犊牛大肠杆菌药敏试验（共9篇）
犊牛大肠杆菌药敏试验 篇1
对农七师123团牛场犊牛所发生的一种以急性腹泻、脱水及虚脱为主要特征的传染病进行了病原的(病料:心血、肝、脾淋巴)分离、培养和鉴定,观察了对兔血的溶血情况,并对两株分离株进行小白鼠感染试验,确定引起此次发病的病原菌为大肠杆菌。通过对两株分离株做药敏试验,表明该分离菌对硫酸链霉素、庆大霉素、恩诺沙星敏感,对土霉素中敏,对其他药物有抗药性。确定引起该牛场犊牛腹泻的病原,为临床预防和治疗提供了依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病原来源
农七师123团牛场病死犊牛的心血、肝、脾、淋巴结。
1.1.2 培养基
LB培养基、麦康凯培养基、SS培养基、三糖铁琼脂培养基、鲜血平板、生化鉴定培养基。
1.1.3 药敏纸片
庆大霉素、卡那霉素、硫酸链霉素、恩诺沙星、土霉素等。
1.1.4 生化试剂
1.1.4. 1 革兰氏染色试剂
碘化钾、草酸铵、碱性复红、95%乙醇、碘片、结晶分析纯化学试剂,自配。
1.1.4. 2 生化鉴定试剂
葡萄糖、乳糖、麦芽、甘露醇、蔗糖、靛基质、硫化亚铁、硫酸钠、α-萘酚、氢氧化钾、甲基红、无水乙醇、硫化氢。
1.1.5 实验动物
5只18～20g健康小白鼠。
1.2 方法
1.2.1 流行病学调查
了解饲养管理,消毒,天气,发病过程,发病率,死亡率,发病症状以及大体解剖学的病变,以便于进一步了解其发病特征。
1.2.2 病料的采集及镜检
无菌操作,采集病死牛的心血、肝、脾、淋巴结,并进行涂片、染色、镜检。
1.2.3 病原菌的分离、培养
分别接种于LB肉汤中37℃培养24h,并进行革兰氏染色,镜检、观察。
1.2.4 病原菌的纯化
细菌分离培养将肺脏、肝脏、脾脏和淋巴结分别接种新鲜兔血营养琼脂平板,每种脏器接种4份平板,2份进行普通需氧培养,2份进行普通厌氧培养,置于37℃恒温箱内24h后观察结果,对培养出的细菌进行革兰氏染色及镜检,将培养出的细菌纯培养,将纯培养物接种LB、麦康凯、三糖铁斜面(穿刺),培养基37℃需氧培养,24h后观察结果。
1.2.5 生化鉴定
1.2.5. 1 糖类分解试验
取分离菌的24h纯培养物分别接种于葡萄糖、乳糖、麦芽甘露醇培养基内,37℃培养24h,观察结果。
1.2.5.2 MR/VP试验
取分离菌的24h纯培养物分别接种在葡萄糖蛋白胨水溶液中,培养37℃24～48h,加入指示剂。
1.2.5. 3 硝酸盐还原试验
取分离菌的纯培养物接种到硝酸盐培养基中,37℃培养24h,在加试剂甲和乙,30s内变红即为阳性,若无颜色出现,加少量锌粒,随后出现红色则是真正的隐形试验。
1.2.6 药敏试验
用药敏纸片法(主要为常用的青霉素类和四环素类)来检测对抗生素药物的敏感性。
1.2.7 动物试验
动物致病性试验,将分离到的大肠杆菌接种到营养肉汤,37℃培养10h,取其培养液接种实验动物,设置对照组。
1.2.8溶血试验
采用平板办法测定分离溶血特性,将大肠杆菌菌种接种到5%兔鲜血LB平板,37℃培养48h后观察溶血情况,菌落周围出现溶血圈者判为溶血阳性。
2 小结与讨论
(1)通过流行病学调查、临床症状、病理变化、病原分离鉴定和动物试验,确定该牛场犊牛死亡原因为大肠杆菌感染所致。
(2)药敏试验结果表明,菌株对各种药物的敏感性存在明显的差异,所有菌株均对硫酸链霉素和庆大霉素敏感,对新霉素和四环素耐药。由于临床上长期盲目用药所造成,建议各地区治疗牛大肠杆菌病时要定期轮换用药,最好先进行药敏试验,选出敏感药物进行有效治疗,避免因盲目用药造成经济损失。
(3)防治本病要采用综合性的防治措施,避免各种应激因素;平时应加强对犊牛的饲养管理,逐步改善牛舍的通风条件;认真落实牛场兽医卫生保健措施;另外在要勤洗犊牛喂奶用具,因为本病的传染与环境密切相关。
(4)通过本试验,为微生物实验室提供了两只犊牛腹泻大肠杆菌株两株,以便进一步研制预防该病的疫苗。
犊牛大肠杆菌药敏试验 篇2
摘要：水禽的各年龄段都易感大肠杆菌病，给水禽的养殖造成很大的损失。检测病死水禽分离到的大肠杆菌对自制的药敏试纸的敏感性，找出合理预防和控制大肠杆菌病的敏感药物。
关键词：水禽源大肠杆菌；药敏；诊治
水禽大肠杆菌病是水禽感染致病性大肠杆菌引起的一种急性或慢性的细菌性传染病。水禽感染大肠杆菌后，由于其年龄、抵抗力以及大肠杆菌的致病力、感染途径等不同因素，会产生许多症状和病变不同的病。如急性败血症、气囊炎、肝周炎、心包炎、卵黄性腹膜炎、输卵管炎、眼炎、关节炎、肉芽肿。大肠杆菌病的病原由某些血清型的大肠杆菌所致，雏鹅有O1、O2、O6等血清型，雏鸭有O78、O8、O7、O73、O19等血清型，产蛋鹅有O2K39、O2K1、O39等血清型。
笔者采取3株来自江苏、安徽等地的雏鹅、雏鸭的心血及纤维素性渗出物、母鹅的变性卵泡等作为被检病料分离到大肠杆菌，通过对自制的药敏试纸敏感性检测，找到科学防治水禽大肠杆菌的药物。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 病料 ①江苏姜堰10日龄鹅，肝肿大，有纤维素性渗出，腹腔中有未被吸收的卵黄；②安徽合田种鹅，患病死亡的母鹅卵黄性腹膜炎，凝固蛋白，输卵管里黄色纤维素性渗出物；③江苏扬州15日龄鸭，肝肿大，有包膜，易剥离，有不凝心血，关节红肿。
1.1.2 药敏试验培养基 营养琼脂平板、血琼脂平板、麦康凯平板培养基。
1.1.3 自制药敏试纸 分别为1-林可霉素（15mg/片）、2-庆大霉素（2mg/片）、3-卡那霉素（12.5mg/片）、4-环丙沙星（2mg/片）、5-复方磺胺嘧啶（10mg/片）、6-强力霉素（5mg/片）、7-复方甲氧嘧啶（10mg/片）、8-链霉素（2000单位/片）、9-氟哌酸（1mg/片）、10-氟苯尼考（15mg/片）。
1.2 方法
1.2.1 细菌分离 1#：姜堰雏鹅：无菌取肝、纤维素性渗出物接种血琼脂平板和营养琼脂平板、麦康凯培养基，37℃有氧培养。
2#：安徽合田种鹅：无菌取变性卵泡接种血琼脂平板和普通琼脂平板、麦康凯平板培养基。37℃有氧培养。
3#：扬州雏鸭：无菌取肝、脑、关节，接种血琼脂平板，37℃，5%CO2厌氧培养和有氧培养24h后，厌氧培养和有氧培养都形成灰白色单个菌落，挑取单个菌落重新划线麦康凯培养基，24h形成红色菌落。
1.2.2 染色镜检 分离到的细菌挑取单个菌落进行革兰氏染色镜检。
