枯草芽孢杆菌制剂

枯草芽孢杆菌制剂（共10篇）

枯草芽孢杆菌制剂 篇1

仔猪早期断奶后, 由于其身体各系统 (尤其是免疫系统) 发育尚未完善, 缺乏母乳提供的免疫抗体, 加之外界环境的改变, 很容易造成腹泻、减食、疾病、甚至死亡等断奶应激情况的发生。断奶应激可降低仔猪的抗体水平, 抑制细胞免疫力, 表现出免疫抑制[1]。

枯草芽孢杆菌制剂已广泛应用于人的功能性食品中, 以及作为动物饲料添加的微生态制剂[2]。在断奶仔猪日粮中加入枯草芽孢杆菌制剂, 可加速其免疫系统的发育, 增强机体抵抗力, 枯草芽孢杆菌能有效分泌降解饲料中复杂碳水化合物的酶, 如降解果胶、葡聚糖、纤维素等的酶, 同时降低了肠道p H值, 有利于幼龄动物对蛋白质的消化吸收, 有效提高饲料的利用率, 提高仔猪的生长速度[3]。

本试验通过在断奶仔猪日粮中添加不同水平的水谷欣枯草芽孢杆菌制剂, 观察其对断奶仔猪生产性能的影响, 从而探讨在饲料中枯草芽孢杆菌制剂的最佳添加量。

1 材料与方法

1.1 试验材料

枯草芽孢杆菌制剂, 为盐城市神微生物科技有限公司研制的水谷欣枯草芽孢杆菌制剂。其主要菌为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌等活性物质, 活菌数超过2×1010cfu/g。

1.2 试验动物

在江西农达畜牧有限公司猪场选取96头体重相近, 健康状况良好的25日龄断奶的长大二元杂交仔猪。

1.3 试验设计

将96头仔猪, 随机分为4个组 (Ⅰ组为对照组, Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ为试验组) , 每个组3个重复, 每个重复8头。对照组饲喂基础日粮, Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组在基础日粮中分别添加0.03%、0.05%、0.07%的水谷欣枯草芽孢杆菌制剂;预试期3d, 试验期28d。

1.4 基础日粮配方

仔猪基础日粮参照NRC (1998) 5~10kg仔猪饲养标准配制。由江西农达畜牧有限公司自主配制。基础日粮配方及营养水平见表1。

注:预混料为每千克日粮提供:维生素A 7 500 u, 维生素D 1 400 u, 维生素E 36 u, 维生素K 3.0 mg, 维生素B11.4mg, 维生素B23.0 mg, 维生素B60.25 mg, 泛酸钙12.0 mg, 胆碱500 mg, 烟酸15.0 mg, 叶酸0.25 mg, 生物素0.04 mg, 铜180 mg, 铁100 mg, 锰60 mg, 锌120 mg, 硒0.3 mg, 碘0.3 mg。

1.5 饲养管理

试验仔猪全部饲养在同一栋封闭式猪舍内, 采用乳头式饮水, 猪舍通风良好, 舍温保持在23℃左右;每天8∶00、11∶00、16∶00、21∶00喂料4次;每天上、下午各清扫猪粪一次, 舍内保持清洁, 每周猪舍消毒1次;试验期间按照猪场常规免疫程序进行免疫注射。

1.6 测定指标与方法

1.6.1 测定生长性能指标。

试验开始与结束时早晨空腹称重计算出每栏 (每个重复) 的平均日增重, 记录每栏 (每个重复) 每天的日采食量计算出平均日采食量。

平均日采食量=总采食量/28d

日增重= (试验末重-试验始重) /28d

料重比=总采食量 (kg) /总增重 (kg)

1.6.2 记录健康状况指标。

每日上、下午清扫猪粪前仔细观察猪群的粪便, 及时记录腹泻仔猪头次数量;并观察仔猪行为方式、毛色、活跃程度等健康状态, 计算出腹泻率。

每个重复的腹泻率 (%) = (每栏仔猪总腹泻头次/8×28×2) ×100%;

1.7 数据处理与分析

试验数据以平均数±标准差的格式表示。采用Excel记录并统计数据, SAS 8.1软件对数据进行方差分析和Duncan'S多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同添加水平的枯草芽孢杆菌制剂对断奶仔猪生长性能的影响

由表2可看出, 试验组较对照组在平均日增重、平均日采食量均有增加且呈正比关系;料重比有所减少, 呈反比关系。与Ⅰ组比较:平均日增重, Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组分别提高了5.77%、16.03%、18.71%;平均日采食量, Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组分别提高了0.94%、4.05%、4.61%;料重比, Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组分别降低了4.62%、10.26%、11.79%。各试验组之间, 与Ⅱ组比较, Ⅲ组、Ⅳ组的平均日增重和日采食量都有显著提高, 料重比显著降低;而Ⅲ组、Ⅳ组之间的平均日增重、日采食量和料重比的差异均不显著, 这与张红兵、黄雪泉等[2,4]关于添加枯草芽孢杆菌制剂对仔猪生产性能的影响研究相一致。

2.2 不同添加水平的枯草芽孢杆菌对断奶仔猪健康状况的影响

从表3可知:日粮中添加枯草芽孢杆菌制剂明显降低了断奶仔猪的腹泻率, 对照组的腹泻率较试验组高;与Ⅰ组比较, Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组的腹泻率分别降低了1.33、4.91、5.35个百分点。

每日观察仔猪发现, 实验组仔猪的精神状态优于对照组。实验组毛发顺直, 皮毛较红润, 饮食欲望较强。而对照组中常有毛蓬松, 耳朵耷拉, 腹泻拉稀的仔猪, 舍栏也较脏乱, 较强的仔猪时不时会攻击体质较弱的仔猪, 出现打架现象, 实验组的这些情况则较少发生。由此可得, 添加枯草芽孢杆菌制剂对仔猪的健康状况起到良好作用, 这与刘影等人的研究结果相符[5]。

3 结论

试验表明, 日粮中添加枯草芽孢杆菌制剂对断奶仔猪的生长发育有较好的影响;添加0.03%、0.05%、0.07%不同水平的枯草芽孢杆菌制剂, 随着添加的量增加对仔猪的生长性能提高和健康状况改善的效果越好, 但0.05%与0.07%的添加量之间差异不显著;因此, 笔者认为水谷欣枯草芽孢杆菌制剂的添加水平以0.05%~0.07%为宜。

参考文献

[1]赖长华.共轭亚油酸对断奶仔猪免疫应激的调控[D].博士学位论文, 2004, 1~22.

[2]黄雪泉.添加枯草芽孢杆菌制剂对仔猪生产性能的影响[B].中国畜牧兽医报, 2010 (37) 7:212~214.

[3]李春凤, 林显华, 谷魏, 等.枯草芽孢杆菌在饲料生产及环境防治中的应用[J].中国饲料, 2013 (1) :10~13.

[4]张红兵, 苏子峰, 等.仔猪断奶过渡料粗蛋白水平和添加枯草芽孢杆菌对仔猪生长性能的影响[J].饲料博览, 2011 (3) :4~7.

[5]刘影, 王春林, 李继光, 等.母猪和仔猪日粮中添加枯草芽孢杆菌对仔猪生产性能的影响[J].饲料工业, 2010, 31 (18) :29~30.

