农杆菌介导（共8篇）
农杆菌介导 篇1
水稻是世界上最重要的粮食作物之一, 它为人类提供了1/3以上的食物和能量。水稻也是虫害十分严重的大田作物, 稻螟虫、水稻负泥虫和稻飞虱危害最为严重, 而且水稻中抗虫资源十分贫乏, 加之田间各种杂草的蔓生, 我国北方水稻虫害和草害已成为生产中两大不可回避的焦点问题, 年经济损失达5%～20%。
转基因技术为抗性品种的培育提供了一条新途径。目前, 农杆菌介导的水稻遗传转化体系已经成为一个有效并初具规模的转化体系, 大多成功的都是籼稻品种, 粳稻起步较慢, 且基因共转化体系尚不完善, 本试验研究重点在于提高目的基因的遗传转化效率, 重点分析农杆菌介导转化北方优质粳稻转化体系中的几个重要参数。
1 材料与方法
1.1 材料
供试水稻: (幼胚) 成熟胚:龙稻6号、松粳9号等粳稻品种由黑龙江省农业科学院耕作栽培研究所提供。成熟胚:吉丰88、通粘1号等粳稻品种由吉林省农业科学院提供。
1.2 农杆菌菌株及质粒
根癌农杆菌 (Agrobacterium tume faciens) 菌株EHA105和质粒PCAMBIA1301由本实验室保存, 其中双元质粒载体PCAMBIA1301的T-DNA区含有ppt抗性基因和β-葡萄糖苷酶 (GUS) 基因。在GUS基因的编码区有一个内含子, 因此, GUS基因在植物中表达显著, 在细菌中则不能表达[1]。
1.3 培养基和试剂
MS培养基:大量、微量MS维生素, 铁盐, L-Pro, 500 mg·L-1水解酪蛋白, 30 g·L-1蔗糖, 2 mg·L-12, 4-D, 7 g·L-1琼脂粉, pH 5.8～6.0;NBC培养基:NB、100 μmol·L-1乙酰丁香酮 (AS) , pH5.2;AAM培养基:AA盐和氨基酸、B5维生素、500 mg·L-1水解酪蛋白、36 g·L-1葡萄糖、68.5 g·L-1蔗糖、100 μmol·L-1AS, pH 5.2;AS、利福平和卡那酶素、链酶素均由黑龙江省农业科学院生物技术研究所保存, X-Gluc购于上海生物工程有限公司。
1.4 组织培养
在无菌器皿中, 成熟胚或幼胚经过以下洗涤:75%酒精浸1～2 min, 再用无菌水洗2次后, 20%的次氯酸钠浸30 min, 无菌水洗4～5次, 用无菌镊子把胚放在无菌滤纸上吸干, 接种与MS培养基上诱导愈伤组织, 一周后, 除去胚分生出的芽, 将愈伤置于MS2 (加2 mg·L-12, 4-D) 培养基上继代培养, 以后每2周继代一次。经2～4次继代后即可选择嫩黄、颗粒状的胚性愈伤准备与菌共培养进行转化, 预培养1～3 d。
1.5 农杆菌的培养及其介导的水稻转化
将携带有质粒PCAMBIA1301的农杆菌EHA105, 在含有30 mg·L-1利福平、50 mg·L-1卡那酶素、50 mg·L-1链酶素的LB液体培养基中 (酵母粉5 g;蛋白胨10 g;NaCl 10 g;pH 7.0;总体积1 L, 高压灭菌) , 震荡培养至D (600 nm) =0.6～2.0, 菌液在无菌的50 mL的离心管中以400 r·min-1×10 min离心, 收集沉淀去上清, 再用30 mL的NBC (MS2+ AS 100 μmol·L-1) 液体培养基重悬, 将预先挑好的愈伤浸在菌液中20～30 min后, 再用无菌滤纸或吸水纸吸去多余的菌液 (无须进一步吸干) , 置于MSCO固体培养基 (可覆盖一层无菌滤纸) 上, 25℃暗培养1～4 d。共培养后直接进行GUS瞬时表达检测并计算瞬时表达率[2]。
GUS瞬时表达率/%=GUS+ 愈伤组织/总愈伤组织×100%。式中GUS+指有GUS基因的表达。
根据实验预计, 设计以下4组实验: (1) 愈伤组织预培养天数:共培养前的愈伤培养天数1、2、3、4、5 d。 (2) 菌液浓度:[D (600 nm) 为0.6、0.8、1.0、1.5、2.0]。 (3) 共培养天数:1、2、3、4 d。 (4) AS的添加浓度:0、100、200、300 μmol·L-1。
1.6 GUS染色分析
根据Jefferson[3]的方法进行。将共培养的愈伤组织浸入适量的X-Gluc染色液 (含50 mmol·L-1 Na3PO4 缓冲液 (pH 7.0) 、0.1%Triton X-100、20%甲醇、0.5 mg·L-1X-gluc) , 于37℃保温过夜, 然后统计产生蓝斑和未产生蓝斑的愈伤组织数量。
2 结果与分析
2.1 愈伤组织预培养天数对GUS瞬时表达率的影响
将连续继代的供试品种获得的愈伤组织转接到新鲜的MS培养基预培养1～6 d, 再分别与农杆菌进行共培养, 3 d后检测GUS基因的瞬时表达率。从表1可看出, 供试粳稻愈伤组织以预培养5 d获得的GUS瞬时表达率最高, 达75%;而少于5 d或高于5 d, 其GUS瞬时表达率均比预培养4 d的数值低, 这表明4 d的预培养时间是愈伤组织活性的最佳时期。
2.2 菌液浓度对GUS瞬时表达率的影响
在农杆菌介导的遗传转化中, 菌液浓度的选择直接关系到转化的成败, 当菌液浓度过低的时候, 携带目的基因的农杆菌细胞数量少使转化效率降低;反之, 如果农杆菌菌液浓度过高时, 一方面会造成细菌不充分影响后期培养, 另一方面由于营养不足造成死菌过多同样限制农杆菌的侵染能力。从表2中可以看出, 菌液浓度在D (600 nm) <1.0时GUS的瞬时表达率随菌液D (600 nm) 增加而升高;当D (600 nm) =1.0～1.2的时候, GUS的瞬时表达率则维持一个相对稳定的水平, 当菌液浓度高的时候, GUS的瞬时表达率的反而下降。
2.3 共培养时间对瞬时表达率的影响
经过预培养4 d的愈伤组织与农杆菌共培养1～4 d后, 进行GUS组织化学染色, 比较不同的共培养天数对瞬时表达率的影响 (见表3) 。从中可以看出3 d可以达到较高的瞬时表达率.共培养时间长会导致农杆菌在愈伤组织表面过度繁殖使组织坏死, 降低转化效率;另一方面, 也影响随后的抗性愈伤组织筛选时对农杆菌的抑制。一般情况下, 共培养2～3 d, 愈伤周围刚出现菌斑, 愈伤组织仍处于嫩黄时较适宜进行细菌筛选。
2.4 不同的AS浓度对GUS瞬时表达率的影响
由于单子叶植物缺少足够多的酚类物质来激活农杆菌的侵染能力, 因此, 在转化过程中必须人为地添加一些酚类物质以提高转化效率。本试验就共培养中添加不同的AS浓度对GUS瞬时表达率的影响进行了比较 (见表4) 。从中可以看出, 在不添加AS的情况下, GUS瞬时表达率为0, 转化基本上是不可能实现的, 当浓度达到100 μmol·L-1时, GUS瞬时表达率迅速提高, 高于100 μmol·L-1时, 瞬时表达率差异并不显著, 说明添加100 μmol·L-1AS就可以达到理想的效果。
3 结论与讨论
农杆菌介导的外源基因的转化是细胞分子水平的相互作用, 在这个遗传转化体系中, 任何影响细胞转化能力的因素都有可能对外源基因的整合转化产生影响, 如不同的碳源、不同的外植体类型、载体类型、农杆菌菌株以及受体组织的类型等均是影响转化的因素。
GUS基因作为一种遗传转化的标记基因, 一般GUS瞬时表达率与转化率成平行关系, 即瞬时表达率越高, 转化效率也越高[4]。因此GUS瞬时表达率是衡量转化效率的一个重要依据, 本试验通过GUS瞬时表达率来衡量各个影响北方优质粳稻遗传转化的因素进行了比较, 从而确定了几个适宜遗传转化体系的重要参数: (1) 农杆菌侵染愈伤组织的菌液浓度以D (600 nm) = 0.8～1.0较为适宜; (2) 最佳共培养时间为2 d; (3) 预培养时间为5 d; (4) 共培养培养基中添加100 μmol·L-1乙酰丁香酮的转化效率有明显提高。
参考文献
[1]程继鸿, 王鸣, 何玉科, 等.植物抗虫基因工程研究进展[J].北京农学院学报, 2000, 15 (1) :56-58.
