放线杆菌

放线杆菌（精选7篇）

放线杆菌 篇1

猪胸膜肺炎放线杆菌病 (APP) 是猪的一种呼吸道传染病, 该病以发病急、发病率高、死亡快为特征, 该病是一种被发现较晚、危害严重但尚无特效防治措施的猪呼吸道传染病, 病原为胸膜肺炎放线杆菌, 临床上多用青霉素、四环素、磺胺类药物治疗, 但长期用药易产生耐药性, 不利于公共卫生;急性发病以后, 单纯使用西药治疗只能减少死亡, 经治疗, 大多形成僵猪, 利用价值低。

笔者采用抗生素和中药相结合对本病进行治疗, 并在青龙县规模养殖场中进行扩大应用, 均收到较好的效果。

1 临床症状及剖检变化

该病临床症状明显, 急性型食欲不振或废绝, 精神沉郁, 严重呼吸困难倒地而死, 后从鼻腔中流出血样泡沫液体, 病程在3天以内, 亚急性型可见耳朵、鼻端、四肢内侧、下腹部、后臀部等处暗红发绀, 咳嗽、气喘, 严重的呈犬坐姿势, 张口呼吸。慢性型以消瘦、食欲不振、咳嗽、气喘、生长缓慢为主, 大多数病例初发病时体温升高到40℃～42℃, 生产条件差的多发;剖检可见纤维素性胸膜炎、肺炎、扁桃体肿大或坏死。肺脏出血、坏死或化脓, 肺心叶、尖叶不对称性肉样变, 心、肺、膈粘连。有的可见肠道出血、肝脏肿大、脾出血。

2 实验室诊断

经实验室检测, 病结合流行病学、临床症状、剖检变化, 可初步诊断为猪胸膜肺炎放线杆菌病。

3 防治措施

3.1 立即对发病猪及时隔离并严格消毒

3.2 药物治疗

病猪用阿米卡星按8毫克/千克体重肌肉注射, 洛美沙星2毫克气管内注射, 氧氟沙星8毫克千克体重, 氟苯尼考0.1毫升/千克体重, 土霉素0.1毫升/千克体重, 1次/天, 连用2～3天, 为避免产生耐药性, 每种抗生素使用3天后, 可采取三种抗生素交叉使用。同时配以氨茶碱、地塞米松等辅助性药物。

3.3 病猪用中药组方

人工牛黄30克、黄连170克、皂角300克、山豆根250克、蒲公英250克, 合计1000克, 粉碎, 制成散剂。拌入300千克饲料, 病猪自由采食, 连喂4～7天。

通过使用抗生素结合中药方剂治疗的规模场发病猪用药3天病情开始明显好转, 体温恢复正常, 腹式呼吸程度减轻, 食欲增强, 并且用药后均无不良反应, 第7天时精神状态、呼吸程度、采食恢复正常, 治愈率可达80%。

4 小结与讨论

4.1 严格执行隔离、消毒制度

饲养场 (户) 做好入场人员、物品的消毒、隔离观察工作, 对圈舍、环境用具等定期进行严格的消毒, 病死猪进行深埋或焚烧。

4.2 坚持自繁、自养, 定期进行普检

尽量做到自繁、自养, 不从外地购进未经检疫的种猪, 确需引种时, 做好预防性免疫及检疫工作。入场后至少观察2～4个月, 经血清学检查为阴性的方可合群。有条件的地方, 如果能做到定期进行血清学检验, 淘汰阳性猪, 对于净化和降低APP的感染有重大意义。

4.3 加强饲养管理, 降低环境应激

通过改善饲养条件和科学的饲养管理, 为猪群创造一个良好的生活环境, 尤其是冬春季节, 做好保温防寒与通风换气工作, 定期消毒, 保持圈舍清洁卫生。

4.4 正确使用治疗药物, 避免滥用抗生素

盲目药物治疗和预防效果甚微, 长期盲目用抗生素药物, 易产生耐药性, 不利于公共卫生, 临床上急性发病以后, 单纯用西药治疗只能减少死亡, 经治疗, 大多形成僵猪, 利用价值低。实验证明采用中西药结合治疗是控制APP的一种有效方法, 不易产生耐药性, 有利于公共卫生, 可提高猪的利用价值, 且对猪没有不良反应。

