犊牛腹泻病原的鉴定

犊牛腹泻病原的鉴定（共4篇）

犊牛腹泻病原的鉴定 篇1

犊牛腹泻是新生犊牛所发生的一种急性腹泻。引起犊牛腹泻的病因很多,包括细菌、病毒、寄生虫等病原微生物以及营养因素和环境因素等。仅大肠杆菌病造成的腹泻死亡占犊牛死亡总数的50% 以上。试验取腹泻病死犊牛粪便、肝脏、肠、脾脏等脏器病料,进行病原分离,对分离菌株进行生化试验、致病性试验及药敏试验,以期为犊牛细菌性腹泻病的防治提供参考依据。

1 材料

试验动物为5日龄昆明小鼠,由河北联合大学实验动物中心提供。

2 方法

2. 1 病料采集

在无菌条件下采取3份细菌性腹泻病死犊牛的粪便及肝脏、肠、脾脏等组织病料。

2. 2 涂片镜检

在实验室将采集的粪样用灭菌棉签涂在载玻片上,将肝脏、脾脏等脏器用镊子夹持涂抹,然后革兰染色,镜检。

2. 3 细菌的分离培养

将采集的3份腹泻粪样按常规方法分别接种于麦康凯、伊红美蓝和血琼脂培养基上,37℃培养24 h,观察生长情况。以无菌接种环分别挑取麦康凯和伊红美蓝培养基上的单个菌落,接种于普通琼脂斜面,37℃纯培养24 h,对纯培养物涂片,革兰染色,镜检及荚膜、芽孢染色镜检。无菌采取肝脏、肠、脾脏等组织病料,直接涂片,革兰染色,镜检及荚膜、芽孢染色镜检。

2. 4 分离菌的生化试验

挑取纯培养物接种于三糖铁琼脂、糖微量发酵管( 葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇) 、尿素分解管、赖氨酸、苯丙氨酸生化管、硫化氢、靛基质反应管、硝酸盐还原管、构椽酸盐管,甲基红( M. R. ) 试验、V - P试验等,37℃培养24 ~ 72 h,观察并记录结果。

2. 5 分离菌的致病性检测

随机挑取麦康凯上纯培养的菌落,接种于营养肉汤中,取24 h内培养物,备用。取健康小鼠20只,随机分为试验组和对照组,每组10只。将上述制备的待测菌液腹腔接种于试验组小鼠,0. 4 m L/只; 对照组小鼠注射等量生理盐水,观察72 h。剖检死亡小鼠,无菌采集心脏和肝脏,涂片、镜检。同时抽取少量腹水在伊红美蓝培养基上均匀涂抹,37℃培养24 h后观察结果。

2. 6 药敏试验

在普通营养琼脂平皿上挑取2个形态相似、直径1 mm左右的菌落接种于3 m L肉汤中,37℃培养16 h,用无菌棉拭子蘸取菌液涂布于琼脂平板表面( 可重复来回划线) ,待稍干后用无菌镊子将各种圆型药物纸片分别贴于培养基表面,各片距离要相等,37℃培养24 h,观察结果。根据药物纸片有无抑菌圈及其直径大小来判断该菌对各种药物的敏感程度。药敏纸片的种类及判定标准见表1。

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3 结果

3. 1 涂片镜检

在显微镜油镜下观察到大量革兰阴性、两端钝圆的短杆菌。大多单个存在,有的成对存在,不形成芽孢和荚膜,还看到部分革兰阳性菌。

3. 2 分离菌的培养特性

分离菌在麦糠凯培养基中形成中等大小、表面光滑、湿润的粉红色菌落; 在伊红美蓝培养基上形成带有金属闪光的紫黑色小菌落; 在血琼脂平板上形成β - 溶血。营养肉汤呈均匀浑浊,底部有黏性沉淀。结果表明,从犊牛腹泻粪便中分离得到的细菌基本符合大肠杆菌的生化特性,可初步判定为大肠杆菌。

3. 3 分离菌的生化特性

分离菌生化特性试验结果见表2。

注: ⊕表示产酸产气; + 表示产酸或阳性反应; - 表示阴性反应。

结果表明从分离菌的生化特性、结合培养特性和形态特征上判断该菌为大肠杆菌。

3. 4 致病性试验检测结果

试验小鼠接种后8 h左右出现腹泻症状,发病率为100% 。发病后小鼠精神沉郁,饮食量减少甚至不饮食。有的小鼠被毛逆立,腹式呼吸,80% 的小鼠肛门周围及尾部粘有黄色稀便。28 h出现死亡,到试验结束时共死亡6只,死亡率为60% 。无菌采集死亡小鼠的心脏和肝脏,涂片、染色、镜检,镜下可见革兰染色阴性的杆菌。接种腹水的营养琼脂培养基上,生长的菌落形态基本符合大肠杆菌的形态特征。空白对照组正常。说明从腹泻犊牛的粪便中分离的大肠杆菌为致病性大肠杆菌。

