肠出血性大肠杆菌（共7篇）
肠出血性大肠杆菌 篇1
肠出血性大肠杆菌O157: H7(以下简称EHEC O157:H7)引起的感染性腹泻越来越严重地威胁着人们的身体健康和生命安全。为了解EHEC O157:H7在南宁市人群及食品、家禽家畜等外环境中的感染情况,2008年广西壮族自治区将南宁市作为肠出血性大肠杆菌监测点,系统地开展了EHEC O157: H7监测工作。现将监测结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
所有数据均来源于2008—2012年南宁市EHEC O157: H7监测点监测数据。
腹泻患者标本:南宁市选取4家三甲医院作为EHEC O157: H7监测点医院。所有标本均由监测点医院的医护人员在肠道门诊采集,标本采集后立即放置冰箱低温保存,并及时送检。
食品标本:在市内各农贸市场和部分宾馆/酒店采集各类生、熟肉食品。
动物粪便及苍蝇标本:在市内各农贸市场和郊区养殖场,采集牛、猪、鸡、鸭为主的动物新鲜粪便标本以及周围环境的苍蝇标本。
1.2 方法
检测方法采用mEC肉汤增菌、免疫磁珠吸附法集菌(或集菌前加胶体金免疫标记筛选),所获得的菌株以血清凝集、生化试验等方法进行系统鉴定。
1.3 统计学分析
使用SPSS 18.0软件进行统计学分析,率的比较使用χ2检验。以P﹤0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 腹泻患者EHEC O157:
H7检出结果 在2 139份患者粪便标本中未检出阳性标本。
2.2 外环境标本EHEC O157:
H7检出结果 2008—2012年共采集外环境标本2 079份,其中家畜家禽等动物粪便2 079份(牛、猪、鸡、鸭、鹅、鸽等),生熟食品849份,苍蝇160份。除在牛、猪、鸡粪便及苍蝇标本中检出EHEC O157: H7菌株20份外,其余标本均未检出EHEC O157: H7。其中牛粪标本阳性率为2.78%,猪粪标本阳性率为1.97%,鸡粪标本阳性率为0.49%,苍蝇标本阳性率1.25%,总阳性率0.38%。各类动物粪便标本EHE CO157∶H7检出情况见表1,经大肠杆菌χ2检验,不同动物粪便EHEC O157: H7阳性率不同,以牛粪检出阳性率最高。
注:χ2=22.964, v=4,P<0.01。
2.3 不同年份EHEC O157:
H7监测标本检出结果 2008—2012年共采集腹泻患者粪便及外环境标本5 227份,检出EHEC O157: H7阳性菌株20份,总阳性率为0.38%。各年份间阳性率的比较,差异无统计学意义(χ2=9.356,v=4,P>0.05);EHEC O157: H7阳性率呈逐年下降趋势。见表2。
注:χ2=9.356, v=4,P>0.05。
3 讨论
EHEG O157: H7是肠出血性肠炎的主要致病菌。该菌感染基本上是一种食源性疾病, 主要通过牛肉、鸡肉、水果、饲料、水等传播, 人与人的亲密接触, 亦可传播。大肠埃希菌O157: H7 的主要毒力因子有志贺样毒素等, 大肠埃希菌O157: H7 感染已经成为世界性的公共卫生问题[1]。
本次通过对南宁市区各监测点腹泻患者粪便及生熟食品、动物粪便和苍蝇等外环境标本进行EHEC O157: H7检测,在动物粪便及苍蝇标本中检出阳性标本20份,其中动物粪便标本18份,苍蝇标本2份,总带菌率为0.38%。从阳性标本的宿主动物的分布情况看,以牛、猪和鸡带菌为主,牛的带菌率最高,与已有的研究结果一致[2,3],牛是该菌的主要宿主。本次监测的牛、猪、鸡的带菌率分别为2.78%,1.97%和0.49%,明显低于江苏省牛、羊带菌率(分别为19.05%和12.01%)[4]以及山东鲁西南地区的猪、牛带菌率(分别为11.17%和7.85%)[5],也低于广西地区的牛、猪、鸡(分别为4.35%、1.27%、0.70%)[3]。提示我市尚处于EHECO 157:H7低污染阶段,暂不具备大流行的条件。
5年来的监测未发现腹泻患者和生熟食品阳性标本,EHEC O157:H7阳性检出率也逐年下降,说明我市在环境治理和对市场所销售的生、熟食品卫生控制比较严格,较好地控制了EHEC O157:H7对食品的污染,未引起市内人群的感染。但王红等[6]在2002—2004年的调查中发现,南宁市的生肉食品存在EHEC O157: H7污染,我们本次的监测结果也表明我市仍有EHEC O157:H7污染存在。EHEC O157:H7可通过多种途径传播,其中以食源性传播为主,水源性传播和接触传播也是重要的传播途径[7]。牛、羊、猪等感染后,可通过粪便持续向外排菌15 d～2个月[8], 而我市多数养殖场的粪便和污水一般都没有经过消毒处理,直接排放,这些带菌的动物粪便有充分的机会造成食品及水体污染,而一旦污染水源,就有可能引起EHEC O157:H7感染性腹泻的暴发,危害公众健康。因此,在公共卫生上应引起高度重视,加强对传染源的管理,特别是对动物疫点家畜家禽应圈养, 动物舍要经常消毒、清扫。动物粪便应该无害化处理, 防止污染水源。继续加强对人群及家畜家禽携带病原菌情况的监测,预测EHEC O157:H7暴发流行的可能性和趋势,采取有力措施, 控制传染源, 切断传播途径, 保护易感人群, 防止疫情的发生。
参考文献
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肠滴虫与大肠杆菌致犬肠炎的诊治 篇2
2008年8月份, 某犬场共养犬32只 (均为10～14月龄金毛犬和德国牧羊犬) , 病犬为14月龄金毛犬, 体重28千克, 精神沉郁、被毛粗乱、消瘦、呕吐, 剧烈腹泻。
主诉:该场犬经常拉稀粥样便, 平均每天2～4次, 逐渐消瘦。曾先后按肠炎治疗, 给予庆大霉素、吡哌酸、拜有利等抗炎治疗, 每次经治疗后病情都有所好转, 但始终未能痊愈。近几天该场犬腹泻剧烈, 于是将症状严重犬带来就诊, 同时还带来一条症状相同的刚病死犬。临床检查, 病犬营养不良, 体温39.6℃, 呼吸、脉搏正常。