[2]朱玉贤.植物基因的克隆与转化研究进展[J].河北科技大学学报, 1999, 20 (2) :5-9.
[3]Jefferson R A.Assaying chimeric genes in plants;the GUSgene fusion system[J].Plant Mol Rep., 1987, 5:387-405.
[4]王关林, 方宏筠.植物基因工程的原理与方法[M].北京:科学出版社, 1998.
农杆菌介导 篇2
影响农杆菌介导的河北杨遗传转化的因素
从预培养时间、侵染菌液浓度、侵染时间、共培养时间及添加AS(乙酰丁香酮)5个方面,以卡那霉素抗性芽频率作为衡量指标,研究了各因素对河北杨遗传转化率的影响.优化筛选的最适转化系统为:预培养2 d,农杆菌活化菌液1/2MS稀释10倍,侵染5 min,共培养4 d.按此方法河北杨叶盘转化率可达35%.
作 者：贾小明 樊军锋 JIA Xiao-ming FAN Jun-feng 作者单位：西北农林科技大学,林学院,陕西,杨陵,712100刊 名：西北林学院学报 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF NORTHWEST FORESTRY UNIVERSITY年，卷(期)：21(5)分类号：S792.119.04关键词：河北杨 遗传转化 转化率
农杆菌介导 篇3
1 玉米的转基因育种技术
玉米的基因导入方法主要有2大类:根癌农杆菌介导转化和无需载体的DNA直接导入的转化。DNA直接导入转化主要包括基因枪法、花粉管通道法、子房注射法、PEG法、电击法、阳离子转化法等。
1.1 根癌农杆菌介导法
农杆菌介导法是转基因技术中经常采用的一种手段。农杆菌在双子叶植物上的遗传转化方法已经十分完善, 由于单子叶植物不是农杆菌的天然宿主, 在单子叶植物上的遗传转化研究落后于双子叶植物。GRIMSLY等首次以玉米为材料, 用农杆菌将玉米条纹病毒 (MSV) 的cDNA导入玉米植株中, 使植株表现了系统感染症状, 这个报道有力地证明了农杆菌能侵染玉米。这是玉米转基因育种的一个重要转折点, 它开创了农杆菌应用于玉米转基因育种的新纪元。GOULD等利用农杆菌转化玉米茎尖分生组织获得转基因植株, SOUTHERN杂交分析结果显示外源基因稳定遗传到R1代。ISHIDA用含超双元载体的农杆菌转化玉米幼胚A188获得成功。黄璐等报道了用根癌农杆菌介导的方法转化玉米栽培品种, 获得转化植株, 并对转化的愈伤组织中沉默的外源基因的甲基化现象进行了分析。
农杆菌介导法具有简单易行, 不需昂贵的设备, 成本低, 转化频率高, 拷贝数少, 遗传表达稳定性较好等优点, 许多研究工作者仍热衷于不断完善这一转化体系, 尤其近几年在单子叶植物特别是禾谷类作物上的突破性进展, 表明农杆菌是很有潜力的一
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种转化方法。
1.2 基因枪介导法
基因枪法是通过基因枪击发火药爆炸、高压气体或高压放电所产生的推力使携带了外源基因的金属微弹穿透植物的组织、细胞壁和膜结构, 将外源基因送入细胞核, 进而整合到植物基因组中, 实现遗传转化。基因枪转化的受体类型非常广泛, 能被基因枪微弹穿透的组织都可以作为转化的受体, 是玉米目前遗传转化的主要方法。受体组织的类型对基因枪的转化也有一定的影响, 具有潜在分化能力的细胞容易接受外来DNA, 转化率高。基因枪法不受基因型的限制, 但缺点是外源基因整合的拷贝数多。
1989年, KLEIN第一次使用基因枪法转化玉米, 并获得成功。PHILIPPE等用山梨糖醇和甘露醇处理玉米的胚性悬浮细胞, 用基因枪把GUS基因导入玉米中, 而且, 经山梨糖醇和甘露醇处理过的细胞, 其转化频率提高了2.7~6.8倍。在我国, 许多研究者均使用基因枪法获得遗传转化的成功。
1.3 种质系统转化法
种质系统转化, 或称生物媒体转化系统, 即利用花粉粒、花粉管通道或利用子房、幼穗及种胚注射外源DNA等方法, 实现外源基因的导入。
子房注射法是指利用显微注射仪或微注射针把外源DNA溶液注入子房中, 靠子房产生的压力及卵细胞的吸收使外源DNA进入受精的卵细胞中。丁群星等首次报道用子房注射法将Bt抗虫毒蛋白基因导入玉米自交系, 经SOUTHERN及PCR检测证明目的基因已整合, 同时对转基因后代植株分子检测也呈阳性, 对玉米螟饲喂显示一定的抗虫效果。在农大60品种上重复试验, 也获得成功。沈世华等利用离体子房注射法转化普通玉米获得成功, 比非离体转化效率有所提高。目前, 该方法转化率还不高, 影响转化效率和结实率的原因是子房经注射受害较深而导致败育。应改进注射技术和注射工具, 尽量减轻对子房的伤害, 提高注射的准确度, 并且DNA和注射工具均不能带菌。尽管如此, 这一方法仍然具有优势, 经过进一步探索, 将是玉米基因转化的一个重要方法。
1.4 其它转化方法
迄今报道在玉米上应用的其它基因直接导入方法还有PEG介导法、电激穿孔法、碳化硅纤维介导法、阳离子转化法等等, 这些方法往往以原生质体为受体材料。尽管已有许多研究表明, 外源基因被导入原生质体在细胞中能瞬时表达, 并且在其再生愈伤组织中稳定整合和表达, 然而由此获得的转基因可育植株却很少。玉米原生质体再生植株强烈地依赖于基因型, 仅有少数几例对生产价值不大的品系如A188等能再生植株, 无法应用于许多栽培品系或品种, 因此这些转化方法受到很大限制。
2 农杆菌介导的玉米转基因受体
2.1 原生质体
FROMM等、RHODE等、WANG等分别以玉米的原生质体为受体, 对玉米进行遗传转化, 并取得了成功。原生质体作为转化受体, 具有转化效率高, 嵌合体少, 可适合于各种转化系统等优点;但原生质体培养周期长, 再生频率低, 遗传稳定性差, 再生植株变异大等缺点。1994年马力耕等通过两步酶解以黄化叶片为材料获得原生质体;2000年文仁来等以花药培养获得的单倍体的愈伤组织, 酶解得到原生质体用于体细胞杂交;2002年支那英等将小麦和玉米原生质体进行杂交得到体细胞杂种。
2.2 愈伤组织
ARMSTRONG等把玉米愈伤组织分为2种类型:Ⅰ型, 白色、紧密坚硬、干燥、表面皱起、生长慢、易发生器官的分化;Ⅱ型, 黄绿色、颗粒状、较紧密、较湿润、生长快、易发生胚状体。Ⅱ型是目前玉米转化的常用受体, 具有较高的转化频率和再生频率。但玉米胚性愈伤组织的诱导明显受到基因型的限制, 能诱导较高胚性愈伤组织的报道目前仅局限于A188、B73等少数基因型材料中。目前已经从玉米叶片、幼穗、茎尖、幼胚、花药等外植体诱导出愈伤组织, 但幼胚是较好的外植体。同时愈伤组织的诱导还受到外植体生理状态和放置方式的影响。
2.3 丛生芽
丛生芽是由于玉米茎伸长受阻, 而从叶掖中长出的大量不定芽, 每个不定芽都有形成幼苗的能力, 而丛生芽的诱导相对愈伤组织较为容易, 并且不用再诱导发芽, 可以提高后代的生成率, 降低工作量。李国圣等利用玉米丛生芽结合基因枪法获得转基因植株。