3. 5 分离菌的耐药性检测结果

分离菌耐药性检测结果见表3。

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结果表明: 分离菌对阿莫西林、链霉素、红霉素敏感,对土霉素、诺氟沙星、庆大霉素中度敏感,对卡那霉素、丁胺卡那则表现出耐药性。

4 讨论

犊牛大肠杆菌性腹泻是犊牛最常见的疾病一,多在5日龄内发病,呈急性经过,主要症状是腹泻、脱水和衰弱。病初腹胀,排水样、黄白色或绿色粪便,发病后1至数日内死亡。试验从腹泻犊牛上采取病料进行病原的分离鉴定,分离菌在形态特征、培养特性和生化特性方面与大肠杆菌基本一致,鉴定为大肠杆菌,表明该奶牛场犊牛细菌性腹泻的病原菌主要是大肠杆菌。

药敏试验结果表明该菌对阿莫西林、链霉素、红霉素敏感,对土霉素、诺氟沙星、庆大霉素中度敏感,对卡那霉素、丁胺卡那、氨苄西林出现耐药性。分离菌对大部分药物不敏感,可能与当地长期或大量使用该类药物,使致病菌已产生耐药性。所以,在生产中可以选链霉素、红霉素、阿莫西林作为由大肠杆菌引起的犊牛细菌性腹泻的首选药物,且应注意交替用药,按疗程投药,严禁超剂量使用,避免或减少耐药菌株的产生。

感染性犊牛腹泻病原学的研究进展 篇2

1病毒

1. 1牛轮状病毒( BRV)

BRV是引起犊牛腹泻的一个重要病原,属于呼肠孤病毒科轮状病毒属。轮状病毒无囊膜,含有11个双链RNA片段( 大小为16 ~ 21 kb) ,病毒非常稳定,可在很宽的p H值范围内保持活力。依据中间衣壳蛋白( VP6) 抗原和基因的相似性,可将轮状病毒分为7个血清群( 从A群到G群) 。A群轮状病毒是引起家畜轮状病毒感染的主要病原。虽然在现地病例中也可检测到B群和C群,但大多数轮状病毒( 95% ) 属于A群。

轮状病毒的蛋白酶敏感蛋白( VP4) 和糖蛋白( VP7) 构成病毒粒子的外衣壳,并可诱导抗病毒中和抗体的产生。依据这两种蛋白抗原性和基因的相似程度性,可将A群轮状病毒进一步分为P型或G型。 已有的报道显示,在家畜中存在16种G型和27种P型。BRV多为G1型、G6型、G8型或G10型,其中以G6型和G10型为主。

BRV的VP4、VP6和VP7蛋白在维持病毒结构、 病毒吸附和抗原性方面起着重要作用。非结构蛋白4( NSP4) 具有病毒肠道毒素的特殊作用。此蛋白会通过提高钙离子进入细胞浆的浓度,干扰细胞的自体平衡。NSP4会加快营养和水分通过小肠上皮细胞的速度,这对于病毒的致病机理要比病理损伤更为重要。

BRV通常引起1 ~ 2周龄犊牛腹泻,犊牛摄入的牛奶给轮状病毒提供了良好环境,使其在胃肠道中很宽的p H值范围内得以生存,并感染肠道上皮细胞[2]。病毒的潜伏期很短,通常在12 ~ 24 h即可在感染犊牛中引起严重腹泻。一旦感染,犊牛会通过粪便排出大量病毒,持续5 ~ 7 d,这会对环境造成污染, 同时会感染同居的其他犊牛。病毒在小肠绒毛上皮细胞的胞浆中复制,导致对小肠绒毛上成熟肠道细胞的破坏,损伤细胞的血管活性成分,激活肠道神经系统,再加上分泌的NSP4会加速轮状病毒感染引起的消化不良/吸收不良腹泻。病毒感染会引起小肠绒毛萎缩,并且通常会影响小肠的基底部。现已有证据表明,在人与动物轮状病毒之间存在着跨种间传播,并伴随着基因重组( 如猪、牛、犬和猫) ,这使得轮状病毒作为人畜共患病病原体被广泛关注[3]。

1. 2牛冠状病毒

牛冠状病毒是有囊膜的单股正链RNA病毒( 大小为27 ~ 32 kb) ,病原体是乙型冠状病毒属的成员( 乙型冠状病毒1型) ,被正式划分为冠状病毒属的2a群[4]。病毒感染牛后可引起三种独特的临床症候群: 1) 1 ~ 2周龄犊牛出现腹泻; 2) 成年牛在冬季出现出血性痢疾; 3) 出现呼吸道疾病( 幼牛和成牛出现呼吸道综合征)[5]。