2 剖检变化
病死犬胃膨大、黏膜发炎, 充满多量液体和气体;十二指肠充满染有胆汁的黏液状液体;空肠、回肠、结肠扩张, 黏膜、浆膜充、出血, 肠内容物呈稀粥样, 棕红色;胆囊胀大, 肝脏、心脏有小点状坏死灶。膀胱积有黄色混浊尿液, 膀胱黏膜脱落。
3 实验室检查
3.1 粪便化验
取病犬粪和病死犬的肠内容物涂片直接镜检, 均见两头稍尖的球形虫体, 活动性极强, 常作突进式活动, 高倍镜下平均每个视野达16个以上。当粪便放置约15分钟时, 虫体活动能力逐渐减弱, 虫体由向前运动逐渐变为原地旋转运动, 其形态和鞭毛数量清晰可见。该虫有三根稍短的前鞭毛, 另一根稍长的鞭毛沿着腹侧向后折返呈游离状态, 胞核位于虫体前端。当虫体沿身体纵轴旋转运动时呈两头稍尖的球形;当虫体直立时则呈正球形, 并见少量白细胞。
3.2 细菌镜检
病死犬肝脏、心血、结肠内容物分别抹片, 革兰染色镜检, 见单个或呈短链状排列、两端钝圆的短杆菌, 无荚膜和芽孢, 有鞭毛, 革兰染色阴性。
3.3 细菌分离培养
取病料接种于普通琼脂培养基, 37℃、24小时长出圆形、微隆起、湿润、半透明的灰白色菌落;肉汤培养基混浊并形成淡灰色沉淀。将该菌纯培养物抹片, 镜检结果同3.2。
3.4 细菌的鉴别培养及生化试验
该菌麦康凯平板培养基呈红色菌落;伊红美蓝平板培养基上菌落呈黑红色并带有金属光泽。用其纯培养物做生化试验, 结果产生靛基质, 不分解尿素, 不产生硫化氢, 不液化明胶, M·R试验阳性, V-P试验阴性, 能发酵葡萄糖、乳糖、甘露醇, 并能产酸产气, 符合大肠杆菌的特性。
3.5 动物试验
选择健康的实验用小豚鼠6只, 随机平均分为试验组和对照组。试验组小豚鼠用0.3毫升培养24小时的肉汤培养物分别腹腔注射;对照组小豚鼠用0.3毫升肉汤培养基分别腹腔注射。2天后试验组小豚鼠发病, 第3天死亡2只, 第4天死亡1只;对照组小豚鼠无发病表现。用病死小豚鼠的肝脏、心血、腹水分别涂片, 革兰染色后镜检, 结果与3.2结果相同。
3.6 药物敏感试验
选择12种抗菌药物用常规纸片法对分离的大肠杆菌进行药物敏感试验, 结果对阿米卡星、头孢曲松钠、强力霉素高敏;对庆大霉素、恩诺沙星、环丙沙星中敏;对红霉素不敏感。
4 治疗
驱虫:犬场所有犬口服甲硝唑, 每只200毫克/次, 每天3次, 连用14天。
控制感染:阿米卡星500毫克+10%葡萄糖注射液150毫升;头孢曲松钠1.5克+氯化钠注射液200毫升, 分别混匀静脉滴注, 连续5天。碳酸氢钠注射液200毫克+氯化钠注射液100毫升静脉滴注, 1天。
病犬隔离饲养, 并将环境、笼舍彻底清扫, 用5%热火碱水喷洒消毒, 每天1次, 连续2周;用具清洗后, 用0.01%高锰酸钾消毒, 放在阳光下照射。喂给营养高、易消化的食物。
治疗3天后, 患犬出现好转, 5天后康复, 犬场犬无死亡。治疗一周后复查, 粪便外观正常, 镜检未见肠滴虫。一月后回访, 未复发, 该场犬营养状况明显改善。
5 体会
5.1 病因分析
从大量临床病例看, 肠滴虫少量寄生时并不引起明显的临床症状;但大量寄生时, 大便呈稀糊状, 其他临床症状并不明显, 临床血液学检验无特征性变化, 所以临床上很容易造成误诊或漏诊。该犬之前的慢性腹泻很可能是肠滴虫在犬体内寄生引起的犬滴虫性肠炎。该病例很可能是滴虫性肠炎导致犬机体抵抗力下降, 继发大肠杆菌感染。
5.2 肠滴虫与贾第鞭毛虫鉴别诊断
肠滴虫易与贾第鞭毛虫混淆, 尤其是当粪便新鲜、虫体活动力强时, 二者难以分辨。但当粪便放置10分钟以上, 虫体活动力减弱时, 在高倍镜下观察贾第鞭毛虫呈半个梨形, 有两个明显而有特征性的吸盘, 两个核, 四对鞭毛。
5.3 肠滴虫病的预防
肠滴虫是属原生动物门的肠道寄生虫, 它通过滋养体进行传播。犬通过采食被滋养体污染的食物与饮水后而感染。其预防除常规环境、笼舍清扫、消毒外, 可采用药物预防, 如:饲料中加入甲硝唑有较好效果。但一般的常规驱虫只是针对蠕虫, 对原虫病无效。
肠出血性大肠杆菌 篇3
1 菌毛的生物学特性
大肠杆菌的菌毛对一定种类红细胞和相应宿主的肠细胞具有粘附作用。当其粘附于红细胞时能使红细胞发生凝集, 且不被D-甘露糖抑制, 这是一种甘露糖抵抗血凝反应 (MRHA) 。除987P无血凝性外, 其余的均具有各自凝集一定种类红细胞的反应谱, 即血凝谱, 可借此来初步鉴别所分离的大肠杆菌的菌毛种类。菌毛的MRHA可被相应的抗体抑制, 故又可用甘露糖抵抗血凝抑制反应 (MRHI) 来对其作出确诊。各种菌毛对肠上皮的粘附作用具有宿主特异性, 并只能粘附于具有相应受体的特定动物的肠细胞上。如K88 只能粘附于仔猪的十二指肠段, K99 和F41 可粘附于初生猪、牛、羊的空肠, 而987P只能粘附于仔猪回肠。通常一个动物的ETEC菌株只表达一种菌毛, 但已发现有些菌株可同时表达两种或更多种菌毛, 而且又发现了新的菌毛。
2 不同培养条件下的菌毛的表达
2.1 培养传代和培养温度对菌毛形成的影响菌毛的体外表达受诸多因素的影响, 其中培养传代和培养温度是一个重要的影响因素。在连续传代3 次后, 菌毛表达最好, 而随着传代次数的延长, 菌毛表达量有所降低。这可能是因为连续传代导致相应质粒丢失, 进而导致菌毛表达的减少或消失。由于K88、K99、987P的遗传决定子位于质粒上, 在多次传代过程中一些质粒丧失, 因而有可能不产生粘附因子。粘附因子F41 的遗传决定子位于染色体上, 但也受其基因表达程度的影响。Briton等[3]认为菌毛的表达具有相变性, 这种相变是自发产生的, 与培养条件密切相关。因而在培养温度的选择上, 37 ℃是菌毛形成的最适温度, 低于18 ℃则不能形成菌毛, 28 ℃以下能形成少量菌毛。
