重组大肠杆菌论文

重组大肠杆菌论文（精选7篇）

重组大肠杆菌论文 篇1

3-羟基丙酸(3-HP:C3H6O3—MW 90.08)是一种重要的平台化合物,工业上可以用来合成很多重要的化工产品,如丙烯酸、丙二酸、1,3-丙二醇等[1],其潜在市场近400万吨/年。由于具有重大的商业开发价值,美国能源部已将3-HP列为世界上12种最具开发潜力的化工产品之一[2]。

目前市售的3-HP主要以石油化工品为原料采用化学合成法生产。近年来,有学者开展了利用甘油生物合成3-HP的研究。2005年,Suthers PF和Cameron DC在专利中首次报道了甘油能在甘油脱水酶(源于克雷伯氏菌)的作用下生成3-羟基丙醛(3-HPA),后者在醛脱氢酶(源于酿酒酵母)的继续作用下生成3-HP[3],但是,由于修饰系统的原因,来自于酿酒酵母的AldH活性在大肠杆菌中始终很低。2008年,Raj SM等以E.coli BL21(DE3)为宿主共表达了源于K.pneumoniae DSM 2026的甘油脱水酶DhaB和源于E.coli K-12 MG1655的乙醛脱氢酶AldH,该重组菌可以直接利用甘油生产3-HP,但其产量仅为0.58 g/L[4],Raj SM等进一步优化了载体及诱导条件后,摇瓶情况下,3-HP的最高产量达到了4.4 g/L[5]。

令笔者不解的是,E.coli BL21(DE3)是E.coli K-12 W3110的衍生株,后者自身携带有醛脱氢酶编码基因ald H(GI:8157331)[6],其酶活经测定达到了0.33 U/mg,为何Raj SM等在构建3-HP生产菌株时还要通过质粒向其引入源于E.coli K12 MG1655的乙醛脱氢酶呢?是出于增加拷贝数的考虑还是其他原因尚不清楚。为此,我们以E.coli BL21(DE3)plysS作为宿主菌,开展了利用内源乙醛脱氢酶AldH及外源甘油脱水酶DhaB生物合成3-HP的研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

本文用到的大肠杆菌菌株和质粒详细列于表1,扩增基因dhaB的引物序列见表2。

1.1.2 试剂

基因组DNA抽提试剂盒,高保真DNA聚合酶购自Promega公司。表达质粒pET8a,E.coli BL21(DE3)plysS 购自Novagen公司。限制性内切酶和DNA连接酶购自Fermatas公司。基因克隆载体pMD18-T和DNA胶回收试剂盒购自TAKARA公司。引物由上海生工生物有限公司合成。3-HP标准品购自Tokyo Kasei Kogyo公司。所有其他的化学试剂,除了特别指明,均购自Sigma-Aldrich公司。

1.1.3 仪器

超净工作台,PCR仪,移液器,恒温培养箱,摇床,分光光度计,安捷伦高效液相系统等。

1.1.4 培养基

LB:用于大肠杆菌的细胞增殖和阳性克隆子的筛选。每1L含10.0 g蛋白胨,5.0 g酵母提取物和10.0 g NaCl,pH 7.0。

M9:用于3-HP的摇瓶发酵。每1L含150 mmol甘油,9.0g Na2HPO4,3.0g KH2PO4,0.25g MgSO4·7H2O,1.0g NaCl,1.0g NH4NO3,0.2g酵母提取物,1mL微量盐溶液(每1L含1.5g FeCl2·4H2O,70mg ZnCl2,100mg MnCl2·4H2O,6mg H3BO3,190mg CoCl2·6H2O,2mg CuCl2·2H2O,24mg NiCl2·6H2O,36mg Na2MoO4·2H2O,2.5 mL HCl)。

根据需要,培养基中添加抗生素:卡那霉素(100μg/mL)、氨苄青霉素(100μg/mL)和氯霉素(34 μg/mL)。

1.2 方法

1.2.1 甘油脱水酶的诱导表达及酶活测定

重组菌E.coli HP在LB培养基中培养至OD 600nm约为1.0,然后加入一定浓度的IPTG诱导甘油脱水酶DhaB的表达,继续培养6h后离心收集菌体细胞,将其重悬于含有100μg/mL溶菌酶的缓冲液Ⅰ(10 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0,0.1 mmol/L PMSF)中并进行超声波破碎处理,高速离心去除细胞碎片,上清液进行SDS-PAGE电泳以检测蛋白表达情况。

甘油脱水酶活力的检测方法参照Tobimatsu T[7]方法所述。

1.2.2 乙醛脱氢酶的酶活测定

乙醛脱氢酶活力的检测方法参照Dickinson等[8]并有所改进。将0.5 mL上清液样品与1 mL浓度为100mmol/L Tris-HCI缓冲液混合(pH 8.0)(含1mmol/L巯基乙醇、100mmol/L KCI,50mmol/L NAD+,50mmol/L乙醛),反应体系在25℃下保温5min,在340 nm波长下进行比色。酶活单位定义:标准反应条件下,1min催化生成1mmol NADH所需要的酶量被定义为1个活力单位(U)。

1.2.3 甘油与3-HP浓度检测

发酵液在10 000×g 条件下离心5min,用安捷伦高效液相系统(Agilent 1100 HPLC system)检测上清液中的甘油和3-HP含量。3-HP用安捷伦G1314紫外分光光度计检测220 nm吸光值,分离柱是HC-18 column (250 × 4.6 μm,5μm;Agilent,USA),每次上样50μl,流速为1mL/min,流动相为水:甲醇=95:5。甘油用安捷伦示差折光检测器检测,分离柱是ZORBAXNH2 column (250 × 4.6 μm,5μm;Agilent,USA),每次上样50μl,流速为1 mL/min,流动相为甲醇:水 = 70:30。数据分析使用Agilent 1100 chemistry station软件。

2 结果与分析

2.1 3-HP生产菌株的构建

抽提克雷伯氏菌的总DNA作为底物,参考Raj SM等设计的引物[4],通过PCR反应扩增出编码甘油脱水酶DhaB的基因条带(图1),回收目的片段并连接到pMD18-T载体,连接产物pMD18-T-dhaB转化E.coli DH5α感受态细胞,在LB(Ampr)平板上筛得阳性转化子。利用引物末端设计的EcoRⅠ和HindⅢ 酶切位点,将dhaB基因片段(约2 700 bp)从克隆载体pMD18-T转移至表达载体pET28a中,连接产物pET28a-dhaB转化E.coli BL21(DE3)plysS感受态细胞,在LB(Chlr,Kanr)平板上筛选阳性转化子。双酶切验证(图2)及测序结果表明,克隆到pET28a上的dhaB和报道序列完全一致,获得的阳性菌株命名为E.coli HP。

2.2 重组菌株全细胞蛋白电泳分析

将重组菌E.coli HP接种至LB培养基,37℃摇床培养,当OD 600nm达到0.6±0.05时,加入1 mmol/L IPTG诱导甘油脱水酶的表达。继续培养6 h后离心收集细胞并制备细胞裂解液,SDS-PAGE检测目的蛋白的表达情况。从图3可以看出,对比空白宿主菌,重组菌中有三个新表达的蛋白,分子量分别约为61kD、21kD和16kD,与DhaB三个亚基的分子量相符,表明甘油脱水酶DhaB在宿主细胞中得到了很好的表达。