病毒的纤突蛋白( S) 在病毒入侵和致病机理中起着重要作用,并可诱导中和抗体的产生。S蛋白包含2个亚基( S1亚基和S2亚基) ,对病毒与宿主的作用至关重要。S1亚基可使病毒结合于宿主细胞的受体上,S2亚基的作用是使病毒囊膜与宿主细胞膜融合。

病毒感染自小肠开始,通常延伸至整个小肠和结肠。在显微镜下可观察到感染的小肠绒毛和结肠隐窝萎缩及固有层坏死。起初S蛋白和血凝素- 酯酶( HE) 蛋白结合并吸附于肠道上皮细胞上,病毒在肠细胞上复制,子代病毒通过正常的分泌机制和细胞溶解被释放出来。虽然隐窝肠道细胞也被感染,但成熟的绒毛上皮细胞是病毒的主要目标。由于病毒对隐窝肠道细胞的破坏,感染动物出现临床症状后持续的时间会更长一些。

1. 3牛病毒性腹泻病毒( BVDV)

BVDV是有囊膜的单股正链RNA病毒( 大小为12. 3 kb) ,是黄病毒科瘟病毒属中的一个成员。此病毒属中有三种病毒: BVDV、边界病病毒和典型猪瘟病毒。依据病毒基因组5'端非翻译区( UTR) 序列的相似性,可将BVDV分为2个型( BVDV1和BVDV2) 。依据它们在培养细胞时引起溶解细胞病变的能力,可将每型病毒进一步分为2种生物型,即致细胞病变型和非致细胞病变型。非致细胞病变型的BVDV毒株与持续感染有关。当前已经鉴定出15个BVDV1 ( BVDV1a ~ BVDV1o ) 和2个BVDV2 ( BVDV2a和BVDV2b) 亚型,其中BVDV1a、BVDV1b和BVDV2a是美国牛群中流行最为广泛的亚型[6], BVDV1c是澳大利亚最普遍的亚型[7]。

由于宿主的免疫状态、怀孕和妊娠时期的不同及存在其他病原体的混合感染,BVDV感染的临床症状会出现由亚临床感染到致死性疾病的不同变化。大多数感染牛会出现体温升高和临床症状,如低烧、白细胞数量减少、厌食和产奶量下降。急性BVDV感染以腹泻、高烧、沉郁、厌食、产奶量下降、口腔溃疡、 出血综合征及淋巴细胞数量减少/白细胞数量减少导致的免疫抑制。由于混合感染其他病原体( 如牛呼吸道病综合征) ,免疫抑制牛对其他疾病更易感。虽然大多数免疫能力健全的牛最终能清除掉病毒,并从疾病中恢复,一些感染牛经常会在很长时间内携带病毒,间歇性地出现,可周期性检测到一过性病毒血症( 如持续感染的动物) 的表象。

在妊娠45 ~ 125 d期间,对怀孕母牛感染非致细胞病变的BVDV,会产出BVDV持续感染( PI) 犊牛。 大多数PI犊牛出生后很虚弱,对其他病原体易感,并会出现生长不良的现象。当接触到外源性或内源性致细胞病变的BVDV后,PI犊牛也会发展为致死性的“黏膜病”。黏膜病在临床上以黏膜溃疡、囊泡形成、糜烂、腹泻和死亡为特征。BVDV以两种主要方式引起犊牛腹泻: 1) 持续感染导致对肠道细胞的主要损伤,并对共感染敏感; 2) 一过性感染,病毒在隐窝肠道细胞中复制,形成损伤,导致腹泻。

1. 4牛凸隆病毒( BTo V)

BTo V是有囊膜的单股正链RNA病毒( 大小为25 ~ 30 kb) ,属于巢状病毒目冠状病毒科的凸隆病毒属,同科成员有马、人和猪的凸隆病毒。凸隆病毒是牛传染性胃肠炎的病原体,并且是仔猪和儿童急性肠道感染的首要原因,现已在全球范围内有关于腹泻牛通过粪便排泄BTo V的报道,这包括美国( 2003年) 、 加拿大( 1998年) 、南非( 1993年) 、德国( 1992年) 、 匈牙利( 2002年) 、奥地利( 2006年) 和韩国( 2008年) 等国家[8]。人与牛的凸隆病毒在形态学上的相似性和抗原性上的交叉反应性已逐步受到关注, BTo V可能是潜在的人畜共患病病原体。

BTo V可在3周龄内的犊牛上引起温和到中度的腹泻[9]。经口服或鼻内接种病毒之后,在小肠绒毛的中下部上皮细胞延伸至隐窝上皮的肠道细胞会感染,导致小肠细胞的死亡和上皮脱落,随之大肠坏死。 对于绒毛和隐窝肠道细胞的损伤会引起吸收不良/消化不良性腹泻。由病毒引起的损伤30% ~ 50% 存在于小肠上部,这会导致感染动物轻度到中度的腹泻。 与牛冠状病毒( BCo V) 一样,在牛鼻分泌物中也检测到BTo V的抗原和RNA,但是这些因子在呼吸道病中的作用仍有待于研究。