1.2.3 细菌生化鉴定 根据细菌的培养特征、染色形态特征，挑取单个菌落接种大肠杆菌微量生化鉴定管，置37℃恒温箱培养24h，观察结果。能够分解葡萄糖和甘露醇，产酸；分解阿拉伯糖、木胶糖、鼠李糖、麦芽糖、乳糖；不分解侧金盏花醇和肌醇；能产生靛基质，不产生尿素酶和硫化氢。符合上述生化反应的，确定为大肠杆菌。
1.2.4 血清学鉴定 将被检菌株的培养物分成2份，一份经121℃高压蒸汽加温2h，破坏K抗原，一份加0.5%福尔马林摇匀后37℃放置24h。分别用各种单因子抗O血清和抗OK血清对处理后的两份菌液作凝集试验。如该菌株含有K抗原，则各种抗O血清不能使经福尔马林处理的菌液凝集，但可被各种抗OK血清中的一种凝集。经高压蒸汽加热的菌液可被一种单因子抗O血清所凝集。
1.2.5 药敏试验 将分离到的大肠杆菌进行药敏试验。挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到营养琼脂培养基上。将含有定量抗菌药物的试纸片贴在已接种了细菌的琼脂表面上，37℃，培养24h。抑菌圈的大小反映出细菌对药物的敏感程度。
2 结果
2.1 细菌分离 三组病料均分离到灰白色、湿润、光滑、不溶血、边缘整齐、麦康凯培养基呈红色菌落、镜检均为G-杆菌。
2.2 这3株细菌经鉴定均为大肠杆菌。
2.3 分离到的细菌血清型为O6、O39、O19。
2.4 药敏试验结果 见表1。
这3株来自不同日龄的鹅和鸭，有着不同的血清型的大肠杆菌，对药物的敏感性大不同，但它们同时对氨基苷类的庆大霉素、卡那霉素高敏感。1#姜堰雏鹅株还对链霉素高敏感，2#合田种鹅株还对氟苯尼考高敏感，3#扬州雏鸭还对环丙沙星和5-复方磺胺嘧啶高敏感。
3 治疗
根据药敏试验结果，给出如下治疗方案：
3.1 姜堰雏鹅，建议养殖户挑出有症状病鹅，隔离饲养，肌肉注射庆大霉素2mg/kg·w，每日2次，连用3d。
3.2 合田种鹅，挑出病重的母鹅淘汰。症状较轻的母鹅，隔离饲养，肌肉注射庆大霉素3mg/kg·w。每日2次，连用5d。检查公鹅的阴茎，有肿大、在不同部位有脓性或干酪样结节的，淘汰。
姜堰雏鹅和合田种鹅群中其它无症状的鹅，饲料中添加林可霉素，每只禽3.0mg/kg或饮水17mg/kg进行预防。
3.3 扬州雏鸭，症状明显的治疗同姜堰雏鹅。其它鸭饲料或饮水中添加环丙沙星，1g药粉加入5kg饲料，或1g药粉加入10kg水进行预防。
这三群鹅和鸭，经过治疗，3d后病情得到控制。禽群中不再出现死亡病例。7d后，鹅群及鸭群恢复原有的采食量，精神状况良好。
4 体会
大肠杆菌是动物肠道中的常在菌，10%～15%的大肠杆菌属于有致病力的血清型。水禽场卫生条件差、地面潮湿、舍内通风不良、氨气味大、饲养密度过高等易诱发本病。初生雏禽的感染是由于种蛋被传染，因此，应注意育雏期保温及饲养密度，改善通风，降低灰尘，勤于除粪，减少氨气的含量；禽舍、孵化器及用具经常清洁和消毒。
禽群中发现发病或死亡的禽只，应及时细菌分离，进行药敏试验，找出该菌较敏感的几种药，添加到饲料和饮水中，会取得较理想的效果。但是，有时也会出现药敏试验很敏感的药，而实际应用效果很差，这时就要更换敏感药，找到最有效的治疗药物。
由于养殖过程中不科学、盲目滥用抗菌药，致使疾病发生后，对治疗药物的选择就显得困难，特别是长时间饲养的场地，只能选择不常用的药物治疗，若药物不敏感有效，不仅造成了药物的浪费，而且还延误了病情，给养殖户造成很大的经济损失。因此，在养殖水禽的过程中，科学合理用敏感药物预防，对控制大肠杆菌病非常重要。
仔猪大肠杆菌分离鉴定及药敏试验 篇3
该病在我国许多地区的养猪场都有发生, 是危害仔猪的重要传染病之一。伴随着规模化、集约化养猪业的发展, 仔猪大肠杆菌性腹泻的发病率越来越高, 危害也越来越严重。据资料统计, 腹泻造成仔猪死亡率在15%~25%, 0~2周龄仔猪的死亡率为26%, 2~4周龄仔猪的死亡率为16%, 这其中70%被认为是由大肠杆菌导致的。朱瑞民 (1988) 统计表明, 我国由大肠杆菌引起的腹泻的发病率和死亡率分别占整个发病率和死亡率的56.2%和24.7%, 给生产造成了巨大经济损失。目前, 各养猪场防治仔猪大肠杆菌感染性腹泻的临床常用方法仍是抗生素, 抗生素广泛使用对此病的预防与控制取得了一定的效果, 但由于养殖户的不合理用药, 使动物长期服用大量抗菌药物, 易破坏肠道正常菌群, 增加反复感染和继发感染的几率, 加速了猪大肠杆菌耐药性的产生和扩散, 从而给该病的防治带了前所未有的困难, 易造成细菌耐药性的产生。因此, 须对大肠杆菌病原菌进行分离鉴定和耐药性分析, 进而指导临床用药。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料:
从太谷县某养猪场采集患白痢的猪仔肛门拭子病料8份。
1.1.2 主要试剂:
培养基及细菌鉴定用的生化试剂等购自河南美凯生物科技有限公司。
1.1.3 供试药片:
购自杭州微生物试剂责任有限公司。
1.1.4 试验动物:
清洁级昆明系小白鼠雌雄各半, 共20只。
1.1.5 器材:
蒸汽高压灭菌锅、培养皿、试管、灭菌棉签、酒精灯、接种棒、滤纸、离心机、镊子、恒温箱、烘干箱、试管架、电炉、烧瓶、无菌工作台、冰箱、电子秤、标记笔、吸耳球、脱色缸, 吸水纸, 擦镜纸、光学显微镜。等
1.1.6 药敏纸片:
庆大霉素、头孢噻肟钠、氟苯尼考、环丙沙星、左氟沙星、强力霉素、丁胺卡那、头孢唑啉钠, 头孢他啶、呋哺妥因、红霉素、复方磺胺、先锋霉素V、痢特灵14种。
1.2 方法
1.2.1 病原样品处理:
直肠棉拭子, 接种麦康凯琼脂平板, 37℃18~24 h后将可疑红色菌落接种于伊红美兰琼脂平板, 37℃18~24 h后再挑取紫黑色带或不带金属光泽的可疑菌落进行革兰氏染色、镜检。将培养特性及形态、染色反应、排列均符合大肠杆菌的菌株在普通营养琼脂斜面上纯增, 进行生化鉴定, 生化符合的确定为大肠杆菌。
1.2.2致病性试验:
用生理盐水洗下菌落制成菌悬液。将小自鼠随机分为两组, 其中一组每只皮下注射0.2 m L菌悬液, 另一组注射相同剂量的无菌生理盐水。将24~48 h死亡的小鼠立即解剖, 死亡的小白鼠经剖检后用伊红美兰琼脂平板进行接种菌回收试验。其培养特性、形态、染色反应符合大肠杆菌的菌株确定为致病性大肠杆菌。
1.2.3药敏试验:
将致病性大肠杆菌采用世界卫生组织 (WHO) 推荐的Kirby.Bauer氏法 (即美国临床实验室标准委员会NCCLS的药敏试验方法) 进行。