2.2 培养基对菌毛形成的影响用常用的营养肉汤、Minca培养液、EME培养液和LB培养液在37 ℃培养大肠杆菌, 均可看到菌毛, 但菌毛出现的时间各不相同。Minca培养液培养的大肠杆菌在24 h后即可形成菌毛, 培养72 h后可形成致密菌毛;营养肉汤培养则需36 h后才可看到菌毛, 72 h后可形成大量致密的菌毛。另外, 培养基中的某些成分也可抑制菌毛的表达, 0.5%葡萄糖可抑制K88 菌毛的表达, 丙氨酸能显著抑制987P的形成。
3 菌毛的提取及纯化
3.1 菌毛提取目前常采用的提取大肠杆菌菌毛的方法[4]有:4 ℃万能混合器混合法;60~65 ℃水浴振荡法;4 ℃组织捣碎法;冰浴匀浆法;4 ℃高速搅拌法。贾静等[5]发现当菌悬液加热至60 ℃时, 可使菌毛和菌体分离, 有效地保证了所提取菌毛的数量和纯度, 而且相对于操作繁琐的混合法、捣碎法以及冰浴匀浆法等, 加热法更为简便、易于操作。
3.2 菌毛纯化收获菌体的主要目的是要得到较纯的菌毛蛋白, 可以通过高速离心分离菌体和发酵液, 然后将离心所得菌体热激搅拌, 使菌毛从菌体上脱落下来。在得到纯菌毛蛋白的过程中, 需要对蛋白质进行盐析和透析。用紫外吸收法在280nm处测定菌毛蛋白OD值, 将粗提出来的菌毛蛋白盐析, 盐析后作透析处理。菌毛蛋白的纯度可用SDS-PAGE检测。
4 菌毛的抗免疫原性机理及作用
菌毛抗原是一种蛋白质, 具有良好的抗原性, 给机体免疫后能产生相应的菌毛抗体, 对菌毛粘附型致病性大肠杆菌具有免疫作用。用菌毛抗原免疫怀孕母猪, 抗体可通过母猪初乳和常乳中的菌毛抗体阻止菌毛粘附肠黏膜, 从而使仔猪获得对大肠杆菌的被动免疫。也可以直接用菌毛抗体给幼畜口服, 在肠道内中和菌毛抗原, 使其失去粘附能力。菌毛的循环抗体在防止下痢上效果不大, 只有经口免疫才能建立对下痢的有效局部保护。作用机理:菌毛抗原进入肠道后, 先由淋巴上皮细胞 (M细胞) 捕获, 再把抗原信息传递给下层的巨噬细胞和B细胞、T细胞, 活化后的B细胞和T细胞循环全身, 一部分回到肠黏膜表面定居, 成为分泌型Ig A的浆细胞和致敏淋巴细胞, 建立起“黏膜局部免疫系统”, 从而有效地对抗菌毛抗原在肠黏膜上皮细胞的粘附, 阻止病原性大肠杆菌的异常繁殖。
最早被证明具有免疫作用的大肠杆菌菌毛是猪ETEC K88 抗原[6], 随后的研究者相继又证明了K99、987P、F41 等动物源[7,8]和CFA-I、CFA-II等人源宿主特异性大肠杆菌菌毛疫苗对一些大肠杆菌病具有良好的免疫保护作用[9]。许崇波等[10]对动物初乳中的菌毛抗体进行分析, 结果表明Ig M的调理素活性最高, 而起抗粘附作用的主要是Ig G。
5 菌毛抗体疫苗的临床应用
近年来, 国内外学者就卵黄抗体的研究和开发做了很多工作, 认为鸡卵黄抗体是一种大量、丰富、方便的特异性抗体的来源。卵黄抗体亦称卵黄免疫球蛋白, 是一种高效防治仔猪大肠杆菌性腹泻的生物制剂, 利用蛋鸡生产特异性卵黄抗体具有可规模化生产、成本低、特异性抗体含量高及安全性好等优点。Marquardt等[12]先后报道了菌毛卵黄抗体对初生和断奶仔猪腹泻的防治效果。Jin等[11]的体外试验表明, 经喷雾干燥的含抗K88 菌毛抗体的鸡卵黄粉能阻碍ETEC K88 与猪小肠黏膜的粘附。肖驰等[13]还比较了菌毛蛋白疫苗卵黄抗体和细菌疫苗卵黄抗体对仔猪大肠杆菌性腹泻的预防效果, 结果表明两种卵黄抗体都有效, 但菌毛疫苗抗体的效果更好;试验还显示卵黄抗体对仔猪黄痢的治愈率高于庆大霉素、土霉素和痢特灵。卵黄抗体经仔猪口服后有抗ETEC感染的作用, 它能与特异性粘附素抗原结合, 减少或阻断粘附素粘附到仔猪肠道乳膜上皮细胞的表面, 使ETEC不能在小肠定居繁殖, 阻碍肠毒素分泌, 从而防止腹泻[14]。用特异性卵黄抗体防治仔猪大肠杆菌性腹泻, 不会影响肠道正常菌群的生长繁殖, 不存在抗药性和药物残留问题, 同时避免了怀孕母猪因注射疫苗引起的应激反应或仔猪母源抗体水平不足而导致的免疫丧失等问题, 是一种安全高效的生物防制剂。
6 小结和展望
关于ETEC菌毛蛋白的研究方法较多, 且都有各自的优势, 但也存在着一些不足。菌毛作为疫苗研制的理想候选蛋白质, 用来制成疫苗免疫母猪, 可使所产仔猪获得被动免疫, 不受大肠杆菌的侵袭。现代分子生物学和免疫学的进一步发展为研制安全有效的ETEC多价疫苗提供了先进的理论和技术支持, 加速了现存ETEC疫苗的完善和新兴ETEC载体、DNA、植物疫苗的发展。如新CFAs的发现提供了更多的抗原种类;ETEC基因组、蛋白质组的深入研究则提供了更多的减毒基因和抗原表位的选择;黏膜免疫调节机制的揭秘也定能为ETEC疫苗的发展开辟新的道路。
摘要：产肠毒素性大肠杆菌 (ETEC) 常引起仔猪腹泻, 在世界范围内造成了严重的经济损失。ETEC的致病作用与其具有粘附性菌毛和肠毒素密切相关, ETEC菌株的菌毛可与宿主黏膜上皮细胞表面的相应受体结合, 并在局部组织定居、繁殖和产生毒素, 损伤小肠黏膜, 使小肠吸收分泌功能失常而致腹泻。本文针对ETEC菌毛的生物学特性、表达条件、免疫原性等方面作一概述。
肠出血性大肠杆菌 篇4
ETEC在肠道内定植后生长增殖, 随后释放肠毒素引发细胞内水、电解质失衡导致水样腹泻。ETEC分泌的肠毒素包括不耐热肠毒素 (LT) 、耐热肠毒素a (STa) 、耐热肠毒素b (STb) 和肠聚集热稳定肠毒素1 (EAST1) [3]。虽然大多数新生仔猪可以通过免疫后母猪的初乳和乳汁获得保护, 但是ETEC感染非侵入性胃肠道感染, 因此粘膜免疫比系统免疫更为重要。目前市场上有几种疫苗, 包括:带菌毛的灭活菌、带LT的纯化菌毛或不带LT的纯化菌毛菌应用怀孕母猪。但随着母猪年龄的增大, 通过这些疫苗所获得免疫逐渐降低;而且在断奶时催乳免疫突然消失, 导致刚断奶的仔猪很容易感染肠杆菌。为了保护刚断奶的仔猪, 积极的肠道粘膜免疫应答尤为重要。
1 口服亚单位疫苗的应用
