枯草芽孢杆菌（共10篇）
枯草芽孢杆菌 篇1
枯草芽孢杆菌是目前研究最为深入的一种芽孢杆菌, 它能产生多种抗菌物质, 现已广泛应用于医药工业、畜牧业及植物病害防治等领域[1]。且多数菌株对人类和环境都具有很好的安全性, 所以近年来枯草芽孢杆菌成为食物病害防治领域的研究热点, 国内外已有较多报道[2]。而枯草芽孢杆菌活菌制剂的活菌数量是其制剂稳定性的重要保障, 所以微生态制剂中活菌数的降低直接影响其使用效果, 这一问题可以通过提高活菌制剂中的芽孢比例得以缓解[3]。通过调控发酵条件提高发酵液中芽孢的比例, 芽孢具有较好的抗逆性, 可以抵抗外界的环境压力, 可以提高活菌制剂的稳定性, 保证其使用效果[4]。
本研究所用菌株枯草芽孢杆菌B91是本实验室的自有菌株, 能够抑制多种植物病原菌, 具有较好的田间防效, 具有广泛的应用前景。本文对其发酵条件进行优化, 提高其发酵液中菌体密度及芽孢形成率, 为下一步扩大生产打下基础。
1 材料与方法
1.1 实验菌种
枯草芽孢杆菌B91菌株由本实验室提供。
1.2 发酵培养基
葡萄糖9.4 g/L, 酵母膏6.9 g/L, 氯化钠3 g/L, K2HPO42 g/L, MgSO40.2 g/L, MnSO410.2 mg/L, CaCO30.2 g/L, 培养基采用湿热灭菌:121℃, 15 min。
1.3 培养方法
1.3.1 种子活化及培养
种子活化及培养参照文献[5]。
1.3.2 发酵培养
接种量均为1%, 250mL的三角瓶装液量为50m L, 摇床转速为150 rpm, 30℃下培养48 h。
1.4 芽孢计数
沸水浴处理待测样品20 min, 灭活未形成芽孢的营养体, 冷却后采用菌落计数法计数测得样品芽孢数[6]。
1.5 单因素实验
选择装液量、发酵液初始pH值、发酵温度作为主要优化因素, 装液量分别设为30mL、50mL、70mL、90mL, 发酵pH值分别设为5、6、7、8、9, 发酵温度分别设为28℃、31℃、34℃、37℃、40℃。
1.6 响应面分析
采用Box-Behnken设计, 在摇瓶发酵条件下优化三个发酵条件:装液量、pH、温度, 设计3因素3水平的响应面分析试验 (表1) 。
2 结果与分析
2.1 单因素实验
2.1.1 装液量对芽孢数量的影响
在摇瓶发酵过程中, 装液量直接关系发酵液的溶氧系数, 装液量越少溶氧越高, 反之亦然。如图1所示, 摇瓶的装液量对芽孢形成数量影响显著 (P<0.05) , 装液量为50 mL/250m L时芽孢数量最多, 达到40.9亿/mL, 当装液量继续增加时, 由于溶氧降低, 抑制了芽孢的形成, 所以芽孢形成数量减少。
2.1.2 初始p H对芽孢数量的影响
如图2所示, 发酵初始pH值对芽孢形成的影响变化趋势, 当发酵初始pH值在5~7, 芽孢形成数量迅速增加, 而当发酵初始pH值为8时芽孢数量达到最大42.1亿/mL, 随着发酵初始pH值继续增加, 芽孢数量呈逐渐下降趋势, 所以初始pH 8设为响应面试验中心试验点。
2.1.3 发酵温度对芽孢数量的影响
发酵温度影响菌体的生长繁殖, 如图3所示, 发酵温度31℃时芽孢形成数量最多, 为43.5亿/mL, 随着发酵温度的升高芽孢数量呈下降趋势, 所以选择发酵温度30℃进行响应面实验。
2.2 响应面法优化发酵条件
响应面试验结果见表2, 经过多元回归拟合, 获得的芽孢数 (Y) 对X1、X2和X3三个自变量的三元二次回归模型方程:Y=44.54-3.1375A-0.125B+1.2375C-2.625AB-1.7AC+1.625BC-6.17A2-1.595 B2-6.82 C2。利用软件Design Expert 8.0进行求导, 解出极值点, 算出每个因素的最佳值:装液量为44.74 mL、初始pH为8.34、温度为31.52℃, 此时模型的理论最优芽孢浓度为45.18亿/mL。
表3为回归模型方差分析结果, 由结果可知模型是显著的 (P≤0.0001) , 并且决定系数为0.9832, 说明该模型是准确可靠的, 因此, 可用此模型对枯草芽孢杆菌B91的发酵条件进行分析和预测[6,7]。
以回归方程为基础, 采用软件分析绘制两两因素间相应的响应面分析图 (图4~6) , 响应曲面的极值点是两个因素交互的最大值, 根据响应面分析结果, 枯草芽孢杆菌B91菌株芽孢浓度最优极值点为装液量为44.7 mL、初始pH为8.3、温度为31.5℃, 预测最优值为45.18亿/mL。
3 讨论与结论
培养条件对于细菌的繁殖, 尤其是芽孢的产生尤为重要, 在单因素实验中发现最适合B91菌株摇瓶发酵的条件为装液量50 mL/250mL, 初始pH值8, 发酵温度30℃, 在此基础上发酵48h芽孢形成较好为43.5亿/mL。在上述条件基础上设计了响应面实验, 响应回归模型的决定系数为0.9832, 说明该模型拟合程度良好, 最优培养条件为装液量44.74 mL、初始pH 8.34、温度31.52℃。在最优条件下发酵培养, 芽孢浓度为44.89亿±0.29亿/mL与模型的理论最优芽孢浓度为45.18亿/mL相近, 说明该模型拟合的有效性。
摘要：在三角瓶培养条件下, 采用单因素实验对枯草芽孢杆菌B91发酵条件装液量、起始p H值及温度进行了优化。在此基础上进行了响应面分析, 获得了响应面回归模型, 模型拟合良好, 确定了菌株B91最佳的产孢发酵条件为装液量44.7 mL、初始pH8.3、温度31.5℃。在最优条件下发酵培养, 芽孢浓度为44.89亿±0.29亿/mL, 较优化前提高了36.4%。
关键词：枯草芽孢杆菌,芽孢,响应面,发酵条件,优化
参考文献
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枯草芽孢杆菌 篇2
枯草芽孢杆菌FY99-01菌株的净水作用
摘要：以5种模拟的污染水样对枯草芽孢杆菌FY99-01菌株的`净水作用进行了研究.结果表明,该菌株能迅速降解有机物,在不同处理条件下水样的COD值都有明显的下降,48 h COD的去除率达67%以上,96 h厌氧条件下反硝化强度为50.2%,好氧条件下为28.6%,144 h总残渣、过滤性残渣的降解率分别为61.3%和24.1%,96 h降解硫化物达100%.作 者：胡咏梅 葛向阳 梁运祥 HU Yong-mei GE Xiang-yang LIANG Yun-xiang 作者单位：华中农业大学农业微生物学国家重点实验室,武汉,430070期 刊：华中农业大学学报 ISTICPKU Journal：JOURNAL OF HUAZHONG AGRICULTURAL UNIVERSITY年，卷(期)：,25(4)分类号：X52关键词：枯草芽孢杆菌 净水 COD去除率 反硝化 残渣 硫化物
枯草芽孢杆菌 篇3
关键词 枯草芽孢杆菌 ；草莓白粉病 ；田间试验
中国分类号 S436.68 文献标志码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.11.018
Abstract Strawberry powdery mildew is a major disease in qionghai strawberry production ， seriously affecting the production of strawberry. Qionghai strawberry planting during the low temperature， high humidity climate， is advantageous to the strawberry powdery mildew. In this article， through different combination formula discovery： Bacillus subtilis according to 4050 g/hm2 dosage used alone to prevent strawberry powdery mildew control effect was 92.09%， and the incidence of mixed chemicals-luna， do after treatment with， has a fast control effect and the advantages of long effective period.