将稀释好的菌液用灭菌棉签铺满整个平板, 待平板干后, 用无菌镊子取各种药片贴于平板上, 每个平板7张药片, 将贴好药片的平板置于37℃的恒温箱中培养24 h后观察实验结果并测出个药片的抑菌圈直径, 并按照标准判定敏感, 中度敏感和耐药情况。
2 结果与分析
2.1 病原分离
分离菌在麦凯琼脂上的菌落特征为中等大小、红色、圆形、湿润、隆起、边缘整齐;在伊红美蓝琼脂平板上的菌落特征为中等、大小、圆形、隆起、边缘整齐、紫黑色、带金属光泽。分离菌株革兰氏染色均为阴性, 菌体中等偏小, 平直, 两端钝圆, 散在。初步判断为大肠杆菌。
2.2 大肠杆菌的分离鉴定
分离出的菌株均能发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇, 均能产酸产气, 大多数菌株不利用蔗糖, 少数缓慢发酵, V-P实验、枸橼酸盐试验均为阴性, 吲哚试验、MR试验均为阳性, 以上试验结果可证明分离出的菌株为大肠杆菌。
2.3 致病性试验
试验组的小白鼠在接种后出现精神萎靡, 进而出现腹泻等临床症状, 接种10 h后开始死亡, 24 h内全部死亡, 解剖死小白鼠, 均能见其内脏充满瘀血, 肝脏肿大, 并且在心血和肝脏中能分离出大肠杆菌, 而对照组的小白鼠无明显变化, 由此可见, 从仔猪肛门处分离出的大肠杆菌具有较强的致病性。
2.4 药敏试验结果
分离的菌株对14种抗菌药物的药敏试验见表1。在14种抗菌药物中, 抑菌作用最强的是丁胺卡那、先锋霉素V, 其次为氟苯尼考、头孢他啶、呋喃妥因、洛美沙星等, 强力霉素、庆大霉素、复方磺胺、红霉素、环丙沙星耐药。
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3 讨论与分析
本次抽样的养猪场8份样品均培养出来大肠杆菌, 经分离、鉴定、动物试验, 确定为由致病性大肠杆菌引起的, 表明致病性大肠杆菌仍是引起仔猪腹泻的主要病原之一, 这与猪场的环境卫生、免疫状态、饲养密度关系密切。
随着抗生素在医学上的广泛应用, 国内外对仔猪腹泻治疗普遍存在抗生素滥用的现象, 造成了大肠杆菌对部分抗生素产生了耐药性, 导致仔猪腹泻临床治愈率偏低[4,5,6,7]。从本结果可以看出, 分离的猪源大肠杆菌对丁胺卡那、先锋霉素V表现出很高的敏感性, 对强力霉素、庆大霉素、复方磺胺、红霉素、环丙沙星耐药。因此, 在实际应用中, 必须经常进行细菌分离和药敏试验, 筛选有效药物进行防治, 以免药物浪费。药敏试验方法简单易行, 特别适宜于大、中型集约化猪场应推广应用。治疗时还应注意配合补液、收敛等对症治疗法[8,9]。
仔猪断奶1~2周内饲粮粗蛋白质水平宜控制在17%~19%, 并保证有充足的常量和微量元素及多种维生素和益生素。在大型集约化的养猪场饲养密度较大, 猪缺少运动, 造成猪抵抗力下降, 如不注意环境卫生, 猪很容易被细菌感染, 因此应该注意定期清扫猪圈, 定期消毒, 为猪的生长创造良好的环境, 从而获得更大的利润。
摘要：采用病原分离的方法, 从太谷地区几家养猪场采集病、死猪肝脏、脾脏、淋巴结, 进行了细菌的分离培养、染色镜检、生化试验和致病性试验, 结果表明, 分离获得的8株疑似大肠杆菌具有典型的生长特性、形态及染色特性;生化鉴定结果显示, 其中有6株为致病性大肠杆菌;通过纸片法, 对分离的致病性大肠杆菌进行药敏试验, 试验结果显示, 临床治疗大肠杆菌病的首选药物是丁胺卡那和先锋霉素V类, 为该地区的大肠杆菌病的预防提供依据。
关键词：仔猪腹泻,大肠杆菌,分离鉴定,药敏试验
参考文献
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犊牛大肠杆菌药敏试验 篇4
关键词：鲫鱼；肠道细菌；枯草芽孢杆菌；分离鉴定；药敏试验
中图分类号： S917.1 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）07-0244-02
收稿日期：2013-10-02
基金项目：国家自然科学基金（编号：31272692、30800847），江苏省高校重点专业类建设项目（编号：2012-2015）。
作者简介：李旭（1992—），男，江苏徐州人，主要从事水产动物微生物学研究。
通信作者：吕爱军，副教授，主要从事微生物及免疫学研究，E-mail：lajand@126.com。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种短杆状、无荚膜能运动的革兰氏阳性细菌，能产中生芽孢，广泛分布于土壤、湖泊、海洋、动植物体表及其栖息地[1]。2003年，我国农业部公布了能够用于生产微生态制剂菌种包括：枯草芽孢杆菌（B. subtilis）、地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）、蜡样芽孢杆菌（B. cereus）等[2]。最近，白延琴等从秸秆垛底层土壤中分离得到1株枯草芽孢杆菌[1]。周金敏等从黄颡鱼肠道中筛选出1株益生性芽孢杆菌[3]，结果表明，枯草芽孢杆菌的抗逆性及在消化道中稳定性强于其他益生菌。马如龙等研究斜带石斑鱼幼鱼肠道的优势菌为芽孢杆菌，对石斑鱼生长和健康具有促进作用[4]。本研究以鲫鱼肠道细菌为主要研究对象，从中分离纯化获得1株芽孢杆菌，并进行了染色特性、菌体形态、生理生化特性及药敏反应等研究，以期为鲫鱼肠道细菌的鉴定、微生态制剂开发等提供依据。
1材料与方法
1.1材料
鲫鱼购自江苏省徐州市某市场，体重约100 g。普通琼脂培养基、细菌生化微量鉴定管及药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司。
1.2方法
1.2.1肠道细菌的分离与鉴定参考吕爱军等方法[5]进行，将新鲜鲫鱼肠道中的菌液，均匀涂布在普通琼脂平板，30 ℃ 恒温培养24 h后，挑取典型单菌落，采用平板劃线法，纯化传代2～3次，转种于4 ℃冰箱保藏、备用。细菌生理生化特性试验等按常规方法进行，分别挑取单菌落涂片进行革兰氏染色及孔雀绿芽孢染色，镜检观察分离菌株的染色及形态特征。
1.2.2药敏试验采用纸片扩散法，用无菌操作将纸片置于接种分离菌株的普通琼脂平板，置于30 ℃温箱中培养24 h后，量取抑菌圈的直径，根据药敏试验判断标准书，确定该菌对不同药物的敏感程度。
2结果与分析