在感染时, 由于菌毛在细菌定植的过程中扮演着至关重要的角色, 使得口服菌毛疫苗的研发发展迅速。纯化的F4ac菌毛是一种很强的口服免疫原, 在断奶仔猪中, 连续两天口服1mg后, 在第4、7、8和11天可分别导致派伊尔淋巴集结、肠系膜淋巴结、血液和固有膜中分泌F4特异性抗体的细胞出现, 所诱导产生的Ig A应答可与口服感染ETEC产生的应答相比。当断奶仔猪连续3天接种口服疫苗并在初免后第16天加强免疫一次, 可以完全能预防口服含F4菌毛的ETEC所致的感染。Joensuu等人建议可用转基因食用苜蓿植物作为F4菌毛粘附和主要亚单位Fae G的载体, 这样既安全又廉价, 但研究表明效果不是很理想[4]。
与菌毛F4相比, 当用F18大肠杆菌感染时, 口服纯化的F18不能诱导产生保护性的免疫应答, 当F18菌毛剂量达30mg并联合使用粘膜佐剂LT (R139G) 也不能产生保护效果[5]。这两种菌毛所产生的免疫原性差异可能它们的结构相关。F18的粘附素是小亚基Fed F, 然而F4菌毛的粘附素主要菌毛大亚基Fae G。在最近的研究中发现, 当断奶仔猪口服重组Fed F并联合使用F4菌毛时, 能减少粪便中F18阳性大肠杆菌的排泄。这种联合疫苗的研发开启了一种对抗F4和F18感染的新途径[2]。
2 口服活疫苗的应用
口服弱毒苗和野生型无致病大肠杆菌活苗是ETEC疫苗接种的另外一种好的途径。当动物口服这些疫苗后, 疫苗菌粘附到小肠细胞触发产生免疫应答, 并迅速产生特异性抗原s Ig A抗体, 阻止产生同类菌毛的致病性菌的繁殖。可Bozic等人报道:在断奶后的第4天, 断奶仔猪单次口服表达F4ac的弱毒大肠杆菌后, 在第7天不能抵抗强毒力菌株的感染[6]。一种名为Coliprotec的口服活疫苗今年来相继在加拿大、巴西、美国等地开始应用, 这种疫苗可抵抗F4阳性ETEC引起的腹泻。这种疫苗含有天然无致病力的大肠杆菌, 表达F4粘附素但不产生毒素。临床实验证明Coliprotec能很好的抵抗致病性F4阳性ETEC的感染且安全性好。F4阳性ETEC引起的断奶后腹泻 (PDW) 一般发生在断奶后3~10天, 因此, 从断奶第1天至发生有一个时间间隔无法得到保护。为了避免这种情况, 第一次接种最好在哺乳期, 但在这个阶段胃肠道存在的哺乳期抗体也许会影响疫苗株的繁殖甚至免疫失败。虽然Bertschinger等人在试验中用F18ac阳性大肠杆菌疫苗免疫哺乳仔猪 (由带有F18特异性初乳Ig A抗体的母猪所产) 取得了好的效果, 但对F18ab没有起到交叉保护[2]。另外, 在Coddens等人的研究中发现, 日龄10天的仔猪中不表达或弱表达F18受体, 在这些猪肠道中不太可能有细菌的繁殖[7]。因此, 对这种疫苗的保护作用需进一步研究。
3 胶囊亚单位活疫苗的应用
为了提高活疫苗和亚单位疫苗的效果, 胶囊疫苗的应用起到了较好的作用。在哺乳期间, 胶囊疫苗可以保护疫苗在胃肠道运输过程中被母源抗体和其他的乳汁因子 (如乳脂球上的受体类似物或乳清等) 中和掉。Felder等人检测了微型胶囊疫苗的效果, 他们将F18阳性大肠杆菌和F18菌毛装在聚丙交酯-乙交酯 (PIg A) 微球中, 通过喷雾干燥和口服的方法免疫新生仔猪和断奶仔猪。结果发现:口服F18菌毛胶囊疫苗没有明显提高断奶仔猪的血清抗体应答, 也不能减少大肠杆菌感染细菌的繁殖, Verdonckde等人研究中也得到了类似的结果[2,5,8]。虽然给哺乳仔猪口服F18阳性大肠杆菌疫苗能取得较好的效果, 但胶囊化的F18阳性大肠杆菌在断奶仔猪和哺乳期仔猪都未能显著诱导应答。
胶囊化的F4菌毛能显著减少攻毒后F4阳性ETEC的分泌, 但当给哺乳仔猪口服接种F4菌毛培养液时不能取得这样的效果, 这表明胶囊化对保护抗原免受胃和小肠前段中酶的降解和失活或受乳汁因子中和有积极作用的, 但需进一步优化以提高其作用。一种由高直链淀粉羟甲基淀粉组成的口服片剂可以用来传送F4阳性大肠杆菌或纯化的F4菌毛, 可以使细菌有更高的成活率并使F4菌毛在胃肠道中更稳定。抗原的释放处决于片剂从酸性的胃内环境到碱性酶的肠道环境过程中的快速膨胀, 触发快速的溶解。分装在Gantrez纳米中的F4胶囊虽然能提高抗F4血清抗体水平, 但与溶解的F4菌毛相比不能提高血清抗体应答[9]。
4 注射疫苗的应用
由于乳汁母源抗体的存在, 可以用注射用免疫对哺乳仔猪进行疫苗。这些疫苗通常只刺激系统免疫而不作用于粘膜免疫系统。在哺乳期间, 肌肉注射福尔马林灭活的F4阳性大肠杆菌可导致免疫抑制。经肌肉免疫1mg F4菌毛能诱导系统Ig A应答。当疫苗剂量降到0.1mg时, 引起的应答反应更强, 这提示除免疫途径外, 抗原剂量在诱导血清Ig A应答中也起着很重要的作用。此外, 用小规模无菌猪进行试验发现, 肌肉注射融合蛋白Fae G-Fed F-LT192A2:B可诱导血清、粪便和肠道冲洗物中Ig A抗体的产生, 这样可以中和CT, 抑制F4和F8的粘附而保护猪只。融合蛋白的使用可以用来研发多价苗来抵抗ETEC诱导的断奶后仔猪腹泻。维生素D3作为免疫调节因子, 可以用来调节系统对肠粘膜Ig A的应答。联合肌肉注射维生素D3和抗原可使派尔集结淋巴结中Ig A ASC数量的增加。在第8天和第25天时用F4菌毛肌内免疫哺乳仔猪, 在第33天攻毒后能减少粪便排泄物, 当维生素D3增加时这种作用更明显[10]。
5 结语
ETEC一直是引起断奶仔猪腹泻的重要原因, 在养猪生产中导致严重的经济损失, 其致病与F4或F8密切相关。当感染时, 在小肠中特异的F4和F8 s Ig A应答可防止细菌增殖。目前, 几个口服疫苗包括亚单位苗和口服活苗在断奶仔猪中取得了较好的效果。由于F4阳性ETEC引起仔猪腹泻一般发生在断奶后的3~10天, 因此在哺乳期间免疫更理想。胶囊化的亚甲基苗和口服活疫苗可以克服疫苗在胃肠道中被降解, 还可防止被母源抗体和/或其他乳汁因子中和, 但目前应用效果不佳。用注射用疫苗是另外一种可行的预防途径, 但用于母猪的注射用疫苗倾向于刺激全身的而不是局部粘膜免疫系统。虽然注射免疫后可诱导系统的Ig A应答和肠道Ig A抗体产生, 但在ETEC感染时, 有效的ETEC免疫通常也需要GALT中特异性抗体Ig A ASC的存在。维生素D3作为一种免疫调节因子在小鼠中取得了好的效果, 但当应用于哺乳仔猪时并没有获得保护性的粘膜免疫。因此, 在注射免疫中, 胶囊化的活疫苗和免疫调节剂的联合使用可以克服哺乳期注射疫苗带来的问题, 但仍需进一步的研究。
