌病安全有效, 可进行推广使用。
4 小结
蜂胶是一种天然物质, 具有抗菌、抗病毒、增强机体免疫功能等作用, 同时具有广泛的生物活性和药理作用。蜂胶制剂易于注射, 吸收快, 注射部位不会出现组织损伤和形成难以消除的硬结, 不会影响胴体品质。肉仔鸡生长周期短, 这一点对肉仔鸡特别重要, 弥补了矿物油佐剂在注射部位出现肉芽肿、硬结, 肉仔鸡出栏前硬结还不消散而影响品质的不足[10]。
经致病性试验和抗原性测定, 试验筛选出3株毒力强、抗原性良好、具有优势血清型的致病性大肠杆菌菌株O5、O54、O78, 将其混合作为制苗种子, 研制出现地多价蜂胶灭活疫苗, 经实验室检测和田间试验能有效抵抗致病性大肠杆菌的攻击, 收到了较为满意的效果。
以前该地区都是从外地购买疫苗, 常因大肠杆菌血清型差异而导致免疫失败。本试验以许昌地区分离出来的大肠杆菌为菌苗, 制成灭活疫苗, 其血清型有很强的针对性, 大大提高疫苗的使用效力, 对防控许昌地区鸡大肠杆菌病具有很强的现实意义。
通过试验建议:肉仔鸡在7～10日龄颈部皮下接种该苗 0.3 mL/只;蛋鸡在1个月龄胸肌首免0.5 mL/只, 在开产前1～2周二免, 以加强免疫力, 剂量为0.6 mL/只。接种疫苗7 d 后就可产生保护力, 到14天保护率达100%, 雏鸡、蛋鸡均可持续 150 d 以上。
疫苗为棕黑色混悬液, 黏度低;在4 ℃条件下存放1个月以上, 瓶底部有沉淀现象, 在使用前充分摇匀, 不影响免疫效果。
参考文献
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大肠杆菌疫苗 篇2
为维护儿童健康，全面落实国家消除麻疹行动计划、降低乙肝发病率。根据《中华人民共和国传染病防治法》、《安徽省预防接种管理条例》等有关卫生法律法规，认真贯彻落实国家卫生部《—2012年全国消除麻疹行动计划》、和《县2010年麻疹疫苗强化免疫和补种乙肝疫苗项目实施方案》。结合本
乡实际，特制定本方案：
一、工作原则
在乡政府组织领导下，各部门各司其职、密切协同、按照职责范围，分工负责。切实做好麻疹疫苗强化免疫和乙肝疫苗补种工作及协调、督促检查工作，确保全乡麻疹强化免疫工作和乙肝疫苗补种任务圆满完成。
二、组织体系及职责
乡政府成立乡麻疹疫苗强化免疫及乙肝疫苗补种工作领导组，乡政府副乡长许令军任组长，潘家宏、施发明任副组长。乡中心校、乡卫生院、县公安局派出所、乡财政所、乡社会事业服务中心为成员单位。领导组下设办公室，负责具体工作。各村也要成立相应领导组织。
乡卫生院：负责制订强化免疫和补种技术实施方案，保证疫苗和耗材的供给，利用预防接种门诊和指定的临时接种点，组织专业人员实施接种，开展接种质量监督和评价，加强接种不良反应的监测和处置，做好与各部门的衔接和协调工作。
乡中心学校：负责组织中小学校和托幼机构向学生发放预防接种宣传单和“接种通知单”。主动开展在校学生的宣传动员和摸底登记工作，协助乡卫生院做好疫苗接种工作。
县公安局派出所：积极配合乡政府、村民委员会对流动人口中适龄儿童的摸底、登记工作。积极应对接种过程中可能发生的影响社会稳定的事件。依法、及时、妥善处置与疫苗接种有关的突发事件。
乡社会事业服务中心：负责组织开展麻疹疫苗强化免疫、乙肝疫苗补种工作的宣传报道工作。
各村民委员会：负责做好非在校儿童麻疹疫苗强化免疫和乙肝疫苗补种的宣传，以及发放接种通知单，摸底调查等工作。
三、工作任务
麻疹疫苗强化免疫的对象为全乡范围内所有8月龄至5周岁（即10月1日至12月31日期间出生）的儿童，包括上述年龄范围内的我乡居住和流动人口儿童，无论既往免疫史及麻疹患病史，凡无麻疹疫苗接种禁忌症的儿童，均免费接种1剂次麻疹疫苗。全乡统一接种时间为2010年9月11日至20日。（具体时间、地点安排见附表）
乙肝疫苗补种对象为1997年1月1日至12月31日出生的未接种过乙肝疫苗或未按免疫程序完成乙肝疫苗3剂次接种的儿童。以及未完成补种的儿童，按规定程序补种。全乡统一接种时间为2010年9月11日至20日。（具体时间、地点安排见附表）
四、工作要求
㈠提高思想认识，确保完成接种任务。本次强化免疫工作，是一次政府组织的强化免疫活动。目标儿童数量众多，时间较紧，摸底和接种任务较重。各行政村、乡直各单位要从构建和谐社会，保障儿童身体健康的高度，切实加强领导，精心组织实施。
㈡广泛宣传发动、引导社会参与。各有关单位、各村要充分利用宣传媒体，采取张贴标语、发放宣传单、上门动员、入户宣传等多种形式，广泛开展宣传工作，认真做好适龄儿童及其监护人的宣传教育工作，引导和动员儿童家长参与这项工作。
㈢认真做好摸底登记工作。各村、乡直各单位要切实做好学校、托幼机构、居家等适龄儿童摸底登记工作，特别要做好散居儿童、流动人口较多居住地适龄儿童的摸底登记工作。在校学生、托幼机构儿童摸底登记以学校、托幼机构的学生花名册为准。非在校儿童摸底登记由各村组织逐户进行登记。全乡统一规定两苗接种摸底登记工作于2010年9月10日前完成，准确掌握接种对象。
㈣精心组织实施、防范接种异常反应。乡卫生院严格按照《预防接种工作规范》要求，精心组织麻疹疫苗强化免疫的每一个环节和步骤，确保接种安全有效。并做好对参加活动人员的技术培训，确保规范接种。且要加强接种异常反应监测，一旦出现疑似接种异常反应情况，要迅速果断处理，避免发生不稳定因素。
㈤加强检查指导、确保接种工作顺利开展。乡卫生院、中心校和乡政府要对麻疹疫苗强化免疫工作准备及实施情况进行全程检查指导。要深入基层实际指导，发现问题，及时解决。这次强化免疫活动，上级财政已安排经费补助接种单位，因此，严禁在本次强化免疫工作中对接种儿童及监护人收取任何费用。
大肠杆菌疫苗 篇3
本周晨会，齐鲁证券推荐了金宇集团（600201），原因是看好公司布氏杆菌疫苗的市场前景。二级市场上，金宇集团股价经历了过去半年时间较快速度的上行，但在阶段调整中并未完全跟随大盘走势，整体而言颇为强势，在短期调整后若无破位，则后市仍有操作机会。
资料显示，金宇集团全资子公司金宇保灵生物药品有限公司与法国诗华动物保健公司成立合资公司（双方各占50%股权），投资总额为人民币2，7 亿元，将开发、生产和销售反刍动物疫苗（口蹄疫疫苗除外）。合资公司初期产品组合为布鲁氏杆菌病疫苗等4个反刍动物疫苗和结核菌素诊断试剂。
齐鲁证券预计，金宇集团合资子公司的布氏杆菌疫苗将于2014年中推出市场，目前来看，公司的布氏杆菌疫苗在种毒和制剂工艺具备较大的领先优势。目前全国肉牛年出栏约5900万头，奶牛存栏1600万头，羊存栏3.5亿只，内蒙古地区羊存栏7900万只，牛存栏1200万头。由于布氏杆菌病是一种人畜共患病，各地对布氏杆菌病的防控重视程度并不弱于四大强免病。
据悉，此前内蒙古和新疆等地对牛羊布氏杆菌病防控高度重视，但苦于没有有效的疫苗防控。因此齐鲁证券预计如若金宇的布氏杆菌疫苗推向市场，内蒙古等地将采用地方政府强免的形式进行免疫防控，这意味金宇的布氏杆菌疫苗存在一次性快速放量的可能性。