1. 5牛诺罗病毒( BNo V)

BNo V是无囊膜的单股正链RNA病毒( 大小为7. 4 ~ 8. 3 kb) ,属于杯状病毒科中的诺罗病毒属。由于诺罗病毒( No Vs) 基因之间存在着高度可变性,依据开放阅读框架( ORFs) 2[主要衣壳蛋白( VP1) ]和3[次要衣壳蛋白( VP2) ]序列的相似性,可将其分为5个基因群( GⅠ ~ GⅤ) 。属于GⅢ群的BNo Vs包含2个原型毒株,即Jena[基因型1 ( GⅢ - 1) ]和New- bury2[基因型2( GⅢ - 2) ]病毒,并与人( GⅠ、GⅡ和GⅣ) 、猪( G Ⅱ - 11、G Ⅱ - 18和G Ⅱ - 19 ) 和鼠( G Ⅴ) 的No Vs在遗传演化上的关系很远。用人的No V感染悉生猪的一个试验研究证实,No V存在着跨种间传播的可能性,这在全球引起了对这种潜在人畜共患病病原体的关注。

现已进行了很多试验来研究BNo V在牛上的感染,并将其与人的No Vs进行分子特征比较[10]。采用分子方法检测到BNo V在不同国家的变化很大,范围为7. 5% ~ 49. 6% 。所有鉴定的BNo Vs与人的No Vs在遗传演化关系上很远,提示BNo Vs成为潜在人畜共患病病原的可能性很小。

No Vs是引起人( 成人和儿童) 急性、散发性非细菌性胃肠炎的主要原因。研究发现,这些病毒可在牛、猪、狗和貂这些动物中引起胃肠道疾病。P. H. Otto等[11]通过口服途径对新生犊牛感染BNo V Jena株,结果发现,病毒可感染小肠上皮细胞,导致绒毛( 空肠与回肠处) 萎缩,引起腹泻和排毒,但血清并不转阳。也有学者从临床健康牛的粪便中检测到BNo V,这引起对BNo V临床重要性问题的关注。

1. 6纽伯病毒

纽伯病毒属于杯状病毒科中新确立的纽伯病毒属[12],病毒基因组大小约为7. 4 kb,含有两个ORFs, 即ORF1( 编码非结构蛋白与衣壳蛋白) 和ORF2( 编码功能未知的蛋白) 。纽伯利因子- 1和内布拉斯加样的牛杯状病毒形成两个独特的基因型,它们分别与英国和美国内布拉斯加州的犊牛腹泻相关。在其他国家也有纽伯病毒的存在,包括法国、意大利和韩国。 纽伯病毒在腹泻犊牛中的流行率为7. 0% ~ 28. 0% , 并与地理位置有关。目前,还没有此病在人与动物间相互传播的证据。研究发现,在纽伯病毒之间存在着基因的多样性,并且鉴定了一个新的基因型[13]。与BNo Vs相似,当用纽伯病毒对新生犊牛进行攻击时, 观察到的损伤主要出现在空肠与回肠,且以绒毛萎缩、肠道细胞损失和隐窝病理性增生为主。

2细菌

2. 1肠炎沙门氏菌

肠炎沙门氏菌可定殖于很大范围宿主的胃肠道。 肠炎沙门氏菌的鼠伤寒血清型和都柏林血清型是引起牛沙门氏菌病的主要病原体。沙门氏菌感染会引起一大类不同的临床症状,从无症状感染到严重的临床沙门氏菌病。急性腹泻通常与鼠伤寒沙门氏菌有关,而系统疾病与都柏林沙门氏菌有关。沙门氏菌通常感染3周龄以内的犊牛,在感染犊牛上经常观察到的损伤包括在小肠黏膜上形成伪膜和肠系膜淋巴结肿大。感染犊牛作为人畜共患病的一个来源,通过饲料途径或直接接触传播细菌。

沙门氏菌毒力的潜在基本机理包括侵入肠道黏膜,在淋巴组织增殖并逃避宿主防御系统的攻击,最终导致系统发病。对于沙门杆菌的致病机理,它可侵入小肠上皮细胞,在巨噬细胞内存活,并引起肠道病理变化。沙门氏菌定殖于免疫细胞、肠道细胞和扁桃体组织[14]。随着淋巴组织( 比如扁桃体) 的感染,沙门氏菌通过侵入单核细胞与巨噬细胞进而扩散到全身。已知沙门氏菌的毒力岛1( SPI - 1) 和SPI - 5会影响3型分泌系统,并在沙门氏菌引起的犊牛腹泻中起主要作用,SPI - 2与第2种3型分泌系统有关,并对其在细胞间的生存起主要作用。