2.4 悬浮细胞
就是将容易分散的细胞通过细胞悬浮液, 将其分散培养, 在多次继代培养后, 将小的细胞团诱导成小的愈伤组织, 然后在固体培养基上继续培养、分化获得再生植株。1994年孙世孟等利用获白×莱1029的愈伤组织, 建立了4个悬浮细胞系, 得到7个再生植株;1996年向太和等提出悬浮细胞系建立的几个关键技术及断胚性悬浮细胞系的参考标准;马莲菊等认为基因型和培养基对悬浮细胞系的建立有影响, 特别是基因。
2.5 子房和幼穗
虽然愈伤组织、悬浮细胞、原生质体和丛生芽都可以获得转基因植株, 但T0代是嵌合体, 若得到转基因的种子还不容易, 并且在嵌合体中基因更容易丢失, 如果通过雌配子或刚刚授精的合子, 则T0代就是带有目的基因的转基因的种子, 而后代基因保存中只是进行自交和基因检测, 较容易。由于农杆菌具有单细胞浸染能力, 未授粉前的成熟雌配子浸在大量农杆菌的液体中, 有可能被农杆菌浸染而获得转基因植株。由于雌配子能够忍受外源DNA, 或变异染色体, 所以可以通过雌配子传递, 而且后代直接通过种子传递避免嵌合体的存在, 易得到稳定的后代。授粉初期的幼穗, 也可以接受外源基因, 吕维涛等就通过幼穗浸染得到稳定的大麦后代。
3 转基因技术在玉米育种中的应用
玉米转基因技术应用领域十分广泛, 主要应用在抗虫转基因玉米、抗除草剂玉米、特种玉米等方面。近年来, 美国许多公司都推出了自己的转基因玉米品种, 抗虫、抗除草剂基因工程已进入商业化应用阶段。至2001年底, 转基因玉米种植面积已达5260万hm2, 经济效益和社会效益明显。
3.1 抗虫转基因玉米
虫害是制约玉米生产的一大因素。目前, 解决玉米虫害的主要方法, 是在玉米植株生长过程中喷施化学杀虫剂。化学杀虫剂不但杀死害虫, 也杀死害虫的天敌, 长此以往会造成生态平衡的破坏和环境污染的日益严重。同时, 由于害虫对农药产生抗药性使人们不断加大使用剂量, 会造成环境污染的恶性循环。转基因抗虫玉米是替代杀虫剂的更有效方法, 同时应采取有效的方法防止害虫对转基因植株产生抗性, 如继续使用部分传统的玉米种子, 并加快培养新一代的抗虫玉米杂交种。
抗虫转基因玉米主要应用的是BT毒蛋白基因, BT (苏云金芽孢杆菌) 在芽孢形成的过程中产生杀虫晶体蛋白 (ICP) , BT毒蛋白在体孢晶体内以原毒素的形式存在, 被昆虫摄取后在昆虫幼虫的肠道内的微碱性条件下经蛋白酶水解转变为毒性多肽分子。可与昆虫肠道上敏感的表面特异受体相互作用, 扰乱细胞的渗透平衡, 从而导致幼虫停止进食, 最终死亡。美国孟山都公司等改造合成了多种BT杀虫蛋白基因, 并转入玉米。1996年美国正式批准BT转基因玉米进入商品化生产, 当年推广面积达31万hm2, 1997年其种植面积达320万hm2, 试验结果表明, 玉米植株对玉米螟等害虫具有明显的抗虫效果, 平均增产9%。
国内在“863”高新技术计划的资助下, 合成了Cry1A基因。王国英等把Cry1A (b) 基因导入米, 育成了稳定的抗虫玉米。李慧芬等把抗虫融合基因Cry1Ac3-cpti导入了玉米。目前我国的转基因玉米已开始环境释放试验。
3.2 抗除草剂转基因玉米
抗除草剂基因工程植物在国外很受重视, 将抗除草剂耐性基因引入玉米是增加其对除草剂选择的安全性一种新的途径, 也是一种高效、低成本、无公害的控制杂草的手段。IMI玉米是美国一家公司开发的抗除草剂, 它对除草剂具有高度耐受性, 允许在其上喷撒除草剂, 以控制一年生杂草和宽叶杂草。该产品于1996年已实现商品化。SR玉米是BASF公司开发的抗除草剂玉米, 对除草剂具有高度耐受性, 在出芽后喷施可防治大多数禾本科的杂草。
在抗除草剂基因中以Bar基因应用最广而且最为成功。来源于吸水链霉素 (Streptomyces hygro-scopicus) 的Bar基因被广泛用作玉米基因转化中的选择标记基因, 除草剂抗性基因的利用不仅可作选择标记, 同时还具有农业生产用途, 带有除草剂抗性的转基因玉米不受除草剂伤害而显著提高产量。用基因枪将来自拟南芥突变体中的抗除草剂基因als (acetolactate synthase) 导入玉米细胞, 经检测具有抗除草剂特性。
近年来, 随着基因转化技术的不断完善, 科学工作者培育出了一大批抗除草剂转基因玉米品种。如抗咪唑啉酮玉米、抗稀禾定玉米、抗Liberty玉米、抗农达玉米、抗Poast玉米、抗草甘膦玉米、抗草铵膦玉米、抗草丁膦玉米等。
3.3 利用转基因玉米作载体生产特殊蛋白
利用转基因玉米生产特种蛋白已成为另一种研究方向。美国德克萨斯大学实验站已将遗传工程玉米天然产生的特别蛋白推向市场。首批大量销售的两种产品是抗生素蛋白和葡萄糖苷酸酶。因为玉米基因易被修饰而且其基础条件已经具备, 用标准技术可以很容易的将所需物质提取出来, 所以该公司选择以玉米为载体通过一定的基因工程手段使其生产特殊蛋白。此外, 抗病毒、高淀粉、高赖氨酸以及转入两种以上的目的基因的转基因玉米正处于试验阶段, 有待于进一步的开发和利用。
3.4 抗病转基因玉米
抗病转基因玉米的主要目标是抗病毒和抗真菌病害。研究发现玉米矮花叶病毒 (MDMV) B株外壳蛋白在转基因植株中表现出对MDMV的抗性。另外, 转几丁质酶基因玉米被认为具有抗真菌病害的效果。
3.5 改良品质
赖氨酸是玉米蛋白质中的限制性氨基酸, 含量高低直接关系到玉米的营养价值。孙学辉等通过基因工程提高了玉米的赖氨酸含量。国外已经报道了通过转基因玉米生产鸡蛋抗生素蛋白, 并已进入商业化生产。
4 玉米转基因存在的问题和育种应对策略
目前一些人们恐惧基因工程创造的转基因新物种带来的危害如环境危害和食品安全性。但鉴于转基因玉米的独特优势, 没有理由仅仅因为它存在一些潜在的风险就视之不理或采取敌视的态度。相反, 我们应该正视现实, 积极解决问题。
a.除加强转基因本身的研究外, 还要加强新基因鉴定和基因分离克隆的研究, 给转基因提供有用的基因源。
b.在玉米转基因研究中, 应认真借鉴别的国家先进经验成果并结合我国的具体实践, 如应把研究重点从玉米转化研究转向转基因的表达研究, 把抗性基因转移转向品质性状基因转移等。
c.在我国亟待进行玉米基因组研究, 这对转基因玉米研究和品种培育十分重要。基因组作图、表达序列标签 (EST) 测序、mRNA转录本作图和蛋白质鉴定等, 将是今后近年玉米分子生物学研究的前沿领域。
农杆菌介导 篇4
根癌农杆菌介导转化川草二号老芒麦胚性愈伤组织
以川草二号老芒麦成熟种子为外植体,经过对培养基的筛选和培养条件优化,建立了愈伤组织再生系统.转化载体为pCAMBIAl304质粒,其T-DNA上携有潮霉素抗性基因(hptⅡ)和类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因(ppIP),经根癌农杆菌EHAl05介导转化结构致密、颗粒状、黄白色的胚性愈伤组织.通过潮霉素筛选和对抗性植株进行分子检测,获得了转基因植株.同时优化了农杆菌遗传基因转化的参数,建立了农杆菌介导的川草二号老芒麦程序化转基因方案.