同时，齐鲁证券测算，假设2014年年中产品推出，赶上内蒙古地区秋防，按2元/头份测算，2014年公司布氏杆菌疫苗有望实现1亿元左右收入，2015年春秋两季，预计实现1.8亿元收入，按30%净利润率，50%权益计算，将为金宇贡献1500万元和2700万元的净利润。并且，如果新疆等牛羊重点养殖区跟进地方性强制免疫，不排除金宇的布氏杆菌疫苗销售超预期的可能性。
除了看好布氏杆菌疫苗未来的发展外，齐鲁证券也调高了金宇集团口蹄疫政府苗的增长预期。由于去年全国多地爆发O型口蹄疫疫情，今年年初多地爆发A型口蹄疫疫情，各地政府口蹄疫免疫加强，今年上半年各公司口蹄疫疫苗政府采购业务收入均有不同程度增长。此外，农业部从今年下半年开始提高政府采购口蹄疫疫苗产品标准，因此齐鲁证券预计未来政府招标价将有望上涨。
整体而言，金宇集团未来的股价催化剂包括：（1）口蹄疫疫情持续爆发，政府苗和市场苗销售超预期；（2）内蒙古和新疆等地将布氏杆菌病纳入强免，布氏杆菌疫苗快速放量；（3）公司其他产品储备进程超预期。
大肠杆菌疫苗 篇4
ETEC在肠道内定植后生长增殖, 随后释放肠毒素引发细胞内水、电解质失衡导致水样腹泻。ETEC分泌的肠毒素包括不耐热肠毒素 (LT) 、耐热肠毒素a (STa) 、耐热肠毒素b (STb) 和肠聚集热稳定肠毒素1 (EAST1) [3]。虽然大多数新生仔猪可以通过免疫后母猪的初乳和乳汁获得保护, 但是ETEC感染非侵入性胃肠道感染, 因此粘膜免疫比系统免疫更为重要。目前市场上有几种疫苗, 包括:带菌毛的灭活菌、带LT的纯化菌毛或不带LT的纯化菌毛菌应用怀孕母猪。但随着母猪年龄的增大, 通过这些疫苗所获得免疫逐渐降低;而且在断奶时催乳免疫突然消失, 导致刚断奶的仔猪很容易感染肠杆菌。为了保护刚断奶的仔猪, 积极的肠道粘膜免疫应答尤为重要。
1 口服亚单位疫苗的应用
在感染时, 由于菌毛在细菌定植的过程中扮演着至关重要的角色, 使得口服菌毛疫苗的研发发展迅速。纯化的F4ac菌毛是一种很强的口服免疫原, 在断奶仔猪中, 连续两天口服1mg后, 在第4、7、8和11天可分别导致派伊尔淋巴集结、肠系膜淋巴结、血液和固有膜中分泌F4特异性抗体的细胞出现, 所诱导产生的Ig A应答可与口服感染ETEC产生的应答相比。当断奶仔猪连续3天接种口服疫苗并在初免后第16天加强免疫一次, 可以完全能预防口服含F4菌毛的ETEC所致的感染。Joensuu等人建议可用转基因食用苜蓿植物作为F4菌毛粘附和主要亚单位Fae G的载体, 这样既安全又廉价, 但研究表明效果不是很理想[4]。
与菌毛F4相比, 当用F18大肠杆菌感染时, 口服纯化的F18不能诱导产生保护性的免疫应答, 当F18菌毛剂量达30mg并联合使用粘膜佐剂LT (R139G) 也不能产生保护效果[5]。这两种菌毛所产生的免疫原性差异可能它们的结构相关。F18的粘附素是小亚基Fed F, 然而F4菌毛的粘附素主要菌毛大亚基Fae G。在最近的研究中发现, 当断奶仔猪口服重组Fed F并联合使用F4菌毛时, 能减少粪便中F18阳性大肠杆菌的排泄。这种联合疫苗的研发开启了一种对抗F4和F18感染的新途径[2]。
2 口服活疫苗的应用
口服弱毒苗和野生型无致病大肠杆菌活苗是ETEC疫苗接种的另外一种好的途径。当动物口服这些疫苗后, 疫苗菌粘附到小肠细胞触发产生免疫应答, 并迅速产生特异性抗原s Ig A抗体, 阻止产生同类菌毛的致病性菌的繁殖。可Bozic等人报道:在断奶后的第4天, 断奶仔猪单次口服表达F4ac的弱毒大肠杆菌后, 在第7天不能抵抗强毒力菌株的感染[6]。一种名为Coliprotec的口服活疫苗今年来相继在加拿大、巴西、美国等地开始应用, 这种疫苗可抵抗F4阳性ETEC引起的腹泻。这种疫苗含有天然无致病力的大肠杆菌, 表达F4粘附素但不产生毒素。临床实验证明Coliprotec能很好的抵抗致病性F4阳性ETEC的感染且安全性好。F4阳性ETEC引起的断奶后腹泻 (PDW) 一般发生在断奶后3~10天, 因此, 从断奶第1天至发生有一个时间间隔无法得到保护。为了避免这种情况, 第一次接种最好在哺乳期, 但在这个阶段胃肠道存在的哺乳期抗体也许会影响疫苗株的繁殖甚至免疫失败。虽然Bertschinger等人在试验中用F18ac阳性大肠杆菌疫苗免疫哺乳仔猪 (由带有F18特异性初乳Ig A抗体的母猪所产) 取得了好的效果, 但对F18ab没有起到交叉保护[2]。另外, 在Coddens等人的研究中发现, 日龄10天的仔猪中不表达或弱表达F18受体, 在这些猪肠道中不太可能有细菌的繁殖[7]。因此, 对这种疫苗的保护作用需进一步研究。
3 胶囊亚单位活疫苗的应用
为了提高活疫苗和亚单位疫苗的效果, 胶囊疫苗的应用起到了较好的作用。在哺乳期间, 胶囊疫苗可以保护疫苗在胃肠道运输过程中被母源抗体和其他的乳汁因子 (如乳脂球上的受体类似物或乳清等) 中和掉。Felder等人检测了微型胶囊疫苗的效果, 他们将F18阳性大肠杆菌和F18菌毛装在聚丙交酯-乙交酯 (PIg A) 微球中, 通过喷雾干燥和口服的方法免疫新生仔猪和断奶仔猪。结果发现:口服F18菌毛胶囊疫苗没有明显提高断奶仔猪的血清抗体应答, 也不能减少大肠杆菌感染细菌的繁殖, Verdonckde等人研究中也得到了类似的结果[2,5,8]。虽然给哺乳仔猪口服F18阳性大肠杆菌疫苗能取得较好的效果, 但胶囊化的F18阳性大肠杆菌在断奶仔猪和哺乳期仔猪都未能显著诱导应答。
胶囊化的F4菌毛能显著减少攻毒后F4阳性ETEC的分泌, 但当给哺乳仔猪口服接种F4菌毛培养液时不能取得这样的效果, 这表明胶囊化对保护抗原免受胃和小肠前段中酶的降解和失活或受乳汁因子中和有积极作用的, 但需进一步优化以提高其作用。一种由高直链淀粉羟甲基淀粉组成的口服片剂可以用来传送F4阳性大肠杆菌或纯化的F4菌毛, 可以使细菌有更高的成活率并使F4菌毛在胃肠道中更稳定。抗原的释放处决于片剂从酸性的胃内环境到碱性酶的肠道环境过程中的快速膨胀, 触发快速的溶解。分装在Gantrez纳米中的F4胶囊虽然能提高抗F4血清抗体水平, 但与溶解的F4菌毛相比不能提高血清抗体应答[9]。
4 注射疫苗的应用
由于乳汁母源抗体的存在, 可以用注射用免疫对哺乳仔猪进行疫苗。这些疫苗通常只刺激系统免疫而不作用于粘膜免疫系统。在哺乳期间, 肌肉注射福尔马林灭活的F4阳性大肠杆菌可导致免疫抑制。经肌肉免疫1mg F4菌毛能诱导系统Ig A应答。当疫苗剂量降到0.1mg时, 引起的应答反应更强, 这提示除免疫途径外, 抗原剂量在诱导血清Ig A应答中也起着很重要的作用。此外, 用小规模无菌猪进行试验发现, 肌肉注射融合蛋白Fae G-Fed F-LT192A2:B可诱导血清、粪便和肠道冲洗物中Ig A抗体的产生, 这样可以中和CT, 抑制F4和F8的粘附而保护猪只。融合蛋白的使用可以用来研发多价苗来抵抗ETEC诱导的断奶后仔猪腹泻。维生素D3作为免疫调节因子, 可以用来调节系统对肠粘膜Ig A的应答。联合肌肉注射维生素D3和抗原可使派尔集结淋巴结中Ig A ASC数量的增加。在第8天和第25天时用F4菌毛肌内免疫哺乳仔猪, 在第33天攻毒后能减少粪便排泄物, 当维生素D3增加时这种作用更明显[10]。