枯草芽孢杆菌制剂 篇2

枯草芽孢杆菌FY99-01菌株的净水作用

摘要：以5种模拟的污染水样对枯草芽孢杆菌FY99-01菌株的`净水作用进行了研究.结果表明,该菌株能迅速降解有机物,在不同处理条件下水样的COD值都有明显的下降,48 h COD的去除率达67%以上,96 h厌氧条件下反硝化强度为50.2%,好氧条件下为28.6%,144 h总残渣、过滤性残渣的降解率分别为61.3%和24.1%,96 h降解硫化物达100%.作 者：胡咏梅 葛向阳 梁运祥 HU Yong-mei GE Xiang-yang LIANG Yun-xiang 作者单位：华中农业大学农业微生物学国家重点实验室,武汉,430070期 刊：华中农业大学学报 ISTICPKU Journal：JOURNAL OF HUAZHONG AGRICULTURAL UNIVERSITY年，卷(期)：,25(4)分类号：X52关键词：枯草芽孢杆菌 净水 COD去除率 反硝化 残渣 硫化物

枯草芽孢杆菌制剂 篇3

关键词 枯草芽孢杆菌 ；草莓白粉病 ；田间试验

中国分类号 S436.68 文献标志码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.11.018

Abstract Strawberry powdery mildew is a major disease in qionghai strawberry production ， seriously affecting the production of strawberry. Qionghai strawberry planting during the low temperature， high humidity climate， is advantageous to the strawberry powdery mildew. In this article， through different combination formula discovery： Bacillus subtilis according to 4050 g/hm2 dosage used alone to prevent strawberry powdery mildew control effect was 92.09%， and the incidence of mixed chemicals-luna， do after treatment with， has a fast control effect and the advantages of long effective period.

Keywords Bacillus subtilis ； Strawberry powdery mildew ； Field trials

草莓白粉病由子囊菌门真菌，羽衣草单囊壳菌（Sphaerotheca aphanis）侵染所致，属专性寄生菌，人工离体培养困难[1]，低温、高湿环境下发病严重，主要危害叶片和果实，是草莓生产中常发性主要病害。一般导致减产20%～30%，严重时病叶率在45%以上，病果率50%以上，严重影响草莓的生产[2]。目前，国内外对白粉病的防治仍以化学防治为主，主要包括有机硫类、苯并咪唑类、三唑类和仿生物植物源类[3]。目前，生产上常用的化学杀菌剂有世高、敌力脱、腈菌唑、翠贝、露娜森等[4-8]，长期使用不仅会使病菌耐药性增强，导致用药次数增加，还会影响草莓食用安全。使用枯草芽孢杆菌防治草莓白粉病试验已有报道[9-10]，但在海南气候条件下和草莓栽培模式下，利用芽孢杆菌菌剂防治白粉病尚未见报道。本试验旨在验证芽孢杆菌菌剂对草莓白粉病的防治效果，探讨芽孢杆菌菌剂科学的使用方法，以便为海南草莓的白粉病防治提供有效的防治措施。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试作物

红颜（红脸颊）。

1.1.2供试药剂

保翠（枯草芽孢杆菌含量≥109个/mL，水剂），北京中农思科生物科技有限公司提供；露娜森（42.8%氟吡菌酰胺·肟菌脂，悬浮剂）由拜耳作物科学（中国）有限公司提供。

1.1.3 试验地点及土壤肥力

试验设在海南省琼海市嘉积镇温泉村草莓种植地；土壤类型：水稻土；土壤肥力中等，具体指标见表1。

1.2 方法

1.2.1 试验设计

草莓于2015年11月25日定植，成活后采用黑色塑料覆盖，株行距18 cm×20 cm。

试验采用随机区组设计，3次重复，每个小区面积24 m2，小区间设保护行，试验设7个处理。处理1：对照（CK），喷施清水；处理2：露娜森0.45 L/hm2（3次）；处理3：露娜森0.45 L/hm2+保翠2.7 L/hm2（1次）、保翠2.7 L/hm2（2次）；处理4：露娜森0.45 L/hm2（1次）、保翠2.7 L/hm2（2次）；处理5～7依次为保翠4.05、2.7、1.35 L/hm2（3次）。常规喷雾，药液对水量675 L/hm2，均匀喷施叶片正反面，连用3次，前2次间隔3 d，第2次与第3次间隔7 d。试验期间不使用其他药剂防治病害。

2016年1月16日第2批草莓顶果采摘盛期，部分果实刚出现白粉病时使用，在下午4～5点开始进行叶面喷施。

1.2.2 调查与计算

1.2.2.1 试验调查时间

分别于施药前1 d、第1次药后3 d、第2次药后7 d、第3次药后7 d和14 d共5次调查草莓的发病情况。

1.2.2.2 调查内容

每小区采用对角线五点取样法，每点调查5株，每株调查全部叶片，每片叶按病斑面积占叶面积的百分比分级，记录调查总叶数和各级病叶数。

1.2.2.3 分级标准及防效计算

0级：无病；1级：病斑面积占叶片面积的5%以下；3级：病斑面积占叶片面积的6%～10%；5级：病斑面积占叶片面积的11%～25%；7级：病斑面积占叶片面积的26%～5O%；9级：病斑面积占叶片面积的51%以上。按如下公式计算病情指数和防治效果：

病情指数=∑（各级病叶数×相对级数值）/（调查总叶数×9）×100

防治效果（%）=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100%

2 结果与分析

nlc202309080856

2.1 保翠芽孢杆菌菌剂对草莓白粉病的防治效果

试验结果见表2。

由表2可知，第1次施药后3 d，各处理平均病情指数均显著降低，分别由药前12.22、12.35和12.15、12.24、12.39和12.15下降至3.51、3.46、3.42、5.02、6.08和8.22。相对防治效果分别达到76.11%、76.45%、76.72%、65.83%、58.61%和44.04%。其中，用露娜森处理病情指数显著降低，防效也达到76%以上。但单独使用露娜森或者露娜森与保翠混配，在用后3 d防效无差异。单独使用保翠芽孢杆菌菌剂，表现出随着使用浓度增加，病情指数和防效改善越明显，但同使用露娜森相比，防治效果滞后，这主要是由于在自然状态下，除成熟叶片和老叶片表面均有菌丝和孢子生长附着外，同一株新稍幼嫩、未见发病的叶片上也有病原菌的存在[11]。因此，芽孢杆菌菌剂要在草莓叶片上发挥作用，必须要快速大量扩繁才能形成局部菌群优势。这需要一定的时间，因此，在短期内，草莓叶片上病原菌仍处于优势地位，所以表现出防效不明显。已有试验发现，叶片喷施保翠芽孢杆菌菌剂3 d后再喷施1次，能加快菌剂的扩繁速度和数量，加快有益菌在草莓叶片上形成优势菌群，从而发挥作用。由病情指数的变化可以看出，白粉病随着发生时间的延长，病害发生程度加重，对照区白粉病病情指数由逐渐加重。

第2次施药后7 d观察，各处理病情指数均显著降低，其中使用露娜森处理防效提高到90%以上，其中以处理3效果最好，其主要原因在于，由于保翠芽孢杆菌菌剂形成了芽孢，对杀菌剂、高温、射线均具有明显的防护作用。因此，把露娜森按使用倍数稀释后加入保翠芽孢杆菌菌剂，混匀后叶面喷施，由于露娜森能直接杀死病原菌，从而减少病原菌对保翠芽孢杆菌菌剂的竞争和抑制作用，待露娜森杀菌剂作用减弱后，保翠芽孢杆菌菌剂中的孢子开始萌发，由于病原菌大部分被杀死，不会对保翠芽孢杆菌菌剂的扩繁带来阻碍，从而加快菌剂的快速繁殖，进而发挥菌剂对病原菌的竞争作用和抑制效果。处理4是先用露娜森杀菌后，在第3天再单独使用保翠芽孢杆菌菌剂，尽管露娜森能杀死叶片的大部分病原菌，但由于需要间隔3 d才使用保翠芽孢杆菌菌剂，在这3 d草莓叶片最初被露娜森杀死的病原菌又重现开始萌发。因此，在叶片上又有可能形成局部优势菌群，从而抑制保翠芽孢杆菌菌剂的扩繁，造成防治效果下降。本试验由于第1、2次用药间隔期短，因此，处理4与处理3相比差异不明显。处理2单独使用露娜森，尽管防治效果同处理3、4相当，但由于2次施药间隔期短，对草莓造成一定药害，具体表现在畸形果多，叶片略有卷缩。

第2次施药后，单用保翠芽孢杆菌菌剂防效明显上升，一般随着使用浓度的增加，防效也在增加，具体表现为：处理5>处理6>处理7，其中，处理5和处理6防效相近，但均显著高于处理7。