作 者：李达旭 张杰 赵建 张艺 李力 刘素君 陈飞 杨志荣 LI Da-Xu ZHANG Jie ZHAO Jian ZHANG Yi LI Li LIU Su-Jun CHEN Fei YANG Zhi-Rong 作者单位：四川大学生命科学学院,生物资源与生态环境教育部重点实验室,成都,610064刊 名：植物生理与分子生物学学报 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF PLANT PHYSIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY年，卷(期)：200632(1)分类号：Q74关键词：川草二号老芒麦 愈伤组织再生 类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因 农杆菌转化
农杆菌介导 篇5
全世界范围内草莓属植物分布较为广泛,约50个种,20个常见种,主要分布在大洋洲南部、南美太平洋沿岸、亚洲、欧洲和非洲等。我国的地域辽阔,气候类型多样,有着丰富野生草莓资源,我国产约7~9个种[2],在世界上属于野生草莓种质资源最丰富的国家[3,4]。
由于草莓的高杂合性和多倍性等特点,给其新品种培育工作带来了一系列难以解决的为题,诸如培育周期长、效率低下、工作量加大等[5],但是随着近年来生产技术持续不断的发展,在提高品种品质、产量方面,传统的草莓培育新品种的方法受到了诸多因素的困扰,生产上还是缺乏抗病虫、抗逆境等的优良品种。所以当前人们可以利用植物分子生物工程技术创造新的种质资源。自国内外针对草莓相继开展的转基因研究的时间是在20 世纪80年代末[6,7,8,9,10,11,12]。草莓基因工程的真正开始是1990年以James等[13]获得的第一株草莓转基因植株为标志的,之后,多种有价值的外源目的基因相继被转入草莓中。因此,基因型是影响草莓遗传转化是否成功的关键,广泛收集草莓品种的不同基因型,探索更有利于草莓遗传转化的再生条件仍是目前研究的重要课题[14]。
1 影响草莓离体再生的各种不同因素
近些年来对草莓外植体离体再生和遗传转化的研究越来越多。许多研究人员从多方面入手进行了大量的研究,努力探寻再生频率高的基因型、外植体类型及培养条件等。
1.1 基因型
因为基因型的影响,即使是同一品种组织的再生频率也不甚相同,所以说基因型对建立再生体系影响很大。许多大量研究表明染色体上的基因可调控外植体的再生能力,在研究草莓的再生体系时,许多研究人员都报道过植物外植体基因型不同,其产生不定芽的能力亦不甚相同。因此对比多种基因型,挑选出再生能力强作为外植体以便建立高效的草莓遗传转化体系[15]。
1.2 外植体的生理状态
在草莓组织培养技术研究中,研究最多、分子生物学工程应用也最多的其中一条途径是以叶片作为外植体不定芽,该途径不定芽再生可分为两种方式:经愈伤组织再生不定芽和直接再生不定芽。此外,叶片的离体再生能力与其再生不定芽能力受叶片的生理状态影响,而叶片的生理状态也受植物叶龄、叶片部位、接种时外植体放置方式等因素影响。通常生长旺盛的幼年型的植株外植体较成年型的植株外植体具有更强的再生能力。温室生长14~30d的植株叶片的再生效率比叶龄在30 d以上至一年生植株叶片的再生率高[16,17]。因此可以通过离体继代繁殖草莓试管苗即可获得大量幼嫩且生长健壮的外植体。
1.3 生长调节剂种类和浓度
植物激素是培养基中的关键物质,不同激素的种类、浓度对植物离体再生效率具有很大影响,这在草莓中也充分体现出来。在建立草莓叶片离体再生体系中,培养基中主要添加的有两类激素,第一类是细胞分裂素,第二类是生长素,激素使用的关键是调节这两种激素的种类与比例。第一类激素一般多选用6-BA,第二类激素一般多选用IBA、IAA、2,4-D、NAA等[18]。在草莓离体再生体系的许多研究中发现,以TDZ与6-BA相比较,TDZ具有更高的活性,可诱导不同基因型的叶片再生不定芽[17,19],TDZ也可促进原生质体的再生[20],所以是TDZ较6-BA更能够明显提高草莓的离体再生效率。TDZ随后被广泛应用于植物组培中是自20世纪80年代初Mok等[21]发现其具有细胞分裂素活性。也发现,作为细胞分裂素,TDZ的特点是具有较宽的有效浓度范围,而且6-BA与TDZ配合使用的效果显著优于NAA和2,4-D与TDZ配合使用的效果[19]。
1.4 温度和光照
草莓的再生体系要求的温度一般是25±2℃,恒温培养[18]。Nehra的研究发现最适光强为12.5μmol·(m-2·S-1)。在低光照或无光照条件下也会产生不定芽,但生长的不定芽是白化且纤细,在光强为25μmol·(m-2·S-1)及以上时,每个外植体的再生效率以及平均再生芽数均会随之下降。当光强达到62.5μmol·(m-2·S-1)时,叶片外植体最终褐化[16]。前期暗培养对草莓影响较复杂[17]。所以今后需要对暗培养作用机制作进一步研究。
2 草莓遗传转化研究进展
2.1 草莓遗传转化方法
在20世纪70年代以来,开发出来的植物遗传转化技术有多种[22],但是目前常用的主要有两种,第一种是农杆菌介导法[23,24,25,26]和第二种基因枪法[27,28,29]。农杆菌介导法是人为首次建立起来的广泛应用的转移基因方法[30],这种遗传转化方法至今一直被广泛应用,它具有许多优势,例如拷贝数低、遗传稳定性高以及能够转入大片段DNA等,而且操作简单、费用低廉。农杆菌主要有两种类型,分别为发根农杆菌和根癌农杆菌,目前主要是根癌农杆菌应用于果树的遗传转化研究中[31],根癌农杆菌介导的遗传转化法也成为应用于草莓中的最主要的遗传转化方法。
2.2 影响农杆菌介导草莓遗传转化效率的主要因素
2.2.1试材基因型
植物遗传转化是否成功的决定性的因素取决于植物的外源基因型[32]。Binns等人研究发现,在一般情况下细胞的生理状态决定了特定的基因型,特别是细菌细胞壁的结构连接的影响,细胞受到创伤后分泌的小分子酚类化合物,研究还发现细胞内源激素水平影响细胞的生长和分化[33]。
2.2.2菌株类型
农杆菌的浸染能力是影响植物遗传转化是否成功的其中一个主要因素。植物遗传转化效率的高低直接取决于农杆菌与外植体之间是否有高侵染力的配合[34]。不同农杆菌的致病性不一样,其中野生的琥珀碱性菌株A281对许多植物都具有超致病性,现在农杆菌介导的草莓遗传转化研究中常用的就是将A281改变后获得的菌株EHA105[31]。利用GUS瞬时表达检测早期阳性抗性愈伤组织的诱导率时,发现琥珀碱型菌株A281的转化效率高于章鱼碱型菌株或胭脂碱型菌株,约是这两种类型菌株10倍多[35],琥珀碱型菌株EHA105约是LBA的8倍[36]。
2.2.3菌液浓度和侵染时间
细菌的浓度和外植体受感染的时间对植物遗传转化的是否成功有很大影响。所以在转化试验过程中要适当缩短繁殖速度快的菌株的侵染时间以及适当延长繁殖速度较慢的菌株的侵染时间。研究认为在植物遗传转化研究中为达到最佳的遗传转化效率可用OD值为0.5的农杆菌菌液侵染外植体10min[37]。
2.2.4共培养时间
在整个遗传转化过程中,共培养时间在其中也是非常重要的环节,在该期间会完成T-DNA的切割、转移和整合等一系列过程。只有共培养时间长于16h细菌在创伤部位才能产生肿瘤。此外共培养的时间也不要过长,否则农杆菌会过度生长造成后期除菌工作致使转化效率降低[37]。共培养时间2~4d是最佳的时间[38,39,40],共培期间产生肉眼可见的菌落时即可进行后续的选择培养或推迟选择培养[41]。众多试验研究结果表明草莓的共培养以3d的时间比较适宜[7,8,10,12,42]。
2.2.5推迟培养和筛选培养
在植物遗传转化试验中常用立即选择或推迟选择这两种选择培养方式。之所以在选择培养中较多采用推迟选择是因为草莓属于对卡那霉素较为敏感的植物。在进行遗传转化试验中多采用卡那霉素浓度在20~50mg·L[14,42,43]。
2.2.6抗生素的种类
抑菌性和选择性两类抗生素在农杆菌介导的植物遗传转化中常被使用到[38]。由于选择标记基因转化细胞可以对抗生素表现出抗性,在再生培养基中加入一定量的选择性抗生素后转化细胞能在选择再生培养基上正常生长,而非转化细胞的植株则逐渐死亡。而抑菌性抗生素的作用是使农杆菌的生长得到抑制,一个有效的受体转化系统应该是既对选择性抗生素敏感又不受抑菌性抗生素的影响。
头孢霉素和羧苄青霉素是草莓上常用到的抑菌性抗生素[14]。转化时可用约250 mg·L-1浓度的头孢来抑制农杆菌的生长,但朱海生等[37]的研究发现300 mg·L-1的羧吩青霉具有更好的抑菌效果,且对不定芽的分化影响亦较小。
在筛选转化植株的过程中潮霉素和卡那霉素两种选择性抗生素常被用到。朱海生等[37]研究表明卡那霉素浓度为20mg·L-1时即可抑制非转化细胞的生长。
2.3 遗传转化在草莓上的应用
农杆菌介导 篇6
1 农杆菌介导玉米遗传转化的发展过程