2.1菌落及形态特征
从鲫鱼肠道中分离纯化获得1株细菌，暂时编号为CB-1，接种于普通琼脂平板30 ℃恒温培养24 h后，形成表面干燥、褶皱、扁平、不透明、乳白色、边缘不整齐、直径2～5 mm的中大菌落；CB-1菌株为革兰氏阳性大杆菌，产芽孢，芽孢呈椭圆、中生状（图1）。
2.2生理生化特性
细菌生理生化试验结果，分离菌CB-1菌株葡萄糖酸盐利用试验、硫化氢产生试验、吲哚产生试验及MR试验为阴性，可利用葡萄糖产酸不产气，不能还原硝酸盐、水解淀粉、分解尿素，不能产生脱羧酶利用赖氨酸、鸟氨酸脱羧生成胺和二氧化碳；β-半乳糖苷、明胶液化试验为阳性。对CB-1菌株进行形态学观察、生理生化特性分析，发现与《常见细菌系统鉴定手册》[6]描述基本一致，初步鉴定为枯草芽孢杆菌。
2.3药敏试验
采用26种抗生素对CB-1菌株进行药敏试验，测量抑菌圈直径，计算平均值。结果表明，CB-1菌株对头孢菌素类（头孢噻吩、头孢哌酮、先锋霉素Ⅳ）、氨基糖甙类（丁胺卡那霉素、庆大霉素、卡那霉素、氯霉素、乙基西梭霉素）、大环内酯类（阿奇霉素、红霉素）等抗生素敏感；对洁霉素、甲硝唑、制霉菌素等不敏感（表1）。
3讨论
国内对鲫鱼肠道中枯草芽孢杆菌的分离鉴定，尚未见相关文献报道。近年来，枯草芽孢杆菌在水产养殖上作为饲料添加剂已被广泛应用。Munro等发现鱼类肠道菌群主要来源于所摄取的活饲料而不是养殖水体[7]。邱燕等通过添加适量枯草芽孢杆菌，发现可改善草鱼肠道黏膜形态，促进草鱼对营养物质的吸收利用[8]。江永明等在饲料中添加枯草芽孢杆菌，能显著促进奥尼罗非鱼的生长[9]。赵士豪等利用大肠杆菌为抑菌对象分离到4株芽孢杆菌，研究高效复合益生菌来替代抗生素，减少抗生素对鱼类养殖的不利影响[10]。唐家毅等从水产养殖环境中筛选出1株芽孢杆菌能够有效降解水体中的氨氮、亚硝酸盐氮[11]。丁祥力等分离1株枯草芽孢杆菌，可有效改善淡水养殖水体的水质[12]。贺刚等从草鱼肠道分离出1株枯草芽胞杆菌并进行药敏试验，结果表明，该菌株对诺氟沙星、头孢哌酮、庆大霉素等抗生素高度敏感[13]。本研究从鲫鱼肠道中分离纯化出1株枯草芽孢杆菌，药敏试验结果表明，CB-1菌株对诺氟沙星、头孢哌酮、庆大霉素等敏感，本研究结果与已有报道结果基本一致[13]。关于鲫鱼肠道中枯草芽孢杆菌的16S rDNA基因分子鉴定及微生态制剂研制，还有待于进一步研究。
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[10]赵士豪，杨会琴，赵春海. 益生菌芽孢杆菌的分离与初步鉴定[J]. 中国农学通报，2012，28（18）：271-275.
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犊牛大肠杆菌药敏试验 篇5
1 材料与方法
1.1 样本
在鸡病门诊送检的病死鸡中, 选用疑似致病性大肠杆菌感染的病死鸡, 病理剖检可见呈现纤维蛋白性肝周炎、心包炎、气囊炎, 以其作为试验样本, 剖检过程中严格按照无菌操作进行。
1.2 质控菌株
大肠埃希菌 (菌株编号为ATCC25922) , 购自中国兽药监察所菌种保藏中心。
1.3 MH培养基与标准药敏纸片
MH培养基, 购自郑州博赛生物科技有限公司;4种标准药敏纸片 (CTX、CIP、AMX/CA、AN) , 分别购自英国OXOID公司、杭州天和微生物试剂有限公司、北京天坛药物生物技术开发公司。
1.4 药敏试验
1.4.1 常规药敏试验
从被检病鸡中获取纯菌落, 用0.5个麦氏比浊标准浓度的菌液涂布MH培养基, 取CTX、CIP、AMX/CA、AN药敏纸片贴在培养基表面, 在35.0, 38.5, 42.0℃进行同步孵育, 在4~6 h之间每30 min判读1次, 6~8 h每隔1 h判读1次, 以后在12, 16, 24小时时各判读1次。
1.4.2 直接药敏试验
无菌打开心包膜、肝包膜, 灭菌棉棒紧贴心壁、肝脏表面擦拭3~4周, 然后用棉棒均匀涂布MH培养基表面。取CTX、CIP、AMX/CA、AN药敏纸片贴在培养基表面, 在35.0, 38.5, 42.0℃进行同步孵育, 在4~6 h之间每30 min判读1次, 6~8 h每隔1 h判读1次, 以后在12, 16, 24小时时各判读1次。
1.5 质量控制试验
在进行常规药敏试验、直接药敏试验的同时进行质量控制试验。试验分5组:第1组, 35.0℃培养温度条件下进口纸片与国产纸片比对试验;第2组在35.0, 38.5, 42.0℃条件下进口纸片比对试验;第3组在35.0, 38.5, 42.0℃条件下国产纸片比对试验;第4组在35.0, 38.5, 42.0℃条件下进口纸片与国产纸片比对试验;第5组在进口纸片与国产纸片质量控制试验结果一致时, 对国产纸片进行连续12 d的质量控制试验。
2 结果与分析
2.1 药敏试验
2.1.1 直接药敏试验不同培养时间的敏感率结果见表1。
由表1可知:改进后的直接药敏试验在6小时时, 敏感率与对照接近;在8小时时, 敏感率与对照相同。因此, 在保证准确率的情况下, 为缩短药敏试验时间, 将药敏试验判读时间定为6 h (优化时间) 。
2.1.2 直接药敏试验优化时间下不同培养温度的敏感率
结果见表2。
由表2可知, 3种温度下敏感率无差异, 与对照相同。因此, 在保证准确率的情况下, 为节约能源, 将药敏试验的培养温度定为38.5℃。
2.1.3 直接药敏试验与常规药敏试验对比
结果见表3。
由表3可知, 改进后的直接药敏试验与常规药敏试验的敏感率相同。直接药敏试验是直接从病鸡挑取菌种, 节省了菌种纯化的时间;培养温度提升为38.5℃;在保证准确率的同时, 将药敏试验的结果判读时间缩短至6 h。
2.2 质量控制试验 (结果见表4)
由表4可知:质量控制试验结果均在标准范围之内, 说明药敏纸片浓度、MH培养基、培养温度及培养时间均符合试验标准, 试验具有精准性和可靠性。在设定的5组试验中, 国产药敏纸片和进口药敏纸片试验均在质量控制范围内, 最终试验结果无差异。
3 讨论
