环状芽孢杆菌（精选9篇）
环状芽孢杆菌 篇1
β-甘露聚糖酶 (β-1, 4-D-mannan mannohydrolase;EC3.2.1.78) 是一种半纤维素水解酶, 根据其作用机制, 它能分解饲料中对营养吸收有妨碍的多糖物质 (包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖等) , 而常用的饲料原料如豆粕、芝麻粕、油菜籽粕等都含有上述多糖物质。β-甘露聚糖酶一方面通过分解上述多糖, 除去其抗营养的不良作用, 促进营养的消化和吸收;另一方面, β-甘露聚糖酶通过内分泌和免疫途径, 提高营养成分 (特别是能量) 利用率, 并且改善动物健康状况, 从而提高动物生产水平[1]。试验在肉鸡饲料中添加环状芽孢杆菌发酵产物 (主要成分为β-甘露聚糖酶) , 以检验该发酵产物在上述两个方面的作用效果, 现报道如下。
1 材料与方法
1.1 发酵产物、饲料及添加剂
发酵产物, 以环状芽孢杆菌为目的菌, 按照一定的发酵工艺[1], 得发酵液8 000×g/min离心20 min, 取上清液。主要成分为β-甘露聚糖酶, 活性为570.9活性单位/m L, 在饲料中的添加量为125 m L/kg。
饲料, 玉米-豆粕型基础日粮。
盐霉素, 添加量为60 g/t, 购自浙江钱江生物技术有限公司。
杆菌肽锌预混剂, 添加量为50 g/t, 天津市新星制药厂生产。
1.2 试验动物
1日龄AA商品肉鸡, 购自北京华都肉鸡公司。
1.3 试验设计
1.3.1 发酵产物对肉鸡体重均匀度的影响
选取1日龄AA肉鸡40只, 随机分为试验组和对照组 (雌雄混养) , 每组20只。
体重, 分别于21, 35, 49日龄对每只鸡称重, 计算体重均匀度。
均匀度的计算方法:个体称重后, 计算鸡群平均体重。然后确定一个在平均体重±10%的范围。在此范围内的鸡数除以所称体重鸡数的百分数就是体重均匀度。
1.3.2 发酵产物在肉鸡受病菌感染以及应激条件下的作用
试验选取80只1日龄AA肉鸡随机分为6组 (雌雄混养) :1组10只, 为不感染不加发酵产物组;2组10只, 为不感染加发酵产物组;3组15只, 为不感染不加发酵产物, 但加入盐霉素以及杆菌肽锌等抗生素;4组15只, 为不感染加入发酵产物, 同时加入盐霉素以及杆菌肽锌等抗生素;5组15只, 为感染不加发酵产物组;6组15只, 为感染加发酵产物组。
试验第16天感染组每只肉鸡经口灌服10 000个堆型艾美儿球虫 (Eimeria acervulina) 卵囊和1 500个巨型艾美儿球虫 (Eimeria maxima) ;分别在肉鸡19, 20, 21日龄每只经口灌服1 m L (1×108个/m L) 产气荚膜芽孢杆菌 (Clostridium perfringens) , 22日龄开始每天每组解剖3只肉鸡观察球虫感染程度以及病变的恢复情况。
试验期为28 d。
1.4 测定项目
1) 采食量, 为每组每只肉鸡从试验开始到结束平均消耗的总饲料量 (kg) ;2) 料重比, 料重比=每组饲料总消耗量/每组总鸡重量;3) 增重, 试验结束时每组鸡重量/每组鸡数量;4) 死亡率, 死亡率=试验结束时的死鸡数/试验开始时的鸡数×100%。
2 结果与分析
2.1 肉鸡体重均匀度
2.1.1 均匀度的比较
见表1。
注:同行数据肩标字母不同表示差异显著 (P<0.05) , 相同表示差异不显著 (P>0.05) 。
由表1经计算可知, 饲料中添加发酵产物后, 肉鸡体重均匀度在各阶段均有明显提高, 提高率最高达到26.7%。说明饲料中添加环状芽孢杆菌发酵产物后可以显著提高鸡群体重均匀度。
2.1.2 各体重阶段鸡数的比较
见表2、图1。
由表2和图1可知:对照组肉鸡在各段均有分布, 其中以1 626~1 825 g范围内为最多, 但也只占到全部肉鸡的35%, 大多数都处在1 376~2 125 g范围之内, 均匀度很差。试验组虽然在1 376~1 625 g和2 126~2 375 g范围也有分布, 但所占比例不大, 大多数肉鸡在1 626~2 125 g之间, 占到80%;而相同比例情况下, 对照组只占到55%。由此可见, 添加发酵产物有效地改善了肉鸡的体重均匀度。另外, 对2组肉鸡进行对比后发现, 试验组比对照组平均增重80 g/只, 平均料重比降低0.2, 可见添加发酵产物可以显著提高肉鸡饲料利用率。
2.2 发酵产物在肉鸡受病菌感染以及应激条件下的作用 (见表3)
注:同列数据肩标字母不同表示差异显著 (P<0.05) , 相同表示差异不显著 (P>0.05) 。“+”表示有此项, “-”表示无此项。
由表3可知:2组添加发酵产物后, 肉鸡采食量增加, 同时增重比没加发酵产物组显著提高 (P<0.05) , 料重比比没加发酵产物酶组显著降低 (P<0.05) , 这是发酵产物的能量效应因素所起的作用。
4组添加发酵产物后, 肉鸡采食量降低, 虽然增重没有不加发酵产物组高, 但料重比比没加发酵产物组低, 进一步验证了发酵产物能分解饲料中的多聚糖, 促进营养物质的消化吸收, 提高能量的利用率。
5, 6组受球虫感染, 肉鸡生长水平受到了严重的阻碍, 采食量、平均增重此前4组出现显著降低 (P<0.05) , 料重比也出现不同程度的增高。但是同在感染条件下, 添加发酵产物后发酵产物对肉鸡生长水平———料重比和增重都起到了一定的恢复作用, 同时肉鸡采食量也有所提高。在死亡率方面, 添加发酵产物组没有肉鸡死亡, 说明发酵产物显著降低了肉鸡死亡率。
在不同时间进行的剖检结果显示, 不加酶组肉鸡肝脏肿胀, 胆囊空虚, 一侧盲肠肿大, 十二指肠黏膜出血 (针尖样出血点) , 盲肠内有半透明黏液;加酶组肉鸡也有相应炎症出现, 但程度较轻, 黏膜有轻微充血。
3 讨论
3.1 发酵产物对肉鸡体重均匀度的影响
饲料中添加相关酶类, 如β-葡聚糖酶、阿拉伯木聚糖酶、甘露聚糖酶, 能在一定程度上补充内源酶的不足, 尤其是对胃肠道酶系发育不全的幼龄动物[2]。而且这些酶类的底物 (多聚糖) 黏度较高, 在饲料营养成分吸收过程中扮演着抗营养因子的角色。添加以β-甘露聚糖酶成分为主的粗酶液可以在一定程度上消除这类抗营养因子的影响。据M.Jackson等报道:β-甘露聚糖酶能使动物的能量利用率增加, 饲料转化效率和生产性能提高, 添加这种酶可以补充肉鸡日粮代谢能600 k J/kg, 补充猪日粮代谢能420 k J/kg;49日龄肉鸡的体重变异率降低16%。本试验结果与之一致, 添加发酵产物使肉鸡体重均匀度提高到23.4%, 并且随着时间的延长改善情况更加显著。由此可见, 饲料中添加β-甘露聚糖酶对畜禽体重均匀度有明显的提高作用, 在目前大规模密集型养殖企业, 体重均匀度的提高有利于畜禽的饲养管理、同期出栏, 从而提高养殖场的生产效益。