2.3 关键酶的表达

按方法所述,分别使用0.1、0.5、1.0 mmol/L IPTG对重组菌E.coli HP进行诱导,测定其甘油脱水酶活性及乙醛脱氢酶活性,实验以携带pET28a的E.coli BL21(DE3)plysS作为对照菌株。结果表明(表3):对照菌株检测不到任何甘油脱水酶活性,重组菌E.coli HP的甘油脱水酶活性随着IPTG浓度的升高而不断提高,在1 mmol/L IPTG的诱导下,其甘油脱水酶的比酶活达到高值,为77.2 U/mg;E.coli HP与对照菌株均携带有相同的乙醛脱氢酶编码基因,其本底酶活经测定均为0.33 U/mg左右。在IPTG诱导条件下,对照菌株的乙醛脱氢酶活性没有变化,表明乙醛脱氢酶的表达不受IPTG的影响,但实验也同时发现,当不同浓度的IPTG对重组菌E.coli HP进行诱导后,其乙醛脱氢酶酶活均有所提高,分别达到了0.58 U/mg、0.55 U/mg和0.64 U/mg,该结果暗示了甘油脱水酶的存在促进了乙醛脱氢酶的表达。

a酶活力数值为3次独立实验的平均值。

2.4 摇瓶发酵实验

参考Raj SM等[5]优化的培养基,我们将重组菌E.coli HP接种到M9培养基(含15 mmol/L维生素B12),37℃摇床培养,间隔5 h取样进行HPLC检测。结果表明:培养至45 h时,重组菌产生的3-HP达到最大值,为5.44g/L,此时甘油浓度从150 mmol/L下降到36 mmol/L,3-HP的摩尔转化率达到了53%,生物量(活细胞数)上升到1.49 × 109 个/mL。继续培养,生物量缓慢增长,甘油浓度继续下降,3-HP含量基本维持稳定。

(▲) glycerol consumption;(●) 3-HP production;(○) cell number. Values are mean±SD of three separate experiments.

3 讨论

甘油转化为3-羟基丙酸需要甘油脱水酶及醛脱氢酶的共同作用,自然界迄今尚未发现同时具有这两种酶的微生物,国外研究者首先开展了基因工程菌的构建工作,他们以E.coli BL21(DE3)作为宿主,在其细胞中异源表达了源自K.pneumoniae 的甘油脱水酶DhaB以及E.coli K-12 MG1655的乙醛脱氢酶AldH[4,5],成功实现了甘油向3-羟基丙酸的生物合成,其最高摇瓶产量达到了4.4g/L;国内也开展了类似研究[9,10],唯一的区别是将宿主更换为E.coli JM109。在本研究过程中,笔者分析认为E.coli BL21(DE3)本身已经携带有AldH编码基因(GI:8157331)[6],再往其内导入源于E.coli K-12 MG1655的AldH并没有必要,因此,我们设计了更简便的技术方案,以E.coli BL21(DE3)plysS作为宿主,仅在其内异源表达了K.pneumoniae的甘油脱水酶DhaB,酶学分析及蛋白质电泳证实,在重组菌株E.coli HP中,两个关键酶均得到了更好的表达,3-HP的产量达到了5.44g/L,比Raj SM等报道最高的摇瓶产量(4.4g/L)提高了23.6%。最近,又有研究者报道了以K.pneumoniae作为宿主构建3-HP基因工程菌的工作,但由于K.pneumoniae将更多的甘油转化成为1,3-丙二醇,因此3-HP的转化率难以提高[11,12]。

研究还发现,重组菌E.coli HP中乙醛脱氢酶AldH的活性达到了0.64 U/mg,而在缺少甘油脱水酶DhaB的宿主细胞中,乙醛脱氢酶AldH的活性仅为0.33 U/mg,该结果表明甘油脱水酶的存在显著促进了乙醛脱氢酶的表达。推测的原因是,甘油脱水酶DhaB的丰度表达必然导致细胞内生成了一定数量的醛,而后者的累积对细胞具有毒性[13],这将迫使细胞合成更多数量的醛氧化酶系来消化醛类物质,乙醛脱氢酶作为关键的醛氧化酶其表达也理应得到促进,具体的诱导作用机制还需进一步研究。

在甘油转化生成3-HP的研究工作中,还有一些关键问题需要解决,比如氧气及高浓度甘油对甘油脱水酶的抑制,辅酶NAD+的再生,以及乙醛脱氢酶活性的提高等等。我们相信,随着研究的深入,这一重要化学品一定会实现其高效的规模化发酵生产。

重组大肠杆菌论文 篇2

重组人成纤维细胞生长因子-8a在大肠杆菌中的可溶性表达

通过低温诱导,成功实现了重组人成纤维细胞生长因子-8a蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达.进一步研究了温度、IPTC浓度、诱导时长、诱导时期(OD600)、培养基类型这5个因素对重组人成纤维细胞生长因子-8a蛋白可溶性表达的.影响,确定了可溶性表达最优化条件.优化表达条件后实现可溶性表达率大干30%.

作 者：付灿 FU Can  作者单位：菏泽学院生命科学系,山东菏泽,274015 刊 名：菏泽学院学报 英文刊名：JOURNAL OF HEZE UNIVERSITY 年，卷(期)：2009 31(2) 分类号：Q786 关键词：重组   人类   成纤维细胞生长因子-8a   大肠杆菌   可溶性表达  

重组大肠杆菌论文 篇3

VEGF165 的生物学功能不依赖其75 位Asn的糖基化,因此可以利用原核表达系统建立一种经济高效的制备方法[9]。 目前见报道的原核表达VEGF165 的工艺均采用大肠杆菌表达系统,且表达蛋白为包涵体,需要特殊的设备以及较大的稀释比进行蛋白复性。复性工艺复杂且二硫键错配的杂质蛋白不宜去除,难以放大进行大量制备[10,11]。Ma L等利用p PIC9K载体构建VEGF165 蛋白酵母表达系统,通过肝素亲和层析捕获重组VEGF165 蛋白[12]。Chung ND等将VEGF165 基因置于Amy3D启动子下,构建转基因植物悬浮细胞表达载体,经18 d悬浮培养重组细胞可获得18 mg /L VEGF165 蛋白[13]。上述制备方法培养周期长,且表达效率低。因此利用大肠杆菌培养周期短,培养工艺简单的特点,建立一种VEGF165 蛋白原核可溶性表达系统具有重要价值。

研究利用带有6* 组氨酸标签的二硫键形成蛋白A( Dsb A) 原核表达载体,建立了在大肠杆菌中可溶性表达Dsb A-VEGF165 的方法; 融合蛋白通过Ni亲和层析纯化,并于使用牛肠激酶去除标签蛋白后,通过肝素亲和层析获得VEGF165 蛋白; 促HUVEC细胞增殖实验表明重组VEGF165 蛋白具有较好的体外活性,结果表明此制备工艺可获得高质量,活性优的重组VEGF165 蛋白。

