大肠杆菌耐药性研究（共10篇）
大肠杆菌耐药性研究 篇1
大量资料显示,集约化养殖场中禽源大肠杆菌耐药现状比较严重,这可能与饲料中添加药物制剂或原料药有关[1,2,3]。青海省偏远山区家禽的养殖主要以散养为主,没有使用药物及添加饲料的经济条件,都采用传统的饲养方式,家禽大量接触药物的可能性很小。为了进一步了解在这种饲喂方式下养殖的禽类体内大肠杆菌的耐药情况及其与省外其他地区存在的差异,本试验对青海山区禽源大肠杆菌的耐药性进行了探讨,旨在为该地区合理用药、有效防治禽大肠杆菌病提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验菌株与质控菌株
试验用大肠杆菌71株,从青海省湟中县共和镇尖达村、东台村、南村3个乡村家庭散养鸡肛拭子样本中分离获得。药敏试验质控菌株大肠杆菌( 菌株编号为ATCC25922) ,由中国农业大学提供。
1.2主要试剂
肠杆菌科细菌生化编码鉴定管( 11种 × 20支) ,购自杭州天和微生物试剂有限公司; 营养肉汤、营养琼脂、MHB肉汤、麦康凯琼脂等培养基,购自北京奥博星生物技术有限责任公司; PCR试剂,购自宝生物工程( 大连) 有限公司; 2 × Taq PCR Master Mix,购自TIANGEN公司。
1.3试验用抗菌药物
萘啶酸、盐酸左氧氟沙星、盐酸环丙沙星,购自浙江新华制药有限公司; 四环素、硫酸庆大霉素,购自邯郸滏荣制药有限公司; 氨苄西林、阿莫西林、克拉维酸,购自石家庄制药集团有限公司; 乳酸甲氧苄啶,购自山东达易利科技开发有限公司; 磺胺甲唑,购自山东寿光富康制药有限公司; 氟苯尼考,购自宁夏太平洋生物制药有限公司; 头孢噻吩钠、头孢噻呋钠、头孢唑林钠,购自浙江海正药业股份有限公司。
1.4细菌的分离鉴定
采用常规方法从肛拭子样本中分离试验菌株。 采用肠杆菌科细菌生化编码鉴定管及PCR法鉴定菌株,以生化试验结果及PCR结果均为大肠杆菌阳性者,确定为大肠杆菌。
1.5药敏试验
采用美国临床实验室标准化协会( CLSI) 推荐的微量稀释法进行药敏试验,测定71株大肠杆菌对12种( 组) 抗菌药物的最小抑菌浓度( MIC) 。在药物配制及结果判定时,萘啶酸、盐酸左氧氟沙星、盐酸环丙沙星参照《全国临床检验操作规程》( 第3版) 标准进行,其余药物均按照CLSI( 2008年) 标准进行。
2结果与分析
2.1试验菌株对抗菌药物的敏感性测定(结果见表1和表2)
株
注: - 表示无中介判断值; S 表示敏感,I 表示中介,R 表示耐药。
由表1可知,从尖达村、东台村、南村3个乡村分离的71株大肠杆菌对受试的12种( 组) 抗菌药物都有不同程度的耐药性,其中耐药性最高的药物为磺胺甲唑/甲氧苄啶,其余依次为四环素、氟苯尼考、萘啶酸、头孢噻呋。分离菌株对氨苄西林、盐酸环丙沙星、盐酸左氧氟沙星、庆大霉素、头孢噻吩、头孢唑啉、 阿莫西林/克拉维酸7种药物的耐药性较低。
由表2可知,各乡村的分离菌株对大多数抗菌药物都有不同程度的耐药性,并且各乡村菌株对各种药物的耐药性存在差异。
尖达村分离菌株耐药性和71株分离菌株总体情况基本一致,对磺胺甲唑/甲氧苄啶、氟苯尼考、四环素耐药性严重,对盐酸左氧氟沙星高度敏感( 敏感率为100% ) ,对阿莫西林/克拉维酸、头孢唑啉、庆大霉素较敏感,但对头孢噻呋、萘啶酸耐药率较高。
东台村分离菌株对庆大霉素、氨苄西林高度敏感,耐药率为0% ,对磺胺甲唑/甲氧苄啶耐药,对四环素、氟苯尼考的耐药水平较总体及尖达村低,但对盐酸左氧氟沙星、头孢噻呋的耐药率较高。
南村分离菌株对磺胺甲唑/甲氧苄啶、四环素、 氟苯尼考有严重的耐药性,对阿莫西林 /克拉维酸、头孢唑啉高度敏感,耐药率为0% ,但对头孢噻呋、萘啶酸耐药性较高,头孢噻吩中介率高。对庆大霉素、氨苄西林、盐酸左氧氟沙星较敏感。
尖达村分离得到的菌株耐药范围广,对11种 ( 组) 抗菌药物耐药,仅对1种抗菌药物无耐药性。 东台村分离得到的菌株对10种( 组) 抗菌药物耐药, 并且耐药率都较高。 南村分离得到的菌株对9种( 组) 抗菌药物耐药,并且除敏感药物外,分离菌株对庆大霉素、氨苄西林的耐药性较总体水平及尖达村分离菌株耐药性低。
%
2.2各乡村所分离的试验菌株多重耐药情况(结果见表3)
由表3可知,在3个乡村所分离的71株禽源大肠杆菌中,仅5. 6% 的菌株表现为对1种抗菌药物耐药,94. 4% 的菌株表现为多重耐药,其中耐2 ~ 4种抗菌药物的耐药菌株所占比例较大,分别为19. 7% 、 28. 2% 、26. 8% ; 耐5种及5种以上抗菌药物的耐药菌株所占比例小。
3讨论
1) 湟中县共和镇3个乡村分离所得的71株禽源大肠杆菌对12种 ( 组) 抗菌药物全部耐药,并且94. 4% 菌株呈现多重耐药,主要为耐2 ~ 4种药物的多重耐药。耐药性严重的药物主要是磺胺甲唑/甲氧苄啶、四环素、氟苯尼考,这与各地区禽源大肠杆菌耐药性研究报道结果[4,5]一致,说明各地区禽源大肠杆菌普遍存在多重耐药性。
2) 71株分离菌株对阿莫西林 / 克拉维酸、头孢唑啉、庆大霉素较敏感,其次为盐酸环丙沙星、盐酸左氧氟沙星、氨苄西林,但来源不同乡村的菌株其耐药性存在差异。为此,本地区禽源大肠杆菌病的治疗宜选择阿莫西林/克拉维酸、庆大霉素,不宜选择磺胺类、 天然四环素类、酰胺醇类药物。
3) 试验菌株来源于1 ~ 2年的山区散养鸡肛拭子样本。据调查,采样鸡最初来源于养鸡场25天左右的雏鸡,在散养过程中都用自产农作物饲养,除病鸡外都未用药,少数鸡在散养初期用过1 ~ 4周商品饲料,在此情况下,菌株仍然具有耐药性的机制有待于进一步研究。通过对采样鸡资料分析,试验菌株的耐药性与采样鸡是否使用过商品饲料及使用时间的长短无相关性。
4) 山区散养鸡在没有用药的情况下饲养1 ~ 2年后,其肠道大肠杆菌仍有严重的耐药性,说明细菌耐药性产生后很难自行消除。为此,合理用药、防止细菌耐药性的产生及如何消除细菌耐药性的研究工作,对养殖业的发展及保护人类健康具有重要意义。
大肠杆菌耐药性研究 篇2
【摘要】耐药结核病是全世界结核病疫情第三次回升的重要原因，结核病耐多药菌株的出现增加了结核病治疗的难度，目前，用于结核病治疗的一线要主要是利福平和异烟肼。异烟肼耐药机制非常复杂，与之耐药相关的基因较多，如：katG，inhA，aphC，kasA，ndh等。其中最主要的耐药基因为katG 、inhA 基因。利福平相关耐药基因研究较为明确，目前认为rpoB基因的突变是MDR-MTB菌株的标志。迄今为止，对利福平和异烟肼抗结核分支杆菌耐药性的检测方法有多种，实际工作中需要将多种检测方法同时运用，以使检测结果真实可信，及时为临床治疗提供有效的依据。
【关键词】耐药结核病；利福平，异烟肼；耐药基因；检测方法