5 结语
ETEC一直是引起断奶仔猪腹泻的重要原因, 在养猪生产中导致严重的经济损失, 其致病与F4或F8密切相关。当感染时, 在小肠中特异的F4和F8 s Ig A应答可防止细菌增殖。目前, 几个口服疫苗包括亚单位苗和口服活苗在断奶仔猪中取得了较好的效果。由于F4阳性ETEC引起仔猪腹泻一般发生在断奶后的3~10天, 因此在哺乳期间免疫更理想。胶囊化的亚甲基苗和口服活疫苗可以克服疫苗在胃肠道中被降解, 还可防止被母源抗体和/或其他乳汁因子中和, 但目前应用效果不佳。用注射用疫苗是另外一种可行的预防途径, 但用于母猪的注射用疫苗倾向于刺激全身的而不是局部粘膜免疫系统。虽然注射免疫后可诱导系统的Ig A应答和肠道Ig A抗体产生, 但在ETEC感染时, 有效的ETEC免疫通常也需要GALT中特异性抗体Ig A ASC的存在。维生素D3作为一种免疫调节因子在小鼠中取得了好的效果, 但当应用于哺乳仔猪时并没有获得保护性的粘膜免疫。因此, 在注射免疫中, 胶囊化的活疫苗和免疫调节剂的联合使用可以克服哺乳期注射疫苗带来的问题, 但仍需进一步的研究。
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[8]Felder CB, Vorlaender N, Gander B, Merkle HP, Bertschinger HU:Microencapsulated enterotoxigenic Escherichia coli and detached fimbriae for peroral vaccination of pigs[J].Vaccine, 2000, 19 (7-8) :706-715.
[9]CalinescuC, Nadeau E, Mulhbacher J, Fairbrother JM, Mateescu MA:Carboxymethyl high amylose starch for F4fimbriae gastro-resistant oral formulation[J].International Journal of Pharmaceutics, 2007, 343 (1-2) :18-25.
大肠杆菌疫苗 篇5
新冠疫苗接种注意事项
1、接种前注意事项 接种前，应提前了解新冠疾病、新冠疫苗相关知识及接种流程;了解自己的身体状况，好好休息，让身体保持在一个较好的生理状态，最好不要空腹接种;新冠病毒疫苗接种部位为上臂三角肌，建议穿方便穿脱的宽松衣服;按组织接种人员通知携带身份证、手机等物品，佩戴好口罩前往。
2、接种时注意事项 全程佩戴口罩，按接种点标识有序排队，保持一米以上社交距离;向医生主动提供自己健康状况，近期服用的药物信息，并如实填写知情同意书;如果接种部位有伤口，尽量避开伤口选择另一侧接种。
3、接种后注意事项 接种完毕，需在接种点留观30分钟;止血棉签丢入医疗垃圾桶或黄色医疗废物垃圾袋中。等在接种点留观区观察30分钟，无不适症状后才可以离开接种点;接种当日注射部位保持干燥并注意个人卫生;如果出现持续发烧等现象，应及时就医并向接种单位报告。
打新冠疫苗之前需要注意什么
1.接种完毕，需在接种点留观30分钟;止血棉签丢入医疗垃圾桶或黄色医疗废物垃圾袋中。
2.等在接种点留观区观察30分钟，无不适症状后才可以离开接种点;接种当日注射部位保持干燥并注意个人卫生;如果出现持续发烧等现象，应及时就医并向接种单位报告。
3.迟种补种
对2剂或3剂次程序的疫苗，未按程序完成接种者，建议尽早补种。免疫程序无需重新开始，补种完成相应剂次即可。对在14天内完成2剂新冠病毒灭活疫苗接种者，在第2剂接种3周后尽早补种1剂灭活疫苗。对在14-21天完成2剂新冠病毒灭活疫苗接种的，无需补种。
4.与其他疫苗同时接种
暂不推荐与其他疫苗同时接种。其他疫苗与新冠病毒疫苗的接种间隔应大于14天。当因动物致伤、外伤等原因需接种狂犬病疫苗、破伤风疫苗、免疫球蛋白时，可不考虑与新冠病毒疫苗的接种间隔。
5.不同疫苗产品替换
现阶段建议用同一个疫苗产品完成接种。如遇疫苗无法继续供应、受种者异地接种等特殊情况，无法用同一个疫苗产品完成接种时，可采用相同种类的其他生产企业的疫苗产品完成接种。
新冠疫苗什么人不能打
1.孕妇、哺乳期妇女，在接种后3个月内有生育计划者请暂缓接种。
2.14天内接种其他灭活疫苗，28天内接种其他减毒活疫苗者建议暂缓接种。
3.发热患者、感染性疾病急性期、严重呼吸系统疾病、心血管疾病、肝肾疾病、恶性肿瘤、血小板减少症或者出血性疾病、药物不可控制的高血压、糖尿病等患者不适合接种。
4.不在18-59岁接种年龄段的人群，需等进一步临床试验数据披露，才能明确是否能后期接种。
新冠疫苗接种禁忌症
1、对疫苗的活性成分、任何一种非活性成分、生产工艺中使用的物质过敏者，或以前接种同类疫苗时出现过敏者;
2、既往发生过疫苗严重过敏反应者(如急性过敏反应、血管神经性水肿、呼吸困难等);
3、患有未控制的癫痫和其他严重神经系统疾病者(如横贯性脊髓炎、格林巴利综合症、脱髓鞘疾病等);
4、正在发热者，或患急性疾病，或慢性疾病的急性发作期，或未控制的严重慢性病患者;
大肠杆菌疫苗 篇6
1 菌株选择
1.1 材料
O78、O2、O9和O24为苗用菌种;各种培养基、硫乙醇酸盐培养基 (TG) 、肉汤、酪胨琼脂 (GA) 与葡萄糖蛋白胨汤 (GP) 、10号医用白油、Span-80、Tween-80、甲醛液、硬脂酸铝;显微镜、振荡器、胶体磨、离心机;各日龄鸡。
1.2 制苗用菌液的制备
将O78、O1、O26和O244种优势血清型菌株分别接种于麦康凯琼脂平板上, 于37℃培养18 h后, 挑取典型菌落接种于琼脂斜面37℃培养18 h, 用斜面上的培养物分别接种于营养肉汤, 在气浴恒温振荡器内37℃培养18 h作为种子液。将种子液按等量倾倒入浇有普通琼脂的克氏瓶中, 置37℃培养18 h, 用灭菌生理盐水洗涤克氏瓶中细菌, 用灭菌纱布过滤, 置于无菌瓶中, 制成细菌悬液。
1.3 纯粹检验与活菌计数
取上述各菌株的悬液少许, 在麦康凯平板培养后染色镜检, 结果纯粹无杂菌。按常规方法分别进行活菌计数, 各菌株菌悬液每毫升活菌含量不低于100亿个。
1.4 灭活及灭活检验
将上述各菌株的菌悬液按等量混匀后加入终浓度为0.4%的甲醛溶液, 37℃灭活72 h, 其间每隔6~8 h振荡1次。在普通琼脂和厌氧培养基37℃培养72 h, 无细菌生长。
1.5 内毒素检测
将0.1 ml鲎试剂与0.1 ml灭活菌液置于10 mm×75 mm试管中, 37℃水浴轻摇60 min取出, 10 min后缓缓倒转试管180度, 仅有少量混浊物, 表明无内毒素。