1 材料与方法

1. 1 质粒、菌株及主要试剂

大肠埃希氏菌DH5α、BL21( DE3) 感受态细胞购自天根生化科技( 北京) 有限公司。p ET-Dsb A载体购自武汉淼灵生物科技有限公司。质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技( 北京) 有限公司; 限制性内切酶EcoRI,Bam HI和DNA片段快连试剂盒均购自Fermentas公司; Chelating Sepharose Fast Flow填料和Heparin Sepharose 6Fast Flow填料购自GE公司; Ek酶及其他分析纯试剂购自上海生工公司。

1. 2 Dsb A-VEGF165 融合蛋白原核表达载体构建

根据Gen Bank: AB021221. 1 人VEGF165 mRNA序列,人工合成CDS序列( Invitrogen公司合成) ; 其中CDS序列5’端引入EcoR I酶切位点和牛肠激酶识别序列编码基因: 5 ’-GAATTCGATGACGACGACAAG-3 ’,3 ’端引入终止密码子及Bam HI酶切位点序列5 ’-TGAGGATCC-3 ’。将合成片段插入p MD18-T Simple载体,获得p MD18T-Dsb A-VEGF165 载体。 p MD18T-Dsb A-VEGF165 载体与p ET-Dsb A载体分别经EcoR I和Bam H I双酶切,回收Dsb A-VEGF165 片段和p ET-Dsb A载体片段,经T4 连接酶连接,常规转化DH5α 感受态细胞,经Amp抗性及X-gal筛选,挑取阳性克隆; 提取p ETDsb A-VEGF165 质粒并经EcoR I和Bam H I双酶切鉴定和DNA测序正确后,转化入BL21( DE3) 感受态细胞中,获得工程菌p ET-Dsb A-VEGF165 /BL21( DE3) 。

1. 3 Dsb A-VEGF165 诱导表达条件优化及放大

将p ET-Dsb A-VEGF165 /BL21( DE3) 重组菌接种至5 m L含100 μg/m L氨苄青霉素的LB培养基中,180 r / min,37 ℃ 过夜培养。次日按1∶ 50 转接至5 m L LB培养基,待OD600 至0. 8 h进行诱导: 分别利用0. 5 mol及1 mol的IPTG浓度,在23 ℃ 和37 ℃ 下诱导16 h和4 h。根据Chhetri G等的方法,在诱导过程培养基中加入5% ( v/v) 乙醇,提高融合蛋白表达水平[14,15]。收集各个条件下诱导后菌体,经超声破碎,12 000 r / min离心,收集上清和沉淀,利用12% SDSPAGE电泳检测Dsb A-VEGF165 融合蛋白表达。

将2 m L过夜培养的p ET-Dsb A-VEGF165 /BL21( DE3) 重组菌液接种至400 m L LB培养基中,37 ℃180 r / min培养至OD600= 0. 8,加入0. 5 mol IPTG及5% ( v / v) 乙醇,23 ℃ 诱导16 h。诱导结束后10 000r / min离心收集菌体,并重悬至20 m L 50 mol Tris( p H8. 0) ,300 mol Na Cl缓冲液中。

1. 4 Ni亲和层析纯化Dsb A-VEGF165 融合蛋白

50% 超声功率,工作30 s,间歇30 s,共60 个循环破碎菌体。经12 000 r/min离心20 min。上清经0. 45 μm滤膜过滤。Ni亲和层析柱经平衡缓冲液( 50 mol Tris( PH8. 0) ,300 mol Na Cl) 平衡10 个柱床体积后,将破菌上清液上样,继续用平衡缓冲液清洗5 个柱体积。随后利用咪唑浓度梯度增加的洗脱缓冲液洗脱。Dsb A-VEGF165 融合蛋白在50 mol Tris( p H8. 0) ,300 mol Na Cl,300 mol imidazole下洗脱。将洗脱的融合蛋白在4 ℃ 下置于20 mol phosphate( p H8. 0) ,150 mol Na Cl缓冲液中透析过夜,置换为磷酸盐缓冲液。

1. 5牛肠激酶酶切去除Dsb A标签蛋白及肝素亲和层析纯化VEGF165 蛋白

按照牛肠激酶说明书,于1 mg Dsb A-VEGF165融合蛋白中加入10 ng EK酶,25 ℃下酶切16 h。将酶解液加入至Heparin Sepharose 6 Fast Flow层析柱后利用20 mol phosphate ( p H8. 0) ,150 mol Na Cl平衡缓冲液平衡5 个柱体积,随后利用含梯度Na Cl的磷酸缓冲液洗脱VEGF165 蛋白。利用12% SDSPAGE电泳检测VEGF165 蛋白纯度。

1. 6 VEGF165 蛋白体外活性鉴定

根据Lee I L等的方法[16],将HUVEC细胞以1. 25 × 104/200 μL / 孔接种到96 孔板中,并加入2倍比稀释的VEGF165 蛋白( 起始浓度为50 ng /m L)100 μL作用于细胞,37 ℃ 培养72 h。随后每孔加入25 μL的alamar Blue继续37 ℃ 培养6 h。利用酶标仪530 /590 nm读取荧光值。实验中每个浓度做三复孔。用Gen5 CHS软件进行四参数回归计算,分析促细胞增殖情况。

2 结果

2. 1 Dsb A-VEGF165 融合蛋白p ET表达载体构建及双酶切鉴定

将带有合成的N端设计有EK酶酶切位点的VEGF165 编码序列p MD8T-Dsb A-VEGF165 载体通过EcoRⅠ/ Bam HI酶切位点插入至p ET-Dsb A中,通过卡那抗性及X-gal蓝白斑筛选阳性克隆子( 图1A) 。阳性克隆质粒通过EcoRⅠ / Bam HI双酶切鉴定,可见约580 bp的Ek-Dsb A-VEGF165 片段及载体片段,如图1B所示。经Invitrogen公司测序,结果说明获得了构建正确的p ET-Dsb A-VEGF165 表达载体。将此表达载体转化入BL21( DE3) 菌体中,获得重组菌,命名为p ET-Dsb A-VEGF165 BL21( DE3) 。

2. 2重组Dsb A-VEGF165 融合蛋白表达条件及优化

将重组p ET-Dsb A-VEGF165 菌接种至LB培养基中培养,随后利用IPTG诱导表达融合蛋白,分别对诱导过程中的IPTG浓度( 0. 5 mol,1 mol) 、乙醇以及培养温度( 37 ℃ 和23 ℃) 和诱导时间( 4 h和36 h) 等条件进行优化。结果显示,0. 5 mol IPTG和1 mol IPTG在37 ℃ 和23 ℃ 条件下诱导4 h,融合蛋白表达水平没有明显差异。在诱导过程中,加入5% ( v / v) 的乙醇,可明显提高融合蛋白表达水平,如图2A所示。在加入5% 乙醇条件下,将诱导温度降至23 ℃同时将诱导时间延长至16 h,可明显提高融合蛋白可溶性表达比率,可溶性融合蛋白部分比率可由70% 提高至85% 以上[图2( b) ]。