肺结核是世界上主要的公共卫生问题，是严重危害人类身体健康的传染性疾病之一。二十世纪五、六十年代人们便期望找到一种有效的方法来控制肺结核的传染，最后达到治愈结核病的目的，但目前肺结核仍是一个全球性的流行病，成为全球性的公共卫生问题，每年大概有2-3百万的人死于这种疾病。近年来，肺结核在艾滋病患者中的广泛传播再一次引起了公众的关注1，耐药结核杆菌尤其是耐多药结核杆菌的出现和传播是导致结核病发病率升高的重要原因。本文就结核杆菌对利福平和异烟肼产生耐药性的相关基因，以及耐药性检测的方法做一综述2。
1 异烟肼
异烟肼（isoniazid，INH），是抗结核病的常用一线药物，在结核病的治疗中一直起着重要的作用。但大多数结核病患者如果长期用药易产生耐药性，这主要是由于长期使用INH可诱导细菌产生基因突变，从而使细菌对INH的耐药性增强。有研究表明 。
1.1 katG 基因是过氧化氢酶‐过氧化物酶的编码基因，katG基因全长2223个核苷酸，上游与相隔44个碱基的furA基因（一种结核杆菌铁调控蛋白编码基因，可能为katG基因的启动子，并调控其表达）相连，下游与相隔2794个碱基的embC基因相连。katG 基因最常见的点突变位点是第315位氨基酸和第463 位氨基酸。其常见的点突变是315位AGC→ACC和463位CGG→CTG。katG基因315位突变通常会造成过氧化氢一氧化物酶活性的降低，造成中等水平到高水平的耐药。在C. Yao1， T. Zhu2， Y. Li1， L. Zhang1， B. Zhang1， J. Huang1 and W. Fu 的研究中选取了41个样本，其中32个分离株的突变是AGC→ACC，9个分离株的突变是AGC→AAC。此外还有研究发现katG基因104、108、138、148位等突变。因而katG基因序列改变的具体位点与katG酶的活性的改变还有待进一步的研究。
1.2 inhA 基因是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）依赖的enoyl‐ACP 还原酶的编码基因。当活化的INH（异烟碱酰基）与inhA酶（enoyl-ACP还原酶）活性部位的辅因子NAD结合后，生成高亲和力的共价化合物，而削弱了NADH和enoyl-ACP还原酶的亲和力，进而干扰了脂酸的合成，从而发挥抗菌作用。inhA 基因突变约占异烟肼临床耐药株的8% ～ 20% ，耐药的发生可由于inhA结构基因突变造成INH与NADH的亲和力下降，或是inhA启动子-15的C→T的点突变，引起对INH耐药。与katG基因突变相比较，inhA基因的突变伴随低水平INH耐药性，InhA的突变不仅引起INH耐药，还会引起结构相近的二线抗结核药物乙硫异烟（ETH）的耐药性，而katG突变后耐药水平的高低取决于基因突变对过氧化氢—过氧化物酶活性的影响，突变导致酶活性完全丧失可引起高度INH耐药。
1.3 kasA 基因，ahpC基因和ndh基因
kasA 基因编码β‐酮酰基载体蛋白合成酶，与分枝菌酸生物合成相关，是异烟肼耐药的另一个相关基因，最常见的突变是第312位点。ahpC 基因是烯酰基还原酶的编码基因，参与氧化-应激应答的表达，它能控制解毒酶基因的如katG 基因的表达。Dhandayuthapani[9]等发现部分katG突变的耐异烟肼分离株存在ahpC启动子（存在于oxyR-ahpC区）突变，增强ahpC表达来补偿过氧化氢酶一过氧化物酶的缺乏，从而抵抗宿主巨噬细胞的氧化。ndh 基因能编码NADH 脱氢酶，ndh 基因的突变使NADH 脱氢酶活性受到抑制，使NADH/NAD 比率升高，抑制異烟肼的过氧化，也阻止异烟酰乙酸NADH 与inhA 酶的结合，从而使结核杆菌产生耐药性。katG、inhA、kasA 、ahpC和ndh基因突变并不能解释所有的异烟肼耐药问题，相关的机制还有待进一步研究。
随着异烟肼耐药相关基因和耐药机制的深入研究，其敏感性必定会得到较大提高。
2 利福平
利福平是抗结核病多药联合方案中的主要成分之一，其主要作用对象是结核分枝杆菌DNA 依赖的RNA 聚合酶的β 亚基，通过抑制mRNA 的转录，发挥抗菌作用，与之相关的耐药基因主要是其编码基因rpoB。rpoB基因是结核杆菌DNA依赖RNA聚合酶β亚单位的编码基因，全长3543个碱基，95%左右的RFP耐药菌株的基因突变都集中在rpoB基因507～533位的27个氨基酸（81bp）组成的区域，这一突变区被称为利福平耐药决定区（RRDR）。当RRDR发生突变时，包括点突变或短的插入、缺失突变等，使DNA依赖性RNA聚合酶B亚单位酶结构改变，利福平不能与细菌RNA聚合酶β亚单位结合而表现为耐药。已知RFP耐药菌的rpoB基因有14种突变，其中9种突变对利福布丁和利福喷丁交叉耐药。531、526位点突变株对所有利福霉素类药物均高度耐药。到目前为止，利福平相关耐药基因研究已较明确，其中以编码531位氨基酸的碱基TCG→TTG的和编码526位氨基酸的碱基CAC→TAC的突变最常见，因此这个区域的突变可作为一种检测结核杆菌耐RFP简易、快速的方法。在临床分离的MDR-MTB中，86%的耐药株有rpoB基因的突变，因此认为rpoB基因的突变是MDR-MTB菌株的标志。
3耐药性的检测方法
迄今为止，对利福平和异烟肼抗结核分支杆菌耐药性的检测方法有多种。变色液体培养基法3利用选择性培养基颜色的改变以检测结核分枝杆菌的耐药性。MTT检测法4 5也被用于结核分枝杆菌耐药性的检测，MTT是黄色四唑盐燃料能在有代谢活性的细胞内被脱氢酶降解产生紫色的甲月替，进而通过分光光度计（570nm）检测吸收光的变化。SYBR Green I-based real-time定量PCR检测法6也被用于结核分枝桿菌耐药性的检测。随着分子生物学的进一步发展，The GenoType MTBDRplus assay7是目前在结核分枝杆菌耐药性的检测中应用最为广泛的一种方法，与传统的检测方法相比较，该方法更能快速的检测出耐药的突变基因，但Jin8 等的研究表明，虽然The GenoType MTBDRplus assay具有较强的优越性，但在其研究中发现一个较罕见的katG S315N突变却不在这一检测方法内。
随着结核分支杆菌耐药性的不断增强以及新型耐药菌株的不断出现，目前如果只单纯的运用某一方法来进行检测是不能得到准确可信的结果，因而我们要将多种检测方法同时运用，以使检测结果真实可信为结核分枝杆菌耐药的检测提供优效的证据。
4 展望
结核病耐多药菌株的出现增加了结核病治疗的难度，而耐药机制是治疗的关键，随着分子生物学技术的发展，耐药机制的研究得到了有效的提高。结核病耐多药菌株主要是由于基因的突变引起，及时对患者的突变菌株进行检测为临床的治疗将提供有效的治疗依据，从而减轻患者的病情，为进一步治疗和控制耐多药结核病提供了有效的手段。
参考文献
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大肠杆菌耐药性研究 篇3
1 材料
1.1 试验菌种