1987年, Grimsley等[1]首先用胭脂碱农杆菌C58将玉米条纹病毒 (Maize Streak Virus) 的cDNA转化玉米幼苗分生组织或靠近生长点的部位, 98%的玉米叶片表现了病毒感染性状, 说明T-DNA已经转化到玉米细胞中, 从而给农杆菌介导的玉米遗传转化带来了一缕曙光。Gould等 (1991) 用gus报告基因和Npt基因通过农杆菌介导法转化玉米FunkG90的芽尖, 得到的再生植株及其子一代基因组中带有标记基因, 从而为建立玉米高效遗传转化体系奠定了基础[2]。Ishida等 (1996) 建立了一套农杆菌介导的高效转化体系, 通过对菌株、菌液浓度、幼胚等各种因素的优化, 使玉米的转化效率达30%, 成为玉米遗传转化进程中的一个里程碑[3]。国内黄璐、卫志明等[4]1999年用带有质粒pGIH的根癌农杆菌EHA101转化玉米栽培品种的愈伤组织, 获得8.1%的转化率, 而且他们还对转化的愈伤组织中沉默外源基因的甲基化现象进行了分析。Huang等成功通过调控农杆菌转化载体的左右两个边界转化再生出不含标记基因的玉米, 解决了转基因玉米在食品安全方面的顾虑。近年来, 关淑艳等利用农杆菌介导法将玉米淀粉分支酶基因的反义表达载体导入玉米自交系中, 并对农杆菌转化系统的条件进行了研究[5]。Yan等通过嘌呤嘧啶抑制剂和表面活性剂Silwet L-77处理提高了农杆菌对掖515和齐319的转化频率。从以上步骤看, 植物被成功转化的关键在于:农杆菌能否吸附到植物细胞壁上;植物能否释放诱导Vir区基因表达的信号分子;植物感受态细胞是否存在。
农杆菌介导法具有简单易行、不需昂贵的设备、成本低、转化频率高、遗传表达稳定性较好等优点, 许多研究工作者仍热衷于不断完善这一转化体系, 尤其近几年在单子叶植物特别是禾谷类作物上的突破性进展, 表明农杆菌是很有潜力的一种转化方法。
2 农杆菌介导的玉米转基因受体
2.1 原生质体
Fromm等以玉米的原生质体为受体, 对玉米进行遗传转化, 并取得了成功。原生质体作为转化受体, 具有转化效率高, 嵌合体少, 可适合于各种转化系统等优点;但原生质体培养周期长, 再生频率低, 遗传稳定性差, 再生植株变异大等缺点。1994年马力耕等通过两步酶解以黄化叶片为材料获得原生质体[6];2000年文仁来等以花药培养获得的单倍体的愈伤组织, 酶解得到原生质体用于体细胞杂交;2002年支那英等将小麦和玉米原生质体进行杂交得到体细胞杂种。
2.2 愈伤组织
1985年Armstrong等把玉米愈伤组织分为2种类型:I型, 白色、紧密坚硬、干燥、表面皱起、生长慢、易发生器官的分化;II型, 黄绿色、颗粒状、较紧密、较湿润、生长快、易发生胚状体。II型是目前玉米转化的常用受体, 具有较高的转化频率和再生频率, 但玉米胚性愈伤组织的诱导明显受到基因型的限制, 能诱导较高胚性愈伤组织的报道目前仅局限于A188、B73等少数基因型材料中。目前已经从玉米叶片、幼穗、茎尖、幼胚、花药等外植体诱导出愈伤组织, 但幼胚是较好的外植体。同时愈伤组织的诱导还受到外植体生理状态和放置方式的影响。
2.3 丛生芽
丛生芽是由于玉米茎伸长受阻, 而从叶掖中长出的大量不定芽, 每个不定芽都有形成幼苗的能力, 而丛生芽的诱导相对愈伤组织较容易, 并且不用再诱导发芽, 可以提高后代的生成率, 降低工作量。李国圣等利用玉米丛生芽结合基因枪法获得转基因植株。
2.4 悬浮细胞
悬浮细胞就是将容易分散的细胞通过细胞悬浮液, 将其分散培养, 在多次继代培养后, 将小的细胞团诱导成小的愈伤组织, 然后在固体培养基上继续培养、分化获得再生植株。1994年孙世孟等利用获白×莱1029的愈伤组织, 建立了4个悬浮细胞系, 得到7个再生植株;1996年向太和等提出悬浮细胞系建立的几个关键技术及断胚性悬浮细胞系的参考标准;马莲菊等认为基因型和培养基对悬浮细胞系的建立有影响, 特别是基因。
3 农杆菌介导的基因转移方法
3.1 共培养法
共培养法是农杆菌介导法转化双子叶植物和单子叶植物中最常用的方法, 也是农杆菌转化玉米最基本的方法。用经过预培养处于对数生长期的活跃农杆菌菌液与玉米的外植体进行共培养, 使农杆菌侵染玉米并将外源DNA整合到玉米基因组中去。
3.2 农杆菌与基因枪结合法
先用基因枪轰击植物细胞, 造成创伤, 然后再用农杆菌侵染, 有利于提高转化效率。Rasmussen等曾用1.0%的酚类物质预处理后的农杆菌细胞和大肠杆菌细胞结合在钨粉粒上, 用基因枪轰击悬浮培养的玉米细胞和烟草细胞, 提高了转化效率。认为是克服玉米基因型限制的一种有效方法。另外, 用分离的Ti质粒直接转化原生质体, 能克服寄主范围的限制, 但玉米的原生质体再生困难, 限制了此法在玉米上的应用。Escudero等用显微注射技术把农杆菌细胞注射到分生组织的单个靶细胞中, 使原来缺乏感受能力的玉米幼胚变得对农杆菌敏感。
4 遗传转化的影响因素
4.1 菌株和载体的选择
目前已经分离得到多种的根瘤农杆菌菌株, 但可以用于玉米转化的并不多, 普遍使用的菌株是LBA4404和EHA101。在玉米嫩枝分泌物中有特异阻遏毒性基因表达的物质, 主要的阻遏物MDI-BOA, 占分泌物的98%。Deepti Mohamalawari等分离出了一种可以抵抗DOMBOA的农杆菌菌株, 转移gus基因和nptⅡ基因, 对组织进行PCR分析确定了GUS基因已经转化入玉米组织细胞中。这种菌株的分离可以提高农杆菌介导基因转化玉米和其他单子叶植物的效率。另外, 菌株和载体的组合对转化至关重要, 其中超双元载体pSB131和pTOK233, 一般用LB4404进行转化。Hiei等的试验表明, 菌株和载体搭配不合适如超强菌株和超双元载体组合的转化效率比普通农杆菌与双元载体组合的效率还要低。
4.2 受体基因型
基因型是影响农杆菌转化效率的一个重要因素。基因型影响农杆菌对玉米的附着, 许多试验证明大多数玉米基因型细胞表面缺乏可供农杆菌识别并与之附着的位点, Ishida发现不同基因型之间转化效率差异显著, 最低为0, 最高为30%。张荣等[7]利用根瘤农杆菌LBA4404转化多种基因型的玉米幼胚, 发现含有A188遗传物质的玉米对农杆菌具有较强的感受性。很多试验表明, 基因型A188是农杆菌转化的理想受体。国内一些研究者正在尝试对我国实际生产中的优良玉米品种使用农杆菌介导法。
4.3 受体的发育状态
成功的基因转化首先依赖于建立良好的植物受体系统[8]。它应满足如下条件: (1) 高效稳定的再生能力。用于植物基因转化的外植体必须易于再生, 有很高的再生频率, 并且具有稳定性和重复性。 (2) 较高的遗传稳定性。 (3) 具有稳定的外植体来源。 (4) 对选择性抗生素敏感。 (5) 对农杆菌侵染有敏感性但无过敏性反应。例如:幼胚是人们最常用的受体, 一般12d左右的幼胚最适宜转化。Ishida等发现A188的1.5~2.0mm长的幼胚比2.0~2.5mm长的幼胚的转化效率高得多。愈伤组织是获得转基因植株的最好来源, 但未见有转化成功的报道, 试验表明转化愈伤组织比转化幼胚要困难多。选择处于活跃分裂增殖状态的、结构疏松、呈小细胞团状、色泽淡黄、大小均匀的Ⅱ型愈伤组织有利于农杆菌的转化。
4.4 培养基成分
农杆菌介导的玉米遗传转化大致可以分为侵染、共培养、恢复培养、筛选培养和植株再生等几个过程。在农杆菌介导的玉米遗传转化研究历程中, 因外植体不同使用的基本培养基也不同。农杆菌介导的遗传转化主要以幼胚和胚性愈伤为受体材料, 使用的基本培养基主要是N6和MS。除基本培养基外, 根据农杆菌转化的机制, 一般还在培养基中加一些特殊组分来提高农杆菌的附着能力、Vir基因的活性和受体材料的感受态。其中乙酰丁香酮、AgNO3、L-半胱氨酸、硫醇类物质都能比较显著的提高玉米的转化效率[9]。
4.5 选择性标记基因
玉米中最早应用的抗卡纳和潮霉素这两种抗生素的基因作为筛选标记基因。之后发现在玉米愈伤组织的筛选中, 利用抗除草剂的bar基因和pat基因的筛选效果要比用抗卡纳基因作为标记基因更为有效。Xianggan Li报道:利用原卟啉原氧化酶作为选择标记, 它是血红素和叶绿素生物合成途径中催化最后共同步骤的酶。当被除草剂抑制后会发生原卟啉Ⅸ的积累并引发光依赖膜的毁坏。通过筛选得到PPO基因的突变体, 可以抵抗除草剂并建立了这种选择标记的玉米选择体系。因而这种非抗生素标记基因通过适当的选择压力, 可明显地区分已转化和未转化的组织, 是一种非常有效的选择性标记基因, 现已被人们广泛应用。
4.6 其它影响因素
除以上几个主要的影响因素以外, 还有一些因素也影响转化农杆菌转化的效率。农杆菌的侵染浓度、侵染的方式、共培养的时间、温度及培养基的pH值等都是影响农杆菌侵染玉米的重要因素。农杆菌的侵染浓度不但能影响农杆菌的附着和基因转移, 而且还影响基因转移后的整合和表达。农杆菌的浓度在OD6000.5~0.7时转化率较高, OD值在0.3左右的菌液最有利于自交系A188幼胚的转化, 偏酸的环境 (pH值5.2左右) 、较低的温度 (22℃左右) 有利于农杆菌的转化。各种影响因素的综合和优化将有助于提高玉米的转化效率。
5 前景和展望
近十几年来, 农杆菌介导的玉米的遗传转化虽然取得了巨大的成就, 但是还存在很多问题亟待解决。农杆菌Ti质粒系统是较理想的转化系统。但由于T-DNA可以在植物染色体的任何区域内插入, 有可能导致有益基因的插入失活。因此, 对外源基因的定点插入问题还有待于进一步研究。叶绿体遗传转化系统[10]为植物导入外源基因提供了新途径, 它不仅以定点整合方式导入外源基因从而消除了位置效应及基因沉默, 而且还具有超量表达目的的基因、母性遗传防止基因扩散等许多优点, 但其转化方法仍然局限于物理转化, 操作复杂成本高, 转移整合无选择性, 不易得到纯合转化体, 是否可以通过改变T-DNA信号肽序列, 使T-DNA复合物导向叶绿体值得研究。相信随着遗传转化技术的进一步创新和完善以及玉米叶绿体基因组分子生物学研究的进一步深入, 叶绿体转化技术必将为玉米遗传转化带来新的生机和活力。