4.5 做好免疫预防工作, 提高猪的抗病能力

疫苗接种是预防猪胸膜肺炎放线杆菌病的有效手段, 但因为细菌血清型的不同, 导致市场上销售的疫苗均有一定的不足之处, 不能抵抗所有血清型的攻击, 不能消除病猪的带菌状态。新生仔猪在2月龄时免疫接种1次, 2周后加强免疫一次, 可以预防胸膜肺炎的急性暴发, 减少死亡, 免疫猪保护率达到85%以上。同时应注意做好其他疫病的预防性免疫工作, 可减少混合感染, 降低呼吸道病的发生。

放线杆菌 篇2

1 材料与方法

1.1 病料

2010年9月至2012年5月, 从宿豫区发生高热综合征的56个猪场共采集猪病料142份, 其中肺50份、关节液30份、心血40份、脑8份、脾脏6份、淋巴结5份和浓汁3份。

1.2 主要试剂及仪器

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD) , 购自中国医药 (集团) 上海化学试剂公司。犊牛血清自制。胰蛋白大豆琼脂 (TSA) 购自Difco公司。微量生化签定试剂购自杭州天和微生物试剂有限公司。TaqDNA聚合酶、d NTPs、DL2000 DNA Marker均购自宝生物 (大连) 有限公司。凝胶成像系统、电泳仪均为Bio-Rad公司产品。PCR扩增仪为Touchgene公司产品。

1.3 分离鉴定

(1) 将病料接种于含NDA和血清的TSA固体培养基, 置于5%CO2, 37℃培养24～48h;挑取圆形、光滑湿润、无色透明、直径1～2mm的可以菌落, 进行纯培养。 (2) 将可以菌落的纯培养物分别接种不含NAD和血清的TSA、不含NAD単含血清的TSA的平板, 观察菌落生长情况和形态大小。 (3) 将可疑菌落的纯培养物接种生化鉴定管, 生化鉴定管中同时加入5μl0.01%的NAD和5μl血清, 置于37℃、5%的CO2培养基, 培养48h观察结果。 (4) PCR鉴定:参照华中农业大学陈凡硕士论文, 根据APP apx IV (No.gi:6671147) 序列设计引物, PCR扩增的产物为377bp大小的片段, 引物由上海生工公司合成。上游引物5'-GCTCACGAACGTTT-GCTCAT-3', 下游引物5'-GGGGACGTAA CTCGGT-GATT-3', 反应体系 (50μl) :10×缓冲液50μl, 2mmol/L d NTPs 1μl, 10umol L/L上下游引物各1μl, 灭菌ddH2O40μl。反应条件:94℃1min, 59℃1min, 72℃30s, 共35个循环;最后72℃延伸10min。PCR产物1.0%琼脂糖凝胶电泳。

2 结果

2.1 培养特性与镜检

在加有血清和NAD的TSA培养基上24h长成半透明菌落, 针尖大小, 直径1～2mm, 侧对光线有虹光。在不含NAD和血清的TSA培养基、不含NAD但含血清的TSA培养基上均不能生长。表明分离的菌株具有NAD依赖性。在血小板上48h长成针尖大小的半透明菌落, 多散在, 少量短链状或长链状。

2.2 生化实验

生化实验结果表明, 分离的可疑菌脲酶试验阳性, CAMP试验阳性, 糖发酵试验结果为木糖阳性、葡萄糖阳性、甘露醇阳性、蔗糖阳性、阿拉伯糖阳性、乳糖阴性。

2.3 PCR鉴定

对上述经鉴定的10株可疑菌进行PCR扩增, 产物经琼脂糖凝胶电泳, 证实大小均与预期大小一致。

3 讨论

放线杆菌 篇3

1 病原与流行特点

猪胸膜肺炎放线杆菌是一种革兰氏染色阴性的小球杆状菌, 本菌为兼性厌氧菌, 对外界抵抗力不强, 一般消毒药即可杀灭。病猪和带菌猪是本病的传染源。种公猪和慢性感染猪在传播本病中起着十分重要的作用, 主要通过空气飞沫传播。病菌随呼吸、咳嗽、喷嚏等途径排出后形成飞沫, 通过直接接触而经呼吸道传播, 也可通过被病原菌污染的车辆、器具以及饲养人员的衣物等间接接触传播。

各种年龄、性别的猪都有易感性, 其中6周龄~6月龄的猪较多发, 但以3月龄仔猪最为易感。本病的发生多呈最急性型或急性型病程而迅速死亡。急性暴发猪群, 发病率和死亡率一般为50%;最急性型的死亡率可达80%~100%。