Keywords Bacillus subtilis ； Strawberry powdery mildew ； Field trials
草莓白粉病由子囊菌门真菌，羽衣草单囊壳菌（Sphaerotheca aphanis）侵染所致，属专性寄生菌，人工离体培养困难[1]，低温、高湿环境下发病严重，主要危害叶片和果实，是草莓生产中常发性主要病害。一般导致减产20%～30%，严重时病叶率在45%以上，病果率50%以上，严重影响草莓的生产[2]。目前，国内外对白粉病的防治仍以化学防治为主，主要包括有机硫类、苯并咪唑类、三唑类和仿生物植物源类[3]。目前，生产上常用的化学杀菌剂有世高、敌力脱、腈菌唑、翠贝、露娜森等[4-8]，长期使用不仅会使病菌耐药性增强，导致用药次数增加，还会影响草莓食用安全。使用枯草芽孢杆菌防治草莓白粉病试验已有报道[9-10]，但在海南气候条件下和草莓栽培模式下，利用芽孢杆菌菌剂防治白粉病尚未见报道。本试验旨在验证芽孢杆菌菌剂对草莓白粉病的防治效果，探讨芽孢杆菌菌剂科学的使用方法，以便为海南草莓的白粉病防治提供有效的防治措施。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试作物
红颜（红脸颊）。
1.1.2供试药剂
保翠（枯草芽孢杆菌含量≥109个/mL，水剂），北京中农思科生物科技有限公司提供；露娜森（42.8%氟吡菌酰胺·肟菌脂，悬浮剂）由拜耳作物科学（中国）有限公司提供。
1.1.3 试验地点及土壤肥力
试验设在海南省琼海市嘉积镇温泉村草莓种植地；土壤类型：水稻土；土壤肥力中等，具体指标见表1。
1.2 方法
1.2.1 试验设计
草莓于2015年11月25日定植，成活后采用黑色塑料覆盖，株行距18 cm×20 cm。
试验采用随机区组设计，3次重复，每个小区面积24 m2，小区间设保护行，试验设7个处理。处理1：对照（CK），喷施清水；处理2：露娜森0.45 L/hm2（3次）；处理3：露娜森0.45 L/hm2+保翠2.7 L/hm2（1次）、保翠2.7 L/hm2（2次）；处理4：露娜森0.45 L/hm2（1次）、保翠2.7 L/hm2（2次）；处理5～7依次为保翠4.05、2.7、1.35 L/hm2（3次）。常规喷雾，药液对水量675 L/hm2，均匀喷施叶片正反面，连用3次，前2次间隔3 d，第2次与第3次间隔7 d。试验期间不使用其他药剂防治病害。
2016年1月16日第2批草莓顶果采摘盛期，部分果实刚出现白粉病时使用，在下午4～5点开始进行叶面喷施。
1.2.2 调查与计算
1.2.2.1 试验调查时间
分别于施药前1 d、第1次药后3 d、第2次药后7 d、第3次药后7 d和14 d共5次调查草莓的发病情况。
1.2.2.2 调查内容
每小区采用对角线五点取样法，每点调查5株，每株调查全部叶片，每片叶按病斑面积占叶面积的百分比分级，记录调查总叶数和各级病叶数。
1.2.2.3 分级标准及防效计算
0级：无病；1级：病斑面积占叶片面积的5%以下；3级：病斑面积占叶片面积的6%～10%；5级：病斑面积占叶片面积的11%～25%；7级：病斑面积占叶片面积的26%～5O%；9级：病斑面积占叶片面积的51%以上。按如下公式计算病情指数和防治效果：
病情指数=∑（各级病叶数×相对级数值）/（调查总叶数×9）×100
防治效果（%）=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100%
2 结果与分析
nlc202309080856
2.1 保翠芽孢杆菌菌剂对草莓白粉病的防治效果
试验结果见表2。
由表2可知，第1次施药后3 d，各处理平均病情指数均显著降低，分别由药前12.22、12.35和12.15、12.24、12.39和12.15下降至3.51、3.46、3.42、5.02、6.08和8.22。相对防治效果分别达到76.11%、76.45%、76.72%、65.83%、58.61%和44.04%。其中，用露娜森处理病情指数显著降低，防效也达到76%以上。但单独使用露娜森或者露娜森与保翠混配，在用后3 d防效无差异。单独使用保翠芽孢杆菌菌剂，表现出随着使用浓度增加，病情指数和防效改善越明显，但同使用露娜森相比，防治效果滞后，这主要是由于在自然状态下，除成熟叶片和老叶片表面均有菌丝和孢子生长附着外，同一株新稍幼嫩、未见发病的叶片上也有病原菌的存在[11]。因此，芽孢杆菌菌剂要在草莓叶片上发挥作用，必须要快速大量扩繁才能形成局部菌群优势。这需要一定的时间，因此，在短期内，草莓叶片上病原菌仍处于优势地位，所以表现出防效不明显。已有试验发现，叶片喷施保翠芽孢杆菌菌剂3 d后再喷施1次，能加快菌剂的扩繁速度和数量，加快有益菌在草莓叶片上形成优势菌群，从而发挥作用。由病情指数的变化可以看出，白粉病随着发生时间的延长，病害发生程度加重，对照区白粉病病情指数由逐渐加重。
第2次施药后7 d观察，各处理病情指数均显著降低，其中使用露娜森处理防效提高到90%以上，其中以处理3效果最好，其主要原因在于，由于保翠芽孢杆菌菌剂形成了芽孢，对杀菌剂、高温、射线均具有明显的防护作用。因此，把露娜森按使用倍数稀释后加入保翠芽孢杆菌菌剂，混匀后叶面喷施，由于露娜森能直接杀死病原菌，从而减少病原菌对保翠芽孢杆菌菌剂的竞争和抑制作用，待露娜森杀菌剂作用减弱后，保翠芽孢杆菌菌剂中的孢子开始萌发，由于病原菌大部分被杀死，不会对保翠芽孢杆菌菌剂的扩繁带来阻碍，从而加快菌剂的快速繁殖，进而发挥菌剂对病原菌的竞争作用和抑制效果。处理4是先用露娜森杀菌后，在第3天再单独使用保翠芽孢杆菌菌剂，尽管露娜森能杀死叶片的大部分病原菌，但由于需要间隔3 d才使用保翠芽孢杆菌菌剂，在这3 d草莓叶片最初被露娜森杀死的病原菌又重现开始萌发。因此，在叶片上又有可能形成局部优势菌群，从而抑制保翠芽孢杆菌菌剂的扩繁，造成防治效果下降。本试验由于第1、2次用药间隔期短，因此，处理4与处理3相比差异不明显。处理2单独使用露娜森，尽管防治效果同处理3、4相当，但由于2次施药间隔期短，对草莓造成一定药害，具体表现在畸形果多，叶片略有卷缩。
第2次施药后，单用保翠芽孢杆菌菌剂防效明显上升，一般随着使用浓度的增加，防效也在增加，具体表现为：处理5>处理6>处理7，其中，处理5和处理6防效相近，但均显著高于处理7。
第3次施药后7 d观察，单用露娜森防效较第2次施药略有降低，这主要是由于后期草莓白粉病危害加重，露娜森持效期降低，间隔7 d使用病原菌又开始在叶片表面蔓延，造成防效降低。其余处理由于后期全部采用保翠芽孢杆菌菌剂防治，因此，随着使用次数增加，防治效果更加明显；使用浓度越高，防效越明显；相同浓度处理，不管前期是否使用露娜森，最终的防效相近。
第3次施药14 d观察，随着用药间隔期的延长，各处理草莓白粉病防效均明显下降。其中处理2单用露娜森后，第14天病情指数达到27.32，防效仅有41.04%。使用保翠芽孢杆菌菌剂处理，防效尽管也有下降，但同處理2相比，降幅要小得多。说明使用保翠芽孢杆菌菌剂处理，能显著提高草莓对白粉病的抵抗能力和持效期。从总体来看，使用保翠芽孢杆菌菌剂可以显著改善草莓对白粉病的防效，总的来看，处理3不仅能快速提高草莓对白粉病的防治效果，而且持效期长达14 d以上，值得在草莓种植区大面积推广。
2.2 芽孢杆菌菌剂对草莓生长的影响
调查草莓在试验处理期间各处理的草莓产量，统计商品果率，估算每公顷产量（见表3）。