来源于本地区11家肉种鸡场和商品肉鸡场的发病鸡, 取病料分离培养而得。
1.2 药品与试剂
致病性大肠杆菌阳性血清, 购自中国兽药监察所。西药药敏纸片购自北京天坛药物生物技术开发公司, 中草药药敏纸片为自制 (相当于含原生药10 mg/片) 。
中草药组方 (每克) :双黄连 (金银花0.40 g、黄连0.60 g) 、白头翁散 (白头翁0.35 g、黄连0.25 g、黄柏0.25 g、秦皮0.15 g) 、三黄加白散 (黄连0.35 g、黄柏0.25 g、黄芩0.25 g、白头翁0.15 g ) 、苦参合剂 (苦参0.60 g、黄连0.40 g) 、鱼腥草粉剂 (1.00 g) 、穿心莲粉剂 (穿心莲粉剂1.00 g) 。用时浓度相当于含原生药1 g/mL。
2 方法与结果
2.1 致病性大肠杆菌的分离与鉴定
2.1.1 菌种的分离
剖检病死鸡, 无菌采取病死鸡的心血、肝脏病料接种于乳糖胆盐肉汤培养基中进行增菌培养, 进一步移接至伊红-美兰琼脂培养基, 37 ℃培养24 h, 挑选典型菌落接种到斜面培养基上作为试验菌种保存。
2.1.2 生化试验
按常规方法进行。结果表明:分离的菌种能发酵甘露醇、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、鼠李糖、蕈糖、果糖, 产酸产气;靛基质试验和M.R.试验阳性;山梨醇、鸟氨酸试验结果阳性;V-P试验和卫矛醇、肌醇、硝酸盐、酒石酸盐、水杨素、精氨酸水解酶、阿拉伯醇、血清菊糖、鸟氨酸、精氨酸脱羧酶、丙氨酸盐、乙酰胺利用试验结果阴性。上述试验结果表明病料中分离出的细菌是病原性大肠杆菌。
2.1.3 血清型鉴定
采用试管凝集方法, 在每毫升含10～60亿菌体抗原的肉汤培养物中加入等量的被检动物菌体抗原阳性血清, 摇匀, 在2～3 min内发生凝集反应者为阳性反应, 不发生凝集反应者则为阴性反应, 根据阳性血清的抗原种类判定被检菌株的血清型。结果见表1。
2.2 诱导前药敏试验
根据血清学试验, 将优势血清型O78作为进一步试验研究对象。试验前将试验菌种在无药乳糖胆盐肉汤培养基上继代接种培养10代, 尽量消除已产生的耐药性。采用纸片扩散法进行药敏试验, 结果见表2 。
2.3 耐药诱导试验结果
注:抑菌圈直径<10 mm为不敏感, 10 mm≤抑菌圈直径<15 mm为中度敏感, 15 mm≤抑菌圈直径<25 mm为高度敏感, 抑菌圈直径≥25 mm为极度敏感。
根据上述试验结果, 选取原始药敏试验中抑菌直径≥15mm的抗菌药物作为进一步试验研究对象进行耐药诱导试验。操作方法: (1) 取已加入5 mL乳糖胆盐发酵培养基的试管27支, 在无菌操作台上将第1～26管中分别用微量移液器移入一种抗菌药物原液, 计算移入药液的量, 使各管中抗菌药物浓度达到抗菌原液的1×10-5, 混匀, 并作好标记, 第27管作空白生长对照。 (2) 将试验菌种接入各试管中, 作抗菌药物的适应性培养, 37 ℃培养24 h, 结果大肠杆菌均能在该浓度培养液中生长良好。 (3) 另取已加入5 mL乳糖胆盐发酵培养基试管27支, 用同样无菌操作方式, 将试管中各抗菌药物抗菌原液稀释至1×10-4, 同样作好标记, 将上述适应培养的大肠杆菌相对应地移接至该浓度培养基中, 37 ℃ 培养 24 h。 (4) 在大肠杆菌在培养基上生长良好时即可移接入下一个10倍梯度的对应抗菌药物培养基中继代培养, 否则仍在同一梯度中继代培养, 直至生长良好, 同时记录细菌的生长情况, 观察培养结果。耐药诱导试验结果见表3 。
2.4 耐药诱导后的药敏试验结果
当细菌不断适应含药培养基环境而产生耐药性后, 随着抗菌药物浓度的10倍递增, 在某一浓度仍无法继续良好生长和继代时, 即可停止该药物的耐药试验, 保留末代产生耐药的菌种, 并分别用纸片法作末代耐药菌种对抗菌药物敏感试验, 结果见表4。
2.5 敏感性恢复试验结果
将已经产生耐药性的大肠杆菌末代培养物分别移接至无药的乳糖胆盐肉汤中继代培养, 并作原耐药名称的标记, 37 ℃培养24 h为一代。每代培养后, 均用原抗菌药敏纸片作药敏试验, 直至细菌对已耐药的抗菌药物敏感性最大程度的恢复, 即可停止继代培养, 并记录试验结果。结果见表5。
3 结论
(1) 鸡大肠杆菌病在铁岭地区普遍存在, 分离的致病性大肠杆菌血清型为O1、O2、 O35、O36、O78、O111, 其中O78为优势血清型。
大肠杆菌耐药性研究 篇4
关键词：鸭疫里默氏杆菌；血清型；鉴定；药敏试验
中图分类号： S858.322.61文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）01-0168-02
收稿日期：2013-05-09
基金项目：江苏省高等学校大学生实践创新训练计划（编号：2012JSSPITP3463）；江苏农牧科技职业学院科技资助项目（编号：YB1204）。
作者简介：蔡丙严（1980—），男，河南濮阳人，硕士，讲师，主要从事动物防疫与检疫专业的教学及科研工作。E-mail：caibingyan20@163.com。鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer，RA）是一种革兰氏阴性、无鞭毛、无芽孢的棒状杆菌，瑞氏染色呈两极着色。鸭疫里默氏杆菌所引起的传染病称为鸭传染性浆膜炎，该病呈世界范围分布，给养鸭业带来了巨大的经济损失[1]。
RA对营养要求较高，在普通营养琼脂和麦康凯琼脂上不生长，在胰酶大豆琼脂（TSA）、血液琼脂、巧克力琼脂上生长良好。RA在初次分离培养时对CO2依赖性强，一般在烛罐或CO2培养箱中，提高CO2浓度和湿度，37 ℃培养 48～72 h，RA生长最佳[2]。RA血清型众多且非常复杂，现在国际上报道的血清型共有21 种，其中优势血清型为 1 型和 2 型[3]，在我国，程安春等在此基础上又发现了4 个新的血清型[4]。血清型的复杂及血清型之间无交叉保护力给此病的防治带来极大的困难，多年来，由于生产上盲目用药、滥用药或超剂量用药，RA对各种抗生素均产生不同程度的耐药性，尤其对喹诺酮类和氨基糖苷类抗生素的耐药性非常普遍，耐药率极高，耐药情况复杂，并且来自同一群不同株对同一药物敏感性有差异的情况非常普遍[5-6]。
从江苏泰州周边地区2个规模养鸭场临床疑似鸭疫里默氏杆菌感染的病死鸭中，进行病原分离和血清型鉴定，并且对分离菌株进行药敏试验，为切实做好该病的防治工作提供依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1病料来源2013年3月，从泰州周边地区获得临床具有典型鸭疫里默氏杆菌感染的病死鸭，从病死鸭的脑、心血、肝脏中分离获得2株菌株，分别命名为TY1、TY2。