3.2 发酵产物在肉鸡受病菌感染以及应激条件下的作用
G.E.Mathis[3]的研究表明, β-甘露聚糖酶可以有效阻止病原菌和寄生虫对肠道的侵袭, 提高动物的抗病能力。本试验虽然没有对添加发酵产物能代替多少能量进行定量的试验, 但试验结果表明, 在采食量相差不大的情况下发酵产物能提高肉鸡增重, 降低料重比;发酵产物显著降低了肉鸡受球虫感染而导致的死亡率, 这也说明该发酵产品可以通过内分泌和免疫调节途径提高肉鸡抗病性, 改善肉鸡健康状况。经过对比可知, 发酵产物对受球虫感染肉鸡的作用比未受感染的肉鸡更强。
另外剖检结果也显示, 发酵产物的添加可以相对改善肉鸡的病理变化;但发酵产物的添加不能从根本上抵抗球虫的感染, 只对肉鸡增重、料重比和死亡率有一定的改善作用。
4 结论
环状芽孢杆菌发酵产物 (β-甘露聚糖酶) 能够去除饲料中的抗营养因子, 促进营养的消化和吸收, 显著改善动物体重均匀度;在受到病菌感染的情况下, 饲料中添加发酵产物后畜禽死亡率下降, 增重、料重比都比对照组有所改善, 说明发酵产物提高了畜禽的抗病性能, 改善了健康状况, 恢复了生长性能。
摘要：为了探究饲料中添加环状芽孢杆菌发酵产物 (β-甘露聚糖酶) 对改善畜禽体重均匀度和抵抗病菌感染方面的作用, 试验将1日龄AA肉鸡随机分组, 通过测定和计算体重、采食量、料重比、增重及死亡率等指标评价发酵产物的作用效果。结果表明:添加发酵产物的试验组鸡群体重均匀度比对照组平均提高23.4%, 平均增重80 g/只, 料重比降低0.2。而肉鸡在感染条件下 (球虫及产气荚膜芽孢杆菌) 添加发酵产物同样有效改善了肉鸡的采食量、料重比及增重, 并显著降低了死亡率。说明发酵产品能有效改善肉鸡体重均匀度, 并通过某种途径提高肉鸡的抗病性能, 改善健康状况, 恢复生长水平。
关键词：环状芽孢杆菌,发酵产物,肉鸡,体重,均匀度
参考文献
[1]杨新建, 段素云.产β-甘露聚糖酶环状芽孢杆菌发酵罐放大工艺研究[J].中国饲料, 2011 (11) :34-37.
[2]BEDFORD M R.Mechanism of action and potential environmental benefits from the use of feed enzyme[J].Anim Feed Sci Technol, 1995, 53 (2) :145-155.
[3]MATHIS G E.Southern poultry research[M].Georgia:Inc Athens, 2000.
环状芽孢杆菌 篇2
1.提高动物的生产性能
饲用芽孢杆菌可提高动物的生产性能，改善饲料转化率。Mongkol等（2002）研究表明，添加0.2%或0.5%的纳豆、枯草芽孢杆菌组与对照组相比，能显著提高肉鸡的生产性能。周振峰（2006）研究地衣芽孢杆菌对荷斯坦泌乳奶牛泌乳性能的影响，结果表明，地衣芽孢杆菌制剂可以缓解热应激、提高产奶量。栾广春等（2008）给泌乳期奶牛饲喂纳豆芽孢杆菌，可显著提高产奶量（P＜0.05），并且随着纳豆芽孢杆菌添加量的增加，产奶量也有增加的趋势。李丽红等（2005）试验表明，饲料中添加0.05%芽孢杆菌复合微生态制剂可以显著提高蛋鸡的产蛋量。朱五文等（2007）在断奶仔猪基础日粮中分别添加不同剂量的枯草芽孢杆菌制剂，试验末期平均净增重、日增重均高于空白对照组。且与添加枯草芽孢杆菌制剂的剂量成正比。刘晓琳等（2008）在断奶仔猪日粮中添加地衣芽孢杆菌，在试验末期（21日龄），添加组体重显著高于空白对照组，平均总增重和平均日增重分别比对照组提高了12.33%和13.89%,差异显著（P＜0.05）；而料肉比显著降低15.49%，差异极显著（P＜0.01）。
2.预防腹泻和防治疾病
芽孢杆菌用于防治畜禽腹泻具有明显效果。戴国俊等（2007）试验表明，地衣芽孢杆菌有降低仔猪腹泻的趋势。吴昌标等（2008）认为，苏云金芽孢杆菌可以用来防治动物捻转血矛线虫、防治动物血吸虫病、猪蛔虫病、绵羊绿铜蝇等。
3.改善畜舍的环境，减少环境污染
环状芽孢杆菌 篇3
本研究所用菌株枯草芽孢杆菌B91是本实验室的自有菌株, 能够抑制多种植物病原菌, 具有较好的田间防效, 具有广泛的应用前景。本文对其发酵条件进行优化, 提高其发酵液中菌体密度及芽孢形成率, 为下一步扩大生产打下基础。
1 材料与方法
1.1 实验菌种
枯草芽孢杆菌B91菌株由本实验室提供。
1.2 发酵培养基
葡萄糖9.4 g/L, 酵母膏6.9 g/L, 氯化钠3 g/L, K2HPO42 g/L, MgSO40.2 g/L, MnSO410.2 mg/L, CaCO30.2 g/L, 培养基采用湿热灭菌:121℃, 15 min。
1.3 培养方法
1.3.1 种子活化及培养
种子活化及培养参照文献[5]。
1.3.2 发酵培养
接种量均为1%, 250mL的三角瓶装液量为50m L, 摇床转速为150 rpm, 30℃下培养48 h。
1.4 芽孢计数
沸水浴处理待测样品20 min, 灭活未形成芽孢的营养体, 冷却后采用菌落计数法计数测得样品芽孢数[6]。
1.5 单因素实验
选择装液量、发酵液初始pH值、发酵温度作为主要优化因素, 装液量分别设为30mL、50mL、70mL、90mL, 发酵pH值分别设为5、6、7、8、9, 发酵温度分别设为28℃、31℃、34℃、37℃、40℃。
1.6 响应面分析
采用Box-Behnken设计, 在摇瓶发酵条件下优化三个发酵条件:装液量、pH、温度, 设计3因素3水平的响应面分析试验 (表1) 。
2 结果与分析
2.1 单因素实验
2.1.1 装液量对芽孢数量的影响
在摇瓶发酵过程中, 装液量直接关系发酵液的溶氧系数, 装液量越少溶氧越高, 反之亦然。如图1所示, 摇瓶的装液量对芽孢形成数量影响显著 (P<0.05) , 装液量为50 mL/250m L时芽孢数量最多, 达到40.9亿/mL, 当装液量继续增加时, 由于溶氧降低, 抑制了芽孢的形成, 所以芽孢形成数量减少。
2.1.2 初始p H对芽孢数量的影响
如图2所示, 发酵初始pH值对芽孢形成的影响变化趋势, 当发酵初始pH值在5~7, 芽孢形成数量迅速增加, 而当发酵初始pH值为8时芽孢数量达到最大42.1亿/mL, 随着发酵初始pH值继续增加, 芽孢数量呈逐渐下降趋势, 所以初始pH 8设为响应面试验中心试验点。