本病发生具有明显季节性, 多发生于4—5月和9—11月。饲养环境突然改变、猪群的转移或混群、拥挤或长途运输、通风不良、湿度过高、气温骤变等应激因素, 均可引起本病发生或加速疾病传播, 使发病率和死亡率增加。

2 临床症状

发病情况可分为最急性型、急性型和慢性型。

2.1 最急性型

突然发病, 病猪体温升高至41~42℃, 心率增加, 精神沉郁, 废食, 出现短期的腹泻和呕吐症状。早期病猪无明显的呼吸道症状, 后期心衰, 鼻、耳、眼及后躯皮肤发绀, 晚期呼吸极度困难, 常呆立或呈犬坐式, 张口伸舌, 咳喘, 并有腹式呼吸。临死前体温下降, 严重者从口鼻流出泡沫血性分泌物。病猪于出现临诊症状后24~36 h内死亡。有的病例见不到任何临诊症状而突然死亡。此型的病死率高达80%~100%。

2.2 急性型

病猪体温升高达40.5~41℃, 严重的呼吸困难, 咳嗽, 心衰, 皮肤发红, 精神沉郁。由于饲养管理及其他应激条件的差异, 病程长短不定。

2.3 慢性型

多于急性期后期出现。病猪轻度发热或不发热, 体温在39.5~40℃, 精神不振, 食欲减退。不同程度的自发性或间歇性咳嗽, 呼吸异常, 生长迟缓。病程几天至1周不等, 或治愈或当有应激条件出现时, 症状加重, 猪全身肌肉苍白, 心跳加快而突然死亡。

3 解剖症状

发病情况不同, 解剖症状也不同。最急性型病死猪剖检可见气管和支气管内充满泡沫状带血的分泌物, 肺充血、出血和血管内有纤维素性血栓形成, 肺泡与间质水肿, 肺的前下部有炎症出现。急性型急性期死亡的猪可见到明显的剖检病变:喉头充满血样液体, 双侧性肺炎, 常在心叶、尖叶和膈叶出现病灶, 病灶区呈紫红色、坚实、轮廓清晰, 肺间质积留血色胶样液体。慢性型肺脏上可见大小不等的结节 (结节常发生于膈叶) , 结节周围包裹有较厚的结缔组织, 心包内可见到出血点。

4 治疗

猪群发病时, 应以解除呼吸困难和抗菌为原则进行治疗, 并要使用足够剂量的抗生素和保持足够长的疗程。本病早期治疗可收到较好的效果, 但应结合药敏试验结果而选择抗菌药物。一般可用强力霉素、泰妙菌素、磺胺类等。对发病猪采用注射给药效果较好, 可在饲料中添加抗生素控制病情抗生素虽可降低死亡率, 但经治疗的病猪常为带菌猪。药物治疗对慢性型病猪效果不理想。

5 预防

放线杆菌 篇4

1.1 抗生素的选择

采用巧克力琼脂平皿试纸片法, 选用青霉素、链霉素、土霉素、氨苄青霉素、罗红霉素、阿米卡星、林可霉素、环丙沙星、氧氟沙星、、氟苯尼考、庆大霉素、卡那霉素等12种抗生素, 进行敏感性试验。结果发现, APP对氧氟沙星、氟苯尼考、阿米卡星高敏, 对氨苄青霉素、林可霉素、环丙沙星、卡那霉素、罗红霉素、链霉素中敏, 对青霉素、庆大霉素、土霉素不敏或低敏。

1.2 中药组方

中药方剂1:黄芪250克、金银花150克、连翘150克, 薏苡根150克、瓜萎150克、紫花地丁150克、桑白皮100克、荆芥100克、防风100克、鱼腥草100克、甘草100克, 加水15000克, 煎成汤剂。5毫升/千克体重灌服或饮水, 每日2次, 连用3~7天。

中药方剂2:黄芩200克、栀子200克、贝母150克、菊花150克, 知母200克、麦冬150克、桑叶150克、桔梗250克、茯苓150克、瓜蒌仁200克、黄连100克、麻黄100克、甘草200克, 加水15000克, 煎成汤剂, 5毫升/千克体重灌服或饮水, 每日2次, 连用3~7天。

此方剂具有清热、解毒、清肺化痰、止咳平喘之功效。

1.3 辅助性药物氨茶碱、地塞米松射液等

2 试验猪的来源及分组

2.1 试验组

受试猪均来自丰宁县三个不同的规模养殖场, 均自然感染患有胸膜肺炎放线杆菌病, 每个规模场依据发病情况按栏自然分成两组, 分别采用抗生素结合中药方剂1进行治疗, 另一组采用抗生素结合中药方剂2进行治疗;将三个规模养猪场分别称为规模场1组、规模场2组、规模场3组。