1.1.2培养基胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA，批号：2107469）、胰蛋白酶大豆肉汤培养基（TSB，批号：2191068），均购自碧迪医疗器械（上海）有限公司；麦康凯琼脂培养基（批号：12075）、普通琼脂培养基（批号：120909），均购自杭州天和微生物试剂有限公司。
1.1.3药品阿莫西林、庆大霉素、环丙沙星、多西环素、头孢吡肟、阿米卡星、复方新诺明、青霉素、链霉素、阿奇霉素、林可霉素、利福平等12种药敏试纸（批号：20120920），购自杭州天和微生物试剂有限公司。
1.1.4试剂革兰氏染液、瑞氏染液、微量生化发酵管，均购自杭州天和微生物试剂有限公司；犊牛血清，购自浙江天航生物科技有限公司；鸭疫里默氏杆菌1～10型阳性血清，购自中国兽医药品监察所。
1.2方法
1.2.1细菌分离培养与形态观察无菌采取病死鸭脑、心血、肝脏等病料，分别接种于普通琼脂培养基、胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）、巧克力琼脂培养基、鲜血琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基平板上，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养 48 h。观察菌落形态，挑取单个疑似菌落涂片，革兰氏染色和瑞氏染色镜检，纯培养后，以40%甘油生理盐水于-70 ℃保存备用。
1.2.2生化试验挑取TSA 琼脂培养基、鲜血琼脂培养基平板上纯化的疑似 RA 菌株，按 Edwards PR 的方法用接种环在超净台将菌落接种于乳糖、半乳糖、蕈糖、果糖、蔗糖、棉子糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇、枸橼酸盐、H2S、M-R、V-P 尿素酶、吲哚等生化培养基上，继续培养 48～72 h 观察试验结果。
1.2.3血清型鉴定将纯化培养的分离菌株在含有5%犊牛血清的 TSA 培养基上，37 ℃、5% CO2培养箱中培养36 h。取1滴标准阳性血清滴于干净玻片上，挑取少量菌落混匀于标准阳性血清中，静置片刻观察玻片凝集结果。
1.2.4药敏试验采用K-B纸片扩散法，将保存的2株菌株分别在TSA琼脂培养基平板上扩增培养，刮取菌落，用灭菌生理盐水稀释细菌悬液至1.5×108个/mL，吸取0.1 mL均匀涂布于TSA琼脂培养基平板上，待菌液表面干燥后，用灭菌镊子将抗生素纸片贴附在琼脂表面，继续培养 48 h后测量抑菌圈直径。
2结果与分析
2.1细菌分离培养特性与形态特征
分离菌株在胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）上生长良好，菌落湿润，小菌落呈露滴样，在麦康凯琼脂培养基和营养琼脂培养基上不生长。取菌落涂片、染色镜檢，革兰氏染色可见阴性小杆菌，单个或成双存在；瑞氏染色呈现两极浓染的小杆菌。
2.2生化试验
由表1可见，TY1和TY2株均不发酵乳糖、半乳糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖等多种碳水化合物，不产生靛基质和硫化氢，过氧化氢酶、氧化酶和明胶液化试验为阳性，符合鸭疫里默氏杆菌的生化反应特征。
表12株分离菌株生化特性鉴定结果
nlc202309041843
项目1结果1项目1结果1项目1结果乳糖1-1麦芽糖1-1M-R1-半乳糖1-1甘露醇1-1H2S1-覃糖1-1山梨醇1-1过氧化氢酶1+果糖1-1枸橼酸盐1-1尿素酶1-蔗糖1-1硝酸盐还原1-1氧化酶1+棉子糖1-1柠檬酸盐1-1吲哚1-葡萄糖1-1V-P1-1明胶液化1+
2.3血清型鉴定
将TY1和TY2株分别与鸭疫里默氏杆菌1～10型单因子阳性血清做玻片凝集试验，两菌株均与1型阳性血清出现清晰的乳白色絮状凝集块，与其他型阳性血清均不反应。由此鉴定，TY1和TY2株均为血清1型。
2.4药敏试验
由表2可见，TY1和TY2株对头孢吡肟、环丙沙星高度敏感，对强力霉素、阿莫西林中度敏感，对复方新诺明、阿米卡星、庆大霉素、青霉素、链霉素、阿奇霉素、林可霉素、利福平耐药。
表22株分离菌株的药敏试验结果
药物名称1抑菌圈直径（mm）TY11TY21药物浓度
（μg/片）头孢吡肟119118115环丙沙星11611715强力霉素112113130阿莫西林114111110复方新诺明1919123.71、1.25阿米卡星1918130庆大霉素1818110青霉素1917110链霉素1718110阿奇霉素1816115林可霉素151712利福平151315注：抑菌圈直径10 mm 以下为耐药（不敏感）；10～15 mm为中度敏感；15 mm以上为高度敏感。
3小结与讨论
鸭疫里默氏杆菌初次分离培养，由于所需生长条件苛刻、病料不新鲜和鸭场大量使用抗生素等原因，往往不易分离到，因此，RA初次分离，病料的采取和培养条件的选择至关重要。从分离过程中发现，在病鸭刚死亡或濒临死亡时无菌采取鸭脑组织和心血，且在TSA琼脂培养基平板上37 ℃、5% CO2培养箱中培养24～48 h，病菌分离成功率较高。
血清型鉴定有利于疫苗的研究和RA 控制。由于RA 血清型较多，且各血清型之间的交叉保护性差， 因此，研制针对本地血清型的RA疫苗对于鸭疫里默氏杆菌的防治具有重要意义[7]。根据胡清海等人的调查，江苏地区主要以1、2、10 型为主[8]。从本次试验结果可知，泰州周边地区规模鸭场分离的2株RA菌株均为血清1型，基本摸清了本地区流行RA菌株的优势血清型，为研制相应血清型的疫苗、控制该病的发生奠定了理论基础。
目前，鸭疫里默氏杆菌已成为国内危害养鸭业最严重的传染病之一，大部分鸭场，尤其是肉鸭场都有此病发生。虽然 RA 对多种抗生素敏感，但极易产生耐药性，而且不同地区、不同菌株对抗菌药物的敏感性不一，给实际治疗工作带来困难，最好能对当地分离菌株进行药敏试验，以便选择最佳药物进行治疗[9]。头孢吡肟为新的第四代注射用头孢菌素，对葡萄球菌属和肠杆菌属（尤其产气和阴沟肠杆菌）的作用更强，对多种质粒介导和染色体介导的β内酰胺酶稳定，兽医临床应用较少。本次药敏试验结果表明，泰州地区鸭疫里默氏杆菌对头孢吡肟和环丙沙星高度敏感，对氨基糖苷类抗生素如庆大霉素、丁胺卡那霉素、林可胺类抗生素和磺胺类抗生素等耐药。因此，临床选择用药时必须以药敏试验结果为依据，才能做到正确用药，减少耐药菌的产生，从而提高治愈率，减少经济损失[10]，有条件的鸭场更应定期对环境中RA的药敏特性进行监测，以便在发病时及时有效地用药。
参考文献：
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[8]胡清海，张知良，苗晋锋，等. 江苏安徽两省鸭疫里默氏杆菌病的流行病学调查研究[J]. 中国兽医科技，2001，31（8）：12-13.