大肠杆菌属于嗜温、快速生长菌, 生长温度的范围为10~45℃, 最适生长温度为20~40℃。人医临床一般从活体采集样本 (血液、脑脊液、胸腹腔积液等) , 样本中病原菌数量较少, 需要分离鉴定后方可进行抗菌药物敏感性试验, 耗时62~96 h[4]。兽医临床针对的样本是因病致死的鸡尸体, 取材较人医临床方便。大量大肠杆菌菌体附着在鸡体内脏器官及其表面形成生物被膜, 生物被膜富集菌体数量往往高于0.5麦氏单位 (在实际培养中, 用0.5麦氏比浊度涂布MH培养基, 培养一段时间后形成单个菌落, 再融合成菌苔;而从肝周炎、心包炎取样直接涂布MH培养基培养一段时间后直接形成菌苔) [2]。因此, 从大肠杆菌致死鸡心脏、肝脏等实质脏器取样, 进行纸片法直接药敏试验是可行的。
邱胜丰[5]研究发现, 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌均在药敏试验阶段培养10 h后出现结果, 比平时培养时间提早8~14 h, 与18~24 h比较符合率为97.1%~99.2%。
4 结论
国际上没有禽用药敏标准, 通常参考“纸片法抗菌药敏试验标准” (WS/T 125—1999) , 从分离、鉴定到药敏报告产生需62~96 h (细菌分离培养需要18~24 h, 纯化一代需要12~24 h, 培养需要16~24 h, 药敏试验需要16~24 h) 。对标准药敏试验的试验条件、试验步骤进行改进, 在保证药敏试验结果科学合理的前提下, 缩短药敏试验所需要的时间。第一, 将标准药敏试验的“细菌分离-鉴定-药敏试验”3步法, 改进为从病死鸡实质脏器采集样品直接涂布进行药敏试验的1步法;第二, 将标准药敏试验培养温度由35.0℃改进为38.5℃;第三, 将标准药敏试验结果判读时间由16~24 h改进为6 h。
鸡源大肠杆菌直接药敏试验可最大限度减少抗生素的使用, 不仅能减少动物性食品中抗生素残留对人体健康的影响, 而且还能减少资源的浪费, 同时还能最大限度降低抗生素残留对环境的污染, 有益于食品安全和生态环境的建设[6]。
参考文献
[1]李萍, 黄翠峰.鸡源大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验研究[J].山东畜牧兽医, 2010, 164 (9) :7-9.
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[5]邱胜丰.缩短细菌药敏孵育时间对药敏试验结果的影响[J].职业与健康, 2007, 23 (11) :970-971.
犊牛大肠杆菌药敏试验 篇6
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1病料来源
病料为荣昌县安抚镇养鹅专业户送检的表现为拉白色稀粪、零星死亡,剖解有心包炎等病变的种雏鹅肝脏、心脏。
1.1.2 培养基
营养肉汤参考相关文献配置[2],伊红美兰琼脂、麦康凯琼脂及各种微量发酵管,分别购自北京奥博星生物技术有限责任公司和杭州天和微生物试剂有限公司。
1.1.3 试验动物
:(1)昆明系健康小白鼠10只,体重为20~23 g/只,由西南大学荣昌校区动物科提供。(2)9日龄荣昌白鹅10只,购自荣昌县某养鹅专业户,饲养3 d后用于作动物致病性试验。
1.1.4 药敏纸片
左氟沙星、庆大霉素、复方新诺明、克拉霉素、红霉素、环丙沙星、先锋噻肟、痢特灵、氟嗪酸、菌必治、利福平、氨曲南、氟哌酸和复达欣,购自杭州天和微生药试剂有限公司,批号:20060118;万古霉素、头孢唑啉、头孢他啶、妥布霉素、头孢呋新、链霉素、呋喃妥因和丁胺卡那霉素,购自杭州天和微生药试剂有限公司,批号:20051122。
1.2 方法
1.2.1 细菌的分离培养和镜检
:取病死雏鹅的肝、心血接种于营养肉汤,37℃培养24 h。然后挑取细菌在营养琼脂、麦康凯琼脂和伊红美兰琼脂平板上划线接种,37℃培养24 h,观察细菌的培养特性,并进行涂片,革兰氏染色镜检,观察其形态。再钩取单个典型菌落接种鲜血琼脂斜面37℃培养24 h,4℃保存。
1.2.2 致病性试验[1]
:(1)小白鼠接种试验:取分离菌接种到营养肉汤中,37℃震荡培养18 h。将小白鼠分为2组,每组5只,第一组腿部肌肉注射肉汤纯培养物0.2 m L/只(约含细菌0.7亿/只),第二组注射灭菌肉汤0.2 m L/只,观察并记录其发病及死亡情况,对发病的小白鼠进行剖解,观察病变,取其病料抹片染色镜检,并分离培养。
(2)雏鹅接种试验:分组和细菌准备同小白鼠,每只雏鹅皮下接种细菌0.3 m L,对照组每只接种灭菌肉汤0.3 m L,观察细菌致病性方法同上。
1.2.3 细菌的生化试验
:取分离菌肉汤培养物进行葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖的发酵试验,同时进行吲哚、MR、VP、柠檬酸盐利用试验和硫化氢试验。将细菌分别接种到相应的微量发酵管中,置37℃温箱培养。糖发酵试验在24 h观察结果,其他生化试验在48~72 h内观察结果[2]。
1.2.4 细菌的药敏试验
:无菌条件下取细菌纯培养物密集划线接种于整个营养琼脂平板,将药敏片均匀贴放到平板上,每个平板6片。将平板倒置于37℃温箱培养24 h,然后观察药物的抑菌情况,并测定各种药物抑菌圈的大小[2]。
2 试验结果
2.1 培养特性及镜检结果
细菌在普通肉汤中均生长良好,均匀混浊,管底有灰白色沉淀,轻摇呈云雾状;在普通琼脂平板为灰白色、半透明、表面隆起、光滑圆润、边缘整齐的菌落,直径为1~3 mm;在麦康凯琼脂培养基上生长出周围粉红色,中心深红色的菌落;在伊红美兰琼脂培养基上形成黑色带有金属光泽的小菌落。经革兰氏染色,该菌为阴性小杆菌,两端钝圆,多单个散在排列。
注:糖发酵试验中,“⊕”表示产酸产气,“+”表示产酸不产气;其余试验中“+”表示阳性,“—”表示阴性
mm
注:判定标准:敏感度按《抗菌药药物药敏试验判断标准》(由中国药品生物制品鉴定所,卫生部抗菌药物细菌耐药性检测中心制定)进行判断,抑菌圈直径大于15 mm者为高敏药物;直径为10~15 mm者为中敏药物;直径为10 mm以下者为耐药
2.2 生化试验结果
该细菌能够发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖和甘露醇,产酸产气;能发酵蔗糖,不产气;吲哚和MR试验阳性;VP试验、柠檬酸盐利用试验、硫化氢试验和尿素分解试验为阴性(见表1)。结合培养特性及镜检结果,鉴定为大肠杆菌。
2.3 致病性试验结果
小白鼠和雏鹅在细菌接种后24 h内各死亡3只,而剩下的在48 h后也死亡。剖检发现小白鼠肝脏肿胀出血,心外膜出血;雏鹅有肝周炎,心包积液,心包膜有轻微的纤维素性渗出等病变。从死亡雏鹅和小白鼠的肝脏和心血中,分离到了所接种的细菌。而对照组无异常表现。