第3次施药后7 d观察，单用露娜森防效较第2次施药略有降低，这主要是由于后期草莓白粉病危害加重，露娜森持效期降低，间隔7 d使用病原菌又开始在叶片表面蔓延，造成防效降低。其余处理由于后期全部采用保翠芽孢杆菌菌剂防治，因此，随着使用次数增加，防治效果更加明显；使用浓度越高，防效越明显；相同浓度处理，不管前期是否使用露娜森，最终的防效相近。

第3次施药14 d观察，随着用药间隔期的延长，各处理草莓白粉病防效均明显下降。其中处理2单用露娜森后，第14天病情指数达到27.32，防效仅有41.04%。使用保翠芽孢杆菌菌剂处理，防效尽管也有下降，但同處理2相比，降幅要小得多。说明使用保翠芽孢杆菌菌剂处理，能显著提高草莓对白粉病的抵抗能力和持效期。从总体来看，使用保翠芽孢杆菌菌剂可以显著改善草莓对白粉病的防效，总的来看，处理3不仅能快速提高草莓对白粉病的防治效果，而且持效期长达14 d以上，值得在草莓种植区大面积推广。

2.2 芽孢杆菌菌剂对草莓生长的影响

调查草莓在试验处理期间各处理的草莓产量，统计商品果率，估算每公顷产量（见表3）。

从表3可以看出，处理3（露娜森与保翠芽孢杆菌菌剂第1次混配，以后2次单用保翠芽孢杆菌菌剂）产量、商品果率和净收益均明显高于其他各药剂处理。单独使用露娜森尽管初期防效最好，但随着时间延长，防效降低，表现在草莓长势较差，出现早衰症状。单独使用保翠芽孢杆菌菌剂，尽管防效较慢，但持效期长，同时还能改善草莓叶片光合作用，根系生长良好，抗旱、耐寒能力增加，除处理7外，商品果率均达到85%以上。处理7由于芽孢杆菌菌剂用量不够，因此在整个生育期均表现出防治效果不突出，叶片黄化严重，产量和商品率均明显降低。

露娜森按100 mL 92元，保翠芽孢杆菌菌剂按200 mL 30元计。

3 结论与讨论

化学药剂和芽孢杆菌菌剂用于防治草莓白粉病均具有明显效果，但二者各有优缺点。其中单独使用化学药剂尽管见效快，但持效期短，导致使用次数增加。芽孢杆菌菌剂尽管防治效果好，持效期长，但前期见效慢，单独使用需要加大用量，这又会加大种植者投入。

因此建议生产中草莓白粉病预防，可以按照2.7 L/hm2的量单独使用；治疗可在田间果实发病初期与露娜森混合使用，在露娜森按2 000倍稀释后最后加入保翠芽孢杆菌菌剂，同时在前2次使用时，施药间隔期以不超过3 d防效最佳，视田间病情发展施用2～3次。

保翠芽孢杆菌菌剂合理使用，能提高单位面积产量和商品果率，增产增收效果明显。保翠芽孢杆菌菌剂用于草莓白粉病防治，在白粉病发生前使用，效果优于发病后，芽孢杆菌的用量和使用次数均明显减少。但本试验由于侧重探讨芽胞杆菌与杀菌剂的合理配合方法，再加上无法准确判断白粉病发生的准确时间，因此本次试验未进行这方面的系统研究。从防治效果来看，一般在果实刚出现白粉病1～2 d时使用效果更明显。

参考文献

[1] Rumbolz J，Kassemeyer H，Steinmetz H，et al.Differentiation of infection structures of the powdery mildew fungusUncinu-la necatorand adhesion to the host cuticle[J]. Canadian Journal of Botany，2000，78（3）： 409-421.

[2] 杨联伟. 草莓白粉病的发病规律和防治措施[J]. 烟台果树， 2005（3）：15-16.

[3] 杨奉才，李向英，高一风，等. 世高、敌力脱防治草莓白粉病试验[J]. 烟台果树，2001，76（4）：37.

[4] 汪建国，沈水土，柯汉云，等. 世高防治草莓白粉病试验[J]. 浙江农业科学，2002（3）：141-142.

[5] 方博云，黄根元. 腈菌唑防治大棚草莓白粉病药效试验[J]. 农药，1998，37（9）：37.

[6] 花秀凤，陈 铣. 50%翠贝DF防治草莓白粉病试验[J]. 福建农业科技，2004（4）：26-27.

[7] 李红霞，马志强. 几种杀菌剂对草莓白粉病的防效研究[J]. 农药学报，2003，5（3）：50-54.

[8] 史功全，杜玉斌. 露娜森防治草莓白粉病药效试验[J]. 现代化农业，2014（3）：24.

[9] 胡洪涛，王开梅，李 芒，等. 几种枯草芽孢杆菌发酵液防治草莓病害的药效试验[J]. 湖北农业科学，2002（2）：52.

[10] 曹春霞，龙 同，程贤亮，等. 枯草芽孢杆菌防治草莓白粉病田问药效试验[J]. 湖北农业科学，2011， 50（20）：4 188-4 189.

[11] 杨 瑞，王建立，于同泉，等. 运用扫描电镜技术观察草莓白粉病菌[J]. 电子显微学报，2013，32（3）：260-264.

枯草芽孢杆菌制剂 篇4

1 试验时间与地点

试验于2014 年5 月1 日—6 月24 日在通辽市三元养殖有限公司进行。

2 材料

2. 1 试验动物

选择体重65 kg左右的育肥猪40头。

2.2枯草芽孢杆菌和乳酸菌复合制剂

枯草芽孢杆菌和乳酸菌复合制剂( 活菌总数≥3 × 108cfu / g) ,山东某生物股份有限公司提供。

3 方法

3. 1 试验设计

选择育肥猪40 头,随机分为对照组和试验组,每组20 头,每组设2 个重复,每个重复10 头,公母各半。对照组饲喂基础日粮,试验组在基础日粮中添加0. 1% 的枯草芽孢杆菌和乳酸菌复合制剂,试验期55 d。试验期间记录每天的耗料量,计算料重比。

3. 2 基础日粮组成及营养水平

基础日粮配制参考《猪饲养标准》( 中国,2004)瘦肉型生长育肥猪每千克饲粮养分含量及结合生产实际配制,均为玉米- 豆粕型日粮,粉料,基础日粮组成及营养水平见表1。

3. 3 饲养管理

试验期间自由采食,保持槽内有料,下料口通畅。自由饮水,保证饮水清洁卫生。猪只免疫按猪场正常免疫程序进行,定期消毒。

注: DDGS为包含可溶性溶解物在内的干燥酒精糟。

3. 4 测定项目及方法

分别在试验开始和结束时对试验猪进行空腹称重,记录每天的耗料量,计算试验期平均日增重。根据增重和采食量计算每个重复的料重比,试验期间记录个体发病及死淘情况,及时结算饲料,以便将死亡猪只的饲料消耗剔除。

3. 5 数据的统计分析

采用Excel 2007 对数据进行整理,采用SPSS13. 0单因素方差分析程序( ANOVA) 进行方差分析,P < 0. 05 表示差异显著,试验数据以“平均数 ± 标准差”表示。

4 结果( 见表2) 与分析

注: 同行数据肩标字母不同表示差异显著( P < 0. 05) ,无肩标表示差异不显著( P > 0. 05) 。

由表2 可见,试验组总增重、平均日增重显著高于对照组( P < 0. 05) ,料重比试验组与对照组之间差异不显著( P > 0. 05) 。

5 讨论与结论

枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性菌,枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多黏菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质,对致病菌有明显的抑制作用,能够刺激动物生长发育,提高免疫球蛋白和抗体水平,增强细胞免疫和体液免疫功能,提高群体免疫力;枯草芽孢杆菌菌体自身合成 α - 淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类,在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用,促进蛋白质合成,减少蛋白质的分解,促进动物生长。

乳酸菌是发酵糖类且主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏阳性菌的总称。乳酸菌对于猪群肠道健康具有重要作用,对有害菌有拮抗作用,能够降低肠道p H值,阻止和抑制有害细菌的侵入和定植,竞争性地排斥、阻止病原菌繁殖,提高猪群健康和生长速度。