[9]谢永平，陈泽祥，许力干，等. 鴨疫里默氏杆菌的分离鉴定及耐药性研究[J]. 广西农业科学，2010，41（7）：729-731.
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大肠杆菌耐药性研究 篇5
1 材料与方法
1.1 菌株
选取本项目组分离鉴定和保存的34株禽致病性大肠杆菌且为辽宁地区优势血清型的代表菌株进行试验。
1.2 药敏纸片
本试验选用的药敏纸片购于杭州微生物试剂有限公司, 选用20种, 药敏纸片规格及其判定标准如表1。
注:低敏 (R) , 中敏 (M) , 高敏 (S) 。
1.3 培养基
麦康凯琼脂、普通营养琼脂和酪蛋白培养基均购自北京奥博星科技有限公司。
1.4 药敏试验
纸片扩散法, 用灭菌接种环挑取待检菌的单个菌落, 用灭菌注射用水稀释到0.5麦氏, 用无菌棉签蘸取菌液均匀涂布于琼脂平板上, 用无菌镊子将药敏纸片贴于培养基表面。将贴好的平皿倒放于37℃恒温箱, 培养18 h后用游标卡尺测量各纸片抑菌直径, 以毫米为单位。
2 试验结果分析
详情见表2。
mm
通过34株禽致病性大肠杆菌分离株对临床常用的20种抗菌药物耐药性的测定统计分析看, 具有如下特点。
2.1 耐药率逐渐升高耐药率逐渐升高, 耐药谱逐渐变广
34株菌耐药谱达28种, 几乎每株都有自己的耐药谱。与2005年相比, 头孢类耐药率增加46.6%, 卡那霉素耐药率增加13.6%, 新霉素耐药率增加33%, 见表3。
2.2 多重耐药趋势增加
34株分离株均为多重耐药, 除庆大霉素、丁安卡那霉素、多粘菌素B、美满霉素外, 分离株对其他16种药物均具有较强的耐药性, 耐药率达50%以上。总体看对氨基糖苷类敏感性较好, 对大环内酯类、β-内酰胺类、四环素类均有较强的耐药性。多重耐药有增加趋势, 2005年本项目组检测的50%以上禽源大肠杆菌分离株对至少10种药物产生不同程度的耐药性, 本次试验34株大肠杆菌均为多重耐药, 仅1株对5种药物耐药, 94.1%的分离株对10种以上药物耐药, 17.6%的分离株 (6株) 对15种药物耐药, 26.4%的分离株 (9株) 对16种药物耐药, 各有2株对18种药及19种药物耐药。可见, 多重耐药现象普遍, 具有明显的增加趋势, 见表4。
2.3 血清型与耐药性关系分析
将试验菌株的耐药性与血清型进行相关性分析, 发现各个分离菌株的血清型与耐药性之间没有明显的相关性, 相同耐药性可出现不同的血清型, 同一血清型的菌株同样表现出不同的耐药性。试验中血清型O92菌株虽然3株菌都对15种药物耐药, 但每株菌又有各自的耐药谱。所以对优势血清型菌株耐药性进行统计分析, 结果表明, 两者之间没有明显的相关性, 见表5。
备注:“15-2”表示耐15种药的菌株数为2。
2.4 交叉耐药
大肠杆菌对某种药物耐药后, 对于结构近似或作用性质相同的药物也可显示耐药, 即交叉耐药。本实验结果菌株对大环内酯类、喹诺酮类、β-内酰胺类表现出明显的交叉耐药。
3 讨论与分析
由于各种抗菌药物的广泛应用, 尤其广谱及超广谱药物不加控制的应用, 是造成耐药菌株大量出现的重要原因, 抗菌药是治疗临床疾病、维持动物健康和生产的重要工具, 同时也是促进动物和人类耐药性微生物产生、选择和传播的重要因素。抗菌药能使接受治疗的机体体内病原菌产生耐药性, 而且能引起整个内源菌群产生耐药。
革兰阴性杆菌耐药性研究 篇6
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
我院ICU病区及烧伤病区患者不同部位分离的革兰阴性杆菌共206株。德灵MicroScan/autoScan4自动微生物分析仪。
1.2 菌株分布
(1)菌株在标本中的分布:革兰阴性杆菌来自痰液标本10株占4.9%;尿液20株占9.7%;脓液160株占77.7%;穿刺液2株占1.0%;血液4株占1.9%;其他标本10株占4.7%。(2)菌株在病区中的分布:重症监护病房(ICU)分离70株占34.0%;老干部病房50株占24.3%;呼吸内科50株占24.3%;其他病区36株占17.6%。
1.3 方法
(1)药敏试验:将相当于0.5麦氏浊度的纯菌悬液接种于B1017-135测试板上,终点浓度达(4～7)×105cfu/ml,经35℃16～20h培养,用MicroScan/autoScan4自动微生物分析仪读板,对菌种进行鉴定以及测得MIC(最低抑菌浓度)。(2)抗生素种类:亚胺培南,头孢他啶,环丙沙星,庆大霉素,头孢曲松钠,头孢吡肟,头孢呋肟,头孢噻肟,头孢西丁,头孢唑啉,氨曲南,阿莫西林/克拉维酸钾。
2 结 果
12种抗生素的耐药率由低到高依次为:亚胺培南(10%);头孢他啶(16%);头孢唑啉(23%);环丙沙星(30%);氨曲南(31%);头孢吡肟(34%);头孢噻肟(43%);头孢西丁(44%);庆大霉素(45%);头孢曲松钠(48%);阿莫西林/克拉维酸钾(60%);头孢呋肟(70%)。亚胺培南和头孢他啶可抵抗84%以上的菌。具体情况见表1。
3 讨 论
我院革兰阴性杆菌感染高发病区为ICU、干部病房、呼吸内科。主要原因是ICU内均为危重症患者,且多接受气管切开、机械通气、留置胃管、导尿管等侵入性治疗。耐药率最低的前6位抗生素的抗菌谱:从6种抗生素的分布看出,耐亚胺培南的主要菌为嗜麦芽窄食单胞菌;耐头孢他啶的主要菌为产诱导型β-内酰胺酶菌群(即:肠杆菌属,弗劳地枸橼酸杆菌,摩根菌,斯氏普罗菲登菌,沙雷菌属)和不动杆菌;耐环丙沙星和氨曲南的主要菌为不动杆菌和大肠埃希菌,后者还有内酰胺酶菌群(即:肠杆菌属,弗劳地枸橼酸杆菌,摩根菌,斯氏普罗菲登菌,沙雷菌属)和不动杆菌;耐环丙沙星和氨曲南型β-内酰胺酶菌群。耐头孢吡肟的主要菌为嗜麦芽窄食单胞菌,不动杆菌,产诱导型β-内酰胺酶菌群和大肠埃希菌。