参考文献
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肠出血性大肠杆菌 篇5
关键词：产肠毒素大肠杆菌(ETEC),环介质恒温介导技术(LAMP技术),优化反应条件,快速检测,生牛乳
食品安全是一个世界性问题[1]。产肠毒素大肠杆菌( ETEC) 与全球范围内许多大规模食源性疾病暴发有关[2,3]。据估计,每年ETEC约导致2亿例腹泻与380 000例死亡[4,5]。ETEC感染引发的腹泻症状与霍乱类似,并且会导致内毒素与凝结素的产生,轻致中度腹泻,严重的会导致霍乱样综合征[6]。
目前,研究者已经开发出了许多检测ETEC的方法,其中单克隆抗体技术耗时长,并且需要特殊的仪器设备[7]。q PCR检测法快捷迅速,具有良好的灵敏性与特异性,但也需要昂贵的q PCR反应系统[8]。此外,生物样本中含有大量的PCR抑制剂( 包括各种有机与无机组分,如洗涤剂、抗生素、酚类化合物、酶、多糖、脂肪、蛋白质和盐等) ,这些抑制剂会抑制PCR反应[9,10]。因此,有必要开发一种敏感、快速、廉价、简便的检测ETEC的方法。
近年来,一种叫做环介质恒温介导( LAMP) 的核酸扩增技术被广泛应用于快速扩增核酸分子[11]。LAMP区别于PCR之处在于有4 ~ 6对同时引物识别目标基因,同时在一种特殊的Bst DNA聚合酶的催化下快速扩增靶序列。一系列反应均是在恒温条件下进行的,因此LAMP反应可以在一个恒温水浴锅中进行,而无需昂贵的温度循环装置。此外,LAMP还有优于PCR的一点在于其阳性结果会导致反应体系浊度变化,可以通过肉眼判断而不需要复杂且昂贵的电泳设备来检测。
试验探讨了LAMP技术用于 检测生牛 乳中ETEC的反应条件。研究目的在于: 1 ) 优化反应条件; 2) 分析LAMP检测法的特异性与敏感性; 3) 建立一种廉价、低消耗的检测生牛乳中ETEC的方法。
1 材料
1. 1 主要试剂
DNA纯化试剂盒,由上海生工生物工程技术服务有限公司提供; 生牛乳,购自四川省成都市商场; 引物,由上海Sangon生物工程技术有限公司合成; 1 ×Thermopol Buffer、限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ,由北京纽英伦生物技术有限公司提供; 其余试剂,均由成都维辉科技有限公司提供。
1. 2 主要仪器
高速冷冻离心机( 型号为Centrifuge 5810 R) ,由Eppendorf公司生产; 恒温培养箱 ( 型号为DHP -9082) ,由上海齐欣科学仪器厂生产; 超净工作台( 型号为JB - CJ - 800) ,由苏州佳宝净化工程设备有限公司生产; 涡旋混匀器( 型号为XW - 80A) ,由上海精科生产; 恒温水浴锅( HH数显式) ,由常州密思仪器有限公司生产; PCR仪( 型号为5334) ,由Eppendorf公司生产; 凝胶成像 系统 ( 型号为Gel DocTMXR + ) ,由Bio - rad公司生产; 电泳仪( 型号为DYC -8C) ,由北京六一仪器厂生产。
2 方法
2. 1 菌株与培养条件
试验所用菌株,见表1。培养条件: 营养肉汤培养基,37 ℃培养24 ~ 48 h。
2. 2 生牛乳的人工接种
将牛乳分装成每份25 m L的供试品,每份供试品接种2 m L ETEC培养液,在37 ℃ 条件下孵育24 h,最终牛乳中微生物指标为1 × 108~ 1 × 109cfu / m L。
2. 3 DNA 的提取
菌株DNA的提取使用离心柱式寡聚DNA纯化试剂盒( 型号为UNIQ - 10) 。接种的生牛乳在缓冲液[20 mmol/L三羟甲基氨基甲烷( Tris) - HCl( p H值为8. 0) ,2 mmol/L乙二胺四乙酸( EDTA) ( p H值为8. 0) ,1. 2% Triton X - 100) ]中连续梯度稀释,10 000 × g冷冻离心,弃上清液,沉淀悬浮于200 μL缓冲液 [20 mmol/L Tris - HCl ( p H值为8. 0 ) ,2 mmol / L EDTA ( p H值为8. 0 ) ,1. 2% Triton X -100]中,在56 ℃ 条件下孵育20 min,涡旋混合后10 000 × g高速离心2 min,取清液作为DNA模板。
2. 4 LAMP 引物
以不耐热肠毒 素A亚基与B亚基编码 基因( Gen Bank登录号为S60731) 为靶基因,特异设计4组引物,见表2。
2. 5 LAMP 反应条件的优化
2. 5. 1筛选最佳引物反应体系: 16 μmol / L引物F3与引物B3,128 μmol / L引物BIP与引物FIP,DNA模板4 μL,8 U Bst DNA聚合酶,0. 45 μmol/L d NTPs,甜菜碱溶液5 μL,1 × Thermopol Buffer。 在60 ℃ 条件下孵育60 min。
2. 5. 2探索最佳反应温度与时间为探讨最佳反应温度与时间,进行10次筛选试验,反应体系构成与步骤同上,引物使用上一步筛选出的最优引物,孵育条件为: 63 ℃ 条件下分别孵育15 min、30 min、45 min、60 min、75 min,分别在55 ℃ 、58 ℃ 、60 ℃ 、63 ℃ 、65 ℃ 条件下孵育60 min。
2. 5. 3组分含量的优化为决定最优Bst DNA聚合酶加入量,进行5次筛选试验,反应体系构成同上,引物加入量分别为2 U、4 U、6 U、8 U、10 U。为决定最优引物量,进行4次筛选试验,引物浓度分别为: B3与F3 8 μmol/L,BIP与FIP 64 μmol/L; B3与F312 μmol / L,BIP与FIP 96 μmol / L; B3与F316 μmol / L,BIP与FIP 128 μmol / L; B3与F320 μmol / L,BIP与FIP 160 μmol / L。反应混合物在60 ℃ 条件下孵育60 min。