2. 3Ni亲和层析纯化Dsb A-VEGF165 融合蛋白及EK酶酶解去除Dsb A标签

p ET-Dsb A载体中,Dsb A N端带有6 * His标签,因此Dsb A-VEGF165 融合蛋白可用Ni亲和层析进行纯化。如图3 所示,通过梯度咪唑浓度洗脱,在300 mol时,融合蛋白可被洗脱,纯度达85% 。12%SDS-PAGE电泳检测可见Dsb A-VEGF165 条带位于约45 k Da处,同理论大小一致[图3( a) ]。

利用10 k Da的透析袋将Ni亲和层析洗脱Dsb A-VEGF165 蛋白的缓冲液透析置换为磷酸盐缓冲液,随后按照1∶ 100 的比例加入Ek酶,25 ℃酶切16h,可将融合蛋白完全酶切[图3( b) ]。

2. 4 肝素亲和层析纯化VEGF165 蛋白及其体外活性检测。

VEGF165 蛋白C端具有与肝素特异结合的结构域,因此可利用肝素凝胶层析进一步纯化VEGF165 蛋白。将EK酶切后的酶解液通过肝素亲和层析纯化,利用含梯度浓度的Na Cl磷酸盐缓冲液洗脱,可获得纯度超90% 的VEGF165 蛋白[图4( a) ]。获得的重组VEGF165 蛋白经12% 非还原SDS-PAGE电泳检测,可见约40 k Da的同源二聚体VEGF165 蛋白[图4( b) ]。

将50 ng /m L重组VEGF165 蛋白进行2 倍比稀释,并作用于HUVEC细胞72 h,随后通过检测细胞对alamar Blue的摄取分析促细胞增殖作用。rhVEGF促HUVEC细胞增殖作用呈剂量依赖性,通过四参数回归分析可知EC50 为13 ng /m L。

3 讨论

目前,国内外公开的重组人VEGF蛋白表达技术,包括利用原核、真核等表达系统,通过表达融合蛋白的方式实现VEGF165 的大量表达。利用真核表达系统如转基因水稻细胞悬浮及毕赤酵母细胞表达VEGF蛋白,存在培养周期长,培养过程不容易控制,成本高、产量低、表达不稳定等,并且后续不容易实现工艺放大[12,13]。Pizarro SA等在大肠杆菌中表达VEGF165 蛋白,获得的均为包涵体蛋白,需要对其进行变性和复性。 因天然且具有活性的VEGF165 蛋白中有16 对二硫键[10],包涵体在复性过程中极易产生二硫键错位,进而影响蛋白活性。并且在复性过程中需要较大的稀释比和复杂的控制条件,不便于制备工艺的放大[11]。 在现有的VEGF165 表达工艺中,VEGF165 蛋白N端都带有标签蛋白,后续纯化工艺中不去除标签蛋白或去除不完全,N端存在残留氨基酸,VEGF165 的蛋白活性往往不理想。

本实验室利用了大肠杆菌表达系统的培养及诱导时间短,培养工艺较容易控制的特点,同时,利用带有6* His的Dsb A标签蛋白帮助VEGF165 蛋白进行正确折叠,实现了VEGF165 蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达。本研究还发现,诱导过程中加入5% 的乙醇,可以显著提高Dsb A-VEGF165 融合蛋白表达水平[( 图2( a) ]; 并且将诱导温度由37 ℃ 降为23 ℃可显著提高融合蛋白的可溶性表达[图2( b) ]。牛肠激酶酶切位点的引入,可以将标签蛋白完全去除,使重组的VEGF165 蛋白同天然蛋白N端保持一致。HUVEC细胞增殖显示,本研究所获得的重组VEGF165 蛋白具有较好的活性,同Lowe J等的研究结果一致[16]。

重组大肠杆菌论文 篇4

从牛分支杆菌培养物中抽提总DNA,扩增了MPT83基因,并克隆入pMD 18-T SimpleVector,将测序正确的目的基因插入表达载体pET-32a(+)中,转化BL21(DE3)宿主菌,IPTG诱导表达,用亲和层析方法对表达蛋白进行了纯化.经测序,构建的`克隆质粒pMD-MPT83与GenBank中的序列一致;构建的表达质粒pET-MPT83经PCR和BamH Ⅰ+HindⅢ双酶切鉴定构建正确;经SDS-PAGE分析,在约42 ku处出现新的蛋白条带,4 h后表达量即达到高峰;Westernblotting分析表明,融合蛋白能够被牛分支杆菌阳性血清所识别;纯化的表达蛋白经SDS-PAGE电泳,出现清晰的单一条带.表明MPT83基因原核表达载体构建成功.

作 者：鲁俊鹏 罗满林 宋延华 邹潍力 LU Jun-peng LUO Man-lin SONG Yan-hua ZOU Wei-li 作者单位：鲁俊鹏,罗满林,邹潍力,LU Jun-peng,LUO Man-lin,ZOU Wei-li(华南农业大学,兽医学院,广东,广州,510642)

宋延华,SONG Yan-hua(广东温氏食品集团有限公司,广东,新兴,527439)

重组大肠杆菌论文 篇5

关键词：铜绿假单胞菌,重组蛋白质类

绿脓杆菌是一种人类和动物的重要条件致病菌, 可以经创伤引起继发性感染[1]。绿脓杆菌具有易定植、易变异、多重耐药和耐药机制复杂等特征。由于细菌的生长离不开脂肪酸的合成, 因此, 抑制脂肪酸的生物合成将直接影响细菌生长和繁殖。在分子水平上, 脂肪酸生物合成 (fatty acid biosynthesis, FAS) 酶系可分为Ⅰ型和Ⅱ型两种类型, FAS-Ⅰ酶系集中分布于于哺乳动物。而FAS-Ⅱ酶系则在细菌中广泛分布的, FAS-Ⅱ酶系中的每一种酶活性均处于不同的蛋白质上, 每一个反应都是由一个单独的酶催化。基因敲除试验和特定靶标抑制剂的使用也证实了FAS-Ⅱ途径中的酶是细菌生存必不可少的[2]。在脂肪酸延长循环的四步反应中, 由烯酯酰-ACP还原酶催化的还原反应是最后一步反应, 也是整个循环反应的限速步骤, 因此烯酯酰-ACP还原酶是整个脂肪酸生物合成途径中最关键的一个酶, 也是作为FAS抑制剂的筛选是一种理想的靶标, 烯酯酰-ACP还原酶IV (FabV) 也是烯酯酰-ACP还原酶系中的一种酶。研究发现, 烯酯酰-ACP还原酶IV是一种NADH依赖型的单功能酶, 由于其分子量比较大, 在溶液中以单体形式存在, 并且其二级结构存在Rossmann折叠, 活性基序为Tyr- (Xaa) 8-Lys[3]。因此烯酯酰-ACP还原酶IV的结构、结合的辅酶, 和活性位点方面都存在较大特异性。本实验的研究主要就是针对绿脓杆菌烯酯酰-ACP还原酶IV阳性克隆转染、诱导、蛋白提纯表达, 从而优化重组蛋白诱导表达时间, 使绿脓杆菌烯酯酰-ACP还原酶IV重组蛋白的表达达到一个良好的水平。为建立以烯酯酰-ACP还原酶IV为靶标的新型抗生素筛选模型奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