2 灭活疫苗的制备
取白油94份、Span-80 6份、硬脂酸铝2份, 先用少量10号白油与硬脂酸铝混合, 加热熔化, 再与全量Span-80及10号白油混合均匀, 116℃高压灭菌30 min, 冷却后为油相。Tween-804份装入带玻璃珠的瓶中灭菌, 冷却后加入灭活好的混合菌液96份振摇至Tween-80完全溶解为水相。油相与水相按1∶1比例混合, 先将油相倾入胶体磨内, 在低速搅拌下缓缓加入水相, 然后高速 (10 000 r/min) 搅拌5 min, 乳化制成油乳剂疫苗, 定量分装备检。
3 试验结果
3.1 物理性状
油苗外观呈乳白色, 3 000 r/min离心15 min不分层;1 ml吸管室温垂直放出0.4 ml, 3次平均所需时间约为7 s;油苗滴于蒸馏水表面, 油滴呈规则图形, 不向四周扩散, 油乳剂为油包水型。
3.2 无菌与安全性检验
将制备好的油乳剂灭活苗分别接种于TG、GA与GP上, 37℃培养96 h, 均无细菌和霉菌生长。将疫苗分别接种于10只10日龄雏鸡, 0.25 ml/只, 10只120日龄蛋鸡, 0.5 ml/只, 观察14 d, 接种24~48 h后全部健活, 且注射部位无异常。
3.3 最小免疫剂量试验
10日龄与120日龄鸡各50只平均分成5组免疫, 15 d后对雏鸡和成鸡用活菌混合液0.25 ml和0.3 ml攻毒, 观察14 d, 试验结果见表1。
雏鸡最小免疫剂量确定为0.2 ml/只, 成鸡最小免疫剂量确定为0.4 ml/只。
3.4 效力试验
3.4.1 动物保护试验
用10日龄雏鸡10只, 0.25 ml/只免疫, 14 d后同另10只未免疫鸡肌注活菌混合液0.2 ml/只, 观察14 d。试验结果见表2。
由表2可知, 对照组死亡率100%, 免疫组保护率达到100%。
3.4.2 抗体凝集效价
将20只10日龄非免疫鸡随机分成2组, 每组10只, 分别接种2批次疫苗各0.25 ml, 免疫后抗体检测。试验结果见表3。
由表3可知, 结果疫苗免疫效果好, 免疫力强。
3.5 免疫产生期试验
将10日龄雏鸡20只分别接种2批次疫苗0.25 ml/只, 接种后不同时间和另10只同批对照鸡分别攻击各菌株活菌混合液, 继续观察14 d, 试验结果见表4。
免疫组接种后5 d开始产生免疫, 第7天保护率达到80%以上, 至9~11 d能够提供完全保护。
3.6 免疫持续期试验
将10日龄雏鸡接种疫苗0.25 ml/只, 于不同时间分别取10只, 与另10只同批对照鸡分别攻各菌株活菌混合液, 继续观察14 d, 试验结果见表5。
免疫后7个月, 试验组攻毒保护率不低于80%, 疫苗免疫后9个月, 攻毒保护率也不低于60%, 疫苗的免疫持续期可达6个月以上。
3.7 保存期试验
将疫苗分别置不同温度和时间保存, 再分别用保存6、9个月的疫苗免疫10日龄雏鸡各10只, 0.25 ml/只, 3周后对10只免疫鸡分别肌注活菌混合液0.2 ml, 另设10只对照组, 观察14 d, 试验结果见表6。
试验结果表明, 4℃保存9个月、25℃报存6个月, 疫苗均无分层破乳情况出现, 疫苗保护率均可达100%。
3.8 田间免疫试验
在吉林市5个区的10个鸡场为试验场地, 每个鸡群平均分成2组, 1组注射油苗, 另一组作为对照。10日龄0.25 ml/只, 120日龄0.5 ml/只, 对照组不注射。在相同管理条件下观察6个月。试验结果见表7。
部分雏鸡注苗后5~6 h以后, 出现轻度精神沉郁现象, 12 h后恢复正常, 注射部位良好;成年蛋鸡无不良反应;鸡各种生理指标未见异常。免疫组与试验组平均死亡率, 差异显著。
4 结论
大肠杆菌疫苗 篇7
为了控制鸡大肠杆菌在鸡群中的传播, 笔者对送检的疑似大肠杆菌病病死鸡进行病原菌的分离鉴定, 采用分离的菌株制成灭活疫苗, 用于鸡大肠杆菌病的预防, 能够明显降低其发病率。
1 材料与方法
1.1 病料来源
乌兰察布市某肉鸡场送检的疑似大肠杆菌病的死鸡若干只, 35日龄发病, 死亡时间未超过12 h。
1.2 细菌的分离培养与纯化
无菌采集有心包炎、肝周炎、纤维素性腹膜炎等病理变化的鸡心血、肝脏、脾脏等病料, 接种于麦康凯琼脂培养基上, 于37℃培养24 h。观察麦康凯琼脂平板上分离培养的菌落, 选红色典型菌落, 接种营养肉汤进行纯培养。依次接种营养琼脂培养基、SS琼脂培养基、伊红美蓝琼脂培养基, 37℃培养24 h。
1.3 细菌的形态学观察
取在麦康凯琼脂培养基上生长的红色典型菌落, 按常规方法进行革兰染色、镜检, 观察结果。
1.4 生化试验
取细菌纯培养物, 利用肠杆菌科细菌生化常规鉴定试剂盒 (杭州天合微生物试剂公司) 进行生化试验鉴定。
1.5 血清型鉴定
取分离到的细菌纯培养物用无菌生理盐水洗下菌苔, 稀释成100亿/m L菌液, 用电热恒温水浴锅隔水加热煮沸2 h, 破坏其菌毛抗原, 用禽大肠杆菌O群血清 (兰州生物制品厂) 进行玻片凝集试验, 以确定其O抗原。
1.6 致病性试验
将分离鉴定的细菌用普通肉汤纯培养, 供接种小白鼠和回归动物试验用。接种试验组小白鼠5只, 每只腹腔注射细菌纯培养液0.5 m L (用生理盐水稀释使其含活菌2亿~5亿个) 。另设对照组, 对照组小白鼠注射生理盐水。接种试验组15日龄健康雏鸡10只, 每只肌肉注射细菌纯培养液0.5 m L, 另设对照组, 对照组注射生理盐水。分开饲养, 观察1周[2]。
1.7 灭活疫苗的制备
将纯培养物接种于普通肉汤, 37℃摇振培养18~24 h, 收集菌液。取少量菌液用于细菌计数, 将原菌液中加入最终浓度为0.3%的甲醛溶液, 在37℃振荡培养24 h, 灭活菌液用盐水稀释, 取4份稀释液加1份铝胶液, 使最终含菌数为100亿~400亿个/m L, 充分混匀。
1.7.1 安全检验
取1月龄健康易感鸡10只, 各颈部皮下或肌肉注射疫苗2 m L, 同时设对照组, 与免疫组同条件饲养2周, 观察结果。
1.7.2 效力检验
取1月龄健康非免疫鸡8只, 各颈部皮下注射疫苗0.5 m L, 同时设对照组, 21 d后连同对照组的鸡均腹腔注射致病性大肠杆菌的肉汤培养液0.5 m L。攻毒后连续观察14 d。
2 结果
2.1 病死鸡的病理剖检变化
腹腔内混有纤维素性渗出物;气囊混浊增厚, 气囊内有黄白色干酪样渗出物;肝脏与心脏表面覆盖有黄白色的纤维素性渗出物;脾脏肿大, 肺脏充血、淤血;肾脏肿大;十二指肠有出血性肠炎变化;盲肠、扁桃体肿胀、出血。
2.2 细菌的分离培养
在麦康凯琼脂培养基上形成中等大小、表面光滑湿润的红色菌落。在肉汤中培养, 呈均匀浑浊生长, 管底有黏性沉淀物, 液面管壁有菌环。在营养琼脂培养基上形成中等大小、圆形微凸起, 表面光滑湿润、半透明灰白色菌落。在SS琼脂培养基上生长较差。在伊红美蓝琼脂培养基上形成紫黑色带金属光泽的菌落。
2.3 细菌的形态学观察