枯草芽孢杆菌制剂 篇5

关键词：枯草芽孢杆菌；黄瓜；促生作用；萌发；生长

中图分类号： S642.201 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）07-0158-03

黄瓜原产于印度的热带潮湿森林地带，自传入中国后已有2 000多年的栽培历史，深受人们的喜爱[1]。长期以来，白粉病是困扰黄瓜生产的重要病害之一，黄瓜白粉病每年5—6月大面积暴发[2]，在黄瓜幼苗和成株期均可发生，常造成重大经济损失[3]。长期以来，白粉病主要依靠化學药剂进行防治。但大量使用化学农药会引起环境污染、药物残留增加、病原菌抗药性提高等社会问题。随着生态农业及无公害食品产业的兴起，使人们倍加关注无污染、无残留、对有益微生物无影响的植物病害防治方法[4]。本试验从黄瓜根际土壤筛选出2株枯草芽孢杆菌H1、H2，用其菌悬液对黄瓜种子进行浸种、灌根后，对其萌发情况、幼苗期与花期植株的氮、磷、钾、叶绿素含量进行初步探索，旨在为黄瓜的无公害生产提供一条可行途径，为植物病害的防治和生物农药的大规模开发提供理论与实践依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试黄瓜品种为长春密刺，由昌吉市亚华种苗有限责任公司生产。供试菌株：枯草芽孢杆菌H1、H2从黄瓜根际土壤分离得到。80%多菌灵可湿性粉剂：石家庄亚润科技有限公司产品。

1.2 菌悬液的制备

1.2.1 供试培养基

选用LB培养基。配方：NaCl 10 g、胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、琼脂15 g、蒸馏水 1 000 mL、pH值7.0～7.2。

1.2.2 枯草芽孢杆菌的培养及菌悬液的制备

（1）平板培养：将枯草芽孢杆菌H1、H2分别接种于LB平板上，28 ℃培养24 h，保存备用。

（2）菌悬液的制备：将培养好的菌株平板内各加入若干无菌水，用已灭菌的接种环轻轻刮去上层菌层，将同一菌株的菌悬液置于150 mL 三角烧瓶中，稀释成 108 CFU/mL 浓度的菌悬液即为原液，用已灭菌的移液管移取菌液，制备成10、50、100、1 000倍稀释液保存备用。

1.3 枯草芽孢杆菌各菌株菌悬液对黄瓜种子萌发的影响

将黄瓜种子放入铺有灭菌滤纸的培养皿内，每皿20粒，分别加入枯草芽孢杆菌系列菌悬液、80%多菌灵可湿性粉剂1 800倍液各 5 mL，以5 mL无菌水处理为对照，28 ℃培养，蒸发损失的水以无菌水补充。每个处理3次重复。分别于24、48、96 h统计萌发率，测量胚根、胚轴长度，称量幼苗鲜重[6]。

1.4 枯草芽孢杆菌H1、H2菌悬液对黄瓜幼苗的影响

试验地点在塔里木大学植物科学学院园艺站温室大棚。将种子分成12组，每组120颗，将每组种子分别浸入枯草芽孢杆菌系列菌悬液、80%多菌灵可湿性粉剂1 800倍稀释液以及无菌水中，于培养箱中28 ℃培养12 h后播种（10月14日）。生长35 d后（11月18日）统计出苗率、植株株高、根系长度及植株的鲜重；取第2对真叶测定氮、磷、钾和叶绿素含量。

1.5 氮、磷、钾和叶绿素含量的测定

氮含量采用凯氏定氮法测定。磷含量采用H2SO4-H2O2消化-钒钼黄比色法测定。钾含量采用H2SO4-H2O2消化-火焰光度法测定[5]。叶绿素含量用叶绿素计于拔苗之前测定。试验测得的所有数据均用DPS进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 黄瓜种子萌发情况统计

各处理浸泡后的种子萌发率、胚根胚轴的长度以及幼苗鲜重如表1和图1所示。种子在清水中发芽情况最好，在 24 h 时已全部萌发，生长96 h后H1 10、50倍稀释液，H2 100、1 000倍稀释液条件的种子全部萌发。H2各处理和80%多菌灵可湿性粉剂处理的种子胚根长均低于对照，H1的50、100倍稀释液处理的胚根分别长于对照27.84%、3299%。H1、H2的50、100倍稀释液处理后的种子胚轴长度和幼苗鲜质量均高于对照。此结果表明，H1和H2各稀释液对种子的萌发具有抑制作用，50、100倍菌体稀释液对胚轴长度和幼苗鲜质量有促进作用。

2.2 幼苗期黄瓜各项指标测定结果

2.2.1 株高、根系长度、单株鲜质量、出苗率的统计

处理后的黄瓜幼苗株高、根长、平均鲜质量及出苗率如表2和图2所示。各处理的株高均高于对照，其中H1的100倍液处理的幼苗株高比对照增加了53.85%。H1和H2的100倍液处理的根系长度明显高于对照，其他处理低于对照。除H2的1 000倍稀释液，其他各处理的单株鲜质量均高于对照，其中H1的100倍液处理的高于对照70.90%。H2原液和H1的100倍液处理的出苗率分别高于对照119.00%和73.36%。

2.2.2 氮含量的测定

各处理黄瓜幼苗叶片的含氮量如表

3所示。菌株H2的10倍稀释液和80%多菌灵可湿性粉剂 1 800倍液处理的黄瓜氮含量高于对照，其他处理均低于对照，其中H2的10倍稀释液与对照在5%水平差异显著。

2.2.3 磷含量的测定

磷含量测定结果如表4所示。各处理叶片中的磷含量均高于对照，且经DPS数据分析在5%水平均无显著差异，说明各处理间磷含量无明显差异。

2.2.4 钾含量的测定

火焰光度法测得黄瓜叶片的钾含量如表5所示。H2原液处理的叶片钾含量略低于对照，其他处理均高于对照，其中H1的50倍稀释液处理与对照差异最显著。

2.2.5 叶绿素含量的测定

不同处理黄瓜幼苗叶片中叶绿素含量如表6所示。除H2的1 000倍液和多菌灵处理的叶

3 结论与讨论

本试验表明，枯草芽孢杆菌对种子的萌发具有抑制作用，且浓度越高抑制作用越大，而100倍稀释液对植株的生长和干物质的积累具有促进作用。

黄瓜幼苗期试验结果表明，经枯草芽孢杆菌H1和H2各稀释液处理后的黄瓜叶片，其磷、钾和叶绿素含量与对照相比都有所增加，氮含量没有明显增加。

叶绿素的光合产物为叶的生长代谢提供了足够的能量，同时，叶绿素含量直接影响植物的光合作用能力和干物质的积累。磷与细胞分裂及有机物的合成、转化、运输都有密切关系。钾能促进光合作用顺利进行及光合产物的转移，增加植株叶面积[6-7]。各物质之间的功能相辅相成，互相影响。经过处理的幼苗平均鲜质量高于对照，并且磷、钾和叶绿素含量均高于对照，在田间也发现经枯草芽孢杆菌处理的植株较为丰盈茁壮，长势较好。以上结果说明枯草芽孢杆菌可促进植物光合作用以及吸收矿质元素、水分的能力。

枯草芽孢杆菌用于生物防治已十分广泛，截至2005年，美国已有5株枯草芽孢杆菌（B.subtilis）获得环保局（EPA）商品化或有限商品化生产应用许可[8]。运用B.subtilis防治黄瓜白粉病也有不少报道。2007年Romero报道B.subtilis对瓜类白粉病的防效与杀菌剂醚菌酯相同[9]。同年Romero又报道B.subtilis产生的脂肽类代谢产物对瓜类白粉病具有抑制作用[10]。胡健2012年研究发现枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对黄瓜白粉病防效显著[11]。李宝庆研究证明枯草芽孢杆菌CAB-1产生的挥发性物质对黄瓜白粉病防效高于80%[12]。以上研究报道表明，枯草芽孢杆菌为黄瓜白粉病的防治提供了新的途径。

本试验从植物生理角度揭示了枯草芽孢杆菌的抗菌机理，为进一步利用枯草芽孢杆菌防治黄瓜病害奠定了一定基础。

参考文献：

[1]徐 宁. 塑料大棚黄瓜白粉病和霜霉病流行预测和管理系统的研究[D]. 南京：南京农业大学，2003.