Pseudomonas aeruginosa CMCC10104, 购买于上海复祥生物科技有限公司。质粒pET-28b (+) , 实验室保存。E.coli BL21 (DE3) , 实验室保存。各种限制性内切酶, 修饰酶购自大连宝生物公司, DNA/Hind III Marker、蛋白质Marker等购自Takara司。PCR纯化试剂盒, 切胶回收试剂盒, 质粒抽提试剂盒等主要购自AXYGEN公司。

1.2 烯酯酰-ACP还原酶IV重组转化子的制备

挑取Pseudomonas aeruginosa CMCC 10104单菌落, 过夜培养后离心、洗涤、去上清, 苯酚/氯仿/异戊醇抽提, DNA沉淀晾干后用溶解, 电泳检测总DNA符合预期目标。配制PCR反应体系进行PCR扩增, PCR扩增结束后取5μl于1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。鉴定PCR产物后使用胶回收试剂盒按照以下步骤来回收、纯化PCR产物。将纯化后的fabV基因以及质粒pET-28b (+) 通过内切酶Hind III和Nde I进行双酶切, 37℃恒温培养箱中酶切8h左右, 并进行琼脂糖凝胶电泳检测。酶切产物回收后酶连过夜。制备大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞, 将酶连产物转化感受态细胞, 制备重组工程菌。将菌种在含有卡那的培养基培养5～6h后抽提质粒, 将电泳初步检测正确的转化子再进行PCR和双酶切检测, 结果得到预期期待目标。

1.3 烯酯酰-ACP还原酶IV重组工程菌的诱导表达优化

1.3.1 诱导开始时间的优化

(1) 在以1%的接种量接入菌种后每隔一小时加入IPTG, 同时每隔1小时取样测定OD600值, 观察其生长。 (2) 取1ml培养液, 电泳分析重组蛋白的表达量。

1.3.2 诱导时间的优化

(1) 在500ml三角瓶中装入50ml LB培养基, 按1%的接种量接入活化菌种, 根据诱导开始时间的最优时间, 将菌液于37℃培养4h。取1ml菌液于1.5ml的离心管中作为未诱导对照, 低温保存。剩余带菌培养液中加入IPTG后继续培养, 每隔1小时测其OD600值, 并取1ml菌液分析蛋白的表达量。

2 结果

2.1 烯酯酰-ACP还原酶IV重组蛋白诱导表诱导开始时间的优化

分析可知, 如果较早开始诱导, 菌体合成蛋白的时间也提前, 而蛋白的产生会影响菌体的生长。因而, 培养0h和1h 就加入IPTG, 其生物量明显低于诱导开始晚的实验组;2h时, 菌体生长已临近对数生长期, 因此菌体正逐步进入快速生长阶段;3h时菌体生长处于对数生长前期, 如果3h作为诱导起始时间, 可以看到, 在诱导开始后2h内菌体依然可以进行快速生长, 之后达到平台期;而在培养4h时, 菌体生长已进

入对数生长中后期, 如果在这时开始诱导, 菌体在1h内就进入了平台期。因而最终菌体量在诱导起始时间在为2h、3h、4h 三者之间没有明显差异。由此可判定, 在菌体对数生长期开始诱导会得到较高的生物量。

对于重组蛋白的表达, 诱导开始时间也会带来不同的结果。如果从0h开始诱导, 那么达到蛋白最大表达量的时间就会提前;而0h、1h、2 h诱导的重组蛋白表达并没有明显差别。而蛋白最大表达量最晚的时间是在4h时诱导。由此可知, 在3h时重组蛋白表达量最大, 其次为2h;而由于0h时开始诱导其生物量低, 因而最终的蛋白表达量也低。所以对于重组蛋白表达来说, 要想得到最大的表达量, 还是在菌体生长的前期诱导为好。也就是说, 在菌体培养3h 时诱导是最佳诱导开始时间。

2.2 烯酯酰-ACP还原酶IV重组蛋白诱导表诱导时间的优化

重组工程菌的生长量是随着时间的增加而逐步增长, 菌体在最初的2h没有明显的增加, 而2h后菌体进入对数生长期, 7h后生物量达到最高点, 之后增长逐步趋于平稳。而重组蛋白的表达呈一个缓慢增长趋势, 在诱导6h后达到重组蛋白表达的最大量, 之后随着诱导时间的增加, 蛋白合成量逐步下降。因此从诱导时间对于工程菌和重组蛋白的影响综合分析可以看出, 在IPTG诱导后6h时, 是工程菌和重组蛋白表达均达到最大表达量的一个时间。

3 讨论

烯酯酰-ACP还原酶IV是2008年才从霍乱弧菌中发现的一类新型的烯酯酰-ACP还原酶, 是一种与FabI同源的新型ENR, 它可以单独存在于细菌FASⅡ, 也可以在绿脓杆菌中与FabI同时存在。它是绿脓杆菌脂肪酸生物合成代谢中的关键酶, 可作为药物筛选的新靶标。

实验结果表明, 绿脓杆菌烯酯酰-ACP还原酶IV能在外源宿主细胞内表达, 且为可溶性表达, 在重组工程菌诱导表达的起始时间与诱导时间达到一个最适时间点, 工程菌的生长量和蛋白的表达量均能达到一个最大值。在此基础上, 后续实验将过量表达的重组蛋白进行纯化, 并且测定酶活, 为建立抑制剂体外筛选模型奠定了基础。在此基础上定向筛选出几种特异的对假单胞菌脂肪酸合成有抑制作用的抗菌物质, 开发出抗菌谱广、物理化学性质稳定的现代抗菌药物。

参考文献

[1]白丹, 余家林.铜绿假单胞菌与机体免疫的相互关系[J].中国微生态学杂志, 2008, 20 (1) :89-90.

[2]Campbell JW, Cronan JE Jr.Bacterial fatty acid biosynthesis:targets for antibacterial drug discovery[J].Ann Rev Microb, 2001, 55:305-332.

重组大肠杆菌论文 篇6

WHO公布的数据显示,全球约1/3的人感染结核分枝杆菌(M.tuberculosis,MTB)。每年新发结核病人约800-1 000万,每年约有300万人死于结核病[1]。目前结核病的治疗主要依赖于化疗药物,但该类药物的大量使用容易导致耐药株的产生。特别是出现多重耐药株(MDR-TB)[2]的暴发流行和严重危害,迫使人们不得不去思考新的治疗策略,其中免疫调节剂的使用是目前较有前景的治疗策略。本研究中,我们将构建的表达肝素结合血凝素与人IL-12融合基因的重组耻垢分枝杆菌(HBHA-hIL12-rMS)[3]用于MTB感染小鼠的免疫治疗,评价其治疗效果,为其用于结核病的治疗研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

MTB的H37Rv株(陕西省结核病防治研究所王瑞惠赠),7H9液体和7H10固体培养基(美国Difco公司)。分枝杆菌培养增强剂分枝杆菌培养增强剂ADC和OADC购自德国Beckton Dickinson公司。RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司。6～8周龄雄性SPF级BALB/c小鼠28只由第四军医大学实验动物中心提供。重组耻垢分枝杆菌HBHA-hIL12-rMS由第四军医大学实验动物中心提供。