2.2 对照组

将规模养猪场1的另外28头患病猪组成对照组, 选用阿米卡星、氟苯尼考、氧氟沙星等单一抗生素, 进行单独对症治疗。

3 疗效判定标准

3.1 痊愈

受试病猪连续用药7天, 临床症状消失, 精神、食欲恢复正常者为痊愈。

3.2 有效

受试病猪连续用药3天, 临床症状缓和, 精神、食欲渐恢复者为有效。

4 治疗结果

中西医药结合治疗APP应用效果

规模场1组, 使用阿米卡星与中药组方1治愈率91.3%;阿米卡星与中药组方2结合组治愈率89.1%。规模场2组使用氧氟沙星与中药结合治疗, 与中药组方1结合治愈率为89.5%;氧氟沙星与中药组方2结合治愈率为92.3%。规模场3组使用氟苯尼考与中药结合治疗, 与中药组方1结合治愈率为84%;氧氟沙星与中药组方2结合治愈率为85.7%。对照组使用阿米卡星、氟苯尼考、氧氟沙星等抗生素治疗, 治愈率为57.1%。

5 小结与讨论

放线杆菌 篇5

1 材料

APP血清1,7型,由Donahule教授惠赠;APP基因组文库,由杨建德等[2]构建;大肠杆菌(E.coli)感受态细胞DH5α、BL21(DE3)和 pET15b载体,购于Novagen生物工程公司;培养大肠杆菌的液体或固体LB培养基、培养APP的TSA及NAD培养基,购自普博欣公司; 用来拯救质粒的大肠杆菌XL-1 MRF’、SOLR和Helper phage,购自Stragene公司;Xhol Ⅰ、BamH Ⅰ、PvuⅡ、T4 DNA 连接酶、Taq酶,均购自上海生工生物工程技术服务有限公司; 4-氯-1-奈酚与邻苯二胺,购自Promega生物工程公司;猪APP康复期血清,由天津农学院预防兽医学实验室制备并保存;醋酸纤维膜、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔和兔抗猪IgG,购自普博欣公司;Talon试剂盒,购自Clonetech 公司。健康新西兰纯系白兔,购于天津实验动物中心。

2 方法

2.1 阳性克隆的筛选及纯化

参照Verma A等[3]的方法进行。具体方法如下:将滴定好的APP基因组文库在一个大的平皿上过夜;将0.025 mol/L的醋酸纤维膜贴在平皿表面,37 ℃作用2～4 h,使噬菌体表达的整合膜蛋白吸附到醋酸纤维膜上;取下醋酸纤维膜,用TBST洗3遍,每次10 min,加入4%脱脂奶粉封闭30 min;之后向该膜依次加入APP康复血清(1∶200)和辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG (1∶4 000)分别作用2 h,每步之间用TBST洗3遍;最后加入新配制的并用过氧化氢处理的4-氯-1-奈酚显色,根据膜上显色斑点选择平皿上的阳性噬菌体克隆;将每个噬菌体克隆纯化,重新用XL-1 MRF’按上述方法进一步纯化,直至醋酸纤维膜上的斑点出现的颜色一致,选择其中一个用于拯救质粒。

2.2 阳性克隆质粒的拯救

拯救方法按Helper phage试剂盒提供的方法及参照Verma A等[3]的方法进行。

2.3 质粒的酶切鉴定及测序

将获得的质粒用Pvu Ⅱ酶切鉴定,确定插入片段的大小,测序分析序列确定开放阅读框架(ORF)。

2.4 PCR扩增

以P1(5′- CACCTCGAGTCTTTAAGTGTCGGTATC -3)为5′引物、P2(5′- TATGGATCCTTAAGCCGTCATTTTTTT–3′)为3′引物(下划线部位分别为Xhol Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点),以拯救质粒为模板进行PCR扩增。反应条件:94 ℃预变性3 min;92 ℃变性1 min,57 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,共30个循环;72 ℃延伸10 min。

2.5 整合膜蛋白(IM)基因PCR产物的连接转化

由于PCR产物的两端含有酶切位点,将PCR产物及pET15b用XholⅠ和BamH Ⅰ酶切后回收,按载体与片段比为1∶3的比例进行连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。