按常规方法涂片, 革兰染色, 镜检。可见散在、两端钝圆、中等大小的革兰阴性杆菌。
2.4 生化试验
生化试验结果显示, 此次分离的大肠杆菌能分解葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇, 产酸产气。不能分解蔗糖。M.R.试验阳性, 吲哚试验阳性, V-P试验阴性, H2S试验阴性, 枸橼酸盐利用试验阴性, 尿素分解试验阴性[3]。
2.5 血清型鉴定
玻片凝集试验结果表明:几株分离菌均为同一血清型O78。
2.6 致病性试验
接种细菌纯培养液的小白鼠出现运动减慢、呼吸加快等一系列症状, 并出现死亡。剖检死亡小白鼠, 心血和肝脏均分离出注射菌株, 对照组小白鼠无异常。回归试验组接种细菌纯培养液的鸡全部发病死亡。剖检死鸡可见心包炎、肝周炎、纤维素性腹膜炎等病理变化, 并从肝脏、脾脏等病料中分离到注射菌株, 对照组无发病鸡[4]。
2.7 灭活疫苗检验
2.7.1 安全检验
14 d内免疫组鸡未见异常临床表现, 剖检时内脏器官及注射部位均无损伤。
2.7.2 效力检验
对照组鸡过夜后即有发病者出现, 表现精神不振等症状, 连续几天不断有病例出现。经剖检证实为注射的大肠杆菌所致。而免疫组连续观察14 d, 无病例出现。
3 小结
试验对疑似大肠杆菌病的死鸡进行细菌分离培养, 通过生化鉴定, 分离鉴定出一株大肠杆菌, 并通过致病性试验证明是由致病性大肠杆菌引起的传染病。
大肠杆菌是条件性致病菌, 预防本病要做到加强饲养管理, 搞好卫生消毒工作, 消除各种发病诱因。抗菌药物虽然可减轻患病鸡群的疫情或暂时控制疫情发展, 但停药后常可复发。特别是耐药菌株的大量出现, 以往有效的许多药物变得无效或低效。所以最好采用大肠杆菌自家灭活疫苗免疫鸡群, 提高机体特异性免疫力, 这样效果可靠, 更适用于血清型复杂的地区。
参考文献
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大肠杆菌疫苗 篇8
本试验从皖西白鹅养殖场采取一定数量的病料, 进行病原菌的分离鉴定, 确定皖西白鹅养殖场大肠杆菌病的流行情况和血清型, 制备大肠杆菌灭活疫苗, 并将之应用于当地养鹅业 (皖西白鹅) , 从而避免或减少了因大肠杆菌感染引起的损失。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料来源
六安市某皖西白鹅养殖场。
1.1.2 材料
麦康凯培养基 (杭州微生物化学试剂有限公司生产, 批号为20080304-00) 、肠杆菌科细菌生化编码鉴定管 (杭州微生物试剂厂生产, 批号为20080201) 、肠道致病性大肠艾希氏菌诊断血清 (宁波天润生物药业有限公司生产, 批号为20080312) 。LB培养基 (自制) 、氢氧化铝胶 (自制) 。
1.1.3 器械
显微镜、恒温培养箱、平皿、冰箱、手提式高压灭菌锅、恒温震荡箱、注射器。
1.1.4 试验动物
小白鼠购于安徽医科大学实验动物中心。
1.1.5 试剂
甲醛溶液、无菌生理盐水、革兰染色液、三氧化铝、氢氧化钠。
1.2 方法
1.2.1 细菌的分离纯化
无菌取疑似患大肠杆菌病病死的皖西白鹅的肝脏、死胚蛋的卵黄接种于麦康凯培养基平板, 37℃恒温培养24 h, 挑取边缘整齐或波状、稍凸起的红色菌落进行革兰染色。经镜检见粗短、两端钝圆、多单个散在、个别成双排列的红色小杆菌, 可初步确定为大肠杆菌。取该菌落接种于麦康凯培养基上进行纯化培养, 直到无杂菌为止, 4℃保存备用。
1.2.2 生化实验
取上述菌落纯培养物接种于硫化氢、苯丙氨酸、葡萄糖盐酸、蛋白胨水 (靛基质) 、葡磷胨水 (MR-VP) 、枸橼酸盐、尿素、半固体琼脂 (动力) 、葡萄糖、赖氨酸、蛋氨酸、鸟氨酸、棉子糖、山梨醇、木糖等肠杆菌科细菌生化编码鉴定管上培养24 h, 观察结果。
1.2.3 致病性实验
将分离纯化后的大肠杆菌接种于麦康凯培养基上37℃培养24 h, 取培养好的大肠杆菌培养物腹腔注射10只18~20 g小白鼠, 每只0.5 m L (每毫升含菌3.0×108个) 。同时设立对照组, 观察结果。
1.2.4 血清型鉴定
用吸管于洁净的玻片上滴1~2滴标准血清, 然后取被检菌少许与血清混匀, 轻轻摇动玻片, 2 min内肉眼判断结果, 试验用无菌生理盐水做对照, 观察结果。
1.2.5 疫苗的制备
(1) 细菌的扩大培养。从血清型鉴定后菌株的麦康凯琼脂平板培养物中取适量接种于LB液体培养基上, 37℃恒温震荡培养过夜, 直到培养基浑浊为止, 4℃保存备用。
(2) 活菌计数。取扩大培养液原液0.5 m L, 加到4.5 m L肉汤培养基中, 混匀后, 作成1∶10的稀释液。用1 m L灭菌吸管吸取1∶10的稀释液1 m L放入到9 m L灭菌肉汤试管中, 混匀, 作成1∶100的稀释液, 依次递增稀释为10-1、10-2、……、10-7。一般由10-5~10-7稀释管中各取0.1 m L, 放在平皿上, 迅速将冷却到46℃的麦康凯琼脂培养基注入平皿15~18 m L, 并转动平皿使混合均匀, 同时将注入1 m L灭菌生理盐水的平皿作空白对照。待琼脂凝固后, 翻转平皿, 置37℃恒温箱中培养18~24 h, 计数平皿内的大肠杆菌菌落数目, 乘以稀释的倍数, 即得每毫升原菌液中所含的大肠杆菌数。
(3) 菌液稀释和灭活。从冰箱中取出原菌液, 根据每毫升菌液中所含的大肠杆菌数, 用无菌生理盐水将其稀释成每毫升含3.0×108个菌, 然后再按照菌种的血清型, 以适当的比例进行混合, 进行灭活。灭活按0.4%在菌液中加入甲醛溶液, 置37℃恒温箱中培养24 h, 此期间每2~3 h充分摇晃一次。
(4) 无菌检查。灭活后, 取其培养物作无菌检查, 用营养琼脂平板2个, 每板接种菌液0.2 m L, 置于37℃恒温箱中培养48 h, 观察结果。
(5) 疫苗的制备。取44 m L 8%的三氯化铝溶液加热至56~60℃, 再取42 m L 4%的氢氧化钠溶液加热至56~60℃, 在60℃水浴缸中将42 m L氢氧化钠溶液缓慢加入44 m L的三氯化铝溶液中, 不断搅拌1 h, 铝胶逐渐形成。调混合液的pH值达5.6~6.0时为终点, 再继续搅拌10 min, 装入瓶内, 121℃高温灭菌30 min, 室温保存。取制备好的氢氧化铝胶与等量灭活菌悬液充分混合后置4℃冰箱保存备用。
1.2.6 疫苗检验
(1) 安全试验。取体重在18~20 g的健康易感小白鼠10只, 每只皮下注射氢氧化铝佐剂疫苗0.5 m L, 同时设立不接种疫苗的对照组, 与免疫组同等条件饲养, 观察7 d。
(2) 免疫效力检验。取体重在18~20 g的小白鼠10只, 分别皮下注射疫苗各0.5 m L, 免疫7 d后以大肠杆菌LB培养物进行攻毒, 每只0.5 m L, 观察1周。
2 结果
2.1 分离镜检与生化实验结果