2. 6 LAMP 产物的检测
LAMP反应体系孵育结束后,在80 ℃ 条件下加热5 min以终结反应,然后经过2% 琼脂糖电泳,溴化乙锭染色后在紫外灯下观察。
2. 7 敏感性检测
从生牛乳中提取的DNA连续梯度稀释后,用作LAMP检测与PCR检测的模板,以比较2种检测方法的敏感性。
2. 8 特异性检测
表1中所有微生物的DNA均用于检测LAMP反应的特异性。不添加模板的组作为阴性对照组。为排除虚假阳性干扰,以ETEC DNA为模板的LAMP产物使用限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ酶切。反应体系: 双蒸水18 μL,LAMP产物10 μL,10 × NE Buffer2 μL,限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ2 μL。37 ℃ 条件下孵育3 h。
3 结果与分析
3. 1 引物的筛选
研究以不耐热肠毒素A亚基与B亚基编码基因( Gen Bank登录号为S60731) 为靶基因,特异设计4组引物( 见表2) 。每组引物经过筛选反应,结果表明,只有引物3才能使靶基因有效扩增( 见图1) 。因此,选择引物3为扩增引物。
M. DL - 2 000 Marker ; Ⅰ. 引物 set 1 ; Ⅱ. 引物 set 2 ; Ⅲ. 引物 set 3 ; Ⅳ. 引物 set 4。
3. 2 最优反应条件筛选的结果
当使用引物3为扩增引 物时,LAMP反应在63 ℃ 与65 ℃ 条件下均能产生电泳条带,而当温度低于60 ℃( 包括60 ℃) 时,不能产生条带( 见图2) ,基于节约能源的因素,判断LAMP反应的最适温度为63 ℃ 。当使用引物3为扩增引物时,LAMP反应所需最低时间为60 min,而且当反 应持续更 长时间( 75 min,其余条件完全相同) ,电泳条带不会变得更清晰( 见图3) ,当反应时间多于1 h,LAMP反应不会提供更可靠的结果,因此判断LAMP反应最佳时间为60 min。
M. DL - 2 000 Marker ; Ⅰ. 65 ℃ ; Ⅱ. 63 ℃ ; Ⅲ. 60 ℃ ; Ⅳ. 58 ℃ ; Ⅴ. 55 ℃ 。
M. DL - 2 000 Marker ; Ⅰ. 15 min ; Ⅱ. 30 min ; Ⅲ. 45 min ; Ⅳ. 60 min ; Ⅴ. 75 min。
3. 3 反应组分含量的优化
研究中,只有当引物含量高于一定值( 引物BIP与FIP高于128 μmol/L,引物B3与F3高于16 μmol / L) 时,DNA模板才会扩增 ( 见图4 ) 。添加更多的引物会使电泳条带更加清晰。当Bst DNA聚合酶含量最低( 2 U) 时,ETEC DNA也能成功扩增( 见图5) 。Bst DNA聚合酶含量并不是影响LAMP反应的主要因素。
Ⅳ. 引物 B3 与 F3 20 μmol /L ,引物 BIP 与 FIP 160 μmol / L ; Ⅲ. 引物 B3 与 F3 16 μmol / L , 引物 BIP 与 FIP 128 μmol/L ; Ⅱ. 引物 B3 与 物 F3 12 μmol/L ,引物 BIP 与 FIP 96 μmol/L ; Ⅰ. 引物 B3 与 F3 8 μmol /L ,引物 BIP 与 FIP 64 μmol / L ; M. DL - 2 000 Marker。
Ⅴ. 10 U ; Ⅳ. 8 U ; Ⅲ. 6 U ; Ⅱ. 4 U ; Ⅰ. 2 U ; M. DL - 2 000 Marker。
3. 4 LAMP 反应的敏感性
当DNA提取液被稀释至1 × 10- 8时( 对应菌落浓度547 cfu /m L) ,仍能检出LAMP,而PCR仅能检测到1 × 10- 7倍的稀释 液。LAMP在检测生 牛乳中ETEC时的敏感性为PCR的1 000倍( 见图6) 。
3. 5 LAMP 反应的特异性
在特异性试验中,ETEC的DNA扩增十分成功,其余9个菌株均未见电泳条带( 见图7A) ,也没有肉眼可见的白色沉淀与颜色反应( 见图7B、图7C) 。经过限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ消化,以ETEC DNA为模板的LAMP反应产物被酶解成为数个核酸片段,消化的产物经过2% 琼脂糖电泳,结果与预期结果一致( 见图7D,即372 bp、285 bp、240 bp、200 bp) ,这证明了LAMP反应在检测ETEC时的特异性。
4 讨论
LAMP反应被广泛应用于疾病检测[12]、食源性致病微生物的检测[13]以及成分的快速判别[14]。研究中,LAMP在检测生牛乳中的ETEC时表现了良好的特异性,原因在于LAMP反应中,引物特异性识别了靶基因的6段独立序列,4段独立序列扩增靶基因[15],与之相比PCR反应仅有1对引物扩增目标基因。考虑到LAMP反应的高敏感性可能会导致假阳性结果,试验使用限制性内切酶对LAMP反应产物进行酶解,酶解所得核酸片段与预期结果一致,这证明了LAMP反应检测生牛乳中ETEC的特异性。
由图3可知,LAMP反应在检测ETEC时比PCR反应灵敏10倍,这与I. Gunimaladevi等[16]的研究结果相似。也有研究表明,LAMP反应比传统的RT -PCR要灵敏10倍[17,18,19]。
有研究表明,LAMP技术在检测ETEC时最佳温度为63 ℃,所需要的最低反应时间为1 h[20,21]。采用LAMP检测生牛乳ETEC体系中,引物最低浓度为: B3与F3 16 μmol/L,BIP与FIP 128 μmol/L,并且靶基因的扩增不随着Bst DNA聚合酶浓度的增加而增加,这一点可用于控制检测成本。