1.2 小鼠的结核分枝杆菌感染

采用尾静脉注射的方式,用MTB毒株H37Rv攻击6～8周龄雄性SPF级BALB/c小鼠,每只小鼠感染剂量为1×105CFU。

1.3 感染小鼠的治疗

感染4周后,随机抽取4只确定小鼠体内MTB感染状况,将剩余24只感染小鼠随机分为4组:第一组在感染后第4周和第6周分别腹部皮下注射1×105CFU的耻垢分枝杆菌(MS);第二组在感染后第4周和第6周分别腹部皮下注射1×105CFU的重组耻垢分枝杆菌(HBHA-hIL12-rMS);第三组从第4周到第8周用异烟肼(INH,54.25 mg/L)联合利福平(RFP,52.5 mg/L)连续饮水1个月;第四组在第4周和第6周分别腹部分别皮下注射生理盐水对照。流程如图1所示。

MTB感染后第4周和第6周分别皮下注射r MS或者MS,并设生理盐水对照,化疗组从第4周至第8周应用INH+RFP连续饮水4周。

1.4 感染小鼠肺部荷菌量检测

攻毒后第8周,每组分别处死三只小鼠,取一侧肺脏,研磨、倍比稀释后涂于7H10平板,4周后计数菌落数,结果以lg CFU表示。

1.5 感染小鼠肺部病理变化

将各时间点的感染小鼠另一侧1/3肺脏多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片,经HE染色进行组织学观察。

1.6 统计学处理

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析,所有数据均采用析因方差分析,组间均数两两比较采用LSD-t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 感染小鼠的鉴定

结核分枝杆菌感染4周后,随机取4只小鼠观察其肺部有明显的白色结节,取另一侧肺脏研磨、倍比稀释后涂于7H10平板,4周后培养出结核分枝杆菌。表明动物感染结核分枝杆菌成功,如图2所示。

A为MTB感染四周后小鼠病变肺脏,B为感染四周后肺脏细菌计数

2.2 MTB感染小鼠的治疗效果检测

如图3所示,第8周,r MS治疗组肺部荷菌量明显少于MS治疗组和生理盐水组(P<0.05),但其对肺部结核分枝杆菌的控制远没有达到INH+RFP联合治疗的效果(P<0.05),MS治疗组肺部荷菌量与生理盐水对照组差异不大(P>0.05)。

各数值分别表示MTB感染小鼠后第8周各组小鼠的肺部荷菌量,数值为3个样本的平均值(±SEM)。

2.3 肺部病理变化

各组小鼠的肺脏经HE染色后,在显微镜下观察。INH+RFP联合治疗组的肺部病理变化明显轻于其他三组,其肺泡壁结构较为完整,肺泡间隔无明显增厚,仅看到少量的炎性细胞侵润。MS治疗组和生理盐水组肺泡壁增厚,肺泡腔缩小,均有大量的淋巴细胞浸润。r MS治疗组肺部肺泡壁增厚程度及淋巴细胞浸润程度均轻于对照组,如图3所示。

A为r MS治疗组,B为MS治疗组,C为INH+RFP联合治疗组,D为生理盐水对照组

3 讨论

目前结核病的治疗主要是采用化疗药物,虽然部分活动性TB患者能够通过该方法治愈,但由于治疗时间长、副作用大,致使患者依从性差,并易导致持续性感染的发生,甚至产生耐药株。耐药结核病的流行,可以导致耐药株之间的交互作用,最终发生广泛的多重耐药株[4],威胁到许多国家的结核病控制计划,因此,探索能够弥补化疗药物缺陷的新的治疗途径迫在眉睫。

治疗性疫苗被视为较有前景的结核病治疗新途径,其中研究较多的为DNA疫苗,但其存在的主要问题是:编码抗原比较单一,引发的免疫应答与MTB自然感染过程有很大差异,需要多次免疫接种,易引发免疫耐受和自身抗体的产生;而亚单位疫苗由于在体内滞留时间短,难以引发长期有效的免疫应答;而活载体疫苗在刺激机体产生保护性免疫应答方面要优于其它基因工程疫苗,是治疗性疫苗研究的一个重要方向。耻垢分枝杆菌生长速率是BCG的10倍,表达外源性蛋白产量高,实验表明耻垢分枝杆菌(MS)能够调节恢复机体保护性免疫,刺激巨噬细胞细胞杀伤效应因子(H2O2、NO)产生,改变Th1/Th2免疫应答模式[5]。朱道银等人构建的携带pZM03载体编码人溶菌素(GLS)和鼠源性IL12的重组耻垢分枝杆菌可以介导很强的MTB特异性免疫反应,能够起到一定的控制结核病的效果[6]。因此以耻垢分枝杆菌为载体的重组活载体疫苗可能成为结核病治疗的有效免疫制剂。

在本研究中,MTB感染小鼠的肺部CFU计数结果说明INH+RFP联合治疗确实有效清除了肺部结核菌。HBHA-hIL12-rMS治疗组肺部荷菌量明显少于MS治疗组和生理盐水组(P<0.05),但其对肺部结核分枝杆菌的控制并没有达到INH+RFP联合治疗的效果。肺部病理变化结果显示,生理盐水对照组小鼠肺泡壁增厚,肺泡腔缩小,有大量的淋巴细胞浸润。感染小鼠应用HBHA-hIL12-rMS免疫治疗两次后,肺部肺泡壁增厚程度及淋巴细胞浸润程度均轻于对照组。INH+RFP联合治疗组肺泡壁结构较为完整,肺泡间隔无明显增厚,仅可见少量淋巴细胞浸润。由此可见,应用HBHA-hIL12-rMS免疫治疗可以有效抑制结核分枝杆菌在体内的增殖,减小机体损伤。但是,单纯应用疫苗很难达到抗结核化疗药物的除菌效果,异烟肼(INH)、利福平(RFP)等抗结核化疗药物仍然是治疗结核病的首选药物。动物实验结果表明在抗结核药物的基础上,使用免疫调节药物,特别是治疗性疫苗,可能会起到良好的治疗效果,有较好的应用前景[7,8]。因此,在下一步的研究中我们将探索INH+RFP联合HBHA-hIL12-rMS的免疫策略,从而进一步控制结核分枝杆菌在机体内的感染。

摘要：评价表达HBHA和hIL12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌用于结核分枝杆菌感染小鼠的免疫治疗效果。结核分枝杆菌H37Rv感染小鼠4周后,用表达HBHA和hIL12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌免疫治疗,检测免疫小鼠肺部荷菌量和组织病理变化。重组耻垢分枝杆菌可有效控制感染小鼠肺部结核分枝杆菌的荷菌量,减轻病理损伤。但在降低肺部荷菌量方面不如化疗药物。表达HBHA和hIL12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌可有效控制结核分枝杆菌在小鼠体内的增殖,可能成为联合化疗药物控制结核病的有效候选疫苗。

关键词：重组耻垢分枝杆菌,结核分枝杆菌,HBHA,hIL-12

参考文献

[1] Cegielski J P, Chin D P, Espinal M A, et al. The global tuberculosis situation. Progress and problems in the 20th century, prospects for the 21st century. Infect Dis Clin North Am,2002;16(1):1—58