从采集到的20个病料中, 在麦康凯培养基上37℃培养24 h。选取红色、中等大小、表面光滑、湿润边缘整齐的菌落, 经革兰染色镜检, 可见有粗短、两端钝圆、多单个散在、个别成双排列的红色小杆菌。生化试验结果见表1。
注:茌产酸产气, +阳性, -阴性。
由以上两种结果判定得到的13株分离菌, 其生物学性状和生化特性均符合大肠杆菌的特征, 革兰染色阴性。
2.3 致病性试验与血清型鉴定结果
(1) 致病性试验。分离菌株接种试验动物, 发现小白鼠注射后精神萎靡, 24 h全部死亡, 对照组全部存活。对死亡小白鼠解剖观察发现, 心脏出血、淤血, 肝脏、脾脏出血坏死, 肠壁变薄, 有出血点, 取其病料抹片染色镜检, 可见革兰阴性杆菌, 分离培养的菌株与所接种细菌性状一致。
(2) 血清型鉴定结果。经玻板凝集试验, 确定该分离菌株血清型为O111。
2.4 平板计数与无菌检查
平板计数:测得活菌数为1.35×109个/m L。
无菌检查:经37℃培养48 h, 未见有细菌生长, 判为合格。
2.5 疫苗检验
物理性状:呈棕褐色的均匀悬液, 贮存后有沉淀, 使用时充分振摇即呈悬液。
安全性检验:试验小白鼠背部皮下注射菌苗0.5 m L/只, 观察96 h均无不良反应, 剖检其注射部位也无异常, 说明该剂量铝胶佐剂疫苗对试验小白鼠是安全的。
效力检验:对照组于24 h内全部死亡, 免疫组全部存活, 结果见表2。结果表明:此疫苗具有免疫保护作用。
3 讨论
据资料报道, 目前已发现的大肠杆菌血清型有160多种, 但对禽类致病的仅占15%左右, 其中最常见的致病血清型为O1、O2、O35、O78等几种;国内目前已经报道的达70多种, 不同地区差别也较大, 这充分说明了临床上治疗大肠杆菌病时的复杂性, 并解释了致病性大肠杆菌广谱灭活疫苗免疫效果较差、无法大范围推广的原因。
本病发生的主要原因:在饲养管理与饲养环境差的情况下, 大肠杆菌就会趁机侵入动物机体, 附着在其黏膜上并进行生长繁殖, 一方面会致使大肠杆菌毒素大量生成, 使动物精神沉郁;另一方面会损伤黏膜, 引起消化不良、采食量下降以及出现拉黄白色或青绿色稀便等, 同时还会引发呼吸道疾病。另外, 该病还会通过母体垂直传播给种蛋, 使该病在孵化过程中和出雏后一周内发生。
(1) 本试验通过对所采病料进行分离培养, 分离到菌株的形态特性、生物学特性以及革兰染色等方面均符合大肠杆菌的特征。
(2) 生物化学实验结果表明, 同一血清型不同菌株之间在某些糖的利用上存在着一些差异。分离到的致病性大肠杆菌除棉子糖、木糖出现一定差异外, 其他生化试验完全一致。
(3) 病死鹅较难通过外观和剖检确定是否为大肠杆菌病。所采病料中有一部分是由于其他原因死亡的病例, 所分离到的细菌还有部分是其他菌种。基层养殖场如果采用本法制备自家灭活疫苗, 应加大采样数量, 分离更多的菌株, 甚至可以在临近的几个鹅场或在一个养殖区域内广泛采集病料, 分离菌株, 制备出适用范围更大的鹅大肠杆菌灭活疫苗。
(4) 安全检验、效力检验结果表明, 本试验研制的疫苗安全, 对小白鼠具有较好的免疫原性, 免疫后7 d产生免疫保护作用。由于时间和资金方面的原因, 所做的试验未采用皖西白鹅检验疫苗的效力。在实际应用前最好用皖西白鹅进行小群试验。小群试验成功后再扩大应用范围。
大肠杆菌疫苗 篇9
本研究在前期开展新疆北疆地区规模化奶牛场致犊牛腹泻大肠杆菌调查的基础上, 根据本地区情况, 以携带K99- Sta1、F41菌毛的O78和O8分离菌株作为制苗菌株, 制备K99- F41二价菌毛油佐剂苗和大肠杆菌全菌体油佐剂灭活苗, 分别以不同剂量免疫怀孕母牛, 检测孕牛初乳及哺乳犊牛血清中的免疫抗体水平及消长规律, 并观察免疫与未免疫犊牛的自然腹泻发病情况, 为有效防控犊牛大肠杆菌性腹泻提供技术支撑。
1 材料与方法
1. 1 菌株
大肠杆菌菌株, 由石河子大学免疫实验室分离自4 日龄腹泻死亡犊牛肠系膜淋巴结, 经鉴定为O78-F41、O8- K99菌株。
1. 2 试验动物
健康小鼠、家兔, 由石河子大学实验动物中心提供; 健康怀孕母牛, 由新疆西部牧业中心牛场提供。
1. 3 主要仪器
高速冷冻离心机 ( 型号为CR22E) , 购自日本日立公司; 紫外- 可见分光光度计 ( 型号为UV - 120 -02) , 购自日本岛津公司; 酶标仪 ( 型号为Power Wave X S 2) , 购自美国Bio - Tek公司; 微量核酸蛋白测定仪 ( 型号为Nano Drop 2000) , 购自海门市其林贝尔仪器制造有限公司。
1. 4 犊牛大肠杆菌全菌体油佐剂灭活苗的制备
犊牛大肠杆菌全菌体油佐剂灭活苗, 由石河子大学课题组自主研发。
1. 5 K99- F41二价菌毛油佐剂苗的制备
将菌种接入Minca液体培养基中, 于37 ℃ 培养36 h, 收集菌体; 采用60 ~ 65 ℃ 水浴振荡法提取菌毛[6], 离心除去菌体; 取上清液, 经饱和硫酸铵盐析沉淀菌毛蛋白, 离心提纯菌毛, 将菌毛蛋白溶液于4 ℃ 冰箱、磁力搅拌器上透析48 h, 用微量核酸蛋白测定仪测定菌毛蛋白含量, 两种菌毛蛋白含量分别为1. 95 mg / m L、1. 85 mg / m L。
将O78- F41和O8- K99菌毛亚单位溶液等量混合后, 用生理盐水将其稀释到2 mg /m L, 用0. 4% 甲醛灭活后与206 双相油佐剂按照1∶1 比例制成K99- F41二价菌毛油佐剂苗。
1. 6 疫苗的无菌检验及安全性检测
将制备好的疫苗接种于麦康凯琼脂平板和LB肉汤培养基中, 37 ℃ 培养3 d, 观察有无细菌生长。取3 只家兔, 分别肌肉注射疫苗, 3m L/只; 取10 只小鼠, 分别肌肉注射疫苗, 0. 3 m L/只; 观察10 d, 测定家兔体温, 记录食欲及精神状态。
1. 7 疫苗免疫孕牛的效果测定
1.7.1试验分组及免疫
选择健康、年龄均在3 ~ 5岁的产前2 ~ 4 周的进口荷斯坦怀孕母牛65 头, 共分为4 个试验组和1 个对照组, 每组13 头牛。A组和B组分别肌肉注射O78- O8大肠杆菌全菌体油佐剂灭活苗3 m L/头和5 m L/头, C组和D组分别肌肉注射K99- F41二价菌毛油佐剂苗3 m L/头和5 m L / 头, 每组牛均免疫2 次, 间隔2 周。对照组不免疫。
1.7.2样品的采集和处理
采集每组母牛产后3, 6, 12, 24, 36, 72 小时的初乳, - 20 ℃ 保存, 备用。采集母牛所生犊牛在灌服首次初乳后1, 3, 5, 7 天的血清, - 20 ℃保存, 备用。
1.7.3初乳及血清抗体效价的检测
参照参考文献[7]中的方法获取初乳的乳清蛋白后测定其抗体效价。采用石河子大学课题组建立的间接ELISA法检测血清抗体效价, 分别采用O78- O8全菌体抗原及K99- F41菌毛蛋白抗原包板。
1.7.4临床观察
每天观察试验组和对照组母牛所产的犊牛情况, 共观察7 d, 记录各组犊牛出现腹泻的时间和症状。