肠出血性大肠杆菌 篇6
1 材料与方法
1.1 病料与试剂
对送检的1头死亡母猪进行解剖, 发现胃内有大的溃疡灶, 肠道出血严重, 其他脏器无明显的肉眼可见病变。无菌取胃、小肠和大肠作为病料。
药敏纸片 (批号为KE16) , 购自浙江康泰生物科技有限公司;微量生化鉴定管 (批号为110912) , 购自杭州天和微生物试剂有限公司;6周龄雌性昆明小白鼠, 购自南昌大学动物试验中心;血液琼脂培养基、肉肝汤培养基、伊红美蓝琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基, 自制。
1.2 细菌的分离与纯化
将收集的病料无菌划线接种于血琼脂培养基, 37 ℃烛缸培养12 h;再分别挑取单个菌落接种于血琼脂培养基进行纯培养, 观察细菌菌落特征。同时将病料接种于肉肝汤培养基中, 37 ℃烛缸培养12 h, 观察结果。
1.3 细菌的鉴定
取纯化的单菌落进行涂片、革兰染色及镜检;并将纯培养物接种于伊红美蓝琼脂和麦康凯琼脂培养基, 37 ℃烛缸培养12～24 h, 观察细菌菌落形态, 染色、镜检。
1.4 生化鉴定
分别挑取各种纯培养物的单菌落于液体培养基中, 37 ℃、200 r/min振荡培养10～12 h;将培养的菌液接种于微量生化鉴定管, 37 ℃烛缸培养24～48 h, 观察结果。
1.5 动物试验
分别取各种培养物的菌液0.5 mL腹腔注射3只小白鼠;同时用3只小白鼠作正常对照, 腹腔注射生理盐水。观察发病及死亡情况。
1.6 药敏试验
药敏试验操作方法按2005年版CLSI/NCCLS M100-S15所述方法进行;判断标准按2010版CLSI M100-S20执行。
2 结果
2.1 病原菌的分离结果及培养特性
肉肝汤培养基无产气和混浊现象。分离菌在血液琼脂培养基上出现2种菌落:第1种为半透明、圆形、湿润、灰白色的菌落 (1号菌) , 第2种菌落比第1种略大, 半透明、圆形、湿润、透明 (2号菌) , 2种菌均不溶血, 革兰染色结果均为阴性、两端钝圆的短杆菌。1号菌在普通琼脂培养基上生长为边缘整齐、光滑、湿润、透明、圆形的菌落;在麦康凯琼脂培养基上为粉红色、圆形的菌落, 中间有1个黑点;在伊红美蓝琼脂培养基上长成紫黑色、带金属光泽的菌落。2号菌在普通琼脂平板培养基上为黏稠、圆形、灰白色菌落;在麦康凯琼脂培养基上为黏稠、红色、圆形菌落;在伊红美蓝琼脂培养基上为棕红色、扁平状菌落。
2.2 生化鉴定结果 (见表1)
注:+表示阳性;-表示阴性;⊕表示产酸、产气。
综合分离菌的培养特性和生化鉴定结果, 判定的1号菌为H2S阳性大肠杆菌, 2号菌为产气肠杆菌。
2.3 动物试验结果
腹腔注射2种菌液16 h后, 小白鼠全部死亡;正常对照的小白鼠观察10 d仍存活。解剖死亡小白鼠可见肠道出血;肝脏周边梗死, 表面有针尖大小出血点;脾脏呈深黑色。对死亡小白鼠的心脏、肝脏以及腹水进行细菌分离, 观察分离菌的菌落形态、大小、革兰染色等生物学特性, 结果与从母猪肠道分离的细菌一致。而将存活的正常对照小白鼠处死后进行细菌分离则未见相应细菌生长。
2.4 药敏试验结果 (见表2)
表2结果表明, 2种菌均对头孢唑啉高度敏感, 对其他药物的敏感度不一致。1号菌 (H2S阳性大肠杆菌) 对新霉素、新生霉素和痢特灵高度敏感, 对哌拉西林和阿米卡星中度敏感, 对其他药物均不敏感。2号菌 (产气肠杆菌) 对阿米卡星高度敏感, 对哌拉西林、链霉素、阿莫西林、新生霉素、痢特灵和强力霉素中度敏感, 对其他药物均不敏感。
3 小结和讨论
目前, 猪传染病仍是影响我国养猪业发展的主要问题, 其中危害最严重的是呼吸系统疾病、繁殖障碍性疾病和腹泻等, 这些疾病发病率和死亡率都较高, 给猪场造成了巨大的经济损失。其中猪细菌性腹泻可造成仔猪死亡, 育肥猪生长发育受阻、饲料报酬降低、混合感染其他病原等, 成为猪群抵抗力下降的主要原因之一。
产气肠杆菌为肠杆菌科、肠杆菌属, 大肠杆菌为肠杆菌科、埃希菌属成员, 两者均为肠道的正常菌。两种细菌仅在动物机体免疫力低下或细菌侵入肠道外部位等特殊条件下引起疾病[2]。近年来, 由于防控疫病的需要, 大量应用抗生素已成为多数猪场的普遍现象, 造成的后果是药物本身的不良反应, 损伤组织器官, 使机体抵抗力降低;引起菌群失调, 二重感染;在选择压力下, 细菌的耐药能力越来越强[3]。在这种条件下, 致病菌或者条件致病菌就有可能大量繁殖, 进而导致腹泻发生。
试验对送检的病猪进行病理剖检, 首先怀疑是魏氏梭菌感染, 但对病料进行瑞氏染色未见粗大杆菌, 却见较多的两端钝圆的短杆菌;取病料用肉肝汤培养基进行细菌分离, 也未分离到魏氏梭菌。在血液琼脂培养基上出现2种大小不同, 形态、颜色基本一致的菌落, 均为革兰阴性的直杆菌。1号菌在伊红美蓝琼脂平板上形成紫黑色、带金属光泽的菌落;在麦康凯培养基上形成粉红色菌落, 菌落中心呈黑色;能发酵葡萄糖、乳糖、果糖、阿拉伯糖、鼠李糖和甘露醇, 产酸、产气;不发酵麦芽糖和蔗糖;硝酸盐和H2S试验结果阳性;鸟氨酸脱羧酶、甲基红-维培和赖氨酸脱羧酶试验结果为阴性。2号菌在伊红美蓝琼脂平板上形成棕红色的菌落;在麦康凯琼脂培养基上为黏稠、红色、圆形菌落;能发酵葡萄糖、乳糖、果糖、阿拉伯糖、麦芽糖和甘露醇, 产酸、产气;不发酵鼠李糖和蔗糖;硝酸盐和甲基红-维培试验结果为阳性;H2S、鸟氨酸脱羧酶和赖氨酸脱羧酶试验结果为阴性。动物试验结果表明, 用分离到的2株菌经腹腔注射小白鼠, 16 h内接种鼠全部死亡, 表明分离菌为致病菌。根据分离菌的培养特性和生化鉴定, 参考《伯杰系统细菌学手册》, 判定1号菌为H2S阳性大肠杆菌, 2号菌为产气肠杆菌。
药敏试验结果表明:2种菌均对头孢唑啉高度敏感, 对其他药物的敏感性不一致。根据药敏试验结果, 使用头孢唑啉和新生霉素3 d病情好转, 用药7 d后至今未见新病例发生。说明目前在抗生素大量使用的条件下, 致病菌的耐药性不断增强, 防控越来越难。根据药敏试验结果有针对性地合理选用高敏药物, 可及时控制和防止细菌性疾病的发生。