2.6 重组质粒的筛选与鉴定

挑取若干个转化子,在3 mL LB液体培养基中培养12～16 h,质粒小量抽提后经1%琼脂糖凝胶电泳,根据DNA分子质量的大小初步筛选阳性质粒;取初步筛选的阳性质粒进行Xhol Ⅰ和BamH Ⅰ酶切,经1%琼脂糖凝胶电泳分析,进一步筛选阳性质粒;对重组质粒进行PCR,比较PCR产物与酶切产物的大小。

2.7 整合膜蛋白的表达

将鉴定为阳性的重组质粒载体转化至BL21 (DE3),在1 mmoL/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的诱导下表达,收集菌体。

2.8 表达蛋白的纯化

采用Talon试剂盒提纯融合蛋白。纯化的蛋白加等量1倍上样缓冲液于100 ℃煮5 min, SDS-PAGE电泳后染色观察。

2.9 Western-blot检测

取纯化的蛋白进行SDS-PAGE分析,将琼脂糖凝胶上的蛋白转印至醋酸纤维膜上,其余方法见2.1。

2.10 整合膜蛋白免疫血清的制备

取健康新西兰纯系白兔2只,以100 μg 重组IM并辅以完全佐剂皮下接种免疫,接种后第14,28天各加强免疫1次,第35天采血分离血清。

3 结果

3.1 整合膜蛋白基因的序列特征

筛选APP基因组文库,其中有2个克隆表达分子质量约为48 ku的蛋白。对拯救质粒进行测序发现,这2个克隆含有相同的开放阅读框,含有1 518个核苷酸,共编码506个氨基酸,序列见图1。经序列分析发现,该蛋白含有49个氨基酸的信号肽,分析结果见图2,预计成熟的蛋白分子质量为48.431 ku。

注:标有下划线的序列为信号肽。

3.2 整合膜蛋白基因的扩增

根据获得的整合膜蛋白基因序列设计PCR扩增引物P1和P2并进行PCR扩增,结果表明扩增的片段大小与预期(预期为1 365 bp)相符,见图3。

a, c. 蛋白质量标准;b. 纯化IM的 Western-blot 结果;d.SDS- PAGE结果; e.1 kb DNA Marker;f.IM 基因扩增产物;g. Xhol Ⅰ和 BamH Ⅰ酶切的重组质粒pET15b- IM。

3.3 重组表达质粒pET15b-IM构建及鉴定

将上一步获得的PCR产物及pET15b用限制性内切酶Xhol Ⅰ和BamH Ⅰ进行酶切,37 ℃ 4 h;经胶回收试剂盒回收后用T4 DNA连接酶连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞;挑取生长的部分菌落加到20 μL的去离子水中煮10 min,4 000 r/min离心5 min,取上清液用P1和P2进行PCR扩增重组质粒中的插入片段;挑取PCR阳性的菌落,摇菌过夜提取质粒,用Xhol Ⅰ和BamH Ⅰ进行酶切鉴定,得到大小约为1.3 kb的片段,见图3。将得到的含有目的片段的重组质粒命名为pET15b-IM。

3.4 表达产物的SDS-PAGE及Western-blot分析

用pET15b-IM质粒转化表达载体,再用1 mmol/L IPTG诱导,表达产物经Talon试剂盒纯化后得到特定的目的蛋白条带,SDS-PAGE分析显示其大小约48 ku,与预测的分子质量相符;Western-blot分析证实该蛋白与阳性血清反应,见图3。

3.5 整合膜蛋白的免疫原性分析

用不同浓度纯化的整合膜蛋白包被ELISA 板, 以制备的兔阳性血清为一抗(1∶100)、HRP标记的羊抗兔IgG (1∶4 000)为二抗分析该蛋白的免疫原性。ELISA结果显示:纯化的整合膜蛋白与兔阳性血清反应明显,当包被蛋白浓度为6 μg/mL时, OD490值达1.2, 随着包被蛋白浓度的降低,OD490 值逐渐下降;当包被蛋白浓度为0.5 μg/mL时, OD490值约为0.7,经分析适合的包被蛋白浓度为2 μg/mL;该蛋白与兔的阴性血清及空白对照反应时OD490值则均在0.3以下,表明该蛋白具有一定的免疫学活性,见图4。

4 讨论

(1)PCP是猪的主要呼吸道传染病之一,对养猪业危害极大[1] ,而其病原APP对许多抗生素易产生耐药性,因而预防该病主要依赖疫苗免疫。近年来,有关APP的研究集中在主要毒力因子的克隆与表达上,这些研究加深了人们对其主要毒力因子的了解。有学者分析了APP血清3型的基因组序列,为进一步研究APP致病的分子机制奠定了基础。