[2]黄仲生，张芝莉. 黄瓜病虫害识别与防治[M]. 北京：中国农业出版社，2002.

[3]刘 峰. 黄瓜白粉病的发生规律及综合防治措施[J]. 上海蔬菜，2008（4）：75-76.

[4]鄭 莉，梁建根，施跃峰. 生防菌ZJH-10对黄瓜灰霉病诱导抗性的研究[J]. 中国农学通报，2009，25（3）：197-201.

[5]华东师范大学生物系植物生理教研组. 植物生理学实验指导[M]. 上海：人民教育出版社，1982：56-158.

[6]陆景陵. 植物营养学：上册[M]. 北京：中国农业大学出版社，2010.

[7]胡霭堂. 植物营养学：下册[M]. 北京：中国农业大学出版社，2003.

[8]Fravel D R. Commercialization and implementation of biocontrol[J]. Annu Rev Phytopathol，2005，43：337-359.

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[10]Romero D，Vicente A，Olmos J L，et al. Effect of lipopeptides of antagonistic strains of Bacillus subtilis on the morphology and ultrastructure of the cucurbit fungal pathogen podosphaera fusca[J]. Journal of Applied Microbiology，2007，969-976.

[11]胡 健，仇广灿，成晓松. 枯草芽孢杆菌WP防治黄瓜白粉病药效试验[J]. 上海蔬菜，2012（1）：58-59.

枯草芽孢杆菌扩培工艺 篇6

1 材料与方法

1.1 菌种、试剂及设备

菌种:枯草芽孢杆菌由三门峡龙飞生物工程有限公司保存。

主要试剂:牛肉膏, 蛋白胨, 氯化钠, 淀粉, 硫酸锰, 玉米粉, 等。

主要设备:隔水式电热恒温培养箱, HZQ-Q振荡器, 立式压力蒸汽灭菌锅。

1.2 菌株的筛选

从购买及实验室保存的枯草芽孢杆菌斜面, 挑去少许菌落划线于促芽孢形成培养基 (牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL) 平皿上, 37 ℃培养20 h左右取出。选择大菌落挑到装有5 mL无菌水的试管中, 震荡均匀后, 置100 ℃水浴中加热15 min, 再涂布于促芽孢形成培养基的平皿上培养, 反复多次。最后选取平皿上的大菌落, 转接到促芽孢培养基的试管斜面上, 37 ℃培养20 h左右拿出放入4 ℃冰箱保存备用。

1.3 发酵培养基优化

通过对培养基碳源、氮源等的选择及配比的正交试验, 确定出最适合枯草芽孢杆菌产芽孢的培养基。

1) 首先选择4种不同培养基进行摇瓶培养, 观察比较活菌数和芽孢形成情况。

2) 培养基的配制:①号培养基为淀粉0.5%+玉米粉1.3%+黄豆粕2.0%+葡萄糖0.5%+碳酸钙0.7%+硫酸铵0.1%+磷酸氢二钾0.3‰+硫酸镁0.2‰;②号培养基为淀粉0.5%+玉米粉1.3%+黄豆粕2.0%+葡萄糖0.5%+碳酸钙0.7%+硫酸铵0.1%+磷酸氢二钾0.3‰+硫酸镁0.2‰+硫酸锰0.2‰+淀粉0.3%;③号培养基为牛肉膏0.3%+蛋白胨1.0%+葡萄糖1.0%+氯化钠0.5%;④号培养基为牛肉膏0.3%+蛋白胨1.0%+葡萄糖1.0%+氯化钠0.5%+硫酸锰0.2‰+淀粉0.3%。

以上4种培养基pH均为7.0～7.2, 且每种培养基各做3瓶, 装液量100 mL/500mL三角瓶, 置立式压力蒸汽消毒器中, 于121 ℃灭菌30 min, 取出备用。

3) 摇瓶种子液制备:将保存的应用菌种在无菌室内接入肉汤培养基中, 在37 ℃、200转/min的摇床上震荡培养12 h。

4) 接种和培养:培养好的种子液以10%接种量, 分别接入4种不同培养基中, 37 ℃振荡培养, 每隔12 h检测1次, 36 h结束培养, 此过程重复3次。

5) 正交试验:将摇瓶结果较好的培养基作为基本培养基, 设计4个因素、3个水平的正交试验, 以进一步优化培养基配比 (培养36 h检测活菌数) 。正交试验设计见表1 (所用培养基中其他营养成分不变) 。

1.4 三角瓶摇瓶模拟发酵罐试验

以摇床正交试验得出的最佳培养基, 进行100 mL/500mL三角瓶摇瓶震荡培养, 并与肉汤培养基培养的进行2次比较试验。

发酵培养条件:培养基121 ℃灭菌30 min, 培养温度37 ℃, 搅拌速度200转/min, 当芽孢率达到80%以上时, 发酵结束, 此试验重复2次。

1.5 吸附载体的筛选

首先选择4种不同载体配比进行吸附试验比较, 4种载体配比后, 置高压蒸汽锅中121 ℃灭菌1 h, 全部按照最终10亿/g含菌量进行吸附, 然后按照最终观察活菌数情况, 进行正交试验, 得出最佳吸附载体。

2 结果与分析

2.1 菌株筛选前后对比

筛选前后种子作对比:从冰箱中拿出筛选前、后的种子斜面各1支, 分别接入1环装有肉汤培养基的三角瓶中, 在37 ℃、每分钟200转的摇床上震动培养, 每12 h涂片观察1次, 培养36 h, 记录活菌数和芽孢率, 此过程重复3次, 结果如图1所示。

菌株优化3次后:在相同的培养时间内 (36 h) , 芽孢形成率由原先的约30%提高到约95%, 活菌数也由原来的8亿/mL提升到15亿/mL。

2.2 发酵培养基优化结果

1) 摇床试验的结果见表2。

摇床试验所确定的4种培养配方依次是:①号培养基为普遍应用于培养细菌的培养基配方;③号培养基为经验配方;②号和④号培养基配方分别是在①、③号培养基的基础上添加0.3%的淀粉和0.2‰的硫酸锰而成。通过本试验证明, 淀粉和锰离子对芽孢形成有促进作用。②号培养基要明显优于其他3种培养基的配比, 培养到36 h芽孢率可达到96.0%以上, 活菌数可达到16.0亿/mL, 固我们选择②号培养基作为基本培养基进行正交试验。

2) 正交试验结果, 见表3。

由表3可见, 影响因素为:硫酸锰>豆粕>葡萄糖>淀粉。适宜条件为:葡萄糖0.5%, 淀粉1.0%, 黄豆粕3.0%, 硫酸锰0.2‰, 磷酸氢二钾0.3‰, 硫酸镁0.2‰, 碳酸钙0.7%, 硫酸铵0.1%。

2.3 三角瓶摇瓶模拟发酵罐试验结果

以摇床正交试验得出的最佳培养基, 与肉汤培养基培养的进行2次比较试验, 结果基本稳定。芽孢生成率对比结果, 如图2所示;活菌数对比结果, 如图3所示。

由图2、3可见, 采用优化培养基培养的结果比肉汤培养基有很大提高。主要体现在:①发酵周期缩短了12 h, 在发酵生产中降低了能耗, 且可提高年产量;②最终活菌数提高了约46.70%, 芽孢形成率高, 菌体死亡率较优化前低20.76%。

2.4 吸附载体筛选结果

吸附载体筛选的正交试验结果, 见表4。

注:麸皮、米糠、沙子、碳酸钙的细度都在80目以上。

由表4正交试验结果可见, 影响活菌因素为:米糠>麸皮>碳酸钙>沙子;最佳吸附载体配比为:麸皮25.0 g+沙子20.0 g+碳酸钙45.0 g。

以正交试验得出的最佳吸附载体配比, 与麸皮25.0 g+沙子25.0 g+碳酸钙45.0 g这个配比进行2次比较试验。试验结果经计算后分别为:最佳吸附载体有效活菌数8.9和9.1亿/g, 麸皮25.0 g+沙子25.0 g+碳酸钙45.0 g载体有效活菌数6.7和7.0亿/g。从结果看, 最佳吸附载体活菌数要比对比吸附载体有效活菌数高。