摘要：为了研究某规模化猪场胀气死亡母猪的病原及筛选有效治疗药物, 试验采用常规细菌分离培养方法, 对其消化道进行致病菌分离、鉴定、动物攻毒试验和药敏试验。结果表明:从肠道内分离出2株细菌纯培养物, 均为革兰阴性短杆菌, 一株菌为H2S阳性大肠杆菌, 另一株菌为产气肠杆菌;2株分离菌均可致死小白鼠。H2S阳性大肠杆菌对新霉素、新生霉素和痢特灵高度敏感, 对哌拉西林和阿米卡星中度敏感, 对其他药物低敏或不敏感;产气肠杆菌对阿米卡星高度敏感, 对哌拉西林、链霉素、阿莫西林、新生霉素、痢特灵和强力霉素中度敏感, 对其他药物低敏或不敏感。
关键词：产气肠杆菌,H2S阳性大肠杆菌,药敏试验
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肠出血性大肠杆菌 篇7
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 仪器7300荧光PCR仪, 购自美国ABI公司。
1.1.2 菌株
本研究收集了10株阪崎肠杆菌, 其中2株为参考菌株 (ATCC 29544、ATCC 51329) , 其余8株为微生物实验室从奶粉中分离并经国标方法鉴定为阪崎肠杆菌;15株阪崎肠杆菌的近源菌株分别是:福氏志贺氏菌ATCC12022、痢疾志贺氏菌CMCC51105、宋内氏志贺氏菌CMCC51592、弗劳地枸橼酸菌CM-CC48021、副溶血性弧菌ATCC17802、金黄色葡萄球菌ATCC25923、铜绿假单胞菌ATCC15442、铜绿假单胞菌ATCC9027、普通变形杆菌CMCC49027、大肠埃希氏菌ATCC25922、大肠埃希氏菌ATCC8739、奇异变形杆菌CM-CC49005;肠炎沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、小肠耶尔森氏菌均来自中国疾病预防控制中心。
1.1.3 试剂
m LST增菌液、胰蛋白胨大豆琼脂 (TSA) 、营养肉汤、阪崎肠杆菌显色培养基购自北京陆桥技术有限责任公司;API20E生化反应板购自法国生物梅里埃公司;荧光PCR试剂引物和探针由深圳生科源公司合成。
1.2 方法
1.2.1 菌株的分离和鉴定
细菌的分离鉴定按照食品安全国家标准GB4789.40-2010《食品微生物检验方法阪崎肠杆菌检验》进行。
1.2.2 模板的提取
取500μL增菌液于1.5m L离心管中, 以13 000r/m离心5分钟, 吸弃上清液, 加50μL DNA裂解液 (或挑取纯菌株培养物于离心管, 直接加50μL DNA裂解液) , 置100℃金属浴5分钟, 冷却后以13 000r/m转速离心5分钟, 留上清液备用。
1.2.3 引物和探针的设计
根据Gen Bank公布的阪崎肠杆菌的16S和23S r DNA的保守区设计一对引物和探针:
引物和探针由深圳生科源公司合成。
1.2.4 PCR反应条件[4]
反应总体积为25μL, 内含5μL模板, 2.5μL 10×PCR缓冲液, 1.5mmol Mg CL, 0.25mmol d NTP, 0.5μL Tag酶, 25 pmol引物, 25pmol探针, 实时PCR反应参数为:50℃2分钟, 95℃3分钟1个循环;95℃5秒, 55℃60秒60个循环, 55℃收集荧光。
1.2.5 灵敏度分析
[5]:选阪崎肠杆菌菌株经m LST增菌液增菌 (16-18h) 后进行10倍递增稀释, 按常规DNA提取方法提取模板DNA, 用分光光度计检测DNA的浓度, 然后取500μL菌液进行荧光PCR检测。
1.2.6 特异性检测
用荧光PCR检测对10株阪崎肠杆菌和15株阪崎肠杆菌的近源菌株TDH基因进行检测, 观察有无交叉反应。1.2.7婴儿食品检测用荧光PCR检测100份婴儿食品 (包括奶粉和米粉) 阪崎肠杆菌TDH基因。食品处理:称取25g食物样品至225m L m LST肉汤增菌液, 36℃4h增菌后取菌液500μL按1.2.2方法提取模板。
2 结果
2.1 特异性分析
25株细菌用荧光PCR检测, 只有10株阪崎肠杆菌产生特异荧光信号, 其他15株细菌均无荧光信号。
2.2 灵敏度检测
DNA检测灵敏度为210.8 fg/μL, 菌液的灵敏度为50~80 cfu/ml。 (表1)
2.3 荧光曲线
将阪崎肠杆菌菌株用m LST肉汤36℃24h增菌后10培递增稀释, 所测的不同浓度的荧光强度曲线线性关系很好 (图1) , 阪崎肠杆菌的稀释度增加所对应的CT值变大 (表2) 。
2.4 婴儿食品检测结果
采集100份不同品牌的国内市售米粉、奶粉, 采用荧光PCR方法与国标方法进行平行对比实验, 荧光PCR方法与国标法检测结果完全一致, 阪崎肠杆菌检出阳性样品数均为9份, 两种方法符合率为100%。从样品处理到报告结果只需8h。
3 讨论
从阪崎肠杆菌不同浓度的荧光强度曲线 (图1) 可以看出, 阪崎肠杆菌扩增效果很好, 浓度降低, CT值随着升高, 荧光强度和循环次数所对应的曲线线性关系很好, 说明用荧光PCR检测阪崎肠杆菌准确可靠。
本法具有以下特点, 灵敏度高, DNA含量为210.8fg/μL即可检出;特异性强, 与其他15种细菌无交叉反应;操作简单, 减少了普通PCR的凝胶电泳和凝胶成像;由于是在密闭的仪器内扩增, 减少了污染环节;检测时间短, 从标本处理到报告结果只需8小时。
检验婴儿米粉婴儿奶粉100份, 检出8株阪崎肠杆菌, 检出率为8%。两种方法符合率为100%。国产婴幼儿配方食品中存在阪崎肠杆菌污染, 各检测机构或奶粉生产厂家要加强对奶粉中阪崎肠杆菌的监测, 以消除潜在食用安全风险。
关键词：婴儿食品,阪崎肠杆菌,荧光PCR
参考文献
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