沙门氏菌病的临床表现以存在纤维蛋白和血液的水样和黏液腹泻为特点[15]。虽然沙门氏菌可引起成牛与犊牛腹泻,但在10日龄至3月龄内的犊牛更普遍,通常会引起严重症状。根据感染的程度( 如临床或亚临床感染) ,犊牛会在不同时间周期中间歇性地排放细菌。

2. 2大肠杆菌

大肠杆菌是引起犊牛腹泻的重要病原体,依据大肠杆菌独特的毒力机制,可将其分为六个致病群: 产肠毒素E. coli、产志贺毒素E. coli、肠致病性E. coli、 肠侵袭性E. coli、肠攻击型E. coli和肠道充血型E. coli[16]。在这些细菌中,最常见的可引起新生犊牛腹泻的是产生K99 ( F5) 吸附素抗原( 通常指E. coli K99+) 和热稳定肠毒素的肠毒素性大肠杆菌( ETEC) 菌株。应该注意的是,有时进行组织病理学鉴定也会得到E. coli的其他致病群,但如果诊断仅集中于E. coli K99+,会漏检其他致病群。

新生犊牛在出生后的最初4 d内对ETEC高度敏感,如果感染就会发展为水样腹泻[17]。在ETEC被摄入后,感染小肠上皮并在小肠绒毛的肠道细胞中增殖。由于p H值低( 不超过6. 5) ,小肠的远端部分为ETEC的定殖提供了最适合的环境。在感染小肠中经常会观察到由于感染细胞的死亡导致的绒毛萎缩和固有层的损伤。细菌表达的K99抗原与细菌吸附有关。在定殖到肠道上皮之后,由ETEC产生的热稳定毒素会上调氯化钠向肠道中的分泌。这种渗透作用会吸收水分进入肠道,导致发展为水样腹泻。

2. 3产气荚膜梭菌

产气荚膜梭菌是革兰阳性、形成芽孢的厌氧菌, 可引起哺乳动物和鸟类很大范围的疾病[18]。依据四种主要毒素( α 毒素、β 毒素、ε 毒素和 ι 毒素) 的产生,将产气荚膜梭菌分为五个毒素型( A型、B型、C型、D型和E型) 。A型菌株单独产生 α 毒素; B型菌株产生 α 毒素、β 毒素和 ε 毒素; C型菌株产生 α 毒素和 β 毒素; D型菌株产生 α 毒素和 ε 毒素; E型菌株产生 α 毒素和 ι 毒素。在这些型的菌株中,C型与犊牛腹泻相关,但通常不如其他病原体如BRV、 BCo V、E. coli、沙门氏菌和微小隐孢子虫更为常见。

α 毒素是主要的致死性毒素,会通过对磷脂膜的水解促进细胞裂解; β 毒素对于胰酶高度敏感,会引起黏膜坏死; ε 毒素会在家畜中引起致死性的肠毒血症; ι 毒素由于高度的血管穿透性,在皮肤坏死中起主要作用。由于肠毒素作用于上皮紧密连接蛋白,可引起腹泻和肠道痉挛。所有型的产气荚膜梭菌都产生 β - 2毒素,最近推测其与肠毒素有协同作用[19]。

由于此细菌在环境中无处不在,大多数家畜对所有型的产气荚膜梭菌都易感。在新生犊牛的胃肠道中都会产生低水平的蛋白水解酶( 如胰酶) ,很容易被C型产气荚膜梭菌感染,所以 β 毒素被认为是犊牛在被此细菌感染后出现临床症状的主要毒力因子。 在这些感染动物中,肠道损伤以弥散性或多病灶、充血性、坏死性肠炎和血样液体膨胀为主要特征。

3原虫

微小隐孢子虫是寄生虫中的原虫,经常与人和新生犊牛的胃肠道疾病相关。犊牛感染微小隐孢子虫后有的不出现症状,有的则发展为严重腹泻并伴随脱水。隐孢子虫大约有24种[20]。感染犊牛的通常为微小隐孢子虫、牛隐孢子虫、赖氏隐孢子虫和安德森隐孢子虫。微小隐孢子虫被认为是犊牛腹泻的首要病原,并且是潜在的人畜共患病病原体[21]。

一旦微小隐孢子虫被牛摄入,卵囊会脱囊释放出孢子体,穿入小肠细胞。脱囊的寄生虫会进行无性( 1型裂殖子) 和有性( 2型裂殖子) 繁殖来产生大配子体和小配子体。在大配子体被小配子体授精后,受精卵发育为孢子,产生可进行自体感染的薄壁卵囊。 接着厚壁卵囊被宿主排出体外。在适宜环境中( 如高温、高湿和低紫外剂量照射) ,卵囊可存活超过一个月,并对消毒剂有抵抗。环境中污染的卵囊可以是人和动物感染的中间来源。