3 讨 论

1) 枯草芽孢杆菌扩培工艺最佳条件为:最佳发酵培养基葡萄糖0.5%+淀粉1.0%+黄豆粕3.0%+硫酸锰0.2‰+磷酸氢二钾0.3‰+硫酸镁0.2‰+碳酸钙0.7%+硫酸铵0.1%。

2) 最佳吸附载体配比为:麸皮25.0 g+沙子20.0 g+碳酸钙45.0 g。

3) 枯草芽孢杆菌在工业水处理、农业领域、畜禽养殖3方面都有广泛的应用, 是一种多功能的有益菌剂。

摘要：本研究课题是从实际生产出发, 以一株枯草芽孢杆菌为研究对象, 通过对培养基碳源、氮源等的选择及配比的正交试验, 确定出最适合枯草芽孢杆菌产芽孢的培养基, 再通过对吸附载体配比的正交试验, 确定出最佳枯草芽孢杆菌液体吸附载体, 为发酵生产过程中枯草芽孢杆菌生产工艺提供参数。结果发现, 枯草芽孢杆菌扩培工艺最佳条件为:最佳发酵培养基葡萄糖0.5%+淀粉1.0%+黄豆粕3.0%+硫酸锰0.2‰+磷酸氢二钾0.3‰+硫酸镁0.2‰+碳酸钙0.7%+硫酸铵0.1%;最佳吸附载体配比麸皮25.0g+沙子20.0g+碳酸钙45.0g。试验表明, 当培养基配方为葡萄糖0.5%、淀粉1.0%、黄豆粕3.0%、硫酸锰0.2‰、磷酸氢二钾0.3‰、硫酸镁0.2‰、碳酸钙0.7%、硫酸铵0.1%, 优化的培养基条件能有效促进枯草芽孢杆菌生长, 并能促进枯草芽孢杆菌芽孢的生成。

关键词：枯草芽孢杆菌,扩培工艺,吸附载体,培养基,正交试验,发酵培养,益生菌剂

参考文献

[1]吴俊罡, 张秉胜, 刘吉华, 等.枯草芽孢杆菌发酵培养基优化培养实验[J].国外畜牧学:猪与禽, 2003, 23 (3) :31-33.

[2]王妹, 陈有光, 段平, 等.枯草芽孢杆菌培养基配方优化的研究[J].渔业现代化, 2008, 35 (6) :44-47.

[3]俞渭江.生物统计附试验设计[M].北京:北京农业出版社, 1991.

枯草芽孢杆菌的分离与初步鉴定 篇7

1 材料与方法

1.1 试验样品

新鲜土壤, 从山东省荷泽市某村田地土壤表层约10 cm下采集的肥土。

1.2 试剂

高保真Taq DNA聚合酶、各种限制性内切酶, 均购自北京赛百盛基因技术有限公司;p MD18-T载体, 购自宝生物工程 (大连) 有限公司;超薄琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和细菌DNAout (G+) , 均购自绵阳高新区天泽基因工程有限公司;E.coli DH5α感受态细胞, 由菏泽学院预防兽医实验室保存。

1.3 样品的热处理

将采集的新鲜土壤加到营养肉汤培养基中, 37℃培养18~24 h, 然后放于75~80℃水浴中热处理10~15 min。

1.4 细菌的分离

将热处理后的培养物用平板划线分离法涂布于普通琼脂平板上, 37℃培养18~24 h;选取生长良好的菌落反复接种, 经数次琼脂培养基培养筛选, 挑选在培养基上呈单个、灰白色、不规则、菌落边缘不整齐、表面粗糙的干燥型菌落镜检、观察并进行纯培养。

1.5 细菌的鉴定

1.5.1 细菌的生化鉴定

根据《伯杰细菌鉴定手册》对分离细菌进行常规的生理生化鉴定。

1.5.2 细菌的PCR鉴定

引物的设计与合成:根据Gen Bank中已发表的枯草芽孢杆菌16S r RNA基因序列应用Primer Premier 5.0软件自行设计合成了1对能扩增1 154 bp基因片段的引物 (由北京赛百盛基因技术有限公司合成) , 序列为P1 5'-CACTGG-GACTGAGACACGG-3', P2 5'-GGCGGCTGGCTC-CTAAAA-3'。

枯草芽孢杆菌基因组DNA的提取:挑取枯草芽孢杆菌单菌落接种到5 m L营养肉汤中, 37℃振荡培养过夜, 参考细菌DNAout (G+) 试剂盒说明书提取全基因组。

PCR体系与反应条件:以提取的枯草芽孢杆菌全基因组DNA为模板, 用合成的引物进行PCR扩增。反应体系 (25μL) :DNA模板2μL, 10×PCR Buffer 2.5μL, 上、下游引物 (25μmol/L) 各0.5μL, d NTP 2μL, Taq DNA聚合酶0.25μL, dd H2O17.25μL。优化的PCR反应条件:94℃5 min;94℃1 min, 57℃1 min, 72℃1 min, 共30个循环;72℃10 min[6]。PCR结束后, 取5μL PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳, 观察结果。

目的片段的回收、纯化及序列测定:参照超薄琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明回收纯化目的片段, 然后将其与p MD18-T载体连接, 将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞, 挑斑, 扩大培养, 抽提重组质粒进行酶切鉴定和PCR鉴定, 将鉴定为阳性克隆的菌液送宝生物工程 (大连) 有限公司测序。

16S r RNA基因序列分析:利用DNAStar软件对所测定基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行编辑, 并与Gen Bank中的序列进行同源性比较。

2 结果

2.1 细菌的形态特征

在普通营养琼脂平板上, 菌落为圆形, 边缘不规则, 表面有皱襞, 挑取单个菌落涂片, 可见革兰阳性、直杆状细菌, 常成对或呈链状排列, 在营养条件贫乏或生长条件不利的情况下形成芽孢。

2.2 生化特性鉴定结果

细菌的生化鉴定结果为接触酶反应阳性, 利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇且产酸, 利用柠檬酸盐, 不利用丙酸盐, 不形成吲哚, 水解淀粉, 可使明胶液化。

上述结果均符合枯草芽孢杆菌的生化特性, 初步证明分离菌为枯草芽孢杆菌。

2.3 细菌PCR鉴定结果

2.3.1 16Sr RNA序列的PCR扩增结果

见图1。

M.DL-2 000 Marker;1~3.PCR扩增产物。

所获得的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳呈单一条带, 大小与预期 (1 154 bp) 相符。

2.3.2 重组质粒的PCR鉴定结果

将所获得的目的片段连接p MD-18T载体, 转化E.coli DH5α感受态细胞, 获得大量重组转化子, 从中随机挑选几个重组转化子单菌落, 以PCR方法进行鉴定, 琼脂糖凝胶电泳结果显示, 以引物P1和P2扩增得到了大小约为1 154 bp的特异性片段, 表明所检测的克隆中含有目的片段 (见图2) 。

M.DL-2 000 Marker;1, 2.重组质粒PCR鉴定结果。

2.3.3 重组质粒的双酶切鉴定结果

重组质粒经Bam HⅠ和HindⅢ双酶切后, 得到大小约为1 190 bp的插入片段和大小约为2 656 bp的载体片段, 证明所挑取的克隆为正确的重组转化子 (见图3) 。

2.3.4 16S r RNA测序结果

将疑似阳性克隆的菌液送宝生物工程 (大连) 有限公司进行测序, 利用DNAStar软件对所测定基因的核苷酸序列进行编辑, 并与Gen Bank中的南京株D1、浙江株ZJUT zy、青岛株H-1、北京株W-3、沈阳株BS3902、上海株EXWB4-09、河南株G7、德国株EHF-S1-AC2Ha以及美国株SMY序列进行同源性比较, 分离株与其他株核苷酸同源性均为99.6%, 其他株之间的核苷酸同源性为100%。