2.4 药物敏感试验结果
该分离菌株对菌必治、先锋噻肟、氨曲南、丁胺卡那霉素和复达欣5种药物高度敏感,对呋喃妥因和庆大霉素中度敏感,而对头孢呋新、左氟沙星、克拉霉素等药物表现为耐药性(见表2)。
3 分析讨论
3.1根据分离细菌的培养特性、染色镜检情况及生化试验结果,鉴定所分离细菌为大肠杆菌。经动物试验表明该分离菌株能致死小白鼠和雏鹅,有较强的致病性。
3.2药敏试验表明所分离的细菌对临床上多种常用的抗菌药物已经产生耐药性,结合周廷宣报道,推荐在荣昌地区雏鹅大肠杆菌病的防治首选药物应以丁胺卡那霉素等为主[2]。由于大肠杆菌对抗菌素产生耐药性是随着临床药物的广泛应用主要是不合理使用而产生的,并能通过耐药质粒的转移而使耐药菌株不断蔓延扩大,致使一些鹅场从未使用过的某些药物也失去效用[3],因此及时开展大肠杆菌的药敏检测,选择细菌敏感的药物来进行该病的预防和治疗十分必要。
当畜主按药敏试验结果,使用丁胺卡那霉素后,迅速的控制了病情的发展,但是由于2 d后停药,又导致了该病的复发。因此,使用高敏药物时,应按说明给药,避免超量和滥用,每个疗程应在4 d以上较好,疗程太短,容易复发,并易产生耐药性。同时注意不要长时间使用同一种药物,应多种高敏抗菌药交替使用,以防止长期使用某种抗菌药而产生抗药性,造成不必要的经济损失[4]。
3.3大肠杆菌是鹅肠道内的常在细菌,正常鹅体内的大肠杆菌是潜在的致病性大肠杆菌,大量的研究和实践证明,当鹅的皮肤或粘膜的防御屏障破坏时,就很容易被感染。凡能引起机体抵抗力降低的各种因素(如环境恶劣、通风不良及其他疾病的存在,特别是各种病毒的感染),都可以诱发大肠杆菌病。因此对雏鹅大肠杆菌病应以预防为主,该病的防治原则是加强管理,控制促发因素,搞好预防,才能使疾病得到有效的控制。预防鹅大肠杆菌病首选疫苗预防,可制备自家(或优势菌株)多价油佐剂苗来免疫,如我国王永坤王永坤研制的鹅大肠杆菌多价灭活苗对种鹅保护率可达98.6%,能有效地控制该病的流行。显的免疫抑制,导用REV感染1日龄
参考文献
[1]周廷宣.幼鹅大肠埃希氏菌的分离与鉴定.四川畜牧兽医,2004(1):25～26
[2]姚火春主编.兽医微生物学实验指导.北京:中国农业出版社,2002
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犊牛大肠杆菌药敏试验 篇7
1 药敏试验筛选治疗鸡大肠杆菌病药物的方法及必要性
1.1 药敏试验方法
从病鸡的病变组织中分离致病性大肠杆菌进行增殖培养;选择多种抗生素采用倍量稀释法或药敏纸片法;利用分离的大肠杆菌进行药敏试验选出抗菌性最高的一种或多种药物, 确定最佳治疗药物和方案, 选择合适的用药途径大群投药。
1.2 用药敏试验筛选的药物治疗鸡大肠杆菌病的必要性
大肠杆菌对药物极易产生耐药性, 随着抗生素的大量使用, 对各种药物产生耐药性的大肠杆菌的菌株也逐渐增多;另外不同地区分离出的鸡大肠杆菌药敏谱不一致;再者, 市场上治疗鸡大肠杆菌的药物种类较多, 成分不清, 养殖户在鸡群发生疾病时难免重复用药, 造成经济损失又延误病情, 所以有必要进行药敏试验筛选出敏感药物来治疗鸡大肠杆菌病。
2 药敏试验与临床疗效不一致的原因
鸡大肠杆菌的药敏试验结果有时与临床疗效不一致, 常出现敏感药物无效、而不敏感药物有效的情况, 笔者认为引起这种现象的原因有以下几点:
(1) 鸡大肠杆菌非原发病原, 而是激发感染。鸡大肠杆菌病易激发于其他疾病, 一般药敏试验分离培养只能培养出需氧菌, 而一些特殊细菌以及病毒等无法培养, 若这类细菌、病毒是主要致病因素, 药敏结果与临床效果会出现差异。
(2) 体内、体外环境不一致。大肠杆菌可以利用某些体内物质生成抵抗抗生素的成分, 导致抗生素失效, 从而出现体外敏感而体内耐药的情况。
(3) 药敏试验操作的影响。采集病料的部位、药敏纸片或药物浓度的变化、细菌培养条件不达标等都会造成假阴性。
(4) 药敏试验剂量与实际用药剂量存在差异以及给药的途径不当。
药敏试验结果的准确性受多种因素的影响, 有药敏试验中的原因, 也有分离大肠杆菌的原因。对药敏试验中的原因, 可结合抗生素的特点使用药物, 对于分离菌本身的原因, 即继发性大肠杆菌病, 应结合临床发病特点, 分清主次, 追根溯源, 单一防治大肠杆菌病并不奏效, 应同时消除其他致病因素, 标本兼治, 方能有效预防并治疗大肠杆菌病。
3 耐药原因及对策
药敏试验中所分离出的大肠杆菌对常规药物的多耐性越来越普遍, 给临床治疗和疾病预防造成了极大的困难, 应针对不同原因采取不同的方法。
(1) 大肠杆菌对药物产生耐药性。遇到这种情况可以考虑增加一些传统药物或不常用的药物进行药敏试验 (如四环素等) , 有些临床上已经长期不用的药物有时反而见效。
(2) 大肠杆菌不是单一病原。临床上大肠杆菌常与其他病原菌混合感染, 药敏试验结果显示对所有抗生素都耐受, 但对药物敏感程度总会有所差别, 有必要进一步试验确定药物的最小抑菌浓度, 可以尝试选用抑菌圈小的药物进行治疗, 再进行观察。
4 小结
犊牛大肠杆菌药敏试验 篇8
2013年4月11日, 大连市某鸡场海兰蛋鸡2 800只, 从190日龄开始陆续发病, 产蛋率迅速下降, 病死率约为6%。病鸡多呈精神沉郁、食欲减退, 腹部膨大, 粪便呈灰绿色或黄色, 多经2~3周死亡。无菌采取病死鸡肝、脾、肾等脏器, 进行生化培养、致病力试验、血清型鉴定, 确定分离菌株为大肠杆菌。通过药敏试验筛选出敏感药物为以后的治疗与预防提供理论依据。
1 材料
1.1 病料来源
大连市某鸡场海兰蛋鸡的病死鸡。
1.2 实验动物
海兰商品代1日龄健康雏鸡20只, 用于致病性试验。
1.3 实验材料
血液琼脂、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖发酵培养基、蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水、半固体琼脂和斜面培养基、M-R试剂、V-P试剂、吲哚试剂均等。大肠杆菌标准抗O血清 (O1O2 O78) 成都生物制品研究所 (批号20120901) 。抗菌素种类为丁胺卡那、新霉素、庆大霉素、复合磺胺、氟哌酸、阿奇霉素6种药物
2 方法
2.1 临床观察
观察发病鸡群临床症状, 同时对病死鸡进行剖检, 观察其病理变化, 详实记录。