(2)研究筛选出蛋白的经过序列分析比较确定为整合膜蛋白,该蛋白可能是与细胞膜结合的一个膜蛋白,据推测可能为跨膜蛋白。跨膜蛋白与外膜蛋白可能有些不同,外膜蛋白在细胞的外侧,首先接触免疫系统,而整合膜蛋白可能只有细胞外部分接触免疫系统。在试验中发现,用整合膜蛋白免疫动物制备的血清ELISA效价要低于外膜蛋白[4],很可能暗示整合膜蛋白的免疫原性比外膜蛋白要弱。试验结果显示,整合膜蛋白具有一定的免疫原性,推测其可能介导部分保护性免疫反应,因此它具有发展成疫苗成分的可能性。研究首次克隆表达了APP的整合膜蛋白,为进一步研究APP的发病机理和其毒力因子的遗传演化关系及有效的免疫制剂提供了参考依据。

参考文献

[1]思汗,林旭埜,郝永清.猪传染性胸膜肺炎的研究进展[J].广东畜牧兽医科技,2007,32(3):6-9.

[2]杨建德,刘燕霏,徐军.猪胸膜肺炎放线杆菌基因组文库的构建[J].天津农学院学报,2008,15(3):1-3.

[3]VERMA A,ARTIUSHIN S,MATSUNAG A,et al.LruA and LruB,novel lipoproteins of pathogenic leptospira interrogans associ-ated with equine recurrent uveitis[J].Infect Immun,2005,73(11):7259-7266.

放线杆菌 篇6

1 材料

1.1 培养基

普通肉汤、普通琼脂、血平板、TSB培养基、营养肉汤、血清肉汤, 均由江西农业大学临床实验室提供。

1.2 药物

氟苯尼考 (含量为99%, 批号为100325) , 张家港市恒盛药用化学有限公司生产;恩诺沙星 (含量为98%, 批号为100914) , 浙江京新药业进出口有限公司生产;甲氧卞氨嘧啶 (TMP, 含量为99%, 批号为091119) , 山东寿光制药厂生产。

1.3 试验菌株

大肠杆菌及胸膜肺炎放线杆菌 (5型) , 由江西农业大学预防兽医教研室分离、鉴定、保存。

2 方法

2.1 抗生素原液的制备及保存

用适宜溶剂溶解恩诺沙星、氟苯尼考、TMP, 配成浓度为1 280 μg/mL的抗生素原液, 4 ℃冰箱保存。

2.2 被测菌种悬液的制备

1) 大肠杆菌:

将保存菌种接种于普通琼脂培养基中, 至37 ℃恒温箱内培养, 次日挑选单个菌落1～2个接种于2 mL普通肉汤培养基中培养。采用活菌计数法测得大肠杆菌的生长浓度为1.24×109 cfu/mL。

2) 胸膜肺炎放线杆菌:

将保存菌种接于血平板 (含8%脱纤兔血) 中培养, 活化后挑选单个菌落接于2 mL TSB培养基[含5%胎牛血清和5 mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD) ]中培养, 采用活菌计数法测得胸膜肺炎放线杆菌的生长浓度为6×108 cfu/mL。

菌液临用前用营养肉汤或血清肉汤稀释, 得含菌量约为1×105 cfu/mL的菌液。

2.3 单药最小抑菌浓度的测定

采用试管两倍稀释法[1], 测定恩诺沙星、氟苯尼考、TMP对大肠杆菌、胸膜肺炎放线杆菌的MIC值。

2.4 联合药敏试验

采用肉汤稀释棋盘法[1]。根据测得的单药对受试菌的MIC值, 然后以其MIC的4倍、2倍、1倍、0.5倍、0.25倍浓度分别进行联合, 测定联合用药效果。以部分抑菌浓度指数 (FIC) 为联合药敏试验的判断依据。FIC= (甲药联用时的MIC/甲药单用时的MIC) + (乙药联用时的MIC/乙药单用时的MIC) 。 判断标准:FIC指数≤0.5为协同作用, >0.5～≤1为相加作用, >1～≤2为无关作用, >2为颉颃作用。

3 结果与分析

3.1 3种药物对猪大肠杆菌及胸膜肺炎防线杆菌的MIC值

3种药物对猪大肠杆菌及胸膜肺炎防线杆菌MIC值的结果见表1。根据CLSI 2009年药敏试验执行标准可知:大肠杆菌对恩诺沙星、TMP耐药, 对氟苯尼考敏感;胸膜肺炎放线杆菌对恩诺沙星、TMP、氟苯尼考均高度敏感。