微小隐孢子虫侵入肠细胞,导致小肠细胞骨架结构的改变,如微绒毛损失和柱状上皮细胞变短,导致感染动物绒毛的严重萎缩。小肠上皮的损伤会导致吸收不良和在小肠管中未消化牛奶的发酵,会引起长期的营养不良,降低感染犊牛的生长率。

4结语

犊牛腹泻给养牛业造成重大的经济损失[22],其中以病毒、细菌和寄生虫等传染性病原体诱发的腹泻为主。虽然目前犊牛腹泻的控制取得很大进展,但存在的问题依然很多[23]。犊牛腹泻受多方面因素的影响,发病情况复杂多样。如一些腹泻犊牛病例是由某个主要病原体引起,但有时经常会观察到混合感染。 而且每种病原体的流行和感染会随着牧场的地理位置、牛群大小和牛场管理实践而发生变化。

犊牛腹泻病原的鉴定 篇3

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病原来源

农七师123团牛场病死犊牛的心血、肝、脾、淋巴结。

1.1.2 培养基

LB培养基、麦康凯培养基、SS培养基、三糖铁琼脂培养基、鲜血平板、生化鉴定培养基。

1.1.3 药敏纸片

庆大霉素、卡那霉素、硫酸链霉素、恩诺沙星、土霉素等。

1.1.4 生化试剂

1.1.4. 1 革兰氏染色试剂

碘化钾、草酸铵、碱性复红、95%乙醇、碘片、结晶分析纯化学试剂,自配。

1.1.4. 2 生化鉴定试剂

葡萄糖、乳糖、麦芽、甘露醇、蔗糖、靛基质、硫化亚铁、硫酸钠、α-萘酚、氢氧化钾、甲基红、无水乙醇、硫化氢。

1.1.5 实验动物

5只18～20g健康小白鼠。

1.2 方法

1.2.1 流行病学调查

了解饲养管理,消毒,天气,发病过程,发病率,死亡率,发病症状以及大体解剖学的病变,以便于进一步了解其发病特征。

1.2.2 病料的采集及镜检

无菌操作,采集病死牛的心血、肝、脾、淋巴结,并进行涂片、染色、镜检。

1.2.3 病原菌的分离、培养

分别接种于LB肉汤中37℃培养24h,并进行革兰氏染色,镜检、观察。

1.2.4 病原菌的纯化

细菌分离培养将肺脏、肝脏、脾脏和淋巴结分别接种新鲜兔血营养琼脂平板,每种脏器接种4份平板,2份进行普通需氧培养,2份进行普通厌氧培养,置于37℃恒温箱内24h后观察结果,对培养出的细菌进行革兰氏染色及镜检,将培养出的细菌纯培养,将纯培养物接种LB、麦康凯、三糖铁斜面(穿刺),培养基37℃需氧培养,24h后观察结果。

1.2.5 生化鉴定

1.2.5. 1 糖类分解试验

取分离菌的24h纯培养物分别接种于葡萄糖、乳糖、麦芽甘露醇培养基内,37℃培养24h,观察结果。

1.2.5.2 MR/VP试验

取分离菌的24h纯培养物分别接种在葡萄糖蛋白胨水溶液中,培养37℃24～48h,加入指示剂。

1.2.5. 3 硝酸盐还原试验

取分离菌的纯培养物接种到硝酸盐培养基中,37℃培养24h,在加试剂甲和乙,30s内变红即为阳性,若无颜色出现,加少量锌粒,随后出现红色则是真正的隐形试验。

1.2.6 药敏试验

用药敏纸片法(主要为常用的青霉素类和四环素类)来检测对抗生素药物的敏感性。

1.2.7 动物试验

动物致病性试验,将分离到的大肠杆菌接种到营养肉汤,37℃培养10h,取其培养液接种实验动物,设置对照组。

1.2.8溶血试验

采用平板办法测定分离溶血特性,将大肠杆菌菌种接种到5%兔鲜血LB平板,37℃培养48h后观察溶血情况,菌落周围出现溶血圈者判为溶血阳性。

2 小结与讨论

(1)通过流行病学调查、临床症状、病理变化、病原分离鉴定和动物试验,确定该牛场犊牛死亡原因为大肠杆菌感染所致。

(2)药敏试验结果表明,菌株对各种药物的敏感性存在明显的差异,所有菌株均对硫酸链霉素和庆大霉素敏感,对新霉素和四环素耐药。由于临床上长期盲目用药所造成,建议各地区治疗牛大肠杆菌病时要定期轮换用药,最好先进行药敏试验,选出敏感药物进行有效治疗,避免因盲目用药造成经济损失。