2.2 病料涂片染色镜检
将病料进行触片, 进行革兰氏染色, 镜检。
2.3 细菌的分离培养
无菌采集病死鸡的气囊、心血、肝脏、脾脏、心脏等病料接种于普通肉汤培养基上, 37℃培养24 h, 抹片, 革兰氏染色后镜检。挑取表面光滑, 边缘整齐, 灰白色半透明的单个小菌落划线接种于麦康凯琼脂平板和伊红美兰琼脂平板, 于37℃培养24 h, 观察结果, 挑选典型菌落接种到斜面培养基上, 鉴定、保存。
2.4 生化试验
将接种斜面培养18~24 h的各菌株菌液, 移种于三糖铁和葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖发酵培养基, 并接种于蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水、半固体琼脂、尿素琼脂中, 37℃培养24~48 h, 观察该细菌在各种培养基中的生长情况, 并进一步进行M-R、V-P和吲哚试验。
M-R试验:取一只经2~3 d培养的葡萄糖蛋白胨水试管, 加入M-R试剂2~5滴, 观察其颜色变化。
V-P试验:取另一只葡萄糖蛋白胨水培养管, 先加含甲萘酚的V-P试剂甲3 m L, 再加V-P试剂乙, (KOH40%) 1 m L, 摇匀后静置试管架上1~2 h后, 观察结果。
吲哚试验:取蛋白胨水培养管先加乙醚少量, 塞紧棉塞振摇试管, 使乙醚与培养液充分混匀, 静置试管架上片刻, 待乙醚浮于液面上层时, 沿管壁加入吲哚试剂2~3滴, 观察其颜色变化。
2.5 致病力试验
营养肉汤37℃培养24 h的菌液, 用生理盐水作5倍稀释, 取1日龄健康的未经任何疫苗接种过的雏鸡, 随机分成两组:第一组10只, 为试验组, 皮下接种菌液0.1 m L, 观察发病情况;第二组10只, 作为对照组, 注射生理盐水。对动物试验后分离到的菌株依据以上方法进行革兰氏染色、镜检、培养性状观察、细菌运动性检查、生化鉴定等。
2.6 血清型鉴定
2.6.1 平板凝集抗原的制备:
用0.5%石碳酸缓冲盐水2 m L, 将琼脂斜面的菌落洗下, 集于瓶中, 121℃高压处理2h, 以破坏其k抗原。
2.6.2 平板凝集反应:
取一张清洁的玻片, 分别将一滴O1、O2和O78的大肠杆菌标准抗O血清滴至玻片上, 再取等量制备好的平板凝集抗原, 与玻片上的抗O血清混匀, 混匀后摇动玻片, 观察有凝集现象, 同时做盐水对照, 半分钟后, 若有凝集粒出现, 则判为阳性, 5 min内不出现凝集颗粒者判为阴性。
2.7 耐药性试验
用纸片扩散法进行药敏试验, 挑取分离培养出的单个典型菌落于肉汤培养基中培养18~24 h, 用无菌棉拭子蘸取菌液, 在管内壁将多余菌液旋转挤去后, 在水解酪蛋白胨琼脂 (ρH 7.2) 表面均匀涂片接种3次, 每次旋转平板60°, 最后沿平板内缘涂抹一周;平板置室温下干燥3~5 min, 用无菌镊子将丁胺卡那、新霉素、庆大霉素、复合磺胺、氟哌酸、阿奇霉素6种药物的含药纸片紧贴于琼脂表面, 各纸片中心相距大于20 mm, 纸片距平板内缘大于15 mm;置35℃恒温箱内16~18 h后, 观察结果。
3 结果
3.1 临床症状及病变
发病鸡群主要表现为大肠杆菌性气囊炎、腹膜炎, 病死鸡多表现精神不振, 咳嗽, 采食下降, 产蛋下降, 气囊混浊增厚, 气囊内有淡黄色干酪样物质, 肝表面、心外膜有白色纤维素性渗出物, 肠道相互粘连, 破损的卵黄散布于腹腔内, 形成气囊炎、肝周炎、心包炎、输卵管炎及腹膜炎。
3.2 病料涂片染色镜检
病死鸡肝、肾等组织培养物涂片染色镜检, 均可见两端钝圆, 多数散在排列, 偶尔有2~3个连在一起的革兰氏阴性短杆菌。
3.3 细菌的分离培养
病料在普通肉汤中分离培养24 h后, 肉汤浑浊、形成菌膜、底管有少量沉淀。分离菌37℃培养24 h, 在普通营养琼脂培养基上形成的菌落呈圆形、中等大小、微隆起、光滑、不透明、边缘整齐、粘稠。在麦康凯琼脂培养基上形成中央凹陷、中等大小的粉红色菌落;血液琼脂平板上在菌落周围形成透明的溶血环, 呈β溶血;在伊红美蓝鉴别培养基上的菌落呈现大肠杆菌特有的黑色带金属光泽菌落。
3.4 生化试验
三糖铁上的反应情况为表面黄色产酸, 底部黄色产酸, 产气, 不产生硫化氢;在葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇和蔗糖培养基中均产生气泡, 并且培养基变成黄色;尿素琼脂不变色, 尿素酶为阴性;硫化氢反应阴性;M-R试验, 液体呈红色为阳性;V-P试验, 液体不变色为阴性;吲哚试验, 乙醚层内出现玫瑰红色为阳性。
3.5 致病性试验
第一组 (试验组) 雏鸡在接种后2h, 精神沉郁, 食欲废绝;24~72 h, 6只雏鸡先后死亡。剖检所见病理变化为呼吸道及消化道黏膜有出血点, 肝脏充血肿大, 其表面和实质内有针尖大的坏死点。取病鸡肝脏染色镜检, 并同时进行细菌分离培养, 其菌的特征与病料中分离的一致。第二组 (对照组) 无发病或死亡。
3.6 血清型试验
病料中分离到的菌株为O78。
3.7 耐药性试验
该菌株对新霉素高度敏感, 对氟哌酸、庆大霉素、丁胺卡那中度敏感, 对复合磺胺、阿奇霉素不敏感。
通过细菌涂片、染色、镜检、分离培养、生化鉴定、动物致病性试验和血清型鉴定结果, 证明该鸡场患病鸡的病原菌为O78型大肠杆菌。
4 讨论
4.1 致病性大肠杆菌是危害养殖业的重要病原菌, 凡能引起机体抵抗力降低的各种因素, 如饲养环境差、鸡舍阴暗潮湿、光照不足、通风不良、饲养密度大、鸡舍没有定期消毒及气候突变等因素均是引发本次疾病的原因, 特别是各种病毒的感染, 都可以诱发大肠杆菌病。因此良好的饲养管理条件和清洁的环境, 避免和减轻应激反应对本病的预防会起到很大的作用。
4.2由于大肠杆菌在鸡舍、鸡体消化道广泛存在, 且不同发病鸡场的大肠杆菌的血清型可能不同以及同一血清型的不同菌株在不同鸡场所表现的致病性也有差异, 因此从发病鸡场的病死鸡体内分离的大肠杆菌并不一定都具有致病性, 必须进行致病性试验, 确定分离菌株致病性的强弱, 然后选择具致病性的分离株研制, 针对不同发病鸡场的疫苗进行免疫接种, 才有可能有效预防不同发病鸡场的大肠杆菌病。
4.3 抗菌药物在临床上广泛应用, 大肠杆菌的耐药性不断地增加。避免细菌耐药性的产生, 应先做细菌药敏试验, 再合理选择用药, 可缩短治疗时间, 又避免滥用抗生素, 同时减少养殖户的经济损失。
防治建议