3.2 FIC指数的测定

3.2.1 对大肠杆菌的联合用药

结果见表2～4。

3.2.2 对胸膜肺炎放线杆菌的联合用药

结果见表5～7。

4 讨论

1) 试验选用的大肠杆菌菌株是从临床中分离得

到的, 对恩诺沙星耐药性严重, 常规用药量几乎不可能抑制或杀死这些细菌。说明在实践中由于恩诺沙星的不合理应用, 已导致大肠杆菌耐药性的产生。

2) 近些年, 在集约化猪场胸膜肺炎放线杆菌的流行越来越严重。

该菌对本试验所用的恩诺沙星及氟苯尼考的MIC值均较小, 敏感性较高, 可用于临床治疗。联合药敏试验结果提示, 临床上胸膜肺炎放线杆菌的感染可以采用联合用药的方法, 恩诺沙星和氟苯尼考的联用及氟苯尼考和TMP的联合对临床治疗均有积极的指导作用。

参考文献

放线杆菌 篇7

关键词：胸膜肺炎放线杆菌,分离鉴定,PCR检测,耐药性

胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)属于巴氏杆菌科嗜血杆菌属,是革兰氏阴性杆菌,有很强的致病性,能够引起猪传染性胸膜肺炎。猪传染性胸膜肺炎放线杆菌可以经消化道和呼吸道感染各年龄段的猪群[1],最常见的病理变化是肺脏出血、坏死和纤维素性渗出。急性感染的猪死亡率高,慢性感染的猪生长缓慢、饲料报酬低[2]。该病在我国的发生率逐年上升,已经严重危害到我国养猪业的发展[3,4,5]。APP血清型有15种[6],地域分布广,再加上长期不合理地使用抗菌药物使其产生耐药性,导致该病的诊断和防控工作异常艰巨。为了解山西省APP的流行分布及耐药情况,以确定有效的防控措施和用药计划,本研究于2014年对山西省11个地区的20个猪场进行了调查。

1材料与方法

1.1病料

2014年1月至12月,从山西省11个地区猪场采集病死猪的肺脏、肝脏、心脏、脾脏等病变组织。

1.2培养基和试剂

营养琼脂培养基、麦康凯培养基购于国药集团化学试剂有限公司;微量生化管、药敏纸片购于杭州天和微生物试剂有限公司;Premix Taq,DL2000 DNA Marker ladder购于宝生物工程(大连)有限公司。

1.3细菌分离培养

无菌取病料,用接种环在血平板上划线,置于10%CO2,37℃培养24h,将疑似菌落接种到麦康凯培养基上。

1.4生化试验

将纯化的细菌接种到微量生化管中,置于10%CO2,37℃培养24~48h,观察结果。

1.5药敏试验

采用K-B药敏纸片法,将纯化的菌落均匀涂布于琼脂平板上,将药敏纸片贴于培养基表面,37℃培养12~16h,观察结果,并依据药敏试验抑菌环直径判断标准来判定试验结果。

1.6致病性试验

将分离获得的菌株活化后接种于5%(v/v)的绵羊血琼脂培养基中,37℃培养18~24h后,稀释菌液,使其浓度为3×1010cfu/ml。取80只40日龄的猪,随机分成试验组1(菌株1),试验组2(菌株2),试验组3(菌株3)和对照组,每组20只,试验组各猪予肌肉注射3ml各分离菌株,对照组各猪肌肉注射等体积灭菌生理盐水。观察发病和死亡情况、剖检变化,并进行细菌分离。

1.7 PCR检测

根据Alain[7]等的方法,设计并合成一对针对APP保守序列APXIV的特异性引物:上游:5’-TGGCACTGACGGT-GATGA-3’,下游:5’-GGCCATCGACTCAACCAT-3’,对分离株进行PCR检测。用DNA提取试剂盒制备分离株的基因组DNA作为PCR扩增的模板,加入酶、引物和dd H2O后,按照以下程序进行扩增:94℃预变性5min,94℃变性30s,54℃退火30s,72℃延伸40s,30个循环,72℃后延伸10min。取5μL PCR产物,用1%琼脂糖凝胶进行电泳分析。