(3)防治本病要采用综合性的防治措施,避免各种应激因素;平时应加强对犊牛的饲养管理,逐步改善牛舍的通风条件;认真落实牛场兽医卫生保健措施;另外在要勤洗犊牛喂奶用具,因为本病的传染与环境密切相关。

犊牛腹泻病原的鉴定 篇4

选取蓝田县玉川镇奇虎养殖场典型的腹泻仔猪10例为研究对象, 观察仔猪腹泻的流行病学资料及具体的临床症状。

2 方法

2.1 流行病学调查

本病发生于20~30日龄仔猪, 发病率较低, 病死率较高。发病季节一般以冬末春初较多。仔猪感染途径主要是经消化道感染, 仔猪出生后随着吸吮母猪奶水而感染。在正常条件下, 大肠杆菌这种肠道常在菌并无致病作用, 但在仔猪抵抗力减弱或消化机能障碍时, 便呈现出一定的致病力。抵抗力弱的仔猪呈现腹泻症状, 严重的可导致败血症而死亡。饲养管理、环境和卫生等方面的各种不良因素都是诱发该病的重要原因。

2.2 症状与剖检

仔猪主要发生下痢, 粪便呈灰白色或灰褐色糊状稀便, 有鱼腥味。有时粪中混有气泡。病猪体温不高, 精神尚好, 有食欲。个别仔猪病情变化快, 出现精神差, 食欲减退或废绝, 呼吸急促, 眼睑发生轻度水肿, 拱背, 发抖, 站立不稳, 重症者引起死亡。剖检变化是尸体外表苍白, 消瘦, 肠粘膜有卡他性炎症变化, 胃壁和肠系膜淋巴结轻度肿胀。

2.3 病原的分离鉴定

取新鲜粪便或肛门拭子, 用灭菌生理盐水稀释或洗涤, 用接种环取上清液分别接种于普通琼脂平板和麦康凯琼脂平板上, 37℃培养24 h, 记录菌落特征, 取单个菌落进行革兰氏染色, 敏片。为了能准确的观察结果, 要求药敏片能有规律的分布于平皿培养基上, 一般可在平皿中央贴一片, 外周可等距离贴若干片 (外周一般可贴七片) , 每种药敏片的名称要明确标记。最后将平皿培养基置于37℃恒温箱中培养24 h后, 观察试验结果。

3结果

3.1病原菌分离鉴定结果

病原菌在普通营养琼脂平板上形成圆形凸起、光滑、湿润、半透明的灰白色菌落, 在麦康凯平板为红色菌落;革兰氏染色细菌形态及染色特性表现为革兰氏阴性无芽孢直杆菌, 两端钝圆, 散在或成对。

根据其染色形态及生化特性结果, 可判定病原菌为产肠毒素性大肠杆菌 (ETEC) 。

3.2药敏试验结果

观察细菌细菌形态及染色特性, 并进行纯化培养。对分离纯化的细菌培养物分别做糖发酵和蛋白质分解等生化试验, 鉴定其生化特性。

2.4药物敏感试验

2.4.1药敏片的制备。以灭菌镊子夹取50片纸片 (直径6 mm) 放入一清洁干燥的青霉素空瓶中, 瓶口以单层牛皮纸包扎。经高压消毒后, 放在烘箱中使其完全干燥。在上述含有50片纸片的青霉素瓶内加入药液0.25 m L, 使各纸片充分浸透药液。同时在瓶口上记录药物名称, 放37℃恒温箱内12h, 干燥后即密封起来, 切勿受潮, 置阴凉干燥处存放, 有效期3~6个月。

2.4.2试验操作步骤。无菌条件下, 用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌, 以每点开始划线涂菌至平皿的1/2, 然后依次划线, 直至细菌均匀密布于平皿。将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停, 取药敏片贴到平皿培养基表面。为了使药敏片与培养基紧密相贴, 可用镊子轻按几下药

药敏试验的结果, 判定标准参照《抗菌药物药效试验判定标准》。抑菌圈直径小于10 mm为低度敏感, 直径在10~18 mm之间为中度敏感, 直径大于18 mm为高度敏感。

对6种常用药物的药敏试验结果表明, 该菌对阿米卡星高敏, 对恩诺沙星、环丙沙星、氯霉素和庆大霉素中度敏感, 对链霉素低敏。

4 讨论

4.1 影响药敏结果的因素

4.1.1 培养基。应根据试验菌的营养需要进行配制。倾注平板时, 厚度合适 (5 mm~6 mm) , 不可太薄, 一般90 mm直径的培养皿, 倾注培养基18 m L~20m L为宜。培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质, 如钙、镁离子能降低氨基糖苷类的抗菌活性, 胸腺嘧啶核苷和对氨苯甲酸 (PABA) 能拮抗磺胺药和甲基苄啶 (TMP) 的活性。