几种主要耐药菌的耐药特点:(1)大肠埃希菌和克雷伯菌:是产质粒介导的超广谱β-内酰胺酶(ESBL)的代表菌种[1],ESBL的特点是能被β-内酰胺酶抑制剂抑制,对β-内酰胺类和氨基糖苷类在内的常用抗菌药物出现多重耐药性[2];头孢他啶是识别ESBL的最佳底物之一[3],对其的耐药率仅有8%～10%。(2)肠杆菌科的产诱导型β-内酰胺酶菌群,包括阴沟肠杆菌、弗劳地枸橼酸杆菌、黏质沙雷菌等,对第3、4代头孢菌素高度耐药。(3)铜绿假单胞菌分离率最高,12种抗生素中,6种对其耐药率在20%以下。铜绿假单胞菌对多种抗生素表现出天然或获得性多重耐药(MDR),其产生的多种酶都能抵抗酶抑制剂的作用。(4)不动杆菌属的分离率居第3位,特别是ICU病房更多见,这与王金良[4]的报道相符;不动杆菌对头孢噻肟,头孢西丁及头孢吡肟和庆大霉素的耐药率较高(41%～84%),耐药率较低的是亚胺培南和头孢他啶。(5)嗜麦芽窄食单胞菌:头孢噻肟和头孢他啶对嗜麦芽窄食单胞菌的耐药率最低,分别是20%和26%;亚胺培南和环丙沙星的耐药率分别是91%和74%,与Vartivrian等的报道相近。74%的嗜麦芽窄食单胞菌对环丙沙星耐药,这是因为环丙沙星广泛用于癌症患者的治疗,以致出现大量的耐药菌株。在医院感染中,首选的抗生素应为复合磺胺类和强力霉素等。(6)在细菌感染中,随着患者住院天数增加,抗生素使用率不断增加,患者分离菌的耐药性也不断上升,形成了抗生素使用与耐药菌出现的恶性循环,最后影响了准确的治疗,因此严格抗生素使用制度非常必要。
参考文献
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大肠杆菌耐药性研究 篇7
1 材料与方法
1.1 菌种
敏感大肠杆菌标准株M1, 由延边大学农学院微生物实验室提供;耐药大肠杆菌K88, 由韩国国立兽医研究所提供;耐药大肠杆菌N01、N02, 由延边大学药理实验室提供。
1.2 中药连翘
中药连翘, 由延边大学农学院药理实验室提供。
1.3 耐药菌株的诱导
采用浓度梯度法进行人工诱导, 具体参照参考文献[2]。以大肠杆菌最小抑菌浓度 (MIC) 的前一个浓度为起始浓度按2的幂次方20, 21, 22, 23, 24, 25, ……依次配制药物含量逐渐递增的LB培养基。首先以敏感大肠杆菌标准株M1对环丙沙星的1/2 MIC为起始浓度, 连续培养5代;在每次进行下一轮培养之前先将菌液移至无药液体培养基中培养, 并进行无杂菌检查;之后将连续诱导的大肠杆菌菌液接入药物浓度等于MIC的含药培养基中, 待其生长后在同一药物浓度的培养基中连续传代2次;然后接种到相邻的高药物浓度的培养基中, 待其生长后传代2次, 再接种到下一个药物浓度的培养基中;依次在20 MIC、21 MIC、22 MIC、23 MIC、24 MIC、25 MIC等逐步升高的药物浓度下连续诱导直至产生耐药性。同样在移至浓度升高的液体培养基之前先在无药液体培养基中培养, 并进行无杂菌检查。
将得到的对环丙沙星耐药的大肠杆菌分别进行氯霉素和四环素的MIC测定及耐药诱导, 在此过程中其方法、步骤均同环丙沙星。在进行耐药诱导的同时还要进行大肠杆菌的鉴别, 以确定没有其他杂菌的污染。
1.4 耐药性抑制试验
1.4.1 平板点种法
参照参考文献[3]中的方法并稍作改进后进行。抑制率= (点种菌落数-药物平板生长菌落数) /点种菌落数×100%。
1.4.2 药敏纸片法
参照参考文献[3]中的方法并稍作改进后进行。
2 结果
2.1 耐药菌株诱导的结果
经环丙沙星诱导, 敏感大肠杆菌标准株M1由低浓度环丙沙星到高浓度环丙沙星逐渐适应, 在含药物培养基中生长速度由缓慢逐渐转为正常。最后选出环丙沙星MIC为8 μg/mL的耐药菌株, 之后转到含有氯霉素和四环素培养基中继续培养诱导, 分别得到氯霉素MIC为32 μg/mL和四环素MIC为32 μg/mL的耐药菌株, 将其作为人工诱导的耐药菌株并编号为M01。
2.2 耐药性抑制试验的结果
2.2.1 平板点种法试验的结果
选取在含有中药连翘 (32 mg/mL) 的琼脂培养基上生长的200个单个菌落, 分别对应点种于含有环丙沙星 (4 μg/mL) 、氯霉素 (16 μg/mL) 和四环素 (16 μg/mL) 的琼脂培养基上。结果见表1、表2。
注:Ⅰ表示中药连翘作用前菌落生长数;Ⅱ表示中药连翘作用后菌落生长数;Ⅲ表示抑制率。
由表1可知:中药连翘对M1、K88、M01的3种抗生素耐药性有较高的抑制作用, 抑制率较高;对菌株N01、 N02的氯霉素耐药性的抑制率较低, 而对环丙沙星和四环素耐药性的抑制率较高。
注:*表示与敏感大肠杆菌标准株M1相比差异显著 (P<0.05) 。
由表2可知, 中药连翘对耐药大肠杆菌K88和M01的抑制率与M1相比差异不显著 (P>0.05) , 对N01、N02的氯霉素抑制率与M1相比差异显著 (P<0.05) 。
2.2.2 药敏纸片法试验的结果
分别将不同的耐药大肠杆菌用中药连翘 (32 mg/mL) 处理, 再进行药敏试验, 结果见表3、表4。
注:Ⅰ表示中药连翘作用前的抑菌环直径;Ⅱ表示中药连翘作用后的抑菌环直径。
由表3可知, 经中药连翘作用后耐药大肠杆菌K88、M01、N01 和N02对环丙沙星的耐药性明显降低, 但N01 和N02对氯霉素的耐药性改变不明显。
注:*表示与敏感大肠杆菌标准株M1相比差异显著 (P<0.05) 。
由表4可知, 经中药连翘作用后耐药大肠杆菌K88、M01、N01 和N02对环丙沙星和四环素的抑菌环大小与M1相比差异不显著 (P>0.05) , N01和 N02对氯霉素的抑菌环大小与M1相比差异显著 (P<0.05) 。
3 讨论
(1) 试验结果证明平板点种法和药敏纸片法结果一致, 表明中药连翘对大肠杆菌的耐药性具有明显的抑制作用。通过平板点种法检测药物对耐药大肠杆菌的抑制率可直观得出耐药性被抑制的程度;而药敏纸片法则通过抑菌环大小体现耐药性变化水平。但中药连翘的有效作用成分及作用机制还有待于进一步研究。
(2) 试验结果证明中药连翘能有效提高大肠杆菌对某些抗生素的敏感性, 但不是对所有的试验菌株均有效。由试验结果可知, 中药连翘对耐药大肠杆菌N01、N02的氯霉素耐药性抑制作用较低, 但对耐药大肠杆菌K88、M01、N01 N02的环丙沙星与四环素的耐药性抑制作用较高, 说明耐药大肠杆菌对不同药物抗性也有较大的差别。中药连翘对耐药大肠杆菌环丙沙星和四环素的耐药性抑制作用明显高于对氯霉素的耐药性抑制作用, 原因可能是不同耐药大肠杆菌对不同药物产生耐药的机制不同造成的[4]。