2 结果与分析
2. 1 疫苗的无菌及安全性检验结果
将制备好的疫苗接种于麦康凯琼脂平板和LB肉汤培养基中, 37 ℃ 培养3 d, 结果均无任何微生物生长。家兔、小鼠接种10 d后全部健康存活。家兔体温正常, 注射部位未见红肿、化脓现象。
2. 2 抗体效价的检测
2.2.1两种疫苗不同剂量免疫母牛后初乳的抗体效价检测
结果见表1。
(OD450值)
由表1 可知, 大肠杆菌全菌体油佐剂灭活苗免疫剂量为5 m L的B组的母牛初乳中抗体效价最高, 产后3 小时达1. 249 ± 0. 063, 而K99- F41二价菌毛油佐剂苗免疫剂量为3 m L的C组的初乳中抗体效价最低, 经统计学分析, 两种疫苗与各自的两种剂量差异不显著。未免疫组 ( 对照组) 初乳中大肠杆菌抗体始终保持较低水平, 明显低于免疫组。
2.2.2两种疫苗不同剂量免疫母牛后初乳乳清抗体消长时间情况
用不同剂量K99- F41二价菌毛油佐剂苗和大肠杆菌全菌体油佐剂灭活苗分别免疫怀孕母牛后, 所测得的产后不同时段的初乳中犊牛大肠杆菌抗体效价呈现一定消长规律, 见图1。
由图1 可知, 产后3, 6 小时时4 个试验组的抗体效价最高, 24 小时后逐渐降低, K99- F41二价菌毛油佐剂苗免疫剂量为3m L的C组的初乳抗体在36小时时下降最快。
2.2.3两种疫苗不同剂量免疫母牛所产犊牛血清中抗体效价的检测
结果见表2。
(OD450值)
由表2 可知, 以K99- F41二价菌毛油佐剂苗免疫剂量为5 m L的D组所产犊牛血清中抗体效价最高, 在第7 天时达到0. 663 ± 0. 057, 而大肠杆菌全菌体油佐剂灭活苗免疫剂量为3 m L的A组最低, 与初乳中抗体的水平相一致。对照组母牛所产犊牛血清中抗体水平始终保持较低水平。
2.2.4两种疫苗不同剂量免疫母牛所产犊牛血清抗体消长时间情况的统计
结果见图2。
由图2 可知, C组和D组所产犊牛血清的抗体水平上升较快, 在第7 天时达到高峰, OD450值在0. 6以上。
2.2.5两种疫苗不同剂量免疫怀孕母牛所产犊牛发生腹泻情况的统计
4个免疫组母牛所产犊牛在产后2~6 h灌服初乳2~4 kg后, 7 d内的腹泻发病率均明显低于未免疫的对照组, 结果见表3。
由表3 可知, B组犊牛腹泻发病率最低, 为7. 7% , 对照组犊牛腹泻发病率为61. 5% 。
3 讨论
1) 本试验提取大肠杆菌K99和F41菌毛的方法是在现有研究报道的基础上进行了优化[8,9,10], 其物理性状良好, 菌毛蛋白含量较高, 经安全检验、无菌检验和效力检验表明疫苗是安全有效的。大肠杆菌全菌体油佐剂灭活苗和K99- F41二价菌毛油佐剂苗在剂量为5 m L时的免疫怀孕母牛产后初乳中抗体效价明显高于3 m L时, 而大肠杆菌全菌体油佐剂灭活苗剂量为5m L时的初乳中抗体效价最高, 在产后3 小时时达到1. 249 ± 0. 063。初乳中的抗体效价虽呈下降趋势, 但在产后72 小时时, 免疫组抗体水平仍高于对照组。在生产实践中, 应在母牛产后3 h内提供足量的第一次初乳, 并尽可能持续2 ~ 3 d, 使犊牛获得更好的母源抗体保护。
2) 免疫组的母牛所产犊牛血清中的抗体效价呈明显上升趋势, 在第7 天时, K99- F41二价菌毛油佐剂苗为5 m L时的犊牛血清中抗体效价最高, 达到0. 663 ± 0. 057, 但对犊牛的保护率略低于大肠杆菌全菌体油佐剂灭活苗剂量为5 m L时, 说明大肠杆菌全菌体油佐剂灭活苗与K99- F41二价菌毛油佐剂苗免疫母牛后初乳抗体、犊牛血清中抗体水平及犊牛抗病力无明显差异。
3) K99- F41二价菌毛油佐剂苗的制备工艺较复杂, 制苗成本高, 且仅有菌毛抗原, 免疫原性不如大肠杆菌全菌体油佐剂灭活苗。因此, 从制苗工艺及实用性考虑, 大肠杆菌全菌体油佐剂灭活苗可能更简单、实用。由于尚未进行犊牛免疫攻毒保护试验, 两种疫苗的差异仍难定论。
摘要：为了比较分析由致犊牛腹泻大肠杆菌分离株K99-F41分别制成的二价菌毛油佐剂苗和全菌体油佐剂灭活苗不同注射剂量时的妊娠母牛、所产犊牛免疫抗体效价及抗体消长时间的差异, 试验采用免疫接种方法将两种疫苗分别按照不同剂量接种怀孕母牛, 收集母牛产后6个时段内的初乳及所产犊牛灌服初乳后1, 3, 5, 7天的血清, 并通过间接ELISA法检测初乳和犊牛血清中相应抗体效价。结果表明:两种疫苗在剂量为5 m L时初乳中抗体效价明显高于3 m L, 初乳中抗体效价在24 h后呈下降趋势;犊牛血清中的抗体效价明显上升;两种疫苗5 m L时犊牛腹泻自然发病率分别为15.4%和7.7%。说明两种疫苗均能产生良好的免疫应答及预防初生犊牛的大肠杆菌腹泻。
关键词：犊牛,腹泻,大肠杆菌,K99-F41,菌苗,免疫效果,抗体消长
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大肠杆菌疫苗 篇10
2008年10—12月期间,某规模养殖场先后从天津、唐山、西安引进奶牛258头,与本地奶牛混群饲养。随着奶牛的大量异地调运,“布病”疫情出现快速上升的趋势。2009年6—11月,“布病”感染阳性奶牛的比例从0.85%上升到5.89%;从2009年11月10日至2010年2月11日,在3个月的时间内感染牛群中44头奶牛发生了流产、死胎的症状。我国对家畜布氏杆菌病采取以检疫净化为主的综合防控措施,同时包括对重点疫区的易感动物接种疫苗,待临床病例逐渐减少和疫情得到有效控制以后,再实施群体和地域的净化[1]。为此,该规模养殖场对“布病”阳性牛隔离淘汰处理,对“布病”阴性牛(假定健康牛)进行免疫接种。现将奶牛群接种S2株布氏杆菌减毒活疫苗的免疫效果报道如下。
1 材料与方法
1.1 试剂、疫苗
“布病”虎红平板凝集试验抗原和试管凝集试验抗原,购自青岛易邦生物工程有限公司,在有效期内使用,按GB/T18646—2002规定的程序操作;S2株布氏杆菌活疫苗,购自中牧实业股份有限公司兰州生物药厂,每瓶含布氏杆菌弱毒活菌4 000亿CFU,用生理盐水稀释疫苗,每头奶牛口服接种500亿活菌剂量,采取投药器喷注到牛舌根及咽喉部免疫。
1.2 疫苗的安全性试验
口服接种S2株布氏杆菌减毒活疫苗以后,观察奶牛群的疫苗接种反应,记录疫苗接种前后1个月的泌乳单产量。
1.3 疫苗的免疫效果测定
根据奶牛场的生产记录,逐月统计疫苗接种前后能繁母牛发生流产、死胎症状的病例数,了解口服免疫对“布病”感染牛群控制流产率的效果;口服接种活疫苗以后15、30、45、60、90 d,对免疫奶牛群按20%的比例随机抽取血液样本,定性(虎红平板凝集试验)和定量(试管凝集试验)检测血清中的布氏杆菌抗体水平,了解活疫苗诱导的抗体消长动态。
1.4 鲜乳样本布氏杆菌核酸检测