2.1.3 发酵温度对芽孢数量的影响
发酵温度影响菌体的生长繁殖, 如图3所示, 发酵温度31℃时芽孢形成数量最多, 为43.5亿/mL, 随着发酵温度的升高芽孢数量呈下降趋势, 所以选择发酵温度30℃进行响应面实验。
2.2 响应面法优化发酵条件
响应面试验结果见表2, 经过多元回归拟合, 获得的芽孢数 (Y) 对X1、X2和X3三个自变量的三元二次回归模型方程:Y=44.54-3.1375A-0.125B+1.2375C-2.625AB-1.7AC+1.625BC-6.17A2-1.595 B2-6.82 C2。利用软件Design Expert 8.0进行求导, 解出极值点, 算出每个因素的最佳值:装液量为44.74 mL、初始pH为8.34、温度为31.52℃, 此时模型的理论最优芽孢浓度为45.18亿/mL。
表3为回归模型方差分析结果, 由结果可知模型是显著的 (P≤0.0001) , 并且决定系数为0.9832, 说明该模型是准确可靠的, 因此, 可用此模型对枯草芽孢杆菌B91的发酵条件进行分析和预测[6,7]。
以回归方程为基础, 采用软件分析绘制两两因素间相应的响应面分析图 (图4~6) , 响应曲面的极值点是两个因素交互的最大值, 根据响应面分析结果, 枯草芽孢杆菌B91菌株芽孢浓度最优极值点为装液量为44.7 mL、初始pH为8.3、温度为31.5℃, 预测最优值为45.18亿/mL。
3 讨论与结论
培养条件对于细菌的繁殖, 尤其是芽孢的产生尤为重要, 在单因素实验中发现最适合B91菌株摇瓶发酵的条件为装液量50 mL/250mL, 初始pH值8, 发酵温度30℃, 在此基础上发酵48h芽孢形成较好为43.5亿/mL。在上述条件基础上设计了响应面实验, 响应回归模型的决定系数为0.9832, 说明该模型拟合程度良好, 最优培养条件为装液量44.74 mL、初始pH 8.34、温度31.52℃。在最优条件下发酵培养, 芽孢浓度为44.89亿±0.29亿/mL与模型的理论最优芽孢浓度为45.18亿/mL相近, 说明该模型拟合的有效性。
摘要：在三角瓶培养条件下, 采用单因素实验对枯草芽孢杆菌B91发酵条件装液量、起始p H值及温度进行了优化。在此基础上进行了响应面分析, 获得了响应面回归模型, 模型拟合良好, 确定了菌株B91最佳的产孢发酵条件为装液量44.7 mL、初始pH8.3、温度31.5℃。在最优条件下发酵培养, 芽孢浓度为44.89亿±0.29亿/mL, 较优化前提高了36.4%。
关键词：枯草芽孢杆菌,芽孢,响应面,发酵条件,优化
参考文献
[1]赵朋超, 王建华, 权春善, 等.枯草芽孢杆菌抗菌肽生物合成的研究进展[J].中国生物工程杂志, 2010, 30 (10) :108-113.
[2]张彩凤.生防菌枯草芽孢杆菌的研究进展[J].现代农村科技, 2015, (21) :47-47.
[3]甄静, 郭直岳, 谢宝恩, 等.枯草芽孢杆菌XK-1产芽孢条件的优化[J].中国农学通报, 2012, 28 (27) :146-151.
[4]郭夏丽, 狄源宁, 王岩, 等.枯草芽孢杆菌产芽孢条件的优化[J].中国土壤与肥料, 2012, (03) :99-103.
[5]孟利强, 赵晓宇, 陈静宇, 等.响应面法优化枯草芽孢杆菌B91发酵培养基[J].安徽农业科学, 2015, (25) :26-29.
[6]陈琳, 孟祥晨.响应面法优化植物乳杆菌代谢产细菌素的发酵条件[J].食品科学, 2011, 32, (3) :176-180.
饲料中蜡状芽孢杆菌的分离与鉴定 篇4
饲料中蜡状芽孢杆菌的分离与鉴定
从西宁市某饲料厂随机采集饲料样品70份,进行蜡状芽孢杆菌的常规分离培养与鉴定.共检出阳性菌株31株,检出率44.29%(31/70),31株分离株的生化试验结果与蜡状芽孢杆菌完全一致,且31株分离株都具有营养要求低、生长速度快的特点.
作 者：张红见 韩志辉 董启伟 ZHANG Hong-jian HAN Zhi-hui DONG Qi-wei 作者单位：青海大学农牧学院,青海,西宁,810016刊 名：青海大学学报(自然科学版)英文刊名：JOURNAL OF QINGHAI UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE)年，卷(期)：27(4)分类号：Q93-331关键词：饲料 蜡状芽孢杆菌 分离鉴定
环状芽孢杆菌 篇5
1试验材料与方法
1.1试验药剂
供试药剂:1000亿芽孢/g枯草芽孢杆菌、有机硅助剂, 由德强生物股份有限公司生产;对照药剂:2%加收米液剂, 由日本北兴化学工业株式会社生产。
1.2试验地基本情况
试验设在八五四农场农业科技研发中心水稻园区4区1池, 土壤为草甸白浆土, 肥力中等, 有机质含量4%, pH值5.8, 碱解氮14.9mg/kg, 速效磷25.4mg/kg, 速效钾68mg/kg, 地势平坦, 20年老稻田, 秋翻地, 春水整地。公顷施尿素180kg, 基∶蘖∶调∶穗=4∶3∶1∶2;公顷施磷酸二铵127.5kg, 全部基施;公顷施50%硫酸钾105kg, 基∶穗=7∶3。试验水稻品种空育163, 5月20日人工插秧, 行穴距27cm×12cm, 本田以“三化一管”技术措施为指导。田间除草采用2次施药, 插秧前配方为稻好适750mL/hm2+阿罗津450mL/hm2+吡嘧磺隆225g/hm2, 插秧后配方为瑞飞特900mL/hm2+草克星150g/hm2。2次防虫, 喷施速克毙450mL/hm2防治水稻潜叶蝇和负泥虫。
1.3试验设计
采用小区对比试验, 小区面积30m2, 3次重复。试验设6个处理, 处理1为1000亿芽孢/g枯草芽孢杆菌150g/hm2+有机硅助剂;处理2为1000亿芽孢/g枯草芽孢杆菌225g/hm2+有机硅助剂;处理3为1000亿芽孢/g枯草芽孢杆菌300g/hm2 (防治穗颈瘟用药1次) +有机硅助剂;处理4为1000亿芽孢/g枯草芽孢杆菌225g/hm2;处理5为加收米1500mL/hm2;处理6为清水对照。根据试验要求, 7月2日田间调查发现水稻叶片上有微小稻瘟病斑点, 处理1、2、4、5和对照按要求计量喷施1000亿芽孢/g枯草芽孢杆菌和加收米;7月15日各处理按要求喷施第2遍药剂, 处理3喷施第1遍1000亿芽孢/g枯草芽孢杆菌;7月25日水稻齐穗后, 处理1、2、4、5和对照按要求计量喷施1000亿芽孢/g枯草芽孢杆菌和加收米, 对照喷施等量清水。喷药采用人工背负式喷雾器, 喷液量225L/hm2, 喷药时天气晴, 微风。