从表3可以看出，处理3（露娜森与保翠芽孢杆菌菌剂第1次混配，以后2次单用保翠芽孢杆菌菌剂）产量、商品果率和净收益均明显高于其他各药剂处理。单独使用露娜森尽管初期防效最好，但随着时间延长，防效降低，表现在草莓长势较差，出现早衰症状。单独使用保翠芽孢杆菌菌剂，尽管防效较慢，但持效期长，同时还能改善草莓叶片光合作用，根系生长良好，抗旱、耐寒能力增加，除处理7外，商品果率均达到85%以上。处理7由于芽孢杆菌菌剂用量不够，因此在整个生育期均表现出防治效果不突出，叶片黄化严重，产量和商品率均明显降低。
露娜森按100 mL 92元，保翠芽孢杆菌菌剂按200 mL 30元计。
3 结论与讨论
化学药剂和芽孢杆菌菌剂用于防治草莓白粉病均具有明显效果，但二者各有优缺点。其中单独使用化学药剂尽管见效快，但持效期短，导致使用次数增加。芽孢杆菌菌剂尽管防治效果好，持效期长，但前期见效慢，单独使用需要加大用量，这又会加大种植者投入。
因此建议生产中草莓白粉病预防，可以按照2.7 L/hm2的量单独使用；治疗可在田间果实发病初期与露娜森混合使用，在露娜森按2 000倍稀释后最后加入保翠芽孢杆菌菌剂，同时在前2次使用时，施药间隔期以不超过3 d防效最佳，视田间病情发展施用2～3次。
保翠芽孢杆菌菌剂合理使用，能提高单位面积产量和商品果率，增产增收效果明显。保翠芽孢杆菌菌剂用于草莓白粉病防治，在白粉病发生前使用，效果优于发病后，芽孢杆菌的用量和使用次数均明显减少。但本试验由于侧重探讨芽胞杆菌与杀菌剂的合理配合方法，再加上无法准确判断白粉病发生的准确时间，因此本次试验未进行这方面的系统研究。从防治效果来看，一般在果实刚出现白粉病1～2 d时使用效果更明显。
参考文献
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枯草芽孢杆菌扩培工艺 篇4
1 材料与方法
1.1 菌种、试剂及设备
菌种:枯草芽孢杆菌由三门峡龙飞生物工程有限公司保存。
主要试剂:牛肉膏, 蛋白胨, 氯化钠, 淀粉, 硫酸锰, 玉米粉, 等。
主要设备:隔水式电热恒温培养箱, HZQ-Q振荡器, 立式压力蒸汽灭菌锅。
1.2 菌株的筛选
从购买及实验室保存的枯草芽孢杆菌斜面, 挑去少许菌落划线于促芽孢形成培养基 (牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL) 平皿上, 37 ℃培养20 h左右取出。选择大菌落挑到装有5 mL无菌水的试管中, 震荡均匀后, 置100 ℃水浴中加热15 min, 再涂布于促芽孢形成培养基的平皿上培养, 反复多次。最后选取平皿上的大菌落, 转接到促芽孢培养基的试管斜面上, 37 ℃培养20 h左右拿出放入4 ℃冰箱保存备用。
1.3 发酵培养基优化
通过对培养基碳源、氮源等的选择及配比的正交试验, 确定出最适合枯草芽孢杆菌产芽孢的培养基。
1) 首先选择4种不同培养基进行摇瓶培养, 观察比较活菌数和芽孢形成情况。
2) 培养基的配制:①号培养基为淀粉0.5%+玉米粉1.3%+黄豆粕2.0%+葡萄糖0.5%+碳酸钙0.7%+硫酸铵0.1%+磷酸氢二钾0.3‰+硫酸镁0.2‰;②号培养基为淀粉0.5%+玉米粉1.3%+黄豆粕2.0%+葡萄糖0.5%+碳酸钙0.7%+硫酸铵0.1%+磷酸氢二钾0.3‰+硫酸镁0.2‰+硫酸锰0.2‰+淀粉0.3%;③号培养基为牛肉膏0.3%+蛋白胨1.0%+葡萄糖1.0%+氯化钠0.5%;④号培养基为牛肉膏0.3%+蛋白胨1.0%+葡萄糖1.0%+氯化钠0.5%+硫酸锰0.2‰+淀粉0.3%。
以上4种培养基pH均为7.0～7.2, 且每种培养基各做3瓶, 装液量100 mL/500mL三角瓶, 置立式压力蒸汽消毒器中, 于121 ℃灭菌30 min, 取出备用。
3) 摇瓶种子液制备:将保存的应用菌种在无菌室内接入肉汤培养基中, 在37 ℃、200转/min的摇床上震荡培养12 h。
4) 接种和培养:培养好的种子液以10%接种量, 分别接入4种不同培养基中, 37 ℃振荡培养, 每隔12 h检测1次, 36 h结束培养, 此过程重复3次。
5) 正交试验:将摇瓶结果较好的培养基作为基本培养基, 设计4个因素、3个水平的正交试验, 以进一步优化培养基配比 (培养36 h检测活菌数) 。正交试验设计见表1 (所用培养基中其他营养成分不变) 。
1.4 三角瓶摇瓶模拟发酵罐试验
以摇床正交试验得出的最佳培养基, 进行100 mL/500mL三角瓶摇瓶震荡培养, 并与肉汤培养基培养的进行2次比较试验。
发酵培养条件:培养基121 ℃灭菌30 min, 培养温度37 ℃, 搅拌速度200转/min, 当芽孢率达到80%以上时, 发酵结束, 此试验重复2次。
1.5 吸附载体的筛选
首先选择4种不同载体配比进行吸附试验比较, 4种载体配比后, 置高压蒸汽锅中121 ℃灭菌1 h, 全部按照最终10亿/g含菌量进行吸附, 然后按照最终观察活菌数情况, 进行正交试验, 得出最佳吸附载体。
2 结果与分析
2.1 菌株筛选前后对比
筛选前后种子作对比:从冰箱中拿出筛选前、后的种子斜面各1支, 分别接入1环装有肉汤培养基的三角瓶中, 在37 ℃、每分钟200转的摇床上震动培养, 每12 h涂片观察1次, 培养36 h, 记录活菌数和芽孢率, 此过程重复3次, 结果如图1所示。
菌株优化3次后:在相同的培养时间内 (36 h) , 芽孢形成率由原先的约30%提高到约95%, 活菌数也由原来的8亿/mL提升到15亿/mL。
2.2 发酵培养基优化结果
1) 摇床试验的结果见表2。
摇床试验所确定的4种培养配方依次是:①号培养基为普遍应用于培养细菌的培养基配方;③号培养基为经验配方;②号和④号培养基配方分别是在①、③号培养基的基础上添加0.3%的淀粉和0.2‰的硫酸锰而成。通过本试验证明, 淀粉和锰离子对芽孢形成有促进作用。②号培养基要明显优于其他3种培养基的配比, 培养到36 h芽孢率可达到96.0%以上, 活菌数可达到16.0亿/mL, 固我们选择②号培养基作为基本培养基进行正交试验。
2) 正交试验结果, 见表3。
由表3可见, 影响因素为:硫酸锰>豆粕>葡萄糖>淀粉。适宜条件为:葡萄糖0.5%, 淀粉1.0%, 黄豆粕3.0%, 硫酸锰0.2‰, 磷酸氢二钾0.3‰, 硫酸镁0.2‰, 碳酸钙0.7%, 硫酸铵0.1%。
2.3 三角瓶摇瓶模拟发酵罐试验结果
以摇床正交试验得出的最佳培养基, 与肉汤培养基培养的进行2次比较试验, 结果基本稳定。芽孢生成率对比结果, 如图2所示;活菌数对比结果, 如图3所示。
由图2、3可见, 采用优化培养基培养的结果比肉汤培养基有很大提高。主要体现在:①发酵周期缩短了12 h, 在发酵生产中降低了能耗, 且可提高年产量;②最终活菌数提高了约46.70%, 芽孢形成率高, 菌体死亡率较优化前低20.76%。
2.4 吸附载体筛选结果
吸附载体筛选的正交试验结果, 见表4。
注:麸皮、米糠、沙子、碳酸钙的细度都在80目以上。
由表4正交试验结果可见, 影响活菌因素为:米糠>麸皮>碳酸钙>沙子;最佳吸附载体配比为:麸皮25.0 g+沙子20.0 g+碳酸钙45.0 g。
以正交试验得出的最佳吸附载体配比, 与麸皮25.0 g+沙子25.0 g+碳酸钙45.0 g这个配比进行2次比较试验。试验结果经计算后分别为:最佳吸附载体有效活菌数8.9和9.1亿/g, 麸皮25.0 g+沙子25.0 g+碳酸钙45.0 g载体有效活菌数6.7和7.0亿/g。从结果看, 最佳吸附载体活菌数要比对比吸附载体有效活菌数高。
3 讨 论
1) 枯草芽孢杆菌扩培工艺最佳条件为:最佳发酵培养基葡萄糖0.5%+淀粉1.0%+黄豆粕3.0%+硫酸锰0.2‰+磷酸氢二钾0.3‰+硫酸镁0.2‰+碳酸钙0.7%+硫酸铵0.1%。