[2] Roy E, Brennan J, Jolles S, et al. Beneficial effect of anti-interleukin-4 antibody when administered in a murine model of tuberculosis infection. Tuberculosis (Edinb),2008;88(3):197—202

[3] 赵勇. 结核分枝杆菌肝素结合血凝素与人IL12融合基因重组耻垢分支杆菌的构建及鉴定.中国人兽共患病学报.2011;27(11):78—82

[4] Blower S, Supervie V. Predicting the future of XDR tuberculosis. Lancet Infect Dis,2007;7(7):443

[5] Martino A, Sacchi A, Volpe E, et al. Non-pathogenic Mycobacterium smegmatis induces the differentiation of human monocytes directly into fully mature dendritic cells. J Clin Immunol,2005;25(4):365—375

[6] Yi Z, Fu Y, Yang C, et al. Recombinant M. smegmatis vaccine targeted delivering IL-12/GLS into macrophages can induce specific cellular immunity against M. tuberculosis in BALB/c mice. Vaccine,2007;25(4):638—648

[7] Silva C L, Bonato V L, Coelho-Castelo A A, et al. Immunotherapy with plasmid DNA encoding mycobacterial hsp65 in association with chemotherapy is a more rapid and efficient form of treatment for tuberculosis in mice. Gene Ther,2005;12(3):281—287

重组大肠杆菌论文 篇7

目前世界上超过三分之一的人口感染结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)[1], 其中5%～10%的人最终会发展为结核病(tuberculosis,TB),成为TB的重要来源和传染源。我国是TB高负担国家之一,现约有4亿MTB感染者,年发病人数130万,死亡病例 13万[2,3]。卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin,BCG)是目前预防TB的唯一疫苗,但其只能有效保护儿童TB的发生,而对成人TB的发生则没有保护效果,因此迫切需要研制新型有效的疫苗来预防和控制TB。

MTB是一种胞内菌,其在巨噬细胞内能够生长繁殖,并能以休眠菌的形式长期存在,是TB复发的主要原因[2,3]。研究报道,MTB在休眠期,即其以休眠菌的状态存在时,能够特异性表达与其休眠相关的蛋白,这些蛋白由休眠调节子DosR(dormancy regulon)基因编码,共48个[4]。MTB休眠相关抗原具有较强的免疫原性,他们能和MTB持续感染者的T细胞发生特异性免疫反应,刺激T细胞增殖,释放IFN-γ和IL-2[5]。因此,将他们作为TB新型疫苗的候选抗原将有可能增强疫苗对MTB已感染人群的免疫保护效果。本研究选择MTB休眠相关抗原中免疫原性和表达量较高的两个蛋白Rv2626c和Rv2031c,构建他们的融合基因,并利用大肠埃希菌—分枝杆菌穿梭表达载体在M.s中表达融合蛋白,为其用于TB新型疫苗的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

MTB毒株H37Rv 基因组DNA,大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达载体pDE22及E.coli DH5α菌株均为本室保存。rTaq DNA聚合酶、Hot start rTaq酶,dNTPs,T4 DNA连接酶,Hind Ш, BamH I,DNA Marker DL2000,预染蛋白Marker, pMD18-T载体等均购自Takara公司;DNA片段胶回收试剂盒、质粒小量抽提试剂盒购自Omega公司。小鼠抗Rv2031c、抗Rv2626c单克隆抗体购自Abcam公司。7H9、7H10培养基及营养因子OADC等均购自BD公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计

根据Genebank公布的MTB Rv2031c和Rv2626c全基因序列设计引物如下:Rv2031c上游引物5’AT GGATCC ATG GCC ACC ACC CTT C 3’含BamH I 酶切位点;下游引物5’AGC GATATC GTT GGT GGA CCG G 3’含EcoR Ⅴ酶切位点。Rv2626c上游引物5’AGC GATATC GGT GGC GGT AGC GGC GGT GGC TCC GGC GGT GGC AGC GGT GGC GGT AGC ACC ACC GCA CGC 3’含EcoR Ⅴ酶切位点和48个bp的疏水性linker(斜体);下游引物5’AGC AAGCTT CTA GCT GGC GAG GGC 3’,含Hind Ш酶切位点。均由北京鼎国公司合成。

1.2.2 Rv2031c和Rv2626c基因的扩增、克隆及测序

以MTB H37Rv菌株的基因组DNA为模板,使用Rv2031c的上下游引物进行PCR扩增。PCR反应体系为:10×PCR buffer 2 μL,dNTPs 4 μL(2.5 mmoL/L),DNA模板0.5 μL,上下游引物各1 μL及rTaq酶0.5 μL,加水至20 μL。PCR反应条件:95 ℃预变性5 min,95 ℃变性15 s,55 ℃30 s,72 ℃50 s,共30个循环,末次循环后,72 ℃延伸10 min。Rv2626c的PCR反应体系为:5×green Buffer 5 μL,dNTPs 4 μL(2.5 mmoL/L),DNA模板0.5 μL,上下游引物各1 μL及Hot start rTaq酶0.5 μL,加水至20 μL。PCR反应条件如上。所得2种目的基因PCR扩增片段经琼脂糖凝胶电泳回收后克隆入pMD18-T载体,Rv2031c使用BamH I和EcoR V双酶切鉴定,Rv2626c使用EcoR V和Hind Ш双酶切鉴定。阳性克隆分别命名为pMD18-T-Rv2031c和pMD18-T-L-Rv2626c,基因序列测定由北京奥科生物技术有限公司完成。

1.2.3 Rv2031c-Rv2626c融合基因大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达载体的构建

将pMD18-T-Rv2031c质粒和pMD18-T-Rv2626c重组质粒分别以EcoR V和Hind Ш双酶切,分别回收pMD18-T-Rv2031c载体片段和Rv2626c片段进行连接转化E.coli DH5α,阳性克隆使用BamH I和Hind Ш双酶切鉴定,命名为pMD18-T-Rv2031c-Rv2626c。将pMD18-T-Rv2031c-Rv2626c和pDE22载体分别使用BamH I和Hind Ш双酶切,回收载体片段和目的基因片段进行连接,连接产物转化E.coli DH5α后涂布于潮霉素抗性平板。阳性克隆经BamH I和Hind Ш双酶切鉴定后命名为pDE22-Rv2031c-Rv2626c。

1.2.4 pDE22-Rv2031c-Rv2626c重组M.s的构建及基因型鉴定

将pDE22-Rv2031c-Rv2626c重组质粒电穿孔法转化M.s感受态细胞,电穿条件为2.5 kV,25 μF,1 000 Ω。电穿产物涂布于潮霉素抗性7H10(含OADC 100 mL/L)平板,37°C培养(3～4) d,筛选单个克隆。挑取单个克隆,接种于含潮霉素(5 μg/mL)的7H9(含OADC 100 mL/L和Tween-80 0.5 g/L)培养液中,37 ℃振荡培养。收集培养菌,使用Rv2031c上游引物和Rv2626c下游引物用PCR法进行基因型鉴定。