4.1.2 细菌接种量。

细菌接种量应恒定, 如太多, 抑菌圈变小, 能产酶的菌株更可能破坏药物的抗菌活性。

4.1.3 药物浓度。

药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的结果, 需精确配制。商品药应严格按照其推荐治疗量配制。

4.1.4 培养时间。

一般培养温度和时间为37℃8 h~18 h, 有些抗菌药扩散慢 (如多粘菌素) , 可将已放好抗菌药的平板培养基, 先置4℃冰箱2 h~4 h, 使抗菌药预扩散, 然后再放37℃恒温箱中培养, 可以推迟细菌的生长, 而得到较大的抑菌圈。

5 防治措施

5.1 饲养管理

5.1.1 仔猪管理。

仔猪管理注意事项很多, 主要有为仔猪提供良好的环境条件, 最大限度地减少可能的应激, 防止仔猪肠道感染。具体防治措施为: (1) 母猪分娩时, 饲养人员应在产床前看护, 帮忙将仔猪身上的粘液擦掉, 然后将仔猪放在有保温的保育箱中, 母猪产后当天可肌注青链霉素或产后康等抗菌剂; (2) 仔猪出生后不久, 要将脐带距腹部7~10 mm的地方剪掉, 用碘酒消毒, 并且尽快让新生仔猪吃上初乳, 同时做好固定乳头工作; (3) 做好保温工作, 保育箱中的温度应在30~32℃, 保育箱外环境温度应在25℃左右, 并且没有贼风, 又可把污浊气体排出舍外; (4) 仔猪出生后24 h内全部注释或口服抗生素 (如:庆大霉素、氟哌酸等) ; (5) 仔猪生后3日龄应补铁, 因为奶中却铁, 补铁可提高血中铁浓度, 缺铁时仔猪易患贫血病、易受冷和感染疫病; (6) 8~10日龄应给仔猪补硒, 补硒可提高抗病力。

5.1.2 母猪管理。

加强母猪饲养管理, 保证母猪产后乳量的平衡与优质, 应采取以下防治措施: (1) 加强妊娠母猪的饲养管理, 合理调配饲养, 保证母猪产后乳量的平衡与优质, 防止母乳过浓、过稀或不足; (2) 在母猪分娩前21 d接种大肠杆菌基因工程苗k88、k99等四价苗; (3) 母猪产前应把整个产房包括床隔板、床面及舍内各种设备彻底清洗消毒, 条件允许应空置4d~5 d后在进待产母猪。

5.2 补液治疗

不管什么原因引起的腹泻, 猪体都要失去大量的水分、盐分、糖分和其他营养物质, 带来一定的不良后果, 严重时甚至危害猪的生命。脱水造成仔猪死亡通常是水和电解质紊乱所致, 因此补液是减少死亡的一项关键措施。常规的静脉输液疗法因使用不便而很难在治疗腹泻之中应用。口服补液盐简单易行, 在治疗畜禽腹泻上取得显著的疗效。口服补液盐由氯化钠、氯化钾、碳酸氢钠、葡萄糖组成, 具有补充水分、电解质、调节酸中毒和补充营养的作用。应用时每25 g加水1 000~1 500 m L, 任其自由饮用或灌服, 灌服量4次/d, 用量为轻度腹泻50~80 m L, 中度脱水80~100 m L, 重度脱水100~130 m L, 总液量要求在4~8 h内用完。

5.3 抗生素治疗

目前抗生素是治疗大肠杆菌的主要方法, 但由于养殖规模、养殖历史和用药习惯的不同, 造成不同地区大肠杆菌的耐药性差异也较大, 所以难以界定某地大肠杆菌对那个抗生素更敏感。通过耐药性试验后, 该猪场可使用药物有阿米卡星、环丙沙星、恩诺沙星、氯霉素和庆大霉素等。阿米卡星20 mg/kg肌注, 还可投服氟哌酸乳剂2 m L, 2次/d。恩诺沙星5 mg/kg与阿托品0.25 mg加维生素B150 mg肌注, 1次/d。

5.4 中药治疗

中草药大都是经过几千年的医疗实践证实对人畜健康有益无害的天然植物或产品, 能起到防病治病, 促进生长发育的作用, 其独特的优点是长期使用而无药物残留, 无抗药性, 药效不减和无毒副作用, 是良好的“绿色”药物添加剂。大黄、黄芩、当归、厚朴、葛根、木香各15 g煎汁放食内母猪一次服, 一般用2剂。苦参60 g、穿心莲40 g、胡黄连20 g、木香20 g、龙胆草30 g、秦皮30 g、诃子30 g、山楂40 g、通草10 g、甘草10 g, 大蒜为引, 水煎5次, 生大蒜捣汁后混合一起, 分5次灌服。

参考文献

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