2结果

2.1细菌分离培养特征

该菌在10%CO2,37℃培养条件下生长良好,24h形成1~2mm湿润、半透明、边缘整齐的菌落。经革兰氏染色,镜检为阴性小杆菌,菌体平直,单个或双个存在。

2.2生化实验

3株分离株生化鉴定结果完全相同(表1),葡萄糖、甘露糖、果糖、麦芽糖、VP试验、尿素酶、氧化酶、透明质酸酶和过氧化氢酶实验均为阳性;甘露醇、山梨醇和MR实验为阴性。

2.3 PCR鉴定

对菌株进行PCR检测,扩增出422bp的片段(附图),说明该菌株为胸膜肺炎放线杆菌。

2.4致病性试验

40日龄试验猪感染后,各实验组第2天猪群开始发病,试验组1有13只发病,试验组2有15只发病,试验组3有14只发病,第3天各试验组试验猪均发病并出现临床症状,主要症状为精神沉郁,高温,呼吸困难。第4天出现死亡高峰,剖检可见纤维素性胸膜炎非常明显,严重的发现肺实质黏附在胸膜壁上。取病死猪的肺部进行细菌分离鉴定,其生化特性与接种菌一致。

2.5药敏试验

由表2可见,3株菌对头孢克肟、氟苯尼考和氨苄西林最为敏感;对阿莫西林、恩诺沙星、环丙沙星等7种抗菌药物为中敏;对链霉素、庆大霉素、强力霉素、四环素和氯霉素表现出耐药。

3讨论

目前,实验室常用的APP诊断方法有血清学试验包括间接凝集试验、补体结合反应、玻片凝集试验、乳胶凝集试验、琼脂扩散试验和ELISA等方法。由于APP有很多血清型,各血清型之间没有很好的交叉反应[8],从而会影响血清学试验的准确性。而细菌分离培养、生化试验等方法费时费力。因此,建立一种方便快捷并且灵敏度高的诊断方法非常必要。

根据瑞士Alain Schaller[7]报道,以App所有血清型菌株做模板,用PCR方法都能扩增出APX IVA基因片段,而从其他亲缘关系相近的细菌中无法扩增这一片段,说明APX IVA基因具有很高的种特异性。因此本研究参照Alain的方法,对3株分离株进行PCR鉴定。结果显示,3株分离株均为胸膜肺炎放线杆菌。在此基础上,本研究继续对这3株APP进行常用抗菌药物敏感性试验。结果显示3株胸膜肺炎放线杆菌对链霉素、庆大霉素、强力霉素、四环素和氯霉素表现出耐药性且都表现出多重耐药,这与国内其他地区的报道[9,10,11]存在一定差异。究其原因可能是各地区使用的抗菌药物种类和用药时间有差异,也可能与细菌的血清型不同有关。

本研究通过对山西省11个地区20个猪场采集病料组织,经过细菌分离培养、生化培养和PCR鉴定,获得3株胸膜肺炎放线杆菌。对3株分离株进行药物敏感性试验测定,结果显示对链霉素、庆大霉素、强力霉素、四环素和氯霉素表现出耐药性。本研究为山西地区猪场防控APP,指导临床合理使用抗菌药物提供了科学依据。

参考文献

[1]蔡宝祥.家畜传染病[M].2版.北京:中国农业出版社,1996.

[2]Savaeye C,Jobert,J L,Berthelot herault F,et al.A PCR assay used to study aerosol transmission of actionobacillus pleuropneumoniae from samples of live pigs under experimental conditions[J].Veterinary Microbiology,2000,73:337-347.

[3]陈如明,谢鸣星,李云峰,等.鲁豫地区驻军猪传染性胸膜肺炎血清学调查[J].中国畜禽传染病,1990(4):38-40.

[4]邬捷,姜永康,曹国文,等.四川猪嗜血杆菌胸膜肺炎血清学调查[J].动物检疫,1990(6):21-22.

[5]华云龙,张应国,钟南.云南猪传染性胸膜肺炎血清抗体调查[J].动物检疫,1992,9(3):27.

[7]Schaller A,Kuhn R,Kuhnert P,et al.Characterization of apx IVA,a new RTX determinant of Actinobacillus pleuropneumoniae[J].Microbiology,1999,145(Pt 8):2105-2116.

[8]Freddy Haesebrouck,Anita Van de Kerkhof.Cross protection between Actionbacillus pleuropneumoniaes biotypes serotpes in pigs[J].Veterinary Microbiology,1996,52(3-4):277-284.

[9]何启盖,王贵平,刘军发,等.猪胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定及药敏试验[J].中国预防兽医学报,2003,25(5):360-363.

[10]李晓华,杨小燕.猪胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定[J].中国兽医科技,2003,33(3):49-51.