2) 最佳吸附载体配比为:麸皮25.0 g+沙子20.0 g+碳酸钙45.0 g。
3) 枯草芽孢杆菌在工业水处理、农业领域、畜禽养殖3方面都有广泛的应用, 是一种多功能的有益菌剂。
摘要：本研究课题是从实际生产出发, 以一株枯草芽孢杆菌为研究对象, 通过对培养基碳源、氮源等的选择及配比的正交试验, 确定出最适合枯草芽孢杆菌产芽孢的培养基, 再通过对吸附载体配比的正交试验, 确定出最佳枯草芽孢杆菌液体吸附载体, 为发酵生产过程中枯草芽孢杆菌生产工艺提供参数。结果发现, 枯草芽孢杆菌扩培工艺最佳条件为:最佳发酵培养基葡萄糖0.5%+淀粉1.0%+黄豆粕3.0%+硫酸锰0.2‰+磷酸氢二钾0.3‰+硫酸镁0.2‰+碳酸钙0.7%+硫酸铵0.1%;最佳吸附载体配比麸皮25.0g+沙子20.0g+碳酸钙45.0g。试验表明, 当培养基配方为葡萄糖0.5%、淀粉1.0%、黄豆粕3.0%、硫酸锰0.2‰、磷酸氢二钾0.3‰、硫酸镁0.2‰、碳酸钙0.7%、硫酸铵0.1%, 优化的培养基条件能有效促进枯草芽孢杆菌生长, 并能促进枯草芽孢杆菌芽孢的生成。
关键词：枯草芽孢杆菌,扩培工艺,吸附载体,培养基,正交试验,发酵培养,益生菌剂
参考文献
[1]吴俊罡, 张秉胜, 刘吉华, 等.枯草芽孢杆菌发酵培养基优化培养实验[J].国外畜牧学:猪与禽, 2003, 23 (3) :31-33.
[2]王妹, 陈有光, 段平, 等.枯草芽孢杆菌培养基配方优化的研究[J].渔业现代化, 2008, 35 (6) :44-47.
[3]俞渭江.生物统计附试验设计[M].北京:北京农业出版社, 1991.
枯草芽孢杆菌 篇5
关键词：枯草芽孢杆菌；黄瓜；促生作用；萌发；生长
中图分类号： S642.201 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）07-0158-03
黄瓜原产于印度的热带潮湿森林地带，自传入中国后已有2 000多年的栽培历史，深受人们的喜爱[1]。长期以来，白粉病是困扰黄瓜生产的重要病害之一，黄瓜白粉病每年5—6月大面积暴发[2]，在黄瓜幼苗和成株期均可发生，常造成重大经济损失[3]。长期以来，白粉病主要依靠化學药剂进行防治。但大量使用化学农药会引起环境污染、药物残留增加、病原菌抗药性提高等社会问题。随着生态农业及无公害食品产业的兴起，使人们倍加关注无污染、无残留、对有益微生物无影响的植物病害防治方法[4]。本试验从黄瓜根际土壤筛选出2株枯草芽孢杆菌H1、H2，用其菌悬液对黄瓜种子进行浸种、灌根后，对其萌发情况、幼苗期与花期植株的氮、磷、钾、叶绿素含量进行初步探索，旨在为黄瓜的无公害生产提供一条可行途径，为植物病害的防治和生物农药的大规模开发提供理论与实践依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试黄瓜品种为长春密刺，由昌吉市亚华种苗有限责任公司生产。供试菌株：枯草芽孢杆菌H1、H2从黄瓜根际土壤分离得到。80%多菌灵可湿性粉剂：石家庄亚润科技有限公司产品。
1.2 菌悬液的制备
1.2.1 供试培养基
选用LB培养基。配方：NaCl 10 g、胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、琼脂15 g、蒸馏水 1 000 mL、pH值7.0～7.2。
1.2.2 枯草芽孢杆菌的培养及菌悬液的制备
（1）平板培养：将枯草芽孢杆菌H1、H2分别接种于LB平板上，28 ℃培养24 h，保存备用。
（2）菌悬液的制备：将培养好的菌株平板内各加入若干无菌水，用已灭菌的接种环轻轻刮去上层菌层，将同一菌株的菌悬液置于150 mL 三角烧瓶中，稀释成 108 CFU/mL 浓度的菌悬液即为原液，用已灭菌的移液管移取菌液，制备成10、50、100、1 000倍稀释液保存备用。
1.3 枯草芽孢杆菌各菌株菌悬液对黄瓜种子萌发的影响
将黄瓜种子放入铺有灭菌滤纸的培养皿内，每皿20粒，分别加入枯草芽孢杆菌系列菌悬液、80%多菌灵可湿性粉剂1 800倍液各 5 mL，以5 mL无菌水处理为对照，28 ℃培养，蒸发损失的水以无菌水补充。每个处理3次重复。分别于24、48、96 h统计萌发率，测量胚根、胚轴长度，称量幼苗鲜重[6]。
1.4 枯草芽孢杆菌H1、H2菌悬液对黄瓜幼苗的影响
试验地点在塔里木大学植物科学学院园艺站温室大棚。将种子分成12组，每组120颗，将每组种子分别浸入枯草芽孢杆菌系列菌悬液、80%多菌灵可湿性粉剂1 800倍稀释液以及无菌水中，于培养箱中28 ℃培养12 h后播种（10月14日）。生长35 d后（11月18日）统计出苗率、植株株高、根系长度及植株的鲜重；取第2对真叶测定氮、磷、钾和叶绿素含量。
1.5 氮、磷、钾和叶绿素含量的测定
氮含量采用凯氏定氮法测定。磷含量采用H2SO4-H2O2消化-钒钼黄比色法测定。钾含量采用H2SO4-H2O2消化-火焰光度法测定[5]。叶绿素含量用叶绿素计于拔苗之前测定。试验测得的所有数据均用DPS进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 黄瓜种子萌发情况统计
各处理浸泡后的种子萌发率、胚根胚轴的长度以及幼苗鲜重如表1和图1所示。种子在清水中发芽情况最好，在 24 h 时已全部萌发，生长96 h后H1 10、50倍稀释液，H2 100、1 000倍稀释液条件的种子全部萌发。H2各处理和80%多菌灵可湿性粉剂处理的种子胚根长均低于对照，H1的50、100倍稀释液处理的胚根分别长于对照27.84%、3299%。H1、H2的50、100倍稀释液处理后的种子胚轴长度和幼苗鲜质量均高于对照。此结果表明，H1和H2各稀释液对种子的萌发具有抑制作用，50、100倍菌体稀释液对胚轴长度和幼苗鲜质量有促进作用。
2.2 幼苗期黄瓜各项指标测定结果
2.2.1 株高、根系长度、单株鲜质量、出苗率的统计
处理后的黄瓜幼苗株高、根长、平均鲜质量及出苗率如表2和图2所示。各处理的株高均高于对照，其中H1的100倍液处理的幼苗株高比对照增加了53.85%。H1和H2的100倍液处理的根系长度明显高于对照，其他处理低于对照。除H2的1 000倍稀释液，其他各处理的单株鲜质量均高于对照，其中H1的100倍液处理的高于对照70.90%。H2原液和H1的100倍液处理的出苗率分别高于对照119.00%和73.36%。
2.2.2 氮含量的测定
各处理黄瓜幼苗叶片的含氮量如表
3所示。菌株H2的10倍稀释液和80%多菌灵可湿性粉剂 1 800倍液处理的黄瓜氮含量高于对照，其他处理均低于对照，其中H2的10倍稀释液与对照在5%水平差异显著。
2.2.3 磷含量的测定
磷含量测定结果如表4所示。各处理叶片中的磷含量均高于对照，且经DPS数据分析在5%水平均无显著差异，说明各处理间磷含量无明显差异。
2.2.4 钾含量的测定
火焰光度法测得黄瓜叶片的钾含量如表5所示。H2原液处理的叶片钾含量略低于对照，其他处理均高于对照，其中H1的50倍稀释液处理与对照差异最显著。
2.2.5 叶绿素含量的测定
不同处理黄瓜幼苗叶片中叶绿素含量如表6所示。除H2的1 000倍液和多菌灵处理的叶
3 结论与讨论
本试验表明，枯草芽孢杆菌对种子的萌发具有抑制作用，且浓度越高抑制作用越大，而100倍稀释液对植株的生长和干物质的积累具有促进作用。
黄瓜幼苗期试验结果表明，经枯草芽孢杆菌H1和H2各稀释液处理后的黄瓜叶片，其磷、钾和叶绿素含量与对照相比都有所增加，氮含量没有明显增加。