(3) 试验初步研究了中药连翘对耐药大肠杆菌的抑制作用, 为进一步从分子水平上探讨中药抑制耐药大肠杆菌的作用机制提供了参考依据。
参考文献
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大肠杆菌耐药性研究 篇8
本研究以贵州大学动物科学学院预防兽医实验室保存的具有多重耐药性的鸭源大肠杆菌分离株E.coil 1 作为试验菌株,对E. coil 1 进行质粒DNA提取,通过PCR技术检测E. coil 1 的TEM型耐药基因,并采用高温- SDS法对菌株进行耐药质粒消除,旨在为研究鸭源大肠杆菌耐药性逆转剂及临床上治疗大肠杆菌病提供一定的理论依据。
1 材料
1. 1 菌株
大肠杆菌试验菌株E. coil 1,为贵州大学动物科学学院预防兽医实验室从临床患鸭病料中分离获得,经培养特征、生化试验、药敏试验、致病性试验及β -内酰胺类耐药基因检测,该菌含TEM型耐药基因。
1. 2 主要试剂
麦康凯琼脂培养基、普通营养琼脂培养基、LB液体培养基及8 种 β - 内酰胺类药敏纸片( 青霉素G、头孢曲松、阿莫西林、头孢氨苄、头孢噻肟、头孢他啶、氨苄西林、苯唑西林) ,均购自杭州微生物试剂有限公司; DL - 2 000 Marker、2 × Taq PCR Master Mix( 包含Taq DNA聚合酶、d NTP、PCR Buffer等) 、质粒小提试剂盒,均购自天根生化科技( 北京) 有限公司; Gold-View Ⅰ型核酸染料,购自北京索莱宝科技有限公司;十二烷胺磺酸钠( SDS) ,为分析纯。
1. 3 引物序列
试验所用引物为TEM型耐药基因的通用引物,引物序列见表1,引物由生工生物工程( 上海) 股份有限公司合成。
2 方法
2. 1 药敏试验
耐药质粒消除前后采用药敏纸片扩散法对E.coil 1 进行耐药情况调查。取增菌培养物150 μL,均匀涂布于普通营养琼脂培养基上,待菌液干后用无菌眼科镊贴入药敏纸片,于37 ℃倒置培养24 h后测定抑菌圈直径并记录。药敏试验判定标准参照药敏纸片的抑菌范围解释标准。
2. 2 质粒的提取
将试验菌E. coil 1 划线接种于麦康凯琼脂培养基上,37 ℃培养24 h; 挑取单个菌落接种于LB液体培养基中,置摇床中于37 ℃培养24 h; 采用质粒小提试剂盒提取细菌质粒DNA,以质粒DNA为PCR扩增模板,- 20 ℃保存,备用。
2. 3 质粒DNA耐药基因的PCR扩增
以质粒DNA为模板,对试验菌E. coil 1 进行耐药基因PCR扩增。PCR反应体系: 2 × Taq PCR Mas-ter Mix 12 μL,上、下游引物各0. 5 μL,模板1 μL,加灭菌双蒸水至25 μL。PCR反应条件: 95 ℃ 预变性5 min; 94 ℃ 变性30 s,56 ℃ 退火1 min,72 ℃ 延伸1 min,共30 个循环; 72 ℃ 终延伸10 min; 最终4 ℃ 结束反应。PCR产物用1% 琼脂糖凝胶电泳检测,并用凝胶成像仪观察及拍照。
2. 4 耐药质粒的消除
采用SDS - 高温交替法对耐药质粒进行消除。将试验菌E. coil 1 划线接种于普通营养琼脂培养基上,37 ℃培养24 h; 挑取单个菌落接种于LB液体培养基上,37 ℃培养18 h; 取该增菌培养物50 μL,接种于5 m L SDS终浓度为0. 5% 的LB液体培养基中,置摇床中于37 ℃振荡培养18 h; 取50 μL该培养物接种于5 m L LB液体培养基中,43 ℃ 培养18 h; 以SDS与高温反复交替处理。提取交替处理后的细菌培养物的质粒,以琼脂糖凝胶电泳对质粒消除情况进行检测,若质粒带未发生变化则继续进行消除; 若质粒带发生变化则进行质粒PCR检测,并结合药敏试验结果对耐药基因的消除情况进行判断。
3 结果与分析
3. 1 质粒DNA耐药基因的PCR扩增结果
采用TEM型耐药基因的通用引物对试验菌耐药质粒消除前所提质粒DNA进行PCR扩增,结果得到大小为1 080 bp的扩增片段,结果见图1。
M.DL-2 000 Marker;1.阳性对照;2.扩增片段。
3. 2 耐药性鉴定结果
3. 2. 1 耐药质粒的消除以SDS - 高温交替法对携带TEM基因的E. coil 1 进行质粒消除,对提取的质粒进行质粒条带检测,部分质粒检测结果见图2。
1~6.SDS处理第5~10次。
由图2 可知,当SDS的终浓度为0. 5% 时,在43 ℃ 条件下进行交替培养,试验菌E. coil 1 经高温、SDS交替处理至第7 次,携带的质粒条带明显减少。3. 2. 2 耐药质粒消除后PCR检测试验菌E. coil 1经高温和SDS交替处理至第7 次时,对质粒DNA进行PCR检测,结果试验菌E. coil 1 不再携带TEM型耐药基因,由于该基因位于试验菌E. coil 1 的相关质粒上,说明耐药质粒已被成功消除,结果见图3。
M.DL-2 000 Marker;1.阳性对照;2.试验菌E.coil 1;3.阴性对照。
3. 2. 3药敏试验用 β - 内酰胺类抗生素( 青霉素G、头孢曲松、阿莫西林、头孢氨苄、头孢噻肟、头孢他啶、氨苄西林、苯唑西林) 对耐药质粒消除后试验菌E.coil 1 进行药敏检测,结果8 种 β - 内酰胺类抗生素的耐药性出现明显变化,均转变为中度敏感或敏感。
4 讨论
大肠杆菌耐药性研究 篇9
【关键词】医院感染；肠杆菌科细菌；细菌分布；耐药性
【中图分类号】R197.324【文獻标识码】B【文章编号】1005-0515（2012）10-0037-02
肠杆菌科细菌是医院感染最重要的一类病原菌，其包括一大群生物性状相似的革兰阴性无芽胞杆菌［1］。随着近年来医院肠杆菌感染日益复杂的趋势，因此了解院内感染中肠杆菌的分布与耐药情况，非常有助于合理的使用抗菌药物。本文将两年来本院院内感染的肠杆菌的分布及耐药分析结果报道如下。
1材料和方法