1.2.5 重组M.s的SDS-PAGE分析

将重组M.s单个菌落接种于含潮霉素(5 μg/mL)的7H9(含OADC 100 mL/L)培养液中,37 °C振荡培养48 h至OD600 nm=0.6,留下诱导前对照样本后,42 ℃分别诱导4 h和8 h后收集菌体,超声裂解后分别收集上清和沉淀,以2×凝胶加样缓冲液50 μL悬浮,煮沸10 min,离心后取10 μL上清进行12%的SDS-PAGE分析。

1.2.6 重组M.s的Western-blot鉴定

将上述制备的样品进行12%SDS-PAGE后以0.15 mA恒流电转2 h转至硝酸纤维素膜上。用50 g/L脱脂奶封闭2 h,PBS洗涤后分别使用抗Rv2031c和抗Rv2626c的单克隆抗体(1∶500稀释)做一抗,4°C过夜,PBS洗涤后加入二抗红外标记的羊抗鼠IgG(1∶10 000稀释)抗体,37 °C孵育1 h。PBS洗涤后红外扫描显色观察结果。

2 结果

2.1 Rv2031c和Rv2626c基因的扩增、克隆及测序

以MTB H37Rv基因组DNA为模板,用合成设计的Rv2031c和Rv2626c基因引物进行PCR扩增,结果成功扩增出与预期一致的各目的基因片段,大小分别为435 bp和480 bp(含48 bp的疏水性linker)(图1)。将各基因PCR扩增产物与pMD18-T载体连接后进行测序,结果各目的基因片段序列与Genbank公布的序列完全一致。

M—DNA marker DL2000,1—带疏水性linker的Rv2626c PCR扩增产物,2—Rv2031c PCR扩增产物

2.2 Rv2031c-Rv2626c融合基因大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达载体的构建

利用限制性酶切位点,将测序正确的Rv2031c和Rv2626c基因片段分别经BamH I与EcoR V,及EcoR V与Hind Ш双酶切后依次亚克隆入同样酶切的pMD18-T载体,构建Rv2031c-Rv2626c融合基因,结果如图2所示成功构建获得Rv2031c-Rv2626c融合基因片段,大小为915 bp,与理论大小相一致。用BamH I和Hind Ш双酶切Rv2031c-Rv2626c融合基因片段,并与同样酶切的大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达载体pDE22连接,构建Rv2031c-Rv2626c融合基因的大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达载体,并命名为pDE22-Rv2031c-Rv2626c。结果如图3所示,重组载体经BamH I和Hind Ш双酶切后能够特异性酶切出与预期大小相一致的载体和目的基因片段,表明Rv2031c-Rv2626c融合基因的大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达载体构建成功。

M—DNA marker DL2000,1—BamH I和Hind Ш 双酶切pMD18-T-Rv2031c-Rv2626c产物

M—DNA marker DL2000,1—BamH I和Hind Ш双酶切 pDE22-Rv2031c-Rv2626c产物,2—BamH I和Hind Ш双酶切pDE22空载体产物

2.3 pDE22-Rv2031c-Rv2626c重组M.s的构建及基因型鉴定

挑起潮霉素抗性平板上筛选的重组M.s单个克隆接种于含潮霉素抗性的7H9培养液中,37 °C培养48 h后,收取培养菌,制备基因组DNA为模板,使用Rv2031c上游引物和Rv2626c下游引物用PCR法进行基因型鉴定。结果成功扩增出Rv2031c-Rv2626c融合基因目的条带,大小与预期相一致,约为915 bp(如图4)。

M—DNA marker DL2000,1—M.s对照, 2—Rv2031c-Rv2626c-rM.s PCR 扩增产物

2.4 重组M.s的诱导表达及SDS-PAGE分析

将基因型鉴定正确的重组M.s接种于含潮霉素抗性的7H9培养液中,37 °C培养48 h后进行42 °C热诱导表达4 h和8 h,收集菌体超声裂解后取上清,12%SDS-PAGE分析诱导表达产物。结果如图5所示,与M.s对照菌及重组M.s未诱导菌相比,重组M.s经42 °C热诱导4 h超声裂解后上清中即有特异性目的蛋白条带出现,且蛋白大小与理论大小相一致,约为35 kDa。当重组M.s经42 °C热诱导8 h后,目的蛋白表达量较诱导4 h时有所增加。

M—蛋白marker,1—M.s对照,2—Rv2031c-Rv2626c- rM.s经42°C,8 h诱导超声后上清,3—Rv2031c-Rv2626c- rM.s经42°C,4 h诱导超声后上清,4—rM.s未经诱导

2.5 Rv2031c-Rv2626c融合蛋白的Western-blot鉴定

将重组M.s经42 °C热诱导8 h后,分别采用抗Rv2031c和抗Rv2626c的单克隆抗体对目的融合蛋白进行Western-blot鉴定。结果如图6、图7所示,重组M.s诱导表达产物在蛋白分子量大小约为35 kDa处均有特异性反应条带出现,而M.s诱导表达产物则无,表明重组M.s能够特异性表达Rv2031c-Rv2626c融合蛋白。

M—预染蛋白marker,1—M.s对照,2—Rv2031c- Rv2626c-rM.S;

M—预染蛋白marker,1—M.s对照,2—Rv2031c- Rv2626c-rM.S;

3 讨论

MTB新型疫苗研究的种类较多,包括DNA疫苗,亚单位疫苗和重组活载体疫苗等。其中重组活疫苗的优点。M.s是一种速生无毒的分枝杆菌,用其作为活载体表达MTB抗原,不仅蛋白表达量高,而且能够较好地保持MTB天然蛋白的生物学特性[10]。此外,M.s生长较快,对其进行基因操作简单,是一种较好的TB新型候选疫苗活载体。

在TB新型疫苗研究中,候选抗原的选择起着关键的作用。近几年的研究发现,在MTB已感染者中MTB在体内主要以休眠菌的状态长期存在,而处于此时期的细菌能够特异性表达与MTB休眠相关的抗原,这些抗原不仅在MTB休眠中发挥着重要的作用,而且也具有较强的免疫原性,能够与MTB已感染人群的外周血T细胞发生特异性的识别,并刺激T细胞产生较高的IFN-r水平。因此,将这些休眠相关抗原作为TB新型疫苗的候选抗原研究具有重要的意义。本研究选取MTB休眠抗原中免疫原性较强的两个抗原Rv2031c和Rv2626c作为TB新型疫苗研究的候选抗原,并构建他们的融合蛋白以期增强机体对MTB休眠菌产生特异性的免疫保护作用。在融合蛋白Rv2031c-Rv2626c中疏水性linker的引入,不仅保障两个蛋白有足够的空间进行正确的折叠,而且利用M.s作为表达宿主能够较好地模拟MTB天然抗原的生物学特性。将Rv2031c-Rv2626c融合基因重组大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达载体,并电穿导入M.s中进行表达,SDS-PAGE结果表明重组M.s能够正确表达目的蛋白Rv2031c-Rv2626c,且Wester-blot结果证实该融合蛋白能够与抗Rv2031c和抗Rv2626c单克隆抗体发生特异性的免疫反应,较好地保留了Rv2031c和Rv2626c各自蛋白的免疫学特性。

总之,本研究成功构建能够表达MTB休眠相关抗原Rv2031c-Rv2626c融合蛋白的重组M.s,为下一步评价其作为TB新型疫苗的研究奠定了基础。

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