1.4试验调查
调查喷药前后田间水稻植株长势情况, 观察1000亿芽孢/g枯草芽孢杆菌对水稻的安全性;试验区随机取3点, 每点连续10穴调查喷药后水稻叶瘟病和穗颈瘟的发病率和严重程度, 计算稻瘟病防治效果;水稻成熟后调查植株生育性状和产量性状, 每处理区收获2m2测产, 了解其对水稻产量的影响。
2试验结果与分析
2.1水稻安全性调查
试验各处理喷药后进行跟踪调查水稻长势情况, 发现水稻没有出现药害症状, 对水稻生长安全。2.2病害防治效果调查
根据对水稻叶瘟病和穗颈瘟的病害调查数据可以看出, 1000亿芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对水稻叶瘟病病情指数防效达到43.30%～56.70%;对穗颈瘟病情指数防效达到71.43%～76.50%。总的来说, 1000亿芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对水稻稻瘟病的防治效果较好。
2.3产量调查
通过植株考种和收获测产可知 (见表1) , 1000亿芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂各处理的水稻穗长、穗粒数、结实率、千粒重和产量都明显高于对照, 与常规药剂相当, 比对照增产5.2%～8.1%。
3小结
通过药剂1000亿芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对水稻稻瘟病防治试验, 明确其对叶瘟病和穗颈瘟的防治效果, 对水稻叶瘟病病指防效为43.30%～56.70%, 对穗颈瘟病指防效为71.43%～76.50%, 对水稻安全, 增产效果明显, 比对照增产5.2%～8.1%。
摘要：通过对水稻破口期和齐穗期喷施1000亿芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂防治水稻稻瘟病试验, 了解其对水稻的安全性和防治效果。结果表明, 1000亿芽孢/g枯草芽孢杆菌的使用对水稻生长安全, 对水稻叶瘟病病指防效为43.30%～56.70%, 对穗颈瘟病指防效为71.43%～76.50%, 增产效果明显, 增产5.2%～8.1%。
枯草芽孢杆菌扩培工艺 篇6
1 材料与方法
1.1 菌种、试剂及设备
菌种:枯草芽孢杆菌由三门峡龙飞生物工程有限公司保存。
主要试剂:牛肉膏, 蛋白胨, 氯化钠, 淀粉, 硫酸锰, 玉米粉, 等。
主要设备:隔水式电热恒温培养箱, HZQ-Q振荡器, 立式压力蒸汽灭菌锅。
1.2 菌株的筛选
从购买及实验室保存的枯草芽孢杆菌斜面, 挑去少许菌落划线于促芽孢形成培养基 (牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL) 平皿上, 37 ℃培养20 h左右取出。选择大菌落挑到装有5 mL无菌水的试管中, 震荡均匀后, 置100 ℃水浴中加热15 min, 再涂布于促芽孢形成培养基的平皿上培养, 反复多次。最后选取平皿上的大菌落, 转接到促芽孢培养基的试管斜面上, 37 ℃培养20 h左右拿出放入4 ℃冰箱保存备用。
1.3 发酵培养基优化
通过对培养基碳源、氮源等的选择及配比的正交试验, 确定出最适合枯草芽孢杆菌产芽孢的培养基。
1) 首先选择4种不同培养基进行摇瓶培养, 观察比较活菌数和芽孢形成情况。
2) 培养基的配制:①号培养基为淀粉0.5%+玉米粉1.3%+黄豆粕2.0%+葡萄糖0.5%+碳酸钙0.7%+硫酸铵0.1%+磷酸氢二钾0.3‰+硫酸镁0.2‰;②号培养基为淀粉0.5%+玉米粉1.3%+黄豆粕2.0%+葡萄糖0.5%+碳酸钙0.7%+硫酸铵0.1%+磷酸氢二钾0.3‰+硫酸镁0.2‰+硫酸锰0.2‰+淀粉0.3%;③号培养基为牛肉膏0.3%+蛋白胨1.0%+葡萄糖1.0%+氯化钠0.5%;④号培养基为牛肉膏0.3%+蛋白胨1.0%+葡萄糖1.0%+氯化钠0.5%+硫酸锰0.2‰+淀粉0.3%。
以上4种培养基pH均为7.0～7.2, 且每种培养基各做3瓶, 装液量100 mL/500mL三角瓶, 置立式压力蒸汽消毒器中, 于121 ℃灭菌30 min, 取出备用。
3) 摇瓶种子液制备:将保存的应用菌种在无菌室内接入肉汤培养基中, 在37 ℃、200转/min的摇床上震荡培养12 h。
4) 接种和培养:培养好的种子液以10%接种量, 分别接入4种不同培养基中, 37 ℃振荡培养, 每隔12 h检测1次, 36 h结束培养, 此过程重复3次。
5) 正交试验:将摇瓶结果较好的培养基作为基本培养基, 设计4个因素、3个水平的正交试验, 以进一步优化培养基配比 (培养36 h检测活菌数) 。正交试验设计见表1 (所用培养基中其他营养成分不变) 。
1.4 三角瓶摇瓶模拟发酵罐试验
以摇床正交试验得出的最佳培养基, 进行100 mL/500mL三角瓶摇瓶震荡培养, 并与肉汤培养基培养的进行2次比较试验。
发酵培养条件:培养基121 ℃灭菌30 min, 培养温度37 ℃, 搅拌速度200转/min, 当芽孢率达到80%以上时, 发酵结束, 此试验重复2次。
1.5 吸附载体的筛选
首先选择4种不同载体配比进行吸附试验比较, 4种载体配比后, 置高压蒸汽锅中121 ℃灭菌1 h, 全部按照最终10亿/g含菌量进行吸附, 然后按照最终观察活菌数情况, 进行正交试验, 得出最佳吸附载体。
2 结果与分析
2.1 菌株筛选前后对比
筛选前后种子作对比:从冰箱中拿出筛选前、后的种子斜面各1支, 分别接入1环装有肉汤培养基的三角瓶中, 在37 ℃、每分钟200转的摇床上震动培养, 每12 h涂片观察1次, 培养36 h, 记录活菌数和芽孢率, 此过程重复3次, 结果如图1所示。
菌株优化3次后:在相同的培养时间内 (36 h) , 芽孢形成率由原先的约30%提高到约95%, 活菌数也由原来的8亿/mL提升到15亿/mL。
2.2 发酵培养基优化结果
1) 摇床试验的结果见表2。
摇床试验所确定的4种培养配方依次是:①号培养基为普遍应用于培养细菌的培养基配方;③号培养基为经验配方;②号和④号培养基配方分别是在①、③号培养基的基础上添加0.3%的淀粉和0.2‰的硫酸锰而成。通过本试验证明, 淀粉和锰离子对芽孢形成有促进作用。②号培养基要明显优于其他3种培养基的配比, 培养到36 h芽孢率可达到96.0%以上, 活菌数可达到16.0亿/mL, 固我们选择②号培养基作为基本培养基进行正交试验。
2) 正交试验结果, 见表3。