中草药防治鸡大肠杆菌
黄芩散:主要由黄芩、双花、板蓝根等组成。按一定的比例取各药, 制成含生药1 g/m L的药液, 治疗大肠杆菌攻毒后的30日龄鸡只, 每日灌服黄芩散液2 m L/只, 连续3 d。预防组27~29日龄, 每日灌服黄芩散药液1 m L/只, 至30日龄攻毒后每天灌服药液1 m L, 连续3 d。
犊牛大肠杆菌药敏试验 篇9
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 病料
选取大竹县某养猪合作社规模猪场疑似黄、白痢感染的腹泻仔猪，采用灭菌棉拭子从发病、濒死或死亡仔猪的直肠取样，共采集疑似病料20份，由大竹县动物疫病预防控制中心诊断室保存。
1.1.2 培养基及试剂
普通琼脂培养基、营养肉汤按文献制备;麦康凯琼脂培养基、SS琼脂培养基、糖发酵管、枸橼酸盐、MR试剂、VP试剂、靛基质等试剂，购自杭州微生物试剂有限公司。
1.1.3 血清
E.coli O抗原单价血清，购自中国兽药监察所。
1.1.4 药敏片
成套药敏纸片，含30种抗生素，购自杭州微生物试剂有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 病原菌的分离培养
将采集的病料分别划线接种于普通琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基上，37℃培养18～24 h;然后挑取典型的单个菌落分别接种于普通琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、SS琼脂培养基、营养肉汤培养基进行纯菌增殖，观察菌落形态，再涂片，作革兰氏染色、镜检。
1.2.2 生化试验
将纯化菌株按肠杆菌科细菌生化鉴定要求分别接种于微量生化管内，37℃培养48～72 h，观察并记录结果。
1.2.3 分离菌的血清型鉴定
将经形态特征及生化特性鉴定为E.coli的菌株接种于麦康凯培养基上，37℃培养24 h;挑取纯培养物中的光滑菌落，接种于营养琼脂斜面，37℃培养24 h;用2 m L 0.5%的石炭酸生理盐水洗下琼脂斜面培养物，置小圆底试管中，制成菌悬液;121℃下高压灭菌2 h，破坏其荚膜抗原，制成高压抗原。用E.coli O抗原单价血清进行微量凝集试验，作血清型鉴定。同时以高压抗原和0.5%石炭酸生理盐水混合物作对照，观察有无自凝现象。
1.2.4 药敏试验
将分离鉴定后的E.coli纯培养物均匀地涂布于麦康凯琼脂培养基平板上，无菌条件下用灭菌镊子将药敏纸片平贴于培养基表面，要求纸片间距离≥24 mm、纸片与培养皿边缘距离≥15 mm，且每种药物需在不同位置贴2片，37℃倒置培养，分别于16 h和24 h观察并记录结果，用游标卡尺测量抑菌圈直径，并计算其平均值。
2 结果与分析
2.1 细菌分离及形态观察
经过37℃培养24 h后，分离菌纯培养物在普通琼脂培养基上生长为圆形、边缘整齐、表面光滑、半透明的小凸起菌落;在麦康凯琼脂培养基上生长为圆形、中等大小红色菌落，直径为1～2mm;在SS琼脂培养基上生长为中等大小、均匀红色、半透明、圆形、稍凸起的光滑菌落;在肉汤培养基中呈浑浊状态，管底有灰白色沉淀，液面管壁有菌环，伴有粪臭味。
分离菌经涂片，革兰氏染色、镜检，可观察到中等大小、无芽胞、单个或多个排列、形态较为一致、两端钝圆的革兰氏阴性球杆菌，疑似E.coli。
2.2 生化鉴定
根据《常见细菌系统鉴定手册》，该菌的16项生化鉴定结果均与E.coli相符，同时结合病症、菌落培养特性及菌体特性，确定该分离菌为E.coli。详见表1。
2.3 血清型鉴定
结果见表2。备检的E.coli通过定型，分属于4种血清型，优势血清型为O20、O101、O141，基本代表了目前该养猪合作社猪场仔猪黄、白痢E.coli的主要流行血清型。
2.4 药物敏感性试验
分离E.coli菌株对复达欣(头孢他啶)、多粘霉素B高度敏感，对氨苄西林、哌拉西林、头孢呋辛、阿米卡星、新霉素等药物中度敏感，对其余17种药物表现为耐药或高度耐药。详见表3。
3 小结与讨论
3.1 随着集约化养猪业的发展，由致病性E.coli引起的仔猪腹泻严重威胁着仔猪的健康，死亡率相对较高，耐过仔猪大多成为“僵猪”，饲料报酬低;并且该病易与其他猪病混合感染，造成仔猪死亡率更高。因此，开展针对性的监测是目前集约化养猪生产中有效防控该病的重要手段。
注：茌表示产酸又产气，+表示阳性，-表示阴性。
注：药敏试验判定以药敏片生产厂家“杭州微生物公司”所提供的标准为参照。
3.2 通过对采集的疑似仔猪黄、白痢拭子病料进行病原分离、形态和培养特性观察及生化鉴定，证实该分离菌为典型的E.coli。说明该场仔猪在出生后所发生的腹泻主要是由致病性E.coli引起的。
3.3 从本次备检样品中分离出的致病性E.coli，有4种血清型，其中血清型O20、O101、O141所占比例较大，表明O20、O101、O141为优势血清型，代表了目前该养猪合作社猪场中仔猪黄、白痢E.coli的主要流行血清型。从全国各地区报道的血清型来看，各省市流行的猪源致病性E coli O型血清型有较大差别，存在地区性、多样性，甚至同一地区的不同猪场，所流行的主要血清型也可能有所不同。此前，四川省其他市、区、县的规模化猪场中有关致病性E.coli O抗原血清型的鉴定及分布还鲜见报道。因此，定期对猪场的E.coli进行分离鉴定，明确当前流行的血清型，有利于开展针对性的免疫预防和临床诊治。
3.4 由于在养猪生产中滥用抗生素，造成目前E.coli的耐药谱和耐药水平不断提高，而且抗生素在畜体内残留对人类的健康也会产生不良影响。通过对分离E.coli进行耐药性试验，表明该场的E.coli耐药情况已较为严重，而且呈多重耐药。30种抗生素类药物中，只对复达欣、多粘霉素B高度敏感，而对氨苄西林、哌拉西林、头孢呋辛、阿米卡星、新霉素等药物中度敏感，对其余17种药物表现为耐药或高度耐药。所以在治疗过程中，应通过采用有效的药物和适当剂量来制定合理的治疗方案，做到“有的放矢”。
3.5 通过本试验研究，掌握了大竹县该养猪合作社仔猪腹泻的发病情况，并筛选出了有效的治疗药物，为制定科学的饲养管理模式，强化公共环境卫生安全等起到了积极的推动作用，也达到了提高猪场产仔成活率和仔猪育成率的目的。
参考文献
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