1.1 资料来源：收集2010年7月至2012年6月本院各类标本（尿、血、痰、咽试子及脓液等）培养分离的肠杆菌科细菌及药敏试验资料，诊断标准参照卫生部《医院感染诊断标准》。
1.2 研究内容：统计分析2年内临床标本分离的肠杆菌的分布情况及主要致病菌的药敏情况的变化。肠杆菌分离鉴定按《全国临床检验操作规程》进行，药敏结果按NCCLS制定的标准进行判断。
1.3 统计方法：采用Excel进行统计分析。
2结果
2.1 医院感染肠杆菌的分布： 收集2年内年各类标本2215份，共培养出肠杆菌科细菌112株，分离率达5.05%。而肠杆菌中检出率前3位的分别是肺炎克雷伯菌（39.3%），大肠埃希菌（29.5%）、阴沟肠杆菌（13.4%），结果详见表1。
2.2 肺炎克雷伯菌的耐药情况： 对肠杆菌科中感染率最高的肺炎克雷伯菌进行耐药性分析。结果显示，在药敏实验中发现肺炎克雷伯菌对大部分抗生素还保持着较高的敏感性，尤其是对亚胺培南和阿米卡星的敏感性保持在90%以上，仅对复方新诺明和氨苄西林/舒巴坦耐药率高，达60%以上。详见表2。表1 2010-2012年检出的肠杆菌构成比（%）
肠杆菌2010-2011年2011-2012年合计株数构成比株数构成比株数构成比肺炎克雷伯菌2038.52440.04439.3大肠埃希菌1732.71626.73329.5阴沟肠杆菌713.5813.31513.4产酸克雷伯菌47.758.398.0粘质沙雷菌35.858.387.1产气肠杆菌11.923.332.7合计52100.060100.0112100.0表2 肺炎克雷伯菌的对抗菌药物的耐药率
抗菌药物药敏结果抗菌药物药敏结果R%I%S%R%I%S%哌拉西林22.74.572.7头孢噻吩20.56.872.7氨苄西林/舒巴坦68.20.031.8诺氟沙星36.40.063.6氨曲南18.26.875.0头孢呋辛13.69.177.3复方新诺明63.613.622.8头孢唑啉27.30.072.7环丙沙星20.511.468.2头孢他啶20.52.377.3妥布霉素38.39.152.6头孢噻肟29.52.368.2庆大霉素25.00.075.0头孢吡肟15.94.579.6亚胺培南0.00.0100.0阿米卡星9.10.090.93讨论
革兰阴性杆菌尤其是肠杆菌科细菌在医院感染中常见的病原菌。虽然近年来的报道表明肠杆菌科细菌的比例呈现下降的趋势［2］，但依然占据着主导地位。本研究中发现院内感染分离的肠杆菌科细菌以肺炎克雷伯菌，大肠埃希菌及阴沟肠杆菌等为主。这也与近年来北京地区的报道相一致［3］。此外，比较这2年的数据，发现肠杆菌感染病例有增加趋势，其中肺炎克雷伯菌感染率有小幅度上升。
细菌耐药一直以来都是院内感染关注的重点。本研究对主要的病原菌肺炎克雷伯菌进行了耐药性检测，结果与近年来的耐药数据相似［4］，肺炎克雷伯菌对大多数药物均较敏感，尤其是阿米卡星和亚胺培南，而对复方新诺明和氨苄西林/舒巴坦耐药率高，这可能是因为本地区不合理使用抗菌药物造成的，从而促使产AmpC酶及超广谱-内酰胺酶的肺炎克雷伯菌比率的上升［5］。
综上所述，通过全面连续的监测院内感染的肠杆菌科细菌分布及耐药性变化，有助于了解本院及本地区主要的病原菌分布及耐药性特点，为合理使用抗菌药物提供了依据。同时也提示了我们应该加强对耐药菌的监测及动态分析。参考文献
［1］ 褚云卓， 年华， 欧阳金鸣等. 医院内感染肠杆菌科细菌分布及耐药分析［J］. 中国公共卫生. 2007
［2］刘君廷， 李思江， 王蕾等. 2009-2011年医院感染细菌病原学分布及药敏变迁［J］. 中国实验诊断. 2012
大肠杆菌耐药性研究 篇10
1 材料和方法
1.1 试验材料
1.1.1 含细菌的病料
2013年1~2月分别于山西太谷地区、榆次地区、祁县地区分离出3株大肠杆菌;在山西农业大学病理试验室病理诊断时取病死鸡组织 (脾脏、肺脏、肾脏、肝脏) 。
1.2 试验方法
1.2.1 培养基的制备
营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、麦康凯琼脂培养基:分别取营养琼脂4.5g, 取营养肉汤5.0g, 取麦康凯琼脂5.1g, 各自加入100m L蒸馏水中, 加热煮沸溶解, 经121℃15min灭菌, 冷却后, 倾注无菌平皿, 37℃温箱中放置48h左右, 检查无菌后, 4℃冰箱保存备用。
1.2.2 病料的采集与分离培养
用手术剪、接种环等, 无菌采集病变的内脏组织, 在营养琼脂平板上划线分离培养同时涂片染色镜检。吊取2个菌落, 接种于2m L营养肉汤, 37℃培养24h。用灭菌的棉拭子蘸取细菌培养液或稀释的菌液, 挤压, 致密而均匀地涂布到培养基表面。
1.2.3 贴药敏纸片
用灭菌尖头镊子, 镊取已制备好的各种干燥抗菌药纸片, 分别贴到培养基表面。在每贴一种纸片后, 应在平板底的对应部位上, 用脂溶性记号笔标记药品名或贴上标签。置37℃温箱内培养24h, 取出观察结果。
2 试验结果
2.1 病原菌的分离鉴定
2.1.1 镜检结果
分离到的3株大肠杆菌镜检为革兰氏阴性, 直杆菌, 大小0.4~0.7μm×2~3μm, 无芽孢, 两端钝圆、散在或成对。
2.1.2 培养特性
分离到的3株大肠杆菌在普通培养基上生长良好, 形成圆形凸起、光滑、湿润、半透明、灰白色菌落, 径约2~3mm;在麦康凯培养基上形成圆形, 扁平, 边缘整齐, 表面光滑, 湿润, 呈鲜桃红色或微红色的菌落;肉汤中培养24h, 呈均匀浑浊, 管底有粘稠沉淀, 液面管壁有菌环。
2.2 药敏试验结果
2.2.1 耐药程度
大肠杆菌A株对19种试验药物中的5种耐药;大肠杆菌B株对19种试验药物中的6种耐药;大肠杆菌C株对19种试验药物中的4种耐药。山西晋中地区分离出来的3株大肠杆菌对万古霉素的耐药程度为100%, 阿莫西林、环丙沙星、磺胺-6-甲氧嘧啶的耐药程度均为66%, 对庆大霉素、磷霉素、淋必治、新生霉素、强力霉素、洁霉素耐药程度均为33%, 对多粘菌素B、阿米卡星、新霉素、头孢拉定、洛美沙星、头孢曲松、左旋氧氟沙星、利福平、头孢他啶耐药程度为0。
3 结论