叶绿素的光合产物为叶的生长代谢提供了足够的能量，同时，叶绿素含量直接影响植物的光合作用能力和干物质的积累。磷与细胞分裂及有机物的合成、转化、运输都有密切关系。钾能促进光合作用顺利进行及光合产物的转移，增加植株叶面积[6-7]。各物质之间的功能相辅相成，互相影响。经过处理的幼苗平均鲜质量高于对照，并且磷、钾和叶绿素含量均高于对照，在田间也发现经枯草芽孢杆菌处理的植株较为丰盈茁壮，长势较好。以上结果说明枯草芽孢杆菌可促进植物光合作用以及吸收矿质元素、水分的能力。
枯草芽孢杆菌用于生物防治已十分广泛，截至2005年，美国已有5株枯草芽孢杆菌（B.subtilis）获得环保局（EPA）商品化或有限商品化生产应用许可[8]。运用B.subtilis防治黄瓜白粉病也有不少报道。2007年Romero报道B.subtilis对瓜类白粉病的防效与杀菌剂醚菌酯相同[9]。同年Romero又报道B.subtilis产生的脂肽类代谢产物对瓜类白粉病具有抑制作用[10]。胡健2012年研究发现枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对黄瓜白粉病防效显著[11]。李宝庆研究证明枯草芽孢杆菌CAB-1产生的挥发性物质对黄瓜白粉病防效高于80%[12]。以上研究报道表明，枯草芽孢杆菌为黄瓜白粉病的防治提供了新的途径。
本试验从植物生理角度揭示了枯草芽孢杆菌的抗菌机理，为进一步利用枯草芽孢杆菌防治黄瓜病害奠定了一定基础。
参考文献：
[1]徐 宁. 塑料大棚黄瓜白粉病和霜霉病流行预测和管理系统的研究[D]. 南京：南京农业大学，2003.
[2]黄仲生，张芝莉. 黄瓜病虫害识别与防治[M]. 北京：中国农业出版社，2002.
[3]刘 峰. 黄瓜白粉病的发生规律及综合防治措施[J]. 上海蔬菜，2008（4）：75-76.
[4]鄭 莉，梁建根，施跃峰. 生防菌ZJH-10对黄瓜灰霉病诱导抗性的研究[J]. 中国农学通报，2009，25（3）：197-201.
[5]华东师范大学生物系植物生理教研组. 植物生理学实验指导[M]. 上海：人民教育出版社，1982：56-158.
[6]陆景陵. 植物营养学：上册[M]. 北京：中国农业大学出版社，2010.
[7]胡霭堂. 植物营养学：下册[M]. 北京：中国农业大学出版社，2003.
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[10]Romero D，Vicente A，Olmos J L，et al. Effect of lipopeptides of antagonistic strains of Bacillus subtilis on the morphology and ultrastructure of the cucurbit fungal pathogen podosphaera fusca[J]. Journal of Applied Microbiology，2007，969-976.
[11]胡 健，仇广灿，成晓松. 枯草芽孢杆菌WP防治黄瓜白粉病药效试验[J]. 上海蔬菜，2012（1）：58-59.
枯草芽孢杆菌 篇6
1 材料与方法
1.1 菌种。
枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 黑龙江省科学院微生物研究所保藏。
1.2 培养基。
1.2.1通用培养基。葡萄糖20.0g+牛肉膏0.5g+蛋白胨15g+氯化钠5g+蒸馏水1L。1.2.2改良培养基。在通用培养基配方的基础上, 增加培养基的碳源和氮源, 由麸皮作碳源、豆饼粉作氮源, 制备成不同密度梯度的培养基。设5个处理:麸皮1.0%+豆饼粉0.5%;麸皮1.0%+豆饼粉1.0%;麸皮1.5%+豆饼粉1.0%;麸皮1.5%+豆饼粉1.5%;麸皮2.0%+豆饼粉1.0%。
1.3 仪器设备。
电子天平, p H计, 上海产, 型号DELTA320;电热鼓风干燥箱, 上海产, 型号101A-3;电热恒温培养箱, 上海产, 型号DHP-9162;垂直流超净工作台, 上海产, 型号2HJH-1112;显微镜, 日本产, 型号Nikon-YS100;手提式高压灭菌锅, 哈尔滨市医疗器械厂制造;可控温式摇床, 哈尔滨市东联科学仪器厂制造。
1.4 方法。
1.4.1菌种活化。将保存的枯草芽孢杆菌移接到斜面试管培养基中, 在恒温培养箱37±1℃培养24 h。1.4.2种子液的制备。取一环已活化完成斜面菌种接入到三角瓶种子培养基中, 500 m L三角瓶中, 装量为100m L种子培养基, 37±1℃, 180 r/min, 摇床中震荡培养24h。1.4.3菌株发酵培养。取1m L培养好的种子液, 以2%的接菌量 (即在每100ml的液体培养基中接入2ml浓度为1x109cfu/ml的发酵液) 分别接入到15个 (每种培养基3个) 装有100 m L发酵培养基的500m L三角瓶中, 37±1℃, 180r/min, 摇床中振荡培养。1.4.4测定方法。将各摇瓶中的发酵液分别在不同时间取样, 用镜检法结合平板活菌计数法, 测定各个时间发酵液中的菌体变化及菌体数量[5]。
2 结果与分析
2.1 菌株在通用培养基中的培养。
将制备好的菌种接种于灭菌的枯草芽孢杆菌通用液体培养基上, 180r/min, 37℃条件下培养, 分别在24h, 36h, 48h, 60h, 72h时取样, 显微镜直接计数法结合平板稀释计数法测定菌体数量, 见图1。
从图1结果可见, 培养时间在24-60h, 菌体数量呈现上升趋势, 在培养至60h时最多, 达6.9×108/ml。此后便不再生长, 菌体开始衰亡, 60-72h, 菌体数量逐渐下降。
2.2 菌株在改良培养基中的培养。
将制备好的菌种接种于灭菌的5个不同处理的液体培养基上, 180r/min, 37℃条件下培养, 分别在24h, 36h, 48h, 60h, 72h时取样, 显微镜直接计数法结合平板稀释计数法测定菌体数量, 结果见图2。
从图2结果可见, 在增加了碳源和氮源以后, 菌体数量在各个时间段均有所增加, 增量最大的是处理3, 菌体数量在培养至60h时达到18.29×108/ml。本研究在对几种配方多次试验基础上进行筛选试验, 最终确定了通用培养基+豆饼粉1.5%+麸皮1.0%为最佳的枯草芽孢杆菌培养基配方, 即改良的枯草芽孢杆菌培养基。
3 结论
对于培养基的选择应该遵循原料取材方便, 来源广泛, 价格低廉的原则, 酵母膏、酵母粉这类药品成本较高, 不适用于工业化生产。本研究在通用培养基中添加了不同比例的的工农业副产品———豆饼粉和麸子粉, 即适量的碳源和氮源, 根据发酵过程中枯草芽孢杆菌菌体数量的变化, 得到最佳培养基配方, 即通用培养基+1.5%豆饼粉+1.0%麸皮, 利用这一配方, 生产出了成本低廉、菌活数达18亿/ml以上的枯草芽孢杆菌菌剂, 达到了促进枯草芽孢杆菌菌株生长的目的, 增加了发酵液中菌体数量和代谢产物, 为工业化发酵生产和大面积推广应用提供充足的、廉价的微生物菌体及发酵菌液。
参考文献
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[2]何红, 蔡学清, 关雄等.辣椒内生枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) BS-1和BS-2防治辣椒炭疽病研究[J].植物病理学报, 2003b, 33 (2) :170-173.