3 讨论

1) 根据芽孢杆菌耐酸、耐盐、耐高温及耐挤压的特性, 试验采用的75~80℃水浴中热处理10~15 min的样品处理方式, 从一定程度上简化了细菌分离的繁琐性, 使分离细菌的操作简单化。

2) 本试验从新鲜土壤中分离得到1株革兰阳性杆菌, 其形态特征以及生理生化特性与文献报道的枯草芽孢杆菌的特性是一致的, 但是由于细菌生理生化性状的可变性以及某些细菌生理生化特性的相似性, 因此用常规的生理生化指标测定很难得到准确的鉴定结果。枯草芽孢杆菌与蜡样芽孢杆菌细菌形态特征及其生理生化特性极其相似, 在伯杰氏细菌鉴定手册 (1984年版) 和国内其他参考文献中都没有查到这两类菌的明显的区别, 因此从形态特征及其生理生化特性只能初步证实分离细菌为枯草芽孢杆菌。

3) 为进一步证实分离得到的细菌为枯草芽孢杆菌, 试验在生理生化鉴定的基础上又进一步做了分子生物学鉴定。16S r RNA基因序列分析在微生物种群分析方面应用广泛, 已成为细菌分类和鉴定的一个有力工具。16S r RNA是核糖体小亚基的骨架, 在结构上分为保守区、半保守区和非保守区, 保守区序列基本恒定, 半保守区和非保守区序列因不同种、属细菌而异, 一般不同属细菌16S r RNA基因同源性为70%~90%, 而同种内不同株间基因同源性>99.5%[4]。本试验扩增的16S r RNA基因序列与Gen Bank中的枯草芽孢杆菌16S r RNA基因的同源性达到99.6%, 大于99.5%, 进一步说明分离细菌为芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌种。本试验分离的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌功能基因及其相关研究奠定了基础。

参考文献

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[1]汤保贵, 徐中文, 张金燕, 等.枯草芽孢杆菌的培养条件及对水质的净化作用[J].淡水鱼业, 2007, 37 (3) :45-48.

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枯草芽孢杆菌制剂 篇8

由于生防微生物在田间条件下易受土壤温湿度、pH值、作物生长状况及土壤生态系统等微环境因素的影响,防治效果不稳定,用于大面积推广应用风险太大。因此,大多数枯草芽孢杆菌的生防研究总体上还处于实验室阶段[11,12,13,14,15,16]。为了解决这一问题,目前主要采用与化学农药复配防病和与其他拮抗微生物协同防病这两种措施。

与化学农药复配防病是通过使用化学药剂来帮助枯草芽孢杆菌克服在土壤生态环境里定殖的过程中与其它微生物群落竞争,从而形成优势种群,使之有足够的群体数量来克服包括病原菌在内的土壤习居微生物的排斥,保持其在植物根、叶周围定殖、分泌抗生素、诱导植物抗病性等作用,同时发挥化学药剂杀虫抑菌速度快、防治效果稳定的优势,通过复配协同作用达到优势互补、用量减少、防效增强的目的[16,17,18,19,20,21]。

1 材料与方法

1.1 供试菌株和虫源

枯草芽孢杆菌由本实验室分离保存。

供试的虫种为菜青虫,黑龙江省科学院生物肥料研究中心室内常年累代饲养多代敏感虫种。

1.2 培养基

斜面培养基:LB培养基(蛋白胨10%,酵母浸粉5%,Na Cl 5%,蒸馏水,pH值自然)。

种子培养基:蛋白胨1%,酵母浸出物0.5%,氯化钠1%,自然p H值。

发酵培养基:蔗糖1%,蛋白胨1%,磷酸氢二钠0.2%,磷酸二氢钠0.2%,pH 7.0。

1.3 菌种活化

将保存的菌种转接到斜面培养基,37℃培养24h,备用。

1.4 种子液的制备

取一环活化的菌种,接入装量为50 m L种子培养基的250 m L三角瓶中,37℃,180 r/min培养18h。

1.5 摇瓶培养

取1 m L种子液,接入盛有50 m L发酵培养基的200mL三角瓶中(接种量为2%,V/V)。置摇床中,30℃振荡培养12h,转速为160 r/min,进行发酵。

1.6 枯草芽孢杆菌生长曲线的测定

取培养好的斜面,用接种环挑3环接种于盛有50mL无菌种子培养基的250mL三角瓶中,采用摇瓶发酵培养条件振荡培养24h。自接种后每2h取样1次测定菌液的OD(600 nm),用未接种的培养基作为空白对照。

1.7 杀虫活性物质的酸碱稳定性测定

取发酵液10 m L进行杀虫实验,再用稀HCl或稀Na OH将其p H值调至2.0,3.5,4.0,5.0,6.5,8.0,9.5,11.0,静置24 h后,再调pH值为原发酵液的pH值6.8后,进行杀虫活性测定。

2 结果与分析

2.1 生长曲线的测定

生长曲线图见1,发酵培养0～2 h为枯草芽孢杆菌的生长停滞期,细菌数量极少;自2h以后进入对数生长期,菌体数量急剧增多;在12h达到生长高峰期,8～12h为枯草芽孢杆菌生长的稳定期,菌体生长缓慢。自12h后细菌数量开始减少,枯草芽孢杆菌进入生长衰亡期。因此,采用8～12h时的菌液作为菌种较合适,此时枯草芽孢杆菌为对数生长末期,既可保持高的细胞活力,又可获得尽可能多的细胞数。

2.2 杀虫活性物质的酸碱稳定性

枯草芽孢杆菌发酵液在pH值为2.0～11.0的条件下处理24 h后,进行杀虫性试验,试验结果见表1。

注:以上试验结果是三次试验结果的平均值

2.3 讨论

研究结果表明,枯草芽孢杆菌的杀虫作用主要有两种方式,一是造成细胞畸形,出现囊泡、肿胀,继而崩溃融解。二是对细胞壁的破坏,造成原生质从细胞壁融解处泄漏,以至消融。

3 结论

通过实验可以得出枯草芽孢杆菌在不同的时间处在不同的生长时期,经实验分析得出枯草芽孢杆菌在8～12h为生长的稳定期,菌体生长缓慢。自12h后细菌数量开始减少,枯草芽孢杆菌进入生长衰亡期。因此,采用8～12 h时的菌液作为菌种较合适,此时枯草芽孢杆菌为对数生长末期,既可保持高的细胞活力,又可获得尽可能多的细胞数。

枯草芽孢杆菌制剂 篇9

1试验材料与方法

1.1试验药剂

供试药剂:1000亿芽孢/g枯草芽孢杆菌、有机硅助剂, 由德强生物股份有限公司生产;对照药剂:2%加收米液剂, 由日本北兴化学工业株式会社生产。

1.2试验地基本情况

试验设在八五四农场农业科技研发中心水稻园区4区1池, 土壤为草甸白浆土, 肥力中等, 有机质含量4%, pH值5.8, 碱解氮14.9mg/kg, 速效磷25.4mg/kg, 速效钾68mg/kg, 地势平坦, 20年老稻田, 秋翻地, 春水整地。公顷施尿素180kg, 基∶蘖∶调∶穗=4∶3∶1∶2;公顷施磷酸二铵127.5kg, 全部基施;公顷施50%硫酸钾105kg, 基∶穗=7∶3。试验水稻品种空育163, 5月20日人工插秧, 行穴距27cm×12cm, 本田以“三化一管”技术措施为指导。田间除草采用2次施药, 插秧前配方为稻好适750mL/hm2+阿罗津450mL/hm2+吡嘧磺隆225g/hm2, 插秧后配方为瑞飞特900mL/hm2+草克星150g/hm2。2次防虫, 喷施速克毙450mL/hm2防治水稻潜叶蝇和负泥虫。