10×PCR Buffer、MgCl2、dNTP、Taq DNA Polymerase、D200 DNA Marker等,购自大连宝生物工程有限公司。按照中华人民共和国农业行业标准(NY/T1467—2007),从鲜乳样本提取总DNA作为模板,针对布氏杆菌OMP25基因合成内外2对引物,采用嵌合式PCR方法进行扩增,扩增完成以后取5 μL PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。同时以S2株布氏杆菌活疫苗作为阳性对照,灭菌双蒸馏水作为空白对照,预期扩增片段长度为419 bp的DNA带。
2 结果
2.1 疫苗的安全性试验
奶牛群接种S2株布氏杆菌减毒活疫苗以后,均未观察到任何接种反应,包括发热、呼吸急促、食欲下降、流产和死胎等症状。接种疫苗前1个月泌乳单产量达到13.65 kg,接种疫苗后1个月泌乳单产量为13.66 kg,对牛乳产量没有显著的影响。结果表明,S2株布氏杆菌减毒活疫苗口服接种是安全的。
2.2 能繁母牛流产率的控制效果
2010年2月14日该奶牛场口服接种S2株布氏杆菌减毒活疫苗,疫苗接种前后能繁母牛逐月统计的流产率见图1。
接种疫苗以前3个月,“布病”感染奶牛场中能繁母牛的月平均流产率达到4.55%,2月上旬出现流产高峰(7.34%)。接种疫苗以后,能繁母牛的月平均流产率降低至2.11%,目前控制在1%以下。试验结果证实,S2株布氏杆菌减毒活疫苗能有效控制“布病”感染牛群发生流产、死胎的症状,减少能繁母牛因流产、死胎导致的经济损失。
2.3 疫苗诱导的血清抗体水平
奶牛群接种疫苗以后,定期采集血清样本检测疫苗诱导的抗体水平,结果见表1。
奶牛接种疫苗以后15 d,即可检出疫苗诱导的布氏杆菌抗体,29.7%的免疫牛显现虎红平板凝集阳性(血清学转换)。30 d抗体水平达到高峰(36%)。45～90 d抗体阳性率呈现缓慢下降的趋势(31.1%～24.5%)。试管凝集定量检测的抗体效价较低,5.6%～14%的血清样本抗体效价为1∶50,6.9%～10.8%的血清样本抗体效价达到1∶100以上。试管凝集试验测定的抗体消长动态与虎红平板凝集基本一致。监测结果表明,口服接种S2株布氏杆菌减毒活疫苗诱导形成的血清抗体水平较低,消失也较缓慢。
2.4 鲜乳样本布氏杆菌核酸检测结果
从接种疫苗的奶牛群不间断随机采集鲜乳样本90份,按NY/T1467—2007规定的程序操作,针对布氏杆菌OMP25基因进行嵌合式PCR扩增。结果见图2。
S2株布氏杆菌活疫苗阳性对照显现1条 419 bp 的DNA带,灭菌双蒸馏水空白对照不显现任何条带,4份被检鲜乳样本显现1条419 bp的DNA带,与预期扩增长度相符合。检测结果证实,免疫奶牛鲜乳样本中能够检出布氏杆菌核酸,检出率为4.44%(4/90)。
3 讨论
3.1 根据我国对牲畜布病疫情的监测结果分析,在上世纪80年代以前,“布病”疫区主要集中在内蒙古、新疆、青海、宁夏和西藏五大牧区;从上世纪90年代以后,牧区“布病”疫情依然严重,同时半农半牧区和农区省份的“布病”疫情明显上升[2]。2008年底,该规模养殖场从天津、唐山、西安大量引进奶牛,与本地牛群混合饲养,导致了“布病”疫情的流行和蔓延。由于养殖场中奶牛的“布病”感染率和患病率较高,处于“布病”感染潜伏期的奶牛数量较大,现阶段对“布病”重点疫区实施疫苗接种和检疫扑杀的综合防控策略。
试验结果表明:对奶牛口服接种S2株布氏杆菌减毒活疫苗是安全的,免疫接种能够有效控制“布病”感染牛群发生流产、死胎的症状,减少由此导致的经济损失。疫苗接种是目前控制重点疫区“布病”流行的一种方法。一旦奶牛群接种活疫苗以后,“布病”感染的疫情被掩盖,而不是消失,因为疫苗接种动物与自然患病动物无法甄别,法定检疫措施严重受阻。布氏杆菌是一种慢性胞内寄生感染,疫苗活菌在动物体内残存的时间较长,对奶牛群构成潜在的风险。同时,S2株活疫苗对人体具有一定的毒性,对奶牛场的饲养员、繁殖员和兽医员形成潜在的威胁。根据内蒙古农牧业科学院防制“布病”的经验,采用“S2株菌苗口服免疫为主的综合性防制措施”,1年1次即可控制“布病”大面积流行,连续3年免疫达到完全控制布病,通过加强检疫、监测和逐步淘汰,3～5年内实现奶牛场净化的目标。
3.2 在布氏杆菌疫苗接种过程中,诱导动物机体主要以细胞免疫为主,以体液免疫为辅。奶牛群口服接种S2株活疫苗以后,血清抗体阳性率达到24.5%～36%,抗体效价较低。这一监测结果与韩磊等[1]描述的血清抗体消长规律比较相似,即“抗体阳性率的最高值出现在免疫后15～45 d(平均30 d),抗体效价达到1∶50～1∶150”;与风英等[3]测定的数据存在较大差异, 即“泌乳牛和育成牛免疫后20、25、30 d的血清效价都达到1∶400”。
3.3 OMP25存在于所有布氏杆菌中,是布氏杆菌的主要外膜蛋白成分之一;OMP36主要存在于牛流产布氏杆菌(B.abortus)中,是构成跨膜通道的膜孔蛋白;OMP31主要存在于羊马尔它热布氏杆菌(B.melitensis)中,在绵羊附睾型布氏杆菌(B.ovis)和犬布氏杆菌(B.canis)中表达量也相对较高。按农业行业标准NY/T1467—2007规定的程序操作,针对布氏杆菌OMP25基因进行嵌合式PCR扩增,有利于提高样本中布氏杆菌的检出率,保证布氏杆菌核酸扩增的属特异性。温富勇等采用“布病”乳汁环状试验抗原检测86份免疫奶牛的鲜乳样本,未检出布氏杆菌特异性抗体,因此认为乳汁是安全的;风英等采用选择性培养基对鲜乳样本进行细菌学检查,未分离到布氏杆菌,因此认为“布病”阴性泌乳牛免疫后乳汁无排菌现象;本试验从“布病”阴性奶牛免疫后采集的鲜乳样本检出布氏杆菌核酸,检出率为4.44%。关于疫苗接种奶牛是否存在乳汁排菌的风险,各地学者持有不同的观点,报告了不同的结果。中国农业大学动物“布病”防控研究室吴清明指出,在“布病”流行和防控技术研究对策中,应增加动物性食品“布病”病原体的基本检测项目[4]。近年来随着现代分子生物学技术的不断发展,国内外学者开始将多聚酶链反应技术(PCR)应用于布氏杆菌核酸的检测[5,6,7]。在本试验检出的4份阳性鲜乳样本中,是存在活的布氏杆菌还是死的布氏杆菌,是接种的减毒疫苗株还是流行的野生强毒株,目前尚不清楚,关于鲜乳样本中布氏杆菌的分离培养与种型鉴定正在研究中。
摘要：某规模养殖场奶牛群发生布氏杆菌病流行和蔓延,能繁母牛出现流产、死胎症状。根据检疫结果对布氏杆菌病阳性牛隔离淘汰处理,对布氏杆菌病阴性牛(假定健康牛)进行免疫接种。奶牛群口服接种S2株活疫苗后15 d,即可检出疫苗诱导的布氏杆菌抗体,30 d抗体水平达到高峰(36%),4590 d抗体阳性率呈现缓慢下降的趋势。结果表明,S2株活疫苗免疫接种能有效控制布氏杆菌病感染牛群发生的流产、死胎症状,减少由此导致的经济损失。试验还对鲜乳样本中布氏杆菌核酸开展了PCR检测,对疫苗接种奶牛是否存在乳汁排菌风险进行了讨论。
关键词：奶牛,布氏杆菌病,S2株布氏杆菌活疫苗,免疫效果。
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