由表3可见, 影响因素为:硫酸锰>豆粕>葡萄糖>淀粉。适宜条件为:葡萄糖0.5%, 淀粉1.0%, 黄豆粕3.0%, 硫酸锰0.2‰, 磷酸氢二钾0.3‰, 硫酸镁0.2‰, 碳酸钙0.7%, 硫酸铵0.1%。
2.3 三角瓶摇瓶模拟发酵罐试验结果
以摇床正交试验得出的最佳培养基, 与肉汤培养基培养的进行2次比较试验, 结果基本稳定。芽孢生成率对比结果, 如图2所示;活菌数对比结果, 如图3所示。
由图2、3可见, 采用优化培养基培养的结果比肉汤培养基有很大提高。主要体现在:①发酵周期缩短了12 h, 在发酵生产中降低了能耗, 且可提高年产量;②最终活菌数提高了约46.70%, 芽孢形成率高, 菌体死亡率较优化前低20.76%。
2.4 吸附载体筛选结果
吸附载体筛选的正交试验结果, 见表4。
注:麸皮、米糠、沙子、碳酸钙的细度都在80目以上。
由表4正交试验结果可见, 影响活菌因素为:米糠>麸皮>碳酸钙>沙子;最佳吸附载体配比为:麸皮25.0 g+沙子20.0 g+碳酸钙45.0 g。
以正交试验得出的最佳吸附载体配比, 与麸皮25.0 g+沙子25.0 g+碳酸钙45.0 g这个配比进行2次比较试验。试验结果经计算后分别为:最佳吸附载体有效活菌数8.9和9.1亿/g, 麸皮25.0 g+沙子25.0 g+碳酸钙45.0 g载体有效活菌数6.7和7.0亿/g。从结果看, 最佳吸附载体活菌数要比对比吸附载体有效活菌数高。
3 讨 论
1) 枯草芽孢杆菌扩培工艺最佳条件为:最佳发酵培养基葡萄糖0.5%+淀粉1.0%+黄豆粕3.0%+硫酸锰0.2‰+磷酸氢二钾0.3‰+硫酸镁0.2‰+碳酸钙0.7%+硫酸铵0.1%。
2) 最佳吸附载体配比为:麸皮25.0 g+沙子20.0 g+碳酸钙45.0 g。
3) 枯草芽孢杆菌在工业水处理、农业领域、畜禽养殖3方面都有广泛的应用, 是一种多功能的有益菌剂。
摘要：本研究课题是从实际生产出发, 以一株枯草芽孢杆菌为研究对象, 通过对培养基碳源、氮源等的选择及配比的正交试验, 确定出最适合枯草芽孢杆菌产芽孢的培养基, 再通过对吸附载体配比的正交试验, 确定出最佳枯草芽孢杆菌液体吸附载体, 为发酵生产过程中枯草芽孢杆菌生产工艺提供参数。结果发现, 枯草芽孢杆菌扩培工艺最佳条件为:最佳发酵培养基葡萄糖0.5%+淀粉1.0%+黄豆粕3.0%+硫酸锰0.2‰+磷酸氢二钾0.3‰+硫酸镁0.2‰+碳酸钙0.7%+硫酸铵0.1%;最佳吸附载体配比麸皮25.0g+沙子20.0g+碳酸钙45.0g。试验表明, 当培养基配方为葡萄糖0.5%、淀粉1.0%、黄豆粕3.0%、硫酸锰0.2‰、磷酸氢二钾0.3‰、硫酸镁0.2‰、碳酸钙0.7%、硫酸铵0.1%, 优化的培养基条件能有效促进枯草芽孢杆菌生长, 并能促进枯草芽孢杆菌芽孢的生成。
关键词：枯草芽孢杆菌,扩培工艺,吸附载体,培养基,正交试验,发酵培养,益生菌剂
参考文献
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[3]俞渭江.生物统计附试验设计[M].北京:北京农业出版社, 1991.
枯草芽孢杆菌的分离与初步鉴定 篇7
1 材料与方法
1.1 试验样品
新鲜土壤, 从山东省荷泽市某村田地土壤表层约10 cm下采集的肥土。
1.2 试剂
高保真Taq DNA聚合酶、各种限制性内切酶, 均购自北京赛百盛基因技术有限公司;p MD18-T载体, 购自宝生物工程 (大连) 有限公司;超薄琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和细菌DNAout (G+) , 均购自绵阳高新区天泽基因工程有限公司;E.coli DH5α感受态细胞, 由菏泽学院预防兽医实验室保存。
1.3 样品的热处理
将采集的新鲜土壤加到营养肉汤培养基中, 37℃培养18~24 h, 然后放于75~80℃水浴中热处理10~15 min。
1.4 细菌的分离
将热处理后的培养物用平板划线分离法涂布于普通琼脂平板上, 37℃培养18~24 h;选取生长良好的菌落反复接种, 经数次琼脂培养基培养筛选, 挑选在培养基上呈单个、灰白色、不规则、菌落边缘不整齐、表面粗糙的干燥型菌落镜检、观察并进行纯培养。
1.5 细菌的鉴定
1.5.1 细菌的生化鉴定
根据《伯杰细菌鉴定手册》对分离细菌进行常规的生理生化鉴定。
1.5.2 细菌的PCR鉴定
引物的设计与合成:根据Gen Bank中已发表的枯草芽孢杆菌16S r RNA基因序列应用Primer Premier 5.0软件自行设计合成了1对能扩增1 154 bp基因片段的引物 (由北京赛百盛基因技术有限公司合成) , 序列为P1 5'-CACTGG-GACTGAGACACGG-3', P2 5'-GGCGGCTGGCTC-CTAAAA-3'。
枯草芽孢杆菌基因组DNA的提取:挑取枯草芽孢杆菌单菌落接种到5 m L营养肉汤中, 37℃振荡培养过夜, 参考细菌DNAout (G+) 试剂盒说明书提取全基因组。
PCR体系与反应条件:以提取的枯草芽孢杆菌全基因组DNA为模板, 用合成的引物进行PCR扩增。反应体系 (25μL) :DNA模板2μL, 10×PCR Buffer 2.5μL, 上、下游引物 (25μmol/L) 各0.5μL, d NTP 2μL, Taq DNA聚合酶0.25μL, dd H2O17.25μL。优化的PCR反应条件:94℃5 min;94℃1 min, 57℃1 min, 72℃1 min, 共30个循环;72℃10 min[6]。PCR结束后, 取5μL PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳, 观察结果。
目的片段的回收、纯化及序列测定:参照超薄琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明回收纯化目的片段, 然后将其与p MD18-T载体连接, 将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞, 挑斑, 扩大培养, 抽提重组质粒进行酶切鉴定和PCR鉴定, 将鉴定为阳性克隆的菌液送宝生物工程 (大连) 有限公司测序。
16S r RNA基因序列分析:利用DNAStar软件对所测定基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行编辑, 并与Gen Bank中的序列进行同源性比较。
2 结果
2.1 细菌的形态特征