1.3试验设计

采用小区对比试验, 小区面积30m2, 3次重复。试验设6个处理, 处理1为1000亿芽孢/g枯草芽孢杆菌150g/hm2+有机硅助剂;处理2为1000亿芽孢/g枯草芽孢杆菌225g/hm2+有机硅助剂;处理3为1000亿芽孢/g枯草芽孢杆菌300g/hm2 (防治穗颈瘟用药1次) +有机硅助剂;处理4为1000亿芽孢/g枯草芽孢杆菌225g/hm2;处理5为加收米1500mL/hm2;处理6为清水对照。根据试验要求, 7月2日田间调查发现水稻叶片上有微小稻瘟病斑点, 处理1、2、4、5和对照按要求计量喷施1000亿芽孢/g枯草芽孢杆菌和加收米;7月15日各处理按要求喷施第2遍药剂, 处理3喷施第1遍1000亿芽孢/g枯草芽孢杆菌;7月25日水稻齐穗后, 处理1、2、4、5和对照按要求计量喷施1000亿芽孢/g枯草芽孢杆菌和加收米, 对照喷施等量清水。喷药采用人工背负式喷雾器, 喷液量225L/hm2, 喷药时天气晴, 微风。

1.4试验调查

调查喷药前后田间水稻植株长势情况, 观察1000亿芽孢/g枯草芽孢杆菌对水稻的安全性;试验区随机取3点, 每点连续10穴调查喷药后水稻叶瘟病和穗颈瘟的发病率和严重程度, 计算稻瘟病防治效果;水稻成熟后调查植株生育性状和产量性状, 每处理区收获2m2测产, 了解其对水稻产量的影响。

2试验结果与分析

2.1水稻安全性调查

试验各处理喷药后进行跟踪调查水稻长势情况, 发现水稻没有出现药害症状, 对水稻生长安全。2.2病害防治效果调查

根据对水稻叶瘟病和穗颈瘟的病害调查数据可以看出, 1000亿芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对水稻叶瘟病病情指数防效达到43.30%～56.70%;对穗颈瘟病情指数防效达到71.43%～76.50%。总的来说, 1000亿芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对水稻稻瘟病的防治效果较好。

2.3产量调查

通过植株考种和收获测产可知 (见表1) , 1000亿芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂各处理的水稻穗长、穗粒数、结实率、千粒重和产量都明显高于对照, 与常规药剂相当, 比对照增产5.2%～8.1%。

3小结

通过药剂1000亿芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对水稻稻瘟病防治试验, 明确其对叶瘟病和穗颈瘟的防治效果, 对水稻叶瘟病病指防效为43.30%～56.70%, 对穗颈瘟病指防效为71.43%～76.50%, 对水稻安全, 增产效果明显, 比对照增产5.2%～8.1%。

摘要：通过对水稻破口期和齐穗期喷施1000亿芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂防治水稻稻瘟病试验, 了解其对水稻的安全性和防治效果。结果表明, 1000亿芽孢/g枯草芽孢杆菌的使用对水稻生长安全, 对水稻叶瘟病病指防效为43.30%～56.70%, 对穗颈瘟病指防效为71.43%～76.50%, 增产效果明显, 增产5.2%～8.1%。

枯草芽孢杆菌制剂 篇10

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地为连作7年的水稻田, 土壤类型为草甸黑土, 有机质含量为3.5%, p H值为6.8。该地块在2011年水稻稻瘟病发生较重, 平均发病级数为3级。

1.2 试验材料

供试药剂:枯草芽孢杆菌 (黑龙江强尔生化技术开发有限公司) 、40%稻瘟灵乳油 (重庆中邦药业有限公司) 。供试水稻品种:空育131。

1.3 试验设计

试验设5个处理, 处理1:枯草芽孢杆菌拔节期150 g/hm2, 始穗期75 g/hm2, 齐穗期75 g/hm2;处理2:枯草芽孢杆菌拔节期150 g/hm2, 始穗期75 g/hm2, 齐穗期150 g/hm2;处理3:枯草芽孢杆菌拔节期150 g/hm2, 始穗期150 g/hm2, 齐穗期150 g/hm2;处理4:40%稻瘟灵乳油拔节期600 g/hm2, 始穗期600 g/hm2, 齐穗期600 g/hm2;以清水作对照 (CK) 。施药日期分别为拔节期6月21日, 始穗期7月27日, 齐穗期8月3日。试验采取大区对比法, 不设重复, 其中处理1、2、3、4面积各为一个自然池, 每个自然池面积1 000 m2。

1.4 试验方法

采用0.01 g电子秤量取试验药剂, 采用机动弥雾机对水450 kg/hm2喷雾, 并于6月5日用10%吡虫啉450 g/hm2对水稻潜叶蝇进行防治。各小区管理条件一致。

1.5 调查内容与方法

试验共调查3次, 分别为第1次施药前 (6月20日) , 最后1次施药前 (8月2日) 和最后1次施药后14 d (8月17日) 。叶瘟病采用5点取样法, 每点取50株;穗瘟病采用5点取样法, 每点取样50穗。记录总株数、病株数和病级数。于10月1日进行测产。

叶瘟病分级标准:0级:无病;1级:叶片病斑少于5个, 长度小于1 cm;3级:叶片病斑6~10个, 病斑长度大于1 cm;5级:叶片病斑11~25个, 部分病斑连成片, 占叶面积10%~25%;7级:叶片病斑26个以上, 病斑连成片, 占叶面积26%~50%;9级:病斑连成片, 占叶面积50%以上或全叶枯死。

穗颈瘟病分级标准:0级:无病;1级:每穗损失5%以上 (个别枝梗发病) ;3级:每穗损失6%~20% (1/3左右枝梗发病) ;5级:每穗损失21%~50% (穗颈或主轴发病, 谷粒半瘪) ;7级:每穗损失51%~70% (穗颈发病, 大部半瘪) ;9级:每穗损失71%~100% (穗颈发病造成白穗) [3,4,5]。用新复极差 (DMRT) 法对试验数据进行方差分析, 其计算公式如下:

2 结果与分析

2.1 对水稻的安全性

通过观察发现, 供试药剂在试验剂量范围内未发现对作物产生药害, 各处理均未出现蹲苗、畸形等药害症状, 各处理秧苗长势与空白对照无明显差别, 对水稻安全。

2.2 不同处理对水稻稻瘟病的防效

由表1可知, 第1次施药前稻瘟病没有发生, 没有调查数据。末次施药前调查, 处理1~4对水稻稻瘟病叶瘟的防效分别为80.17%、83.97%、89.57%、84.60%, 按照防效高低顺序排列为:处理3>处理4>处理2>处理1;未次施药后14 d调查, 处理1~4对水稻穗瘟的防效分别为80.36%、88.57%、90.46%、93.21%, 按防效高低排列为:处理4>处理3>处理2>处理1。虽然从数据上看各处理间防效有一定差别, 方差分析表明, 2次调查各处理之间对水稻稻瘟病的防效差异均不显著。

2.3 不同处理对水稻产量的影响

由表2可以看出, 处理1~4的产量分别为8 500.00、8 710.00、9 008.33、8 735.83 kg/hm2, 处理1~4分别较CK增产7.41%、10.07%、13.84%、10.39%。

注:小区测产面积为30 m2。

3结论与讨论

试验结果表明:黑龙江强尔生化技术开发有限公司生产的枯草芽孢杆菌, 在试验用药范围内对水稻安全, 对水稻稻瘟病防治效果好, 增产效果明显, 可以在生产中推广使用。推荐预防水稻叶瘟应在发病初期用药, 预防穗颈瘟施药时期以抽穗始期及齐穗期各用1次药为宜, 用药量为每次150 g/hm2, 采用茎叶均匀喷雾。

参考文献

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[2]贾书娟, 曾大兴, 吴小丽, 等.枯草芽孢杆菌C-D6抗菌蛋白对稻瘟病菌的抑菌作用[J].中国生物防治学报, 2011, 27 (3) :362-367.

[3]畦善新.枯草芽孢杆菌防治水稻稻瘟病试验示范[J].农村经济与科技, 2011, 22 (7) :31-32.

[4]王辉.枯草芽孢杆菌防治水稻稻瘟病试验示范[J].中国农村小康科技, 2009 (2) :69, 72.