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枯草芽孢杆菌 篇7
由于生防微生物在田间条件下易受土壤温湿度、pH值、作物生长状况及土壤生态系统等微环境因素的影响,防治效果不稳定,用于大面积推广应用风险太大。因此,大多数枯草芽孢杆菌的生防研究总体上还处于实验室阶段[11,12,13,14,15,16]。为了解决这一问题,目前主要采用与化学农药复配防病和与其他拮抗微生物协同防病这两种措施。
与化学农药复配防病是通过使用化学药剂来帮助枯草芽孢杆菌克服在土壤生态环境里定殖的过程中与其它微生物群落竞争,从而形成优势种群,使之有足够的群体数量来克服包括病原菌在内的土壤习居微生物的排斥,保持其在植物根、叶周围定殖、分泌抗生素、诱导植物抗病性等作用,同时发挥化学药剂杀虫抑菌速度快、防治效果稳定的优势,通过复配协同作用达到优势互补、用量减少、防效增强的目的[16,17,18,19,20,21]。
1 材料与方法
1.1 供试菌株和虫源
枯草芽孢杆菌由本实验室分离保存。
供试的虫种为菜青虫,黑龙江省科学院生物肥料研究中心室内常年累代饲养多代敏感虫种。
1.2 培养基
斜面培养基:LB培养基(蛋白胨10%,酵母浸粉5%,Na Cl 5%,蒸馏水,pH值自然)。
种子培养基:蛋白胨1%,酵母浸出物0.5%,氯化钠1%,自然p H值。
发酵培养基:蔗糖1%,蛋白胨1%,磷酸氢二钠0.2%,磷酸二氢钠0.2%,pH 7.0。
1.3 菌种活化
将保存的菌种转接到斜面培养基,37℃培养24h,备用。
1.4 种子液的制备
取一环活化的菌种,接入装量为50 m L种子培养基的250 m L三角瓶中,37℃,180 r/min培养18h。
1.5 摇瓶培养
取1 m L种子液,接入盛有50 m L发酵培养基的200mL三角瓶中(接种量为2%,V/V)。置摇床中,30℃振荡培养12h,转速为160 r/min,进行发酵。
1.6 枯草芽孢杆菌生长曲线的测定
取培养好的斜面,用接种环挑3环接种于盛有50mL无菌种子培养基的250mL三角瓶中,采用摇瓶发酵培养条件振荡培养24h。自接种后每2h取样1次测定菌液的OD(600 nm),用未接种的培养基作为空白对照。
1.7 杀虫活性物质的酸碱稳定性测定
取发酵液10 m L进行杀虫实验,再用稀HCl或稀Na OH将其p H值调至2.0,3.5,4.0,5.0,6.5,8.0,9.5,11.0,静置24 h后,再调pH值为原发酵液的pH值6.8后,进行杀虫活性测定。
2 结果与分析
2.1 生长曲线的测定
生长曲线图见1,发酵培养0～2 h为枯草芽孢杆菌的生长停滞期,细菌数量极少;自2h以后进入对数生长期,菌体数量急剧增多;在12h达到生长高峰期,8～12h为枯草芽孢杆菌生长的稳定期,菌体生长缓慢。自12h后细菌数量开始减少,枯草芽孢杆菌进入生长衰亡期。因此,采用8～12h时的菌液作为菌种较合适,此时枯草芽孢杆菌为对数生长末期,既可保持高的细胞活力,又可获得尽可能多的细胞数。
2.2 杀虫活性物质的酸碱稳定性
枯草芽孢杆菌发酵液在pH值为2.0～11.0的条件下处理24 h后,进行杀虫性试验,试验结果见表1。
注:以上试验结果是三次试验结果的平均值
2.3 讨论
研究结果表明,枯草芽孢杆菌的杀虫作用主要有两种方式,一是造成细胞畸形,出现囊泡、肿胀,继而崩溃融解。二是对细胞壁的破坏,造成原生质从细胞壁融解处泄漏,以至消融。
3 结论
通过实验可以得出枯草芽孢杆菌在不同的时间处在不同的生长时期,经实验分析得出枯草芽孢杆菌在8～12h为生长的稳定期,菌体生长缓慢。自12h后细菌数量开始减少,枯草芽孢杆菌进入生长衰亡期。因此,采用8～12 h时的菌液作为菌种较合适,此时枯草芽孢杆菌为对数生长末期,既可保持高的细胞活力,又可获得尽可能多的细胞数。
枯草芽孢杆菌在生猪养殖中的应用 篇8
1 枯草芽孢杆菌作用机理及使用效果
1.1 耗氧产酸, 调节肠道微生态平衡, 达到预防腹泻、下痢等疾病
枯草芽孢杆菌在生长过程中耗氧, 造成肠道低氧, 并产生丙酸、丁酸等有机酸降低肠道内PH值, 促进有益厌氧菌如乳酸菌、双歧杆菌等的生长, 同时抑制肠道病原细菌如大肠杆菌、沙门氏菌等的生长繁殖, 提高有益微生物在肠道细菌种间的竞争优势, 达到预防猪腹泻及下痢的目的。
1.2 分泌多种酶类, 提高饲料消化利用率
枯草芽孢杆菌可分泌多种酶如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、葡聚糖酶等, 降解动植物性饲料中复杂有机物, 促进消化吸收, 提高饲料利用率。
1.3 产生多种营养素, 参与机体新陈代谢
枯草芽孢杆菌在动物肠道内生长繁殖, 能产生维生素、促生长因子和蛋白多肽类抗菌物质等多种营养物质, 还可以提高动物对钙、磷的利用率, 参与机体的新陈代谢。减少粪便中氮、磷、钙的排泄量, 减少有害气体排放, 降低养殖场所氨气、吲哚等有害气体的浓度, 减轻粪便臭味, 改善养殖环境。
1.4 提高动物免疫力
枯草芽孢杆菌能够刺激动物免疫器官的生长发育, 激活淋巴细胞, 提高免疫球蛋白和抗体水平, 通过淋巴循环活化全身的免疫防御系统, 提高动物免疫力和抗病力。同时缓解厌食, 生长缓慢等应激反应。
2 枯草芽孢杆菌用法用量
2.1 直接饲喂
直接饲喂包括两种使用方法, 直接饲喂枯草芽孢杆菌要注意添加量, 并不是添加得越多越好, 但量太少也不起作用, 添加得多, 一来增加成本, 二来太多的菌也不起作用。
2.1.1 第一种方法, 拌料时添加到饲料里, 也是使用最为方便且利用最充分的方法, 因为枯草芽孢杆菌有很好的耐热性 (90℃) , 可能参与饲料的高温造粒, 而且具有很好的耐贮藏性能, 一般饲料质量保证期是几个月, 而枯草芽孢杆菌在常温下保存两年也只损失不到10%。添加量按全价饲料添加计算, 一般保证饲料内50万～100万个活菌/克, 乳猪添加量是仔猪、生长猪、育肥猪的两倍。
2.1.2 第二种方法, 是添加到猪所饮水中直接饲喂, 添加量按直接饲喂饲料的量里活菌总数计算。
2.2 发酵饲料喂养猪
枯草芽孢杆菌还可用来发酵饲料, 配合酵母菌、黑曲霉等其他益生菌, 在一定温度及湿度下发酵粗饲料如木薯渣、秸杆、酒糟、蔗渣等。
2.3 发酵垫料床用发酵剂
发酵垫料床养猪是目前兴起的比较环保的养殖方法, 垫料里最重要的成分微生物发酵剂就是多种益生菌混合物, 而枯草芽孢杆菌因环境适应性强, 成为该发酵剂里最主要也是最普遍的添加物。
3 枯草芽孢杆菌用于养猪时注意事项
枯草芽孢杆菌 篇9
1 材料与方法
1.1 试验地概况
试验地为连作7年的水稻田, 土壤类型为草甸黑土, 有机质含量为3.5%, p H值为6.8。该地块在2011年水稻稻瘟病发生较重, 平均发病级数为3级。
1.2 试验材料
供试药剂:枯草芽孢杆菌 (黑龙江强尔生化技术开发有限公司) 、40%稻瘟灵乳油 (重庆中邦药业有限公司) 。供试水稻品种:空育131。
1.3 试验设计
试验设5个处理, 处理1:枯草芽孢杆菌拔节期150 g/hm2, 始穗期75 g/hm2, 齐穗期75 g/hm2;处理2:枯草芽孢杆菌拔节期150 g/hm2, 始穗期75 g/hm2, 齐穗期150 g/hm2;处理3:枯草芽孢杆菌拔节期150 g/hm2, 始穗期150 g/hm2, 齐穗期150 g/hm2;处理4:40%稻瘟灵乳油拔节期600 g/hm2, 始穗期600 g/hm2, 齐穗期600 g/hm2;以清水作对照 (CK) 。施药日期分别为拔节期6月21日, 始穗期7月27日, 齐穗期8月3日。试验采取大区对比法, 不设重复, 其中处理1、2、3、4面积各为一个自然池, 每个自然池面积1 000 m2。