目前玉米的遗传转化研究主要集中于单基因转化, 且用于转化的有用基因为数极少, 因此寻找更多的有用基因, 探索多基因的共同转化可能是进一步研究的方向。
参考文献
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[3]ISHIDA Y, SAITO H, OHTA S et al.High efficiency transformation of maizemediated by Agrobacteriumtum efaciens[J].Nature Biotechnology, 1996 (14) :745-750.
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[5]关淑艳, 王丕武, 马义勇, 等.应用农杆菌介导法将淀粉分支酶基因反义表达载体转入玉米自交系的研究[J].吉林农业大学学报, 2005, 27 (5) :498-502.
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[7]张荣, 王国英, 张晓红.根癌农杆菌介导的玉米遗传转化体系的建立[J].农业生物技术学报, 2001, 19 (1) :45-48, 104.
[8]于艳波, 李景鹏.玉米遗传转化系统的研究进展[J].生物技术, 2002 (6) :43.
[9]张素芝, 荣廷昭.农杆菌介导的玉米遗传转化系统研究进展[J].遗传 (Beijing) , 2008 (10) :1249-1256.
农杆菌介导 篇7
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
供试材料为六倍体普通小麦(Triticum aestivum L.,AABBDD, 2n=6x=42)HB341、SN2618,是选育的小麦冬性高代品系,由国家小麦改良中心泰安分中心种植保存。
根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株为GV3101,质粒为pBI121,由中国科学院遗传研究所提供。质粒T-DNA区含有nos P启动的筛选标记基因新霉素磷酸转移酶基因(NPT Ⅱ)和CaMV 35s-P启动的β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS),二者的终止子都是nos T。
1.1.2 试剂
乙酰丁香酮(AS)、卡那霉素(Km)购自Sigma公司;链霉素(Sm)、利福平(Rif) 、羧苄青霉素(Carb)购自上海第四制药厂;其它常规试剂购自上海化学试剂有限公司。
1.1.3 仪器
PHG-280BX型恒温光照培养箱(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司);SHA-C水浴恒温振荡器(江苏恒丰仪器厂);YX400Ⅲ全自动电热蒸汽消毒器(上海三申);SW-CI-IC净化工作台(上海三申);723可见分光光度计(上海分析仪器三厂);HR-7751MS微波炉(青岛海尔)。
1.1.4 培养基
①组织培养基本培养基:
MS培养基附加水解酪蛋白(CH)500mg/l、谷氨酰胺200mg/l、天门冬酰胺150mg/l、蔗糖30g/l、琼脂粉8g/l。
②成熟胚愈伤组织诱导培养基:
基本培养基附加2, 4-D 2mg/l、NAA 0.5mg/l、ABA 0.1mg/l。
③分化培养基:
基本培养基附加细胞分裂素(KT)5mg/l。
④预培养、共培养培养基:
分化培养基附加AS 200μmol/l。
⑤筛选培养基:
分化培养基附加卡那霉素(Km)50mg/l、头孢霉素(Cef)200mg/l。
⑥生根培养基:
1/2MS培养基附加蔗糖20g/l,用8g/l琼脂粉进行固化。
⑦农杆菌培养液为YEP培养液:
酵母提取物10g/l、蛋白胨10g/l、NaCl 5g/l附加利福平(Rif)25mg/l、Km 50mg/l。
培养基的配制[13]:培养基成分除植物生长调节剂和抗生素外,按比例溶解混匀,组织培养培养基pH值调至5.8,YEP培养基pH值调至7.0~7.2,高压蒸汽灭菌121℃ 20 min,待培养基温度降至40~50℃时过滤灭菌加入植物生长调节剂和抗生素。
1.2 方法
1.2.1 小麦成熟胚的组织培养
选取小麦颜色、大小、饱满度相对一致的当年熟种子,70%(v/v)酒精浸泡5min,无菌水冲洗2~3次,经0.1%的升汞(HgCl2)浸泡20min,无菌水冲洗6~8次后,置于无菌保湿滤纸上,26℃暗培养16~20h,待种子露白,用镊子撕破种皮,破坏胚芽和胚根,剥出种胚,接种在诱愈培养基上,26±1℃暗培养15d。挑选胚性愈伤组织转入分化培养基,26±1℃暗培养10d后,转入同温条件下光培养,光照强度40μmol·m-2 s-1,光照时间16h·d-1。分化培养40d。
1.2.2 接种菌液的制备
接种菌液的制备参见文献[9],略有改动。在重悬菌液中加入乙酰丁香酮(AS)和Triton 100(终浓度分别为200μmol/l、1%),用于侵染小麦外植体。
1.2.3 选择抗生素选择压的确定实验
选取SN2618、HB341成熟种子,表面消毒后植于生根培养基,培养基中附加不同浓度的Km。Km浓度设定为0mg/l、10mg/l、20mg/l、30mg/l、40mg/l、50mg/l、60mg/l、70mg/l。在26±1℃、光照强度40μmol·m-2 s-1、光照时间16h·d-1的条件下,培养20d,然后观察统计白化苗数。每实验每处理接种100粒种子,实验重复1次。
1.2.4 外植体预培养时间对转化的影响实验
选取基因型HB341成熟种子,进行愈伤组织培养15d,挑选胚性愈伤组织,置于预培养培养基上,预培养时间设为0d、1d、2d、3d、4d,用OD600=0.6的菌液侵染30min,用滤纸吸干菌液,放于共培养培养基上,共培养3d,然后转移至筛选培养基筛选培养30d,统计卡那霉素抗性芽存活率。每处理外植体数为80,实验重复2次。
1.2.5 接种菌液浓度及侵染时间对转化的影响实验
选取基因型SN2618的成熟种子,进行愈伤组织培养15d,挑选胚性愈伤组织预培养3d,然后进行接种侵染。接种菌液配制成OD600分别为0.2、0.4、0.6和0.8的四个浓度,侵染时间设为10min、30min、45min和60min四个处理组,分别侵染后,放于含AS的共培养培养基上培养3d,洗菌后转移至筛选培养基筛选培养30d,统计卡那霉素抗性芽存活率。每处理外植体数为80,实验重复2次。
1.2.6 数据计算及统计分析
愈伤组织诱导率=诱导出愈伤组织的外植体数/接种的外植体数×100%;
转化率=分化出卡那霉素抗性绿芽或绿芽原基的愈伤组织块数/接种的愈伤组织块数×100%。
实验数据在0.05概率水平上进行方差齐性检验、单因素方差分析、Duncan多范围检验等,所用统计分析软件为DPS。
2 结果与分析
2.1 选择抗生素选择压的确定
研究结果表明(表1),在培养基中加入不同浓度的Km,对HB341和SN2618两个基因型幼苗的生长和发育有极显著影响(P<0.01);同时也表明,不同小麦基因型对Km的敏感性不同。经过20d的培养,对照组(0mg/l Km)幼苗生长正常,根系发达;而实验处理组随着Km浓度的增加,白化苗数增多,根逐渐变少变短。HB341在Km浓度为40mg/l、50mg/l、60mg/l、70mg/l四组中,白化苗比率为100%;SN2618在Km浓度为60mg/l、70mg/l两组中,白化苗比率为100%。HB341比SN2618对Km敏感,筛选HB341的转化细胞时,Km的选择压可以设定为40mg/l,筛选培养20d;筛选SN2618的转化细胞时,Km的选择压可以设定为60mg/l,筛选培养20d。
2.2 外植体预培养时间对转化的影响
实验结果表明(图1),预培养时间对愈伤组织的转化率影响显著(p<0.05)。愈伤组织预培养时间在0~3d,转化率随预培养时间的增加而增加;在预培养时间为3d时,转化率达到最高,为6.32%,比没有进行预培养的对照组(0d)转化率提高了1.07倍;预培养4d时,转化率反而有所下降,为4.12%。
在以后的转化实验中,预培养时间均为3d。
2.3 接种菌液浓度及侵染时间对转化的影响
实验结果说明(图2),菌液浓度和侵染时间对抗性芽存活率有明显的影响。在菌液浓度OD600为0.2、0.4的两组实验中,侵染时间对转化率影响不明显,转化率基本持平;而0.6组实验,表现为先增加后降低,在侵染时间30min时转化率达到最大值6.00%;0.8组则表现出整体降低的趋势。在小麦幼胚愈伤组织的遗传转化中也有类似的结果报道[10]。
本实验得到的优化组合为菌液浓度OD600=0.6,侵染30min。
注:相同字母表示在0.05概率水平上差异不显著。Note: the same letter showed significantly no difference at 0.05 probability level.