在普通营养琼脂平板上, 菌落为圆形, 边缘不规则, 表面有皱襞, 挑取单个菌落涂片, 可见革兰阳性、直杆状细菌, 常成对或呈链状排列, 在营养条件贫乏或生长条件不利的情况下形成芽孢。
2.2 生化特性鉴定结果
细菌的生化鉴定结果为接触酶反应阳性, 利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇且产酸, 利用柠檬酸盐, 不利用丙酸盐, 不形成吲哚, 水解淀粉, 可使明胶液化。
上述结果均符合枯草芽孢杆菌的生化特性, 初步证明分离菌为枯草芽孢杆菌。
2.3 细菌PCR鉴定结果
2.3.1 16Sr RNA序列的PCR扩增结果
见图1。
M.DL-2 000 Marker;1~3.PCR扩增产物。
所获得的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳呈单一条带, 大小与预期 (1 154 bp) 相符。
2.3.2 重组质粒的PCR鉴定结果
将所获得的目的片段连接p MD-18T载体, 转化E.coli DH5α感受态细胞, 获得大量重组转化子, 从中随机挑选几个重组转化子单菌落, 以PCR方法进行鉴定, 琼脂糖凝胶电泳结果显示, 以引物P1和P2扩增得到了大小约为1 154 bp的特异性片段, 表明所检测的克隆中含有目的片段 (见图2) 。
M.DL-2 000 Marker;1, 2.重组质粒PCR鉴定结果。
2.3.3 重组质粒的双酶切鉴定结果
重组质粒经Bam HⅠ和HindⅢ双酶切后, 得到大小约为1 190 bp的插入片段和大小约为2 656 bp的载体片段, 证明所挑取的克隆为正确的重组转化子 (见图3) 。
2.3.4 16S r RNA测序结果
将疑似阳性克隆的菌液送宝生物工程 (大连) 有限公司进行测序, 利用DNAStar软件对所测定基因的核苷酸序列进行编辑, 并与Gen Bank中的南京株D1、浙江株ZJUT zy、青岛株H-1、北京株W-3、沈阳株BS3902、上海株EXWB4-09、河南株G7、德国株EHF-S1-AC2Ha以及美国株SMY序列进行同源性比较, 分离株与其他株核苷酸同源性均为99.6%, 其他株之间的核苷酸同源性为100%。
3 讨论
1) 根据芽孢杆菌耐酸、耐盐、耐高温及耐挤压的特性, 试验采用的75~80℃水浴中热处理10~15 min的样品处理方式, 从一定程度上简化了细菌分离的繁琐性, 使分离细菌的操作简单化。
2) 本试验从新鲜土壤中分离得到1株革兰阳性杆菌, 其形态特征以及生理生化特性与文献报道的枯草芽孢杆菌的特性是一致的, 但是由于细菌生理生化性状的可变性以及某些细菌生理生化特性的相似性, 因此用常规的生理生化指标测定很难得到准确的鉴定结果。枯草芽孢杆菌与蜡样芽孢杆菌细菌形态特征及其生理生化特性极其相似, 在伯杰氏细菌鉴定手册 (1984年版) 和国内其他参考文献中都没有查到这两类菌的明显的区别, 因此从形态特征及其生理生化特性只能初步证实分离细菌为枯草芽孢杆菌。
3) 为进一步证实分离得到的细菌为枯草芽孢杆菌, 试验在生理生化鉴定的基础上又进一步做了分子生物学鉴定。16S r RNA基因序列分析在微生物种群分析方面应用广泛, 已成为细菌分类和鉴定的一个有力工具。16S r RNA是核糖体小亚基的骨架, 在结构上分为保守区、半保守区和非保守区, 保守区序列基本恒定, 半保守区和非保守区序列因不同种、属细菌而异, 一般不同属细菌16S r RNA基因同源性为70%~90%, 而同种内不同株间基因同源性>99.5%[4]。本试验扩增的16S r RNA基因序列与Gen Bank中的枯草芽孢杆菌16S r RNA基因的同源性达到99.6%, 大于99.5%, 进一步说明分离细菌为芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌种。本试验分离的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌功能基因及其相关研究奠定了基础。
参考文献
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环状芽孢杆菌 篇8
1 对象与方法
1.1 病例选择
我院2011年11月—2012年8月收治便秘儿童40例, 男24例, 女16例, 年龄1岁~14岁。均符合下列标准至少2项, 并持续1个月以上: (1) 每周排便小于3次; (2) 大便干燥坚硬, 排便过程中>1/4的时间在费力; (3) 排便时间长于10 min, 排便后有不畅感; (4) 对排便有恐惧感, 排便时疼痛, 常需借助外力帮忙。除便秘外同时伴有腹胀、腹痛、多屁、呕吐、食欲不振等, 严重时可出现头晕乏力、头痛等, 且排除器质性、内分泌性或代谢性疾病及药物引起的便秘儿童。
1.2 方法
本组儿童均采用开塞露或肥皂水灌肠排出宿便, 解除症状后服用凝结芽孢杆菌, 3岁以下小儿1~2片/次, 3次/d, 3岁以上小儿3片/次, 3次/d。将药片化入温开水 (40°以下) 果汁或牛奶中服用或嚼服, 连服2周~4周, 均进行基础综合治疗, 包括小婴儿强调母乳喂养, 年长儿生活规律、心情舒畅, 参加适当体育运动, 多食蔬菜水果, 多饮水, 食物不要太精过细, 少食油炸速食, 养好良好的排便习惯等。
1.3 注意事项
(1) 若服用凝结芽孢杆菌期间患感染性疾病, 同时服用抗菌药, 则凝结芽孢杆菌应与抗菌药间隔2 h, 不需停药。 (2) 凝结芽孢杆菌系活菌制剂, 切勿置于高温处, 需40℃以下温水化开。 (3) 不能忽视基础综合治疗, 尤其是训练按时排便的重要性。应循序渐进, 切记不可操之过急。
1.4 疗效评判标准
显效:每周排便大于4次, 为软便, 排便后有舒畅感, 无腹痛、腹胀等伴随症状, 已形成良好的排便习惯。有效:每周排便次数增多, 对排便无恐惧感, 排便后无不畅感, 但大便仍偏硬。腹痛、腹胀等伴随症状好转。无效:每周排便次数仍小于3次, 排便困难, 大便坚硬, 伴随症状无改善, 仍需借助外力帮忙。
2 结果
服用2周时显效25例, 有效9例, 无效6例, 显效及有效占85%。延长有效9例无效6例疗程至4周时显效29例, 有效7例, 无效4例, 显效及有效占90%。提示:延长疗程显效及有效率再次增加, 未发现任何不良反应。
3讨论