1.4 试验方法
采用0.01 g电子秤量取试验药剂, 采用机动弥雾机对水450 kg/hm2喷雾, 并于6月5日用10%吡虫啉450 g/hm2对水稻潜叶蝇进行防治。各小区管理条件一致。
1.5 调查内容与方法
试验共调查3次, 分别为第1次施药前 (6月20日) , 最后1次施药前 (8月2日) 和最后1次施药后14 d (8月17日) 。叶瘟病采用5点取样法, 每点取50株;穗瘟病采用5点取样法, 每点取样50穗。记录总株数、病株数和病级数。于10月1日进行测产。
叶瘟病分级标准:0级:无病;1级:叶片病斑少于5个, 长度小于1 cm;3级:叶片病斑6~10个, 病斑长度大于1 cm;5级:叶片病斑11~25个, 部分病斑连成片, 占叶面积10%~25%;7级:叶片病斑26个以上, 病斑连成片, 占叶面积26%~50%;9级:病斑连成片, 占叶面积50%以上或全叶枯死。
穗颈瘟病分级标准:0级:无病;1级:每穗损失5%以上 (个别枝梗发病) ;3级:每穗损失6%~20% (1/3左右枝梗发病) ;5级:每穗损失21%~50% (穗颈或主轴发病, 谷粒半瘪) ;7级:每穗损失51%~70% (穗颈发病, 大部半瘪) ;9级:每穗损失71%~100% (穗颈发病造成白穗) [3,4,5]。用新复极差 (DMRT) 法对试验数据进行方差分析, 其计算公式如下:
2 结果与分析
2.1 对水稻的安全性
通过观察发现, 供试药剂在试验剂量范围内未发现对作物产生药害, 各处理均未出现蹲苗、畸形等药害症状, 各处理秧苗长势与空白对照无明显差别, 对水稻安全。
2.2 不同处理对水稻稻瘟病的防效
由表1可知, 第1次施药前稻瘟病没有发生, 没有调查数据。末次施药前调查, 处理1~4对水稻稻瘟病叶瘟的防效分别为80.17%、83.97%、89.57%、84.60%, 按照防效高低顺序排列为:处理3>处理4>处理2>处理1;未次施药后14 d调查, 处理1~4对水稻穗瘟的防效分别为80.36%、88.57%、90.46%、93.21%, 按防效高低排列为:处理4>处理3>处理2>处理1。虽然从数据上看各处理间防效有一定差别, 方差分析表明, 2次调查各处理之间对水稻稻瘟病的防效差异均不显著。
2.3 不同处理对水稻产量的影响
由表2可以看出, 处理1~4的产量分别为8 500.00、8 710.00、9 008.33、8 735.83 kg/hm2, 处理1~4分别较CK增产7.41%、10.07%、13.84%、10.39%。
注:小区测产面积为30 m2。
3结论与讨论
试验结果表明:黑龙江强尔生化技术开发有限公司生产的枯草芽孢杆菌, 在试验用药范围内对水稻安全, 对水稻稻瘟病防治效果好, 增产效果明显, 可以在生产中推广使用。推荐预防水稻叶瘟应在发病初期用药, 预防穗颈瘟施药时期以抽穗始期及齐穗期各用1次药为宜, 用药量为每次150 g/hm2, 采用茎叶均匀喷雾。
参考文献
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[4]王辉.枯草芽孢杆菌防治水稻稻瘟病试验示范[J].中国农村小康科技, 2009 (2) :69, 72.
枯草芽孢杆菌 篇10
微生物提高采收率是非常重要的三次采油技术, 它利用微生物和/或其代谢产物来采出残余油, 通常, 我们认为约30%的原油地质储量可通过现行的提高采收率技术采出 (Abtani和Reestaazad, 2001;Khire和Khan, 1994;Premuzic, 1992) 。然而, 包括化学或物理过程在内的压力降、水驱及蒸汽驱技术对大多数油藏是不适用的 (Vanbyke, 1991) 。如果化学表面活性剂利用不合理, 则会伤害油层, 且成本很高, 还会留下很多残余油。除非对油藏环境造成更大的伤害, 否则这些残余油很难再被驱替出来 (Turkovskaya, 1999) 。造成采收率低的因素有很多, 主要因素是一些油藏的渗透率低或原油的黏度高导致的流动性低。油水间的界面张力高, 则造成毛管力高, 导致原油残留在岩石中 (Banat, 1995) 。生物表面活性剂是不同表面活性化学物质的组合, 这些物质由很多种类的微生物产生, 如芽孢杆菌 (Cooper和Goldenbergy, 1999;Sung和Kuo, 1998) 。因同时具有亲水基和非亲水基, 生物表面活性剂可分散在水/气或水/油界面以降低界面张力 (Youssef等人, 2004) 。这些性质使其成为较好的提高采收率用剂 (Bannat, 1995;Bannat等人, 2000) 。这种生物表面活性剂与化学表面活性剂相比有以下优点:低毒性, 高降解度及较好的环境匹配性, 高泡沫度, 高选择性及极值pH、温度和盐度下的特殊活性 (Fietcher, 1992;Sullivan, 1998;Gautham和Taygi, 2006;Bodour和Miller, 2002;Gerson, 1998) 。目前的研究已经评估了可产生芽孢杆菌的脂肽的分离、确定以及生物表面活性剂的提取。这些菌株的排泄物使原油成分发生了变化, 这种变化正是我们所期望的 (MahmudiehLab, 2007) 。
2 选材与方法
样品取自Tehran炼油厂油品集输站附近被油污染的土壤。所有样品均一式三份。样品一到实验室, 马上进行实验。各取样品1 mL加到9 mL浓度为0.9%的NaCl溶液中, 混合物放置于振荡器里振荡1 h, 得到分散效果好的悬浮液 (Francy和Tomas, 1991;Adria等人, 2003) 。通过培养羊血琼脂, 完成溶血测试 (Banat, 1995) 。脂肽是可以破坏红血球膜的代谢产物。界面张力用DU-NOUY测定 (AkhavanSepahy等人, 2005) 。芽孢杆菌通过在平板计数琼脂上用倾注法分离出来。单独培养通过生态学、生物化学及分子生物学技术预先确定。运用Bergey的鉴定生物学方法和16 SrRNA方法, 16 SrRNA方法用fD1和rD1做引体。16 SrRNA方法分为以下步骤:
◇ 通过Amersham仪器提取DNA
◇ 在琼脂糖浆中做电泳实验
◇ 用于PCR的特殊引体包含的核苷酸如下:
fDl 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
rDl 5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3'