3 讨论
在遗传转化研究中,如何筛选出转化体是一个重要环节。本研究所用植物表达载体质粒pBI121携带有筛选标记基因NPT Ⅱ,导入、整合并充分表达NPT II基因的小麦转化细胞,具有对氨基糖苷类抗生素的抗性,在筛选培养基上能够生存增殖;未转化的细胞则因不含NPT II基因而被抗生素抑制或杀死。根据本实验研究结果(表1),小麦在发芽成苗期即对应于组织培养中的分化成苗期,对Km比较敏感。依据小麦不同基因型,Km有效筛选浓度范围在40~60mg/l,筛选培养时间为20~30d。在实验过程中观察到,筛选培养10d,非转化苗就有明显的白化表现或生长不良;筛选培养30d后仍为绿色生根正常苗者,几乎不存在转化假阳性问题。但有些文献研究结果显示[11],Km不适合作为小麦遗传转化的选择剂,与本实验结果不一致。笔者认为,出现这一差异可能是由于小麦基因型、实验起始外植体和操作细节、选择培养时期等各方面不同造成的,其中基因型的不同是主要原因。
预培养培养基中加入适量的AS并进行一定时间的预培养,能提高转化效率,可能因为AS是农杆菌介导遗传转化的有效诱导物质,随着预培养时间的适当延长,外植体中AS含量增加,侵染后AS诱导侵入愈伤组织的农杆菌Vir基因的表达,进而增强了农杆菌对细胞的转化能力,提高了转化率;但同时AS是一种酚类化合物,具有氧化作用,与愈伤组织长时间直接接触,可使愈伤组织老化褐变,影响组织细胞活性,降低转化效率。
农杆菌接种侵染的过程是农杆菌侵入植物组织并吸附在植物细胞上的过程。菌浓度越高,侵染时间越长,农杆菌侵入植物组织并吸附在细胞上的数量越多;但同时,植物材料浸没在农杆菌菌液里,菌液环境(pH值、渗透压、氧气、菌的代谢物等)对植物造成的伤害越严重,愈伤组织的存活率也越低。因此寻找适宜的菌液浓度和侵染时间组合,是成功转化所必需的。本实验得到的优化组合为菌液浓度OD600=0.6,侵染30min,认为采用此菌浓度和侵染时间对于外植体的转化及抗性芽的存活都比较有利。
根据实验研究结果,农杆菌介导的小麦成熟胚愈伤组织遗传转化的主要因子,如筛选抗生素的选择压、外植体预培养时间、接种菌液浓度及侵染时间等得到了优化,优化后的转化条件是:胚性愈伤组织在附加AS 200μmol/l的分化培养基上预培养3d,在OD600=0.6的菌液中侵染30min,在附加Km 40~60mg/l的分化培养基上筛选培养30d。小麦成熟胚愈伤组织遗传转化主要因子的优化,为提高小麦遗传转化效率,建立高效的转化体系奠定了基础。
摘要：目的:提高小麦成熟胚愈伤组织的转化效率,为建立快速高效的小麦遗传转化体系奠定基础。方法:以普通小麦HB341、SN2618成熟胚愈伤组织为受体,通过农杆菌GV3101/pBI121介导,进行选择剂选择压、外植体预培养时间、接种菌液浓度及侵染时间等遗传转化主要因子的优化研究。结果:最适宜的转化条件是:胚性愈伤组织在附加200μmol/l乙酰丁香酮的分化培养基上预培养3d,在OD600=0.6的接种菌液中侵染30min,然后在附加40～60mg/l卡那霉素的分化培养基上筛选培养30d,即可获得假阳性率很低的转基因小麦抗性芽。结论:该研究为快速高效小麦遗传转化体系的建立提供了依据。
关键词：小麦,遗传转化,优化
参考文献
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农杆菌介导 篇8
关键词：里氏木霉,根癌农杆菌,分生孢子,潮霉素磷酸转移酶,双元载体
0 引言
里氏木霉(Trichoderma reesei)可以大量合成并分泌纤维素酶,在诱导条件下,它分泌到发酵液中蛋白总量可达100g/L[1]。因此,T.reesei也是具有吸引力的基因工程宿主菌。利用T.reesei表达蛋白的前提是通过遗传转化将目的基因转入到其细胞内。对T.reesei进行转化的经典方法为原生质体转化法[2],但原生质体的制备和再生费力费时,而且转化的重复性差、效率较低。根癌农杆菌介导的转化方法(Agrobacterium tumeficiens Mediated Transformation,ATMT)具有操作简便、转化效率高、重复性好等特点,在丝状真菌的转化中日益受到重视。
根癌农杆菌(Agrobacterium tumeficiens)能够在受伤部位侵染植物,将其Ti质粒上的T-DNA (transfer DNA)转入植物细胞并整合进植物的基因组。根据这一特点发展的根癌农杆菌介导植物细胞的转化已成为一种常用方法。除了植物细胞以外,ATMT也能对酵母[3,4]、丝状真菌[5]、动物细胞[6]进行转化。传统的丝状真菌转化方法需制备原生质体,而ATMT对丝状真菌的转化可以孢子、菌丝等直接作为转化受体,操作更为简便。ATMT在丝状真菌的转化中的应用日益广泛,目前已通过ATMT对60余种丝状真菌成功地实现了转化[7]。
作者以农杆菌载体pCAMBIA0380为基础,构建了含潮霉素抗性基因的双元载体pCAM-hph,使用ATMT方法实现了T.reesei的转化,并对转化条件进行了探讨。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
里氏木霉(Trichoderma reesei QM9414)购自美国典型培养物保藏中心(ATCC),大肠杆菌E.coli TOP10F’购自Invitrogen,根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens LBA4404 由作者实验室郑易之教授惠赠。质粒pCAMBIA0380购自CAMBIA(Australia),pAN7-1为山东大学汪天虹教授惠赠,pMD18-T Simple Vector购自Takara(大连)。
1.1.2 试剂
限制性内切酶、DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、DNA片段纯化试剂盒、DNA分子量标记等购自Takara(大连)。利福平Rifampicin 购自北京鼎国生物技术公司;潮霉素(hygromycin B)购自Amresco;卡那霉素(kanamycin)和氨苄青霉素(ampicillin)购自上海生工;乙香丁香酮(AS,acetosyringone)为BBI公司产品;Cefotaxime为医用抗生素(由深圳大学医院提供),其他化学试剂均为国产分析纯。PCR引物合成和DNA序列测定由上海生工完成,所使用的引物列于表1。
1.1.3 培养基
T.reesei的平板及斜面培养基为PDA培养基(土豆浸出汁20%、葡萄糖1%,Agar 2%),用于转化子筛选时加入100μg/mL潮霉素和500μg/mL cefotaxime。T.reesei液体培养基为Mandels培养基[8]。大肠杆菌的培养基为LB培养基,用于筛选转化子时加入终浓度为100μg/mL的氨卞青霉素或50μg/mL的卡那霉素。根癌农杆菌的培养基为YEP培养基(MgSO4 2mmol/L、牛肉膏0.5%、酵母抽提物0.1%、蛋白胨0.5%、蔗糖0.5%、利福平20μg/mL),筛选转化菌株时加入50μg/mL的卡那霉素。根癌农杆菌的诱导培养基为IM培养基(K2HPO4 10mmol/L、KH2PO4 10mmol/L、NaCl 2.5mmol/L、MgSO4 2mmol/L、CaCl2 0.7mmol/L、FeSO4 9μmol/L、(NH4)2SO4 4mmol/L、Glucose 10mmol/L、Glycerol 0.5%、AS 200μmol/L)。