(1) 单纯采用多食蔬菜水果, 增加体育运动, 训练排便习惯等基础综合治疗治疗便秘, 患儿及家长不能长期坚持, 且起效慢, 收效甚微。口服泻药治疗便秘, 起效快, 但存在引起损伤肠神经、腹痛、水电解质紊乱、变态反应、肝毒性反应及结肠黑色素沉着病等副作用[1]。尚有引起肠套叠的不少报道。 (2) 既往我科口服妈咪爱治疗小儿便秘。其主要成分为枯草杆菌、肠球菌。20世纪80年代以来, 关于肠球菌致病性的报道越来越多, 医院感染占据相当一部分。尿路为粪肠球菌最多见的感染部位, 其次有皮肤软组织感染、腹腔感染、败血症、心内膜炎和脑膜炎等。且肠球菌的治疗并不顺利, 肠球菌对青霉素类、头孢霉素类、氨基糖苷类、万古霉素均可产生耐药[2,3,4,5]。International Probiotics Association和世界卫生组织 (WHO) 已建议:益生菌中不宜使用肠球菌。 (3) 既往我科也使用贝飞达治疗小儿便秘, 其主要成分为长型双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和粪肠球菌, 同样存在肠球菌, 且需要2~10℃冷藏, 给使用带来不便。 (4) 也有采用肠动力药西沙比利治疗便秘者, 每片5 mg, 口服混悬液1 mg/m L, 剂量为0.1~0.2 mg/kg, 每日2次, 疗程1周~2周。近年来临床应用发现有腹泻、痉挛性腹痛等不良反应, 美国发现本药引起严重心律紊乱导致死亡病例。 (5) 其他如中药、推拿对便秘也有一定作用。但中药入口苦, 推拿时小儿哭闹, 家长不能坚持, 未起效即中断。 (6) 凝结芽孢杆菌能耐胃酸进入肠道, 其有效成分凝结芽孢杆菌TBC169。a) 能分泌大量乳酸, 促进肠道蠕动, 恢复肠动力。b) 能分泌抗菌凝固素, 抑制肠道内变形杆菌、痢疾杆菌等肠道有害菌, 减少氨、胺、吲哚等肠道毒素的产生, 从而解除肠道毒素对肠道的麻痹作用[6、7]。c) 能分解多糖为低聚糖, 提供肠道有益菌生长所需营养物质, 促进有益菌增殖, 快速恢复肠道菌群平衡。d) 其表层蛋白具有保水性, 润肠通便。e) 能产生葡萄糖异构酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、支链淀粉酶、β-半乳糖苷酶、木糖异构酶、纤维素酶、半纤维素酶等40多种消化酶, 从而有效地缓解和消除腹胀、消化不良和食欲不振等伴随症状。
总之, 凝结芽孢杆菌是从各个角度发挥作用治疗小儿便秘的, 没有任何副作用, 不含肠球菌, 且口味好, 服用方便, 剂量容易掌握, 患儿及家属易接受, 若配合基础综合治疗, 疗效显著, 值得临床推广应用。值得一提的是凝结芽孢杆菌是惟一耐胃酸和可室温保存的产芽孢乳酸菌制剂, 除治疗小儿便秘外, 同时可用于小儿慢性腹泻、消化不良、抗菌药继发性腹泻、新生儿黄疸、湿疹等的治疗。凝结芽孢杆菌TBC169能够产生多种维生素, 如叶酸、烟酸、维生素B1、B2、B6、B12等, 直接促进宿主对蛋白质、钙、铁、锌和维生素D的消化吸收和利用, 可显著促进双歧杆菌、乳酸杆菌等肠道有益菌增殖, 同时还能提高机体抵抗力, 具有良好的生理保健作用。
均有停经史, 停经时间38 d~84 d。1例在乡医院考虑不全流产行清宫术, 术中出现难以控制的大出血, 阴道填塞后转至我院。1例院外彩色多普勒超声提示葡萄胎可能, 我院未复查彩色多普勒超声行清宫术时发生大出血。另3例术前彩色多普勒超声提示子宫切口妊娠可能。
1.2辅助检查尿人绒毛膜促性腺激素 (HCG) 均为阳性, 血HCG值在874.1~17 356 m IU/m L。3例B超检查是宫内孕孕囊位于子宫下段前壁肌层变薄, 局部血流丰富;2例彩色多普勒超声宫体下段前壁肌层变薄, 并可见宫腔内异常回声及少许血流信号。
1.3治疗及结果1例院外清宫大出血转入我院病例, 积极输血、支持治疗, 同时行剖腹探查, 术中见子宫原剖宫产切口处4 cm×3 cm紫色包块并有活动性出血, 患者无生育要求行子宫次全切除术, 术后病理证实:子宫切口处妊娠。1例我院清宫大出血病例行超选择性子宫动脉栓塞术后剖腹检查, 术中见子宫下段明显增粗瘢痕处突起, 行子宫下段前壁切开, 见大量机化组织及暗红色血块附着于原瘢痕处, 予以瘢痕切除加修补术, 术后恢复良好。病理证实:子宫切口妊娠。血HCG短期内恢复正常。3例诊断子宫切口瘢痕妊娠病例, 给予甲氨蝶呤20 mg, 1次/d, 肌注连用5 d, 米非司酮50 mg, 2次/d口服, 连用5 d。复查血HCG降至正常后, B超监测下清宫, 清宫时出血不多,
参考文献
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产菊粉酶芽孢杆菌发酵条件优化 篇9
菊粉是由D-呋喃果糖以β-2, 1-糖普键连接的多聚果糖。其还原端连接一个葡萄糖基, 呈直链结构, 富含于菊芋等多种菊科植物中, 是制备果糖或高果糖、菊粉寡糖和燃料酒精的极好原料[1]。菊粉酶是水解菊粉的高效专一作用剂, 学名为β-2, 1-D-果聚糖水解酶 (EC3.2.1.7) , 属于β-果糖苷酶类。菊粉酶可在一定的温度条件下水解菊粉为果糖或者低聚果糖。用菊粉酶水解菊粉生产果糖和低聚果糖, 价格低廉、工艺简单, 有着非常重要的商品应用价值。因此, 菊粉酶特别是微生物源菊粉酶的研究开发受到世界各国的普遍重视[2,3,4]。本文报道了对一株新筛选到的产菊粉酶芽胞杆菌的发酵条件进行优化, 为菊粉酶的应用和生产提供一定的理论基础。
2 材料与方法
2.1 材料
菌株:本实验室筛选并保存的巨大芽孢杆菌 (Bacillus megaterium) 。
主要试剂:菊粉 (广州泽钰生物科技有限公司, 国产分析纯) ;3, 5-二硝基水杨酸 (DNS) (上海展云化工有限公司, 化学纯) ;其他试剂为市售国产分析纯或生物试剂。
仪器:722分光光度计 (上海舜宇恒平科学仪器有限公司) ;智能生化培养箱 (上海博迅实业有限公司医疗设备厂) ;恒温振荡器 (常州国华电器有限公司) 。
培养基:①发酵培养基。菊粉20.0g/L、蛋白胨5.0g/L、NaCl 5.0g/L、K2HPO4·3H2O 3.0g/L, 初始pH 6.0。②PDA培养基。马铃薯 (去皮, 切碎) 200.0g/L、葡萄糖20.0g/L、琼脂20.0g/L, pH自然。③斜面培养基。查氏培养基[5]。以上培养基在配置完成后, 均需115℃高压灭菌30min。
2.2 方法
菊粉酶活力测定:采用3, 5—二硝基水杨酸法 (DNS比色法) 。取1mL粗酶液, 加人4mL的2%菊粉溶液 (pH5.0, 0.lmol/L醋酸缓冲液配制) , 55℃水浴中保温10min;取反应液0.5mL加人1.5mL DNS混匀, 沸水浴中反应5min, 迅速冷却并稀释至25mL, 在540nm下测定其吸光度, 根据葡萄糖标准曲线计算样品中的还原糖含量[6,7]。菊粉酶活力单位定义为:在上述条件下, 每分钟生成1umol还原糖所需的酶量为一个酶活单位 (U) 。
产菊粉酶芽孢杆菌发酵条件优化:①碳源对产酶的影响。将菊粉20g/L、淀粉20g/L、麸皮20g/L、麦芽糖20g/L、蔗糖20g/L作为碳源, 其他发酵条件相同, 30℃, 160r/min振荡培养3d后测定酶活性选出最佳碳源。②氮源对产酶的影响。将5g/L的酵母膏5g/L、蛋白胨5g/L、牛肉膏5g/L、磷酸氢二铵5g/L、硫酸铵5g/L作为氮源, 其他条件与发酵培养相同, 测定酶活性选出最佳氮源。③pH值对产酶的影响。以上条件确定后, 采用不同的初始pH值4.0、5.0、6.0、7.0、8.0发酵培养后测定酶活性, 确定最佳初始pH。④温度对产酶的影响。以上条件确定后, 采用不同的初始温度20℃、30℃、40℃、50℃发酵培养后测定酶活性, 确定最适培养温度。⑤装液量对产酶的影响。以上条件确定后, 采用不同的装液量即250mL锥形瓶分别装菌液30mL、50mL、70mL和90mL发酵培养后测定酶活性, 确定最佳装液量。
正交试验:根据单因子试验的结果, 找出对酶活性影响较大的几个因素, 确定不同水平, 设计正交试验, 研究各因素之间的交互作用。
3 结果与分析
3.1 不同生长时间的菌株产菊粉酶活性比较
由酶活性曲线可知, 培养到第二天时, 菌株酶活最大, 因此选用培养2d的芽孢杆菌研究其培养条件的优化方案。
3.2 不同培养条件对菌株产菊粉酶活性的影响
碳源对产酶的影响:碳源对微生物代谢产酶过程的影响可分为两个方面:它既是酶蛋白碳骨架构成以及合成能量的主要来源, 又是诱导或者阻遏酶产生的作用物。不同的碳源由于本身结构、性质的不同, 对同一菌株产同种酶的影响不同[8]。因此, 在其他条件不变的情况下, 选用4种不同的碳源发酵培养菌株, 测定产酶活力, 分析不同碳源对于其产菊粉酶的酶活力影响, 结果见图2。
由图2可见, 菊粉作为碳源时Bacillus megaterium所产菊粉酶的酶活力最高。据报道, 菊粉酶的产生是受诱导与阻遏作用的双重调控[9]。一定浓度下的菊粉, 对菊粉酶的合成具有明显的诱导作用。因此, 在本试验中, 菊粉为碳源时所产酶活性最高, 可认为是菊粉对菊粉酶合成诱导作用的结果, 因此选用菊粉作为最佳碳源。
氮源对产酶的影响:分别选用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、磷酸氢二铵为氮源, 在其他条件不变的情况下, 测定不同氮源对菊粉酶的酶活力的影响, 结果见图3。从图3可见, 作为碳源时菌株产酶活力最高。蛋白胨属于有机氮源, 其丰富的内含物, 可为菌株的生长提供碳源、氮源、生长因子等营养物质, 有利于菌株的生长及产酶, 因此选择酵母膏作为最佳氮源。
初始pH值对产酶的影响:微生物培养基的pH必须控制在一定的范围内, 以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。本试验选用4.0—7.0的梯度培养基初始酸碱度对产酶的影响进行研究, 结果见图4。由图4可见, pH对菌株的发酵产酶活力有影响, 在pH值为6.0时发酵液具有最高酶活力, 因此最适初始pH为6.0。
温度对产酶的影响:芽孢杆菌的生长及酶活力的表达均需要合适的温度。本实验选用20℃、30℃、40℃、50℃ 4个温度梯度培养之后, 测定的酶活结果见图5。由图5可见, 30℃之前, 温度升高, 酶活增强;30℃之后, 温度继续升高会使酶活降低, 因此30℃是酶活力最高的培养温度。
装液量对产酶的影响:装液量不同会对菌种造成营养成分的含量不同和氧气流通状况不同等方面的影响, 从而可能影响菌的产酶。采用不同的装液量即250mL锥形瓶分别装菌液30mL、50mL、70mL和90mL, 发酵培养后测定酶活性, 以确定最佳装液量。由图6看出, 不同的装液量对酶活力有影响, 其中250mL锥形瓶装液50mL时, 酶活力最大, 因此以50mL/250mL为最佳装液量。
注:K1、K2、K3分别为各因素水平的酶活性总和;A为菊粉浓度 (g/L) , B为酵母膏浓度 (g/L) , C为培养基初始pH。
3.3 正交试验确定最优发酵条件
根据单因子实验和相关报道, 碳源、氮源、初始pH对菌株产菊粉酶的酶活力影响较大[10], 因此采用三因素三水平正交表对菊粉、酵母膏以及pH进行优化试验, 以确定最适发酵培养条件 (表1) 。
根据分析得到各因素对产酶活性的影响顺序为C>A>B, 最佳方案为A2B1C2, 即菊粉浓度30g/L、酵母膏浓度7.0g/L、初始pH=6.0。根据最佳组合方案配置发酵培养基, 测定酶活力为2.354U/mL。由此确定最优发酵培养条件为:菊粉30.0g/L、酵母膏7.0g/L、NaCl 5.0g/L、K2HPO4·3H2O 3.0g/L, 初始pH为6.0, 250mL发酵三角瓶装液量为50mL、30℃、160r/min, 振荡培养2天。
4 结论
通过单因素和正交试验, 本文确定了巨大芽孢杆菌 (Bacillus megaterium) 的最佳发酵产酶条件为:菊粉30.0g/L、酵母膏7.0g/L、NaCl 5.0g/L、K2HPO4·3H2O 3.0g/L, 初始pH为6.0, 250mL发酵三角瓶装液量为50mL, 30℃, 160r/min振荡培养2天。在最佳的发酵产酶条件下, 酶活力高达 2.354U/mL, 较优化前提高了1.43倍。
经过发酵条件的优化之后, 酶活性有了显著的提高, 但产酶量仍然不能达到工业要求。因此, 需要对野生菌株采用不同的理化因子进行诱变以筛选出优良的生产菌株。关于该菌的诱变、酶的纯化和动力学正在研究之中。
摘要：采用液体摇瓶培养方法, 探讨了碳源、氮源、pH值、培养温度等各种因素对巨大芽孢杆菌 (Bacillus megaterium) 分泌菊粉酶能力的影响。通过正交试验对主要影响因素进行优化, 结果表明, 最适产酶发酵条件为:菊粉30.0g/L、酵母膏7.0g/L、NaCl 5.0g/L、K2HPO4.3H2O 3.0g/L, 初始pH 6.0, 250mL发酵三角瓶装液量为50mL, 30℃, 160r/min振荡培养2d, 酶活力达到最高, 为2.354U/mL, 比优化前提高了1.43倍。
关键词：芽孢杆菌,菊粉酶,筛选,发酵条件
参考文献
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