样品被送到SQ实验室 (德国) 进行进一步的分子生物研究。将其检测结果与其他的菌株相比较, 检测出匹配的菌株。通过特殊软件已将图像画出, 但不是我们已知的核苷酸类型。最后, 将实验结果和基因库序列表进行了比较 (Blackwood和Turenne, 2004) 。准备培养液 (Merck) 用于接种体。在35 ℃条件下, 接种体 (OD450 nm 0.8~0.9) 在培养液中生长8~12 h。为了合成生物表面活性剂, 我们选用了一种矿物质盐介质, 该介质的组成如下:Na2HPO42g/L、KH2PO42 g/L、MgSO4·7H2O0.01g/L、NaNO32.5g/L、NaCl0.8g/L、CaCl20.2g/L、KCl0.8g/L, FeSO4·7H2O0.001g/L, 以及1mL包括ZnSO4·7H2O525mg/L、MnSO4·4H2O200 mg/L、CuSO4·5H2O705mg/L、Na2MnO4·2H2O15mg/L、COCl2·6H2O200mg/L、H3-BO315mg/L、NiSO4·6H2O27mg/L微量元素的溶液 (mg/L) (Francy和Thomas, 1991) 。碳水化合物 (葡萄糖、蔗糖、果糖及甘露糖) 加入后, 最终浓度为2% (体积分数) 。碳氢培养基 (原油) 的浓度增加了2% (体积分数) 。不同的氮源加到营养液中, 如硝酸钠、蛋白胨及酵母提取物 (3%) 。为研究菌株生长情况, 在烧瓶中装200 mL的培养液, 在30~50 ℃的温度下搅拌, 转速为200 r/min。检测到不同NaCl浓度、pH值条件下产生的生物表面活性剂。介质的pH值也相应地进行了调整。重复实验过程, 实验结果取各单独实验的平均值 (Tulra等人, 2002) 。采用的测乳化活性的方法是由Cooper和Goldenbergy (1999) 及Tabatabaee等人 (2005) 设计的。提取脂肽的方法是对Youssef等人 (2004) 方法的修正。在1 L的烧瓶中培养200 mL的菌株, 其中原油浓度为2%。48 h后, 通过界面张力测试, 检测到有部分表面活性剂产生。在4 ℃条件下, 用离心机将细胞分离, 离心机转速为10 000 r/min, 旋转15 min。用1%的HCl溶液将培养液酸化至pH值为2.0, 并用乙醚提取。醚在35 ℃的真空条件下蒸发掉, 残余物被重新溶解于二氧甲烷溶液中。然后, 用三氧甲烷-甲醇-乙酸混合液 (25∶15∶4∶2) 在活性硅胶盘 (20 cm×20 cm×0.25 cm, MERK, F.R.G) 上将其分馏。向盘子上喷洒含有重铬酸盐的硫酸, 并在150 ℃下加热15 min, 可看到有棕色斑点出现, 是脂质成分。向盘子上喷洒壬醇溶液, 并在110 ℃下加热10 min, 可看到有红色斑点出现, 是氨基酸成分。
3 结果及讨论
通过微生物作用来生产表面活性物质或脂肽已引起越来越多的关注, 尤其因其在提高采收率应用上的潜力。由于环境中微生物的多样性及同种微生物水平的多样性, 导致可用很多不同的方法来检测和 (或) 确定目前存在的大部分微生物。然而, 由于微生物的多样性及生存环境的不同, 没有一种方法可以用来提取、检测及确定所有存在于被油样污染的土壤中的微生物。因此, 本实验尝试着用特殊溶液培养杆菌种类。从Tehran油田集输站附近被油污染的土壤中分离出约60种芽孢杆菌, 并用于进一步的研究。溶血活性是描述细菌的一种方法, 细菌菌株的溶血活性可通过接种羊血琼脂来测定。脂肽也是可以破坏红血球膜的代谢产物。图1所示结果可证明所有菌株产生生物表面活性剂的能力。应用Bergy的鉴定细菌学分类学方法和16 SrRNA基因法, 通过生态学、生物化学及分子生物学技术可以鉴别分离的菌株。
用Taq DNA聚合酶和基因组DNA作为模板, 用fD1和rD1在94℃下预变质10 min后做引体;在94 ℃下45 s, 56 ℃下45 s, 72 ℃下60 s, 72 下10 min, 共转30个循环, 第一次得到PCR产物。不断加入1%的琼脂糖凝胶后, 用溴化物可检测到产物。按照1∶50的比例将PCR产物稀释, 将其作为相同PCR条件下的吸收模板, 并利用DIG PCR标定混合物 (Roche) 。将由16 SrDNA得到的结果用特殊软件进行分析, 并将分析结果与已知的数据库序列相对照, 发现99%是地衣形芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。用标准乳化液测定方法测定分离出来的纯菌株的乳化活性。乳化活性单元被限定为本文所使用的材料与方法。地衣形芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的乳化活性分别为92%和90%。然而, 这些物种在培养液中可将表面张力降至30 mN/m和29 mN/m。一些效果好的生物表面活性剂可将水的表面张力从65 mN/m降至29 mN/m。
实验所得结果与Banat (1995) 所得结果相一致。菌株在原油、葡萄糖、蔗糖、甘露糖及乳糖中的生长能力如图2、图3所示。结果表明, 原油可为分离出来的细菌生产生物表面活性剂提供最好的碳源和能量。
目前实验中, 为了使地衣形芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌在适宜条件下得到最大量的脂肽产物, 对实验条件进行了标准化。实验结果在不同氮源中的变化如图4、图5所示, 如酵母提取物、硝酸铵、消化蛋白质及硝酸钠。因氮源作用, 地衣形芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌分别将表面张力减少了35 mN/m、36 mN/m。
图4、图5表明硝酸钠适于本源菌株产生脂肽。一些实验结果表明, 培养液的种类和生长条件可影响生物表面活性剂的种类和产量。鉴于此, 本实验检测了碳源、氮源、pH值及NaCl浓度。实验中, 分离出来的芽孢杆菌在适宜的温度下, 可以利用不同的碳源产生脂肽。虽然有关于中温条件下产生生物表面活性剂的报道, 但Markkar和Cameotra (1998) 从含烃培养液中分离出嗜温芽孢杆菌。当NaCl浓度大于6%时, 脂肽合成物会减少。不同浓度的NaCl (2%~20%) 对脂肽的合成均有影响。
图6表明, 向介质中加入NaCl可使表面张力降低, 但高浓度的NaCl不会使菌类大幅降低表面张力。本实验分离得到的菌株特性与Yakimov和Amro (1997) 的实验结果相似。据报道, 在NaCl浓度为6%的条件下, 从油藏分离出来的地衣形芽孢杆菌可产生表面活性剂 (Banat, 1993) 。图7为pH值对表面张力的影响结果, 该表面张力是在地衣形芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌产生的表面活性剂作用下测得的。菌株可在pH值6~9之间生长, 但两种本源细菌生长的最佳pH值为6.8。当pH=4时, 脂肽的产量会很少。
经过对地衣形芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌产生的表面活性剂的初步分析, 我们可以通过Rf值确定不同的脂质 (表1、表2) , 如重铬酸盐、甘油二酸酯及天然磷脂。在硫酸中检测到重铬酸盐, 这表明脂质提取物中含有缩氨酸类物质。到目前为止, 已经有关于从地衣形芽孢杆菌BA550和枯草芽孢杆菌jf-2分离出的表面活性脂质的报道 (McInerney,
Javaheri, 1990;Yakimov和Timmis, 1995;Jenny, 1992;Youssef等人, 2004) , 我们所得结果与这些结果相类似。这些菌株生产生物表面活性剂的潜力及其在石油工业上的应用是很明显的, 尤其对于微生物提高采收率来说更为明显。