1.2 方法
1.2.1 载体构建
用HindⅢ 和EcoRⅠ酶切质粒pAN7-1,得到分子量约为1 500bp的DNA片段,它含有构巢曲霉色氨酸合成酶基因的终止子(TrpC)和潮霉素磷酸转移酶基因(hph)的一部分。该片段经切胶纯化后与用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切的质粒pCAMBIA0380连接,得到重组质粒pCAMBIA-1.5kb。以P1、P3为引物,以质粒pAN7-1为模板进出PCR扩增,得到分子量约2 600bp的DNA片段,它含有构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因gpdA的启动子和hph基因的剩余部分。PCR产物经ApaⅠ、EcoRⅠ分别单酶切纯化后,与经同样处理的pCAMBIA-1.5kb相连接,得到双元表达载体pCAM-hph。
1.2.2 根癌农杆菌的转化
利用改进的冻融法进行转化[9]。
1.2.3 根癌农杆菌介导T.reesei的转化
T.reesei转化受体的准备:用0.85%的生理盐水从PDA平板上洗下培养4d的T.reesei孢子,离心,用IM培养基重悬,并调整至孢子浓度为106个孢子/mL。里氏木霉原生质体的制备按照作者实验室的方法进行[8]。以T.reesei菌丝体为转化受体时取在Mandels培养基中培养48 h的T.reesei湿菌丝0.02g,用1mL IM培养基重悬。
转化用根癌农杆菌的准备:在含抗生素的YEB培养基中培养已转入双元载体pCBAM-hph的根癌农杆菌(抗生素的加量为kanamycin 100μg/mL,rifampicin 20μg/mL),培养温度28℃,转速200r/min,培养时间约24h (使OD660达到0.5-0.7)。取1.5mL上述农杆菌培养液在16 000g下离心10min,弃上清。离心所得的菌体用200μL IM培养基洗涤2次,并用同样体积的IM培养基重悬后接种到5mL IM培养基中培养6h。
转化过程及转化子的鉴定:将100μL的T.reesei孢子悬浮液(或菌丝、原生质体等其它形式的转化受体)与100μL农杆菌的诱导培养物混合后涂布于IM琼脂平板上,IM平板事先用玻璃纸覆盖,涂布时孢子和菌液涂布在玻璃纸的表面。共培养约2d后,将玻璃纸转移至含100μg/mL hygromycin和500μg/mL Cefotaxime的PDA平板上进行选择性培养并筛选转化子。通过PCR扩增hph基因鉴定阳性转化子。
2 结果与分析
2.1 双元重组质粒的构建和鉴定
双元载体pCAM-hph的构建过程如图1所示。由于酶切位点的限制,分两步将质粒pAN7-1中的hph表达盒插入到质粒pCAMBIA0380中的左边界序列和右边界序列之间。首先从pAN7-1中用HindⅢ 和EcoRⅠ双酶切下约1 500bp DNA片段,将它插入到经同样处理的质粒pCAMBIA0380中得到重组质粒pCAMBIA-1.5kb。然后用PCR方法扩增约2 600bp DNA片段,经ApaⅠ和EcoRⅠ 分别单酶切后与同样处理的重组质粒pCAMBIA-1.5kb连接,得到双元载体pCAM-hph。双元载体pCAM-hph构建完成后,使用酶切、PCR扩增和序列分析方法验证载体的正确性。
2.2 根癌农杆菌介导的T.reesei转化
经乙酰丁香酮诱导的根癌农杆菌转化子和里氏木霉的分生孢子在IM平板共培养48h后,将玻璃纸转移至含100μg/mL潮霉素的PDA平板上培养,4d后可见有黄色的菌落产生。通过多次平均计数,得出的转化效率为25.8个转化子每106个分生孢子。从选择PDA平板上任意挑取6个转化子,将其接种到T.reesei液体培养基(含hygromycin)进行培养。采用CTAB法提取基因组DNA,以H1、H2为引物扩增潮霉素磷酸转移酶基因(hph),获得了1 000bp左右的特异性条带(图2)。对该特异性条带进行了DNA序列分析,结果表明,T-DNA已经整合到T.reesei的基因组上。
随机挑取8个转化子接种到含100μg/mL 潮霉素B的PDA平板上进行二次筛选,将所获得的单菌落在不含hygromycin的PDA培养基上传代培养5次。5次传代培养的重组菌株经液体培养后提取总DNA,并进行PCR检测。在所有的5次传代培养物中都检测到hph基因,说明转化子的遗传稳定性较高(数据未列出)。
2.3 转化条件对转化效率的影响
2.3.1 AS浓度对转化效率的影响
使用含不同AS浓度的IM培养基进行农杆菌的诱导和农杆菌与T.reesei的共培养,结果如图3所示。结果表明,在IM培养基中不加AS,不能进行有效的转化,随着AS浓度的提高,转化子数量也增加,在AS浓度达到400μmmol/L时,可获得25.8个转化子。更高浓度的AS会抑制根癌农杆菌的活性,影响转化效率。另外,我们还发现在农杆菌活化时添加适量AS,有利于转化效率的提高。
2.3.2 细菌浓度对转化效率的影响
将使用IM培养基诱导培养的根癌农杆菌细胞离心后用IM培养基重悬,获得不同浓度的农杆菌诱导培养物。分别使用这些诱导培养物与T.reesei孢子进行共培养转化,结果如图4所示。在农杆菌诱导培养物的OD660为0.8时,转化效率最高,过高或过低的细菌浓度对转化效率有一定的影响。
2.3.3 真菌孢子浓度对转化效率的影响
根癌农杆菌活化后,取OD660为0.8的100μL初始菌液与不同浓度的T.reesei分生抱子悬液混合,涂板共培养2d后进行转化子筛选,结果如图5所示。成功的转化需要有一定的孢子浓度,且在孢子浓度106/mL时,转化效率最大。结合图4的结果,推测在根癌农杆菌介导的丝状真菌转化中,细菌浓度和真菌孢子浓度需具有一个合适的比例才能较好地实现。
2.3.4 共培养时间对转化效率的影响
共培养时间在24h内,将玻璃纸转移到筛选平板继续培养时不会出现转化菌落。延长共培养时间,在筛选平板中形成的转化菌落数量明显增加。当在时间过长,转化效率反而有所下降,而且形成的转化菌落会相互重叠,假阳性转化子明显增加,给筛选带来困难(图6)。
2.3.5 pH值对转化效率的影响
根癌农杆菌介导植物细胞转化时,vir区基因的活化除了需要酚类等化学物质的诱导外,还要求较低pH值(5.4~5.6)。使用根癌农杆菌介导T.reesei的转化时,共培养平板的pH值在5.0~5.5时,转化效率超过20个转化子/106个分生孢子(图 7),此结果和用农杆菌介导的方法进行植物的转化比较相似。当共培养的pH为6.5以上,在PDA选择平板上没有T.reesei转化菌落长出。
2.3.6 不同形式的T.reesei转化受体对转化效率的影响
在利用根癌农杆菌介导进行丝状真菌转化时,绝大多数使用真菌孢子作为转化受体[7]。我们分别使用T.reesei的分生孢子、原生质体和菌丝作为转化受体,结果表明采用原生质体为转化受体时转化效率最高(图8),可能的原因是以原生质体为转化受体时T-DNA整合入里氏木霉的过程中受到的限制较少。但由于制备原生质体的过程繁琐,而转化效率提高不足1倍,因此使用ATMT方法进行丝状真菌转化时仍以孢子作为转化受体比